CN103917244B - 用于提高细胞表面的etec cs6抗原呈递的方法及可由其获得的产物 - Google Patents
用于提高细胞表面的etec cs6抗原呈递的方法及可由其获得的产物 Download PDFInfo
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Abstract
用于提高细胞表面的ETEC CS6抗原呈递的方法,其包括以下步骤:将表达所述抗原的细胞与包含按重量计0.6%至2.2%苯酚的水溶液接触,使得所述抗原的呈递提高至少100%。用于制造全细胞死疫苗的方法,所述疫苗用于针对表达CS6之ETEC进行免疫接种。可通过以上方法获得的细胞和疫苗。
Description
发明领域
本发明涉及可用于制备ETECCS6抗原的方法,特别是用于制造疫苗,以及可通过所述方法获得的细胞和疫苗。
背景技术
大肠菌表面抗原6(Colisurfaceantigen6,CS6)是肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)细菌的最普遍非菌毛定植因子(colonizationfactor,CF)之一,肠产毒性大肠杆菌细菌是发展中国家的婴儿和儿童以及这些地区的旅行者中的痢疾的最常见病因。
由于针对ETEC的免疫保护主要通过在肠部局部产生的IgA抗体介导,因而很多的努力集中在开发基于CF的口服疫苗。已经开发了诱导抗CF免疫应答的ETEC候选疫苗,例如以CF-ETEC+CTB联合口服疫苗的形式,其包含表达最常遇到的几种CF(即CFA/I、CS1、CS2、CS3、CS4和CS5)的5种死ETEC菌株和重组霍乱毒素B亚单位(choleratoxinBsubunit,CTB,其与ETECLT的B亚单位高度同源)(LevineMM,GironJA,NoriegaF.Fimbrialvaccines.In:P.Klemm编辑.Fimbriae:adhesion,biogenics,geneticsandvaccines,CRCPress,BocaRaton,Fla.1994,55-70页;SvennerholmA-M,TobiasJ.VaccinesagainstenterotoxigenicEscherichiacoli.ExpertRevVaccines2008;7:795-804.)
之前的工作已经描述了表达致免疫量的菌毛CF抗原(例如CFA/I和CS2)(其在福尔马林处理后保留)的候选大肠杆菌疫苗菌株的制备。然而,产生表达致免疫量的CS6的大肠杆菌并且在全细胞死疫苗中保留CS6蛋白的免疫活性的尝试到现在都是失败的。
本文描述了具有非抗生素选择标记thyA的重组非产毒大肠杆菌菌株的构建,其在细菌表面表达大量的CS6抗原,并且表现为细菌的苯酚灭活不破坏CS6抗原性质。相反,出乎意料地发现苯酚处理显著提高在细胞表面呈递的抗原量。这一提高非常有价值,因为在口服全细胞疫苗中可包含的细胞数目是疫苗开发的主要限制因素,这是由于以下事实,即口服给予太大数目的细菌产生副作用例如呕吐,特别是在婴儿对象中。通过提高每个细胞呈递的抗原量,可以提高疫苗中的抗原量而不提高疫苗中细胞的总数目。
用这种苯酚杀死的CS6过表达大肠杆菌细菌口服免疫接种的小鼠诱导强的应答于CS6的粪便和肠IgA以及血清IgG+lgM抗体,其超过了由天然表达CS6且之前被用作疫苗菌株的ETEC参照菌株所诱导的应答。数据表明,所述非产毒且过表达CS6的苯酚灭活大肠杆菌菌株在口服ETEC疫苗中是有用的成分。
定义
在本公开内容的上下文中,下面的术语具有以下含义。
缩写ETEC指肠产毒性大肠杆菌(Escherichiacoli)细菌。
术语CS6抗原意指大肠菌表面抗原6,其为ETEC细菌的最普遍非菌毛定植因子之一。术语ETECCS6抗原同义地使用。
术语全细胞死疫苗(killedwholecellvaccine)是指包含完全(完整)但死的(非活的)细菌的疫苗。
术语非抗生素选择标记指在选择过程中不需要使用抗生素的用于选择质粒的遗传选择标记。实例包括thyA(胸苷酸合成酶,thymidinylatesynthetase)回补。
附图简述
图1:用于表达CS6的pJT-CS6-thyA构建体。首先构建质粒pJT-CFA/I-ThyA(A),然后用完整扩增的CS6操纵子替代CFA/I操纵子产生pJT-CS6-thyA(B)。
图2:通过斑点印迹(A)和抑制ELISA(B)检测的C600-CS6重组菌株和CS6参照菌株E11881/23上的CS6表面表达。两种菌株均在液体CFA培养基中培养,用IPTG诱导重组菌株,均被洗涤并且在以109细菌/ml为初始密度的连续稀释下进行测试。**P<0.01,通过Student'st检验,双尾。
图3:用相同数量的苯酚杀死的C600-CS6细菌和E11881/23细菌口服免疫接种C57B1/6小鼠后(n=5只小鼠/组),针对CS6的血清IgG+lgM以及粪便提取物和肠提取物ELISAIgA效价。对于每个组中的小鼠,效价表示为几何平均数(GM)+标准误(SE);对于粪便和肠提取物,根据提取物中的总IgA水平调整水平。对照指在免疫接种前小鼠中的抗体水平。**P<0.01,***P<0.001,通过Student'st检验,双尾。
发明概述
在第一方面中,公开了用于提高细胞表面上的ETECCS6抗原呈递的方法,其包括以下步骤:将表达所述抗原的细胞与包含按重量计0.6%至2.2%苯酚的水溶液接触,使得所述抗原的呈递提高至少100%,优选至少200%,更优选至少300%。
优选地,所述接触步骤的持续时间为1小时至72小时。更优选地,所述接触步骤的持续时间为1.5小时至42小时。
优选地,所述接触步骤期间的温度为18℃至42℃,更优选地18℃至38℃,甚至更优选地18℃至22℃或36℃至38℃。
优选地,苯酚浓度为按重量计0.8%至2.0%,更优选地按重量计1.0%至2.0%。
优选地,所述细胞包括大肠杆菌细胞。优选地,所述抗原为通过所述细胞重组过表达的。
优选地,第一方面的方法还包括以下步骤:通过抑制ELISA(inhibitionELISA)或斑点印迹(优选抑制ELISA)对所述细胞的抗原呈递和未经处理但在其他方面可比较的细胞的CS6抗原呈递进行比较。
在第二方面中,还公开了用于制造全细胞死疫苗的方法,所述疫苗用于针对表达CS6之ETEC进行免疫接种,所述方法包括根据前述权利要求中任一项的方法,其中苯酚浓度,接触温度和接触时间的选择使得发生伴随CS6抗原呈递提高的至少107倍的细胞灭活。
优选地,在第二方面的方法中,苯酚浓度为按重量计0.6%至2.0%,接触时间为6小时至72小时,接触温度为18℃至22℃。更优选地,苯酚浓度为按重量计0.75%至0.85%,接触时间为40±2小时,接触温度为20±1℃。
在第三方面中,公开了可通过根据第一或第二方面的方法获得的细胞。
在第四方方面中,公开了用于针对表达CS6之ETEC进行免疫接种的疫苗,其包含第三方面的细胞。
发明详述
用于提高CS6抗原呈递的方法
在第一方面中,本发明提供了用于提高细胞表面上的ETECCS6抗原呈递的方法,其特征在于其包括以下步骤:在合适的温度下将表达所述抗原的一种或更多种细胞与包含按重量计0.6%至2.2%苯酚的水溶液接触合适的时间,使得所述抗原的呈递提高至少20%。抗原的呈递提高至少20%意指,与没有经历所述方法但是在其他方面可比较的细胞相比,细胞表面的并且通过合适的方法(详细参见下文)可检测的抗原呈递的量至少翻倍。优选地,抗原呈递的提高为至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%,更优选地至少100%、125%、150%、175%、200%、250%或300%。最优选地,提高至少100%。
所述水溶液可以是例如添加苯酚的磷酸缓冲盐水(PBS),但是许多不同的水缓冲液是合适的。优选的是,缓冲液的pH为5至9,更优选6至8,最优选6.5至7.5。所述缓冲液的盐浓度优选为50至200mM,更优选100至150mM,最优选约137mM。合适的PBS缓冲液可以为如下:在1升中,8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4,pH7.4。
苯酚浓度、温度和时间这些变量表现出某些程度的相互依赖性。如果温度升高,则需要较低的苯酚浓度和/或较短的时间以实现呈递的提高(反之亦然)。如果处理时间延长,则可以利用较低的苯酚浓度和/或较低的温度(反之亦然)。借助于本文教导的指引,技术人员将能够使用常规试验(而无显著负担)来根据手头的需要调整苯酚浓度、时间和温度的组合。
处理的合适持续时间可以为0.1小时至240小时或1小时至240小时。优选地,处理时间可以为1小时至72小时。更优选地,处理时间可以为1.5小时至42.0小时,最优选地,处理时间为2.0小时至40.0小时。
处理的合适温度范围为1℃至45℃或者4℃至45℃。优选地,所述温度可以为18℃至42℃。从实用的角度看,可优选的是在环境温度(室温)进行所述方法以避免需要专门的设备来维持温度。因而一个优选的温度范围是18℃至25℃,甚至更优选18℃至22℃,最优选约20℃。可优选的还有在升高的温度进行所述方法以缩短过程的持续时间和/或以降低所需的苯酚浓度。因而另一个优选的温度范围是35℃至42℃,甚至更优选36℃至38℃,最优选约37℃。
苯酚浓度范围可优选地为按重量计0.7%至2.0%,更优选按重量计0.75%至2.0%,还更优选按重量计0.8%至2.0%,仍更优选按重量计0.85%至2.0%,甚至更优选按重量计0.9%至2.0%,以及最优选按重量计1.0%至2.0%。在一个优选的实施方案中,苯酚浓度为按重量计为0.6%至2.0%,接触时间为6小时至72小时,接触温度为18℃至22℃。在另一个优选的实施方案中,苯酚浓度为按重量计0.6%至2.0%,接触时间为2小时至4小时,接触温度为36℃至38℃。
以上方法中的细胞可以是大肠杆菌细胞。从实用的角度看这可以是有利的,因为大肠杆菌容易在实验室中生长和进行遗传操作。此外,所述方法的主要目的是提供针对ETEC的疫苗,从而可有利的是使用抗原的大肠杆菌宿主以为被呈递的抗原提供更天然的环境。优选地,所述细胞为非产毒大肠杆菌细胞。但是,应当理解所述方法也可以用其他表达CS6的细胞。
在合理的限制内细胞浓度不是至关重要的。认为任何多达1012个细胞/ml的浓度是可行的。实用的优选细胞浓度范围可以是108-1012个细胞/ml。最优选的范围是109至2-1010个细胞/ml。
ETECCS6抗原产生可以通过遗传改造在细胞中重组地诱导(参见实施例1)。这便于每个细胞产生高水平的抗原,有利于将疫苗剂量所需的细胞数目最小化,导致副作用的最小化。然而,所述方法也可以使用天然地(即没有任何遗传改造地)表达CS6抗原的细胞。然而优选地,所述方法的细胞是非产毒大肠杆菌宿主细胞,其由于用表达CS6的质粒转化而过表达CS6抗原。优选地,所述质粒具有非抗生素选择标记,即发挥作用不需要使用抗生素的选择标记。最优选地,宿主细胞是胸苷营养缺陷的并且CS6过表达质粒携带胸苷酸合成酶(ThyA)回补因子,从而选择可以使用缺乏胸苷的培养基进行。优选地,CS6过表达通过tac启动子或本领域公知的类似强诱导型启动子驱动。
对于测量因本发明方法引起的CS6抗原呈递提高,本文公开了可用的方法,并且这些方法也可以从文献中知晓。优选地,使用如本文公开的抑制ELISA测定(参见实施例2和相关的材料和方法)或通过也在本文中公开的斑点印迹(参见实施例2)进行测定。优选地,第一方面的方法包括另外的步骤:分析由细胞呈递的CS6抗原量(例如使用以上技术),以及将所述呈递的量与由未经历使用包含苯酚之水溶液的处理但是在其他方面可比较的细胞所呈递的CS6抗原量进行比较。合适地,在接触步骤之前将部分细胞取出并储存以这样作为对照样品。
用于制造疫苗的方法
在第二方面中,本公开内容提供了用于制造全细胞死疫苗的方法,所述疫苗用于针对表达CS6之ETEC进行免疫接种,所述方法包括根据第一方面的方法,其中选择苯酚浓度、接触温度和接触时间以使得发生伴随CS6抗原呈递提高的至少107倍的细胞灭活。优选地,灭活的程度为至少108倍,更优选109倍,还更优选1010倍,并且最优选在处理之后没有有活力的细胞。可以通过本领域公知的任何普通方法确定细胞灭活。本文在题为材料和方法的章节中公开了合适的方法。
利用苯酚灭活细胞并提高抗原呈递可以是有利的,因为这减少了疫苗制造中加工步骤的数目。苯酚灭活还解决了由CS6抗原被正常情况下优选的灭活方法(福尔马林处理)破坏的倾向所导致的问题(参见实施例2)。
优选地,在第二方面的方法中,苯酚浓度为按重量计0.6%至2.0%,接触时间为6小时至72小时,接触温度为18℃至22℃。可替换的优选条件组为其中苯酚浓度为按重量计0.6%至2.0%,接触时间为2小时至4小时并且接触温度为36℃至38℃。另一个优选的条件组为其中苯酚浓度为按重量计1.1%至1.3%,接触时间为16±3小时并且接触温度为20±2℃。另一个优选的条件组为其中苯酚浓度为按重量计1.1%至1.3%,接触时间为40±8小时并且接触温度为20±2℃。还优选条件组为其中苯酚浓度为按重量计1.4%至1.6%,接触时间为6±2小时并且接触温度为20±2℃。仍然还优选的条件组为其中苯酚浓度为按重量计0.75%至0.85%,接触时间为40±2小时并且接触温度为20±1℃。
可通过本发明方法获得的细胞和疫苗
在第三方面中,提供了可通过根据第一方面或第二方面的方法获得的细胞。苯酚处理导致抗原和/或细胞壁结构的明显改变,使得更多的抗原更能够被检测到(无论在体外例如通过抗体还是在体内通过免疫系统)。换言之,这样处理的细菌细胞已经通过第一或第二方面的方法获得了新的结构(尽管不可用结构术语描述结构的改变)。
在第四方面中,提供了用于针对表达CS6之ETEC进行免疫接种的疫苗,其包含根据第三方面的细胞。
实施例
对于与实施例相关的实验流程的细节,读者可以参照题为材料和方法的章节。
实施例1:在大肠杆菌C600-CS6中表达CS6
如图1A和1B中描述的,通过PCR扩增从具有CS6表面表达的野生型ETEC菌株制备的携带CS6结构基因(cssA、cssB、cssC、cssD)的DNA片段,并克隆以构建表达载体pJT-CS6-ThyA。随后该质粒被电穿孔至胸腺嘧啶依赖的、非产毒大肠杆菌C600-ΔthyA菌株,并且通过向生长培养基添加IPTG诱导CS6表面表达(如在免疫斑点印迹测定中所示)(图2A)。在缺乏诱导物的情况下未观察到CS6表达(未显示数据)。当使用斑点印迹测定检测由重组C600-CS6菌株的CS6表达时,我们发现与CS6参照菌株E11881/23(其之前在CF-CTB-ETEC疫苗中被用作CS4+CS6疫苗菌株)相比,该菌株表达提高至少8倍的CS6水平(图2A)。同样地,当使用抑制ELISA测定来特异性确定CS6之表面表达时,也发现与参照菌株相比,在重组菌株上CS6的量约增大为10倍(图2B)。
实施例2:灭活细菌而不破坏CS6抗原性质
为了杀死表达CS6的细菌同时保留在其表面上的CS6抗原性质,比较了甲醛和苯酚的效果。初步的研究显示用0.3%或0.6%甲醛处理细菌尽管安全地杀死细菌但导致可检测CS6抗原的完全丧失(数据未显示)。相反,用0.5%苯酚处理细菌不仅杀死了测试的细菌,还保留了CS6抗原(数据未显示);另一方面,更低测试浓度(0.25%)的苯酚未导致细菌的完全杀死。这些结果表明,苯酚处理可以用于灭活细菌同时保留CS6抗原。为了制定出最优的灭活方法,因此针对重组C600-CS6菌株和用于比较的另一CS6过表达菌株(TOP10-CS6-Amp)二者的灭活测试了不同浓度的苯酚。如在表2中所示,如通过抑制ELISA测试的,对于用0.5%、0.8%、1%和1.6%(不是用0.25%)的苯酚测试两种菌株,灭活了细菌并且还保留了表面CS6。当细菌用0.8%苯酚灭活时发现了CS6的最高水平,与未处理的细菌相比,该处理实际上的确可重现地提高了CS6抗原表面的估计量(表2)。基于这些结果,因此使用浓度为0.8%的苯酚灭活C600-CS6和参照菌株E11881/23二者,如通过抑制ELISA测试的,与对照菌株的相比,其在重组菌株中导致死细菌具有量提高6倍的CS6。这些灭活的细菌随后用于小鼠的口服免疫接种。
表2-用不同浓度的苯酚灭活之后,C600-CS6和TOP10-CS6-Amp菌株的表面CS6水平和生长的缺乏
a通过在材料和方法中描述的抑制ELISA测量表面CS6水平;四次确定的平均值±SE。
b用苯酚灭活之后,如在材料和方法中描述的测试经处理的细菌的无菌性(即生长的缺乏),-代表没有生长,以及+代表生长。
实施例3:苯酚杀死的C600-CS6在小鼠中的免疫原性
在重组菌株C600-CS6的免疫原性的第一测试中,我们用相同数量的苯酚杀死的细菌免疫Balb/C和C57Bl/6小鼠两种组,并且比较了通过ELISA测量的响应于CS6的血清抗体。尽管在两种类型的小鼠中都诱导了显著的抗CS6应答,但是在C57Bl/6小鼠中抗体应答大幅高于在Balb/C小鼠中的(未显示数据)。由此我们使用C57Bl/6小鼠用于进一步的口服免疫接种研究,其中比较了口服施用的苯酚杀死的C600-CS6疫苗制剂和参照菌株E11881/23的免疫原性。结果显示,所有经免疫的小鼠应答产生针对CS6的血清IgG+IgM抗体,并且与用参照菌株E11881/23免疫的小鼠中的相比,用C600-CS6细菌免疫的小鼠中针对CS6的抗体效价平均高60倍(图3)。还检测了针对CS6的粪便和肠IgA抗体应答(图3)。在两种情况下,当与用对应的参照菌株免疫的小鼠种的水平相比时,重组C600-CS6菌株诱导显著地、平均高75倍的针对CS6的粪便和肠IgA抗体水平;参照菌株仅仅诱导了比未免疫对照小鼠中观察到的略高的黏膜IgA抗CS6水平。
实施例4:在20℃优化苯酚处理提高CS6抗原呈递
在旋转式振荡器(150rpm)中于37℃培养C600-CS6菌株过夜(16小时至18小时)。将过夜培养物的等分试样稀释1/100并且所产生的培养物如上孵育2小时,之后添加IPTG至终浓度为1mM以诱导CS6的表达。然后培养物进一步在相同条件下孵育另外6小时。然后收获细菌,用PBS洗涤两次(以避免来自培养基的任何残留物的存在),并且在PBS中重悬至密度为OD600=16(对应于大约2×1010个细菌/ml)。
将经诱导的调整OD的细菌培养物分到8个250ml的瓶中,每个含有25ml的细菌培养物。在零时间(即未处理细菌)取出一部分用于活力计数(viablecounting)。向瓶中添加二十五(25)ml苯酚至终浓度(按重量计%)为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5或2.0,随后所有瓶在室温和80rpm下孵育1小时、2小时、6小时、16小时和40小时。每个时间点之后,从每个瓶移出1ml各细菌悬液(带有苯酚)至eppendorf管中。收获细菌,用PBS彻底洗涤两次(以避免来自苯酚的任何残留物的存在),并且用1mlPBS重悬。悬液贮存在4℃并用于抑制ELISA。结果在表3中示出。
表3-用不同浓度的苯酚在20℃灭活不同时间后,C600-CS6菌株上的表面CS6水平。
a通过如在材料与方法中描述的抑制ELISA测量表面CS6的水平。数值为两次确定的平均。
实施例5:苯酚处理以工业规模提高CS6抗原呈递并同时灭活细菌
用过表达CS6抗原的大肠杆菌菌株(ETEX24)接种500升发酵罐。在通过IPTG诱导表达后发酵继续8小、时。收获细菌并经500kD超滤器洗涤,最终以20×109个细菌/ml的浓度分配。添加苯酚至终浓度为0.8%(重量/体积)并且悬液于20℃在持续搅拌下维持40小时。悬液经500kD超滤膜以磷酸缓冲盐水洗涤并贮藏在4℃。
在灭活流程期间,在灭活之前、灭活后1、2、18和40小时取样品用于测试生存力。简言之,所取样品通过离心洗涤并在原始体积的PBS中重悬,随后在PBS中进行稀释并铺板在定殖因子琼脂(ColonisationFactorAgar,CFA琼脂)上。平板在37℃孵育并在第二天计数。
在灭活前的新鲜材料和经洗涤的灭活材料上进行抑制ELISA以定量CS6抗原的量。
显而易见地明显的是,可以以工业生产水平同时实现有效的细胞灭活和CS6抗原呈递的提高(表4)。
表4:在20℃灭活的时间过程
材料和方法
细菌菌株和培养物。在本研究中使用的细菌菌株列在表1中。使用非产毒胸腺嘧啶营养缺陷型的C600-ΔthyA大肠杆菌菌株(N.I.A.Carlin和M.Lebens,未发表)构建疫苗候选菌株C600-CS6。使用ETEC菌株E11881/23(其之前被用作CF-ETEC+CTB疫苗中的表达CS4+CS6的菌株)作为参照菌株。为了CS6的表达,细菌在CFA培养基中生长(EvansDG,EvansDJJr.,CleggS,PauleyJA.PurificationandcharacterizationoftheCFA/IantigenofenterotoxigenicEscherichiacoli.InfectImmun1979;25:738-48),需要时补充氨苄青霉素(100μg/ml)。
表1-本研究中所使用的菌株、质粒和引物的列表
表达载体pJT-CS6-ThyA的构建。为了构建C600-CS6重组菌株,首先产生质粒pJT-CFA/l-ThyA。用XhoI和AvrII消化质粒pJT-CFA/l-Cm(TobiasJ,HolmgrenJ,HellmanM,NygrenE,LebensM,SvennerholmA-M.Over-expressionofmajorcolonizationfactorsofenterotoxigenicEscherichiacoli,aloneortogether,onnon-toxigenicE.colibacteria.Vaccine2010;28:6977-84.)以移除氯霉素抗性基因(cat)。随后在PCR反应中使用质粒pNC-4(N.I.A.Carlin;未发表)以扩增thyA基因(来自霍乱弧菌(Vibriocholerae))。正向引物P1(SEQIDNO:1)与thyA上游98bp位置起始的序列同源并且具有Eco31I和4vrII的限制性位点,并且反向引物P2(SEQIDNO:2)与thyA下游75bp结束的序列同源并且在5′端具有Eco31I和XhoI的限制性位点(表1)。PCR条件如下:95℃5分钟,31个循环的94℃15秒、58℃30秒和72℃50秒,和在72℃的最终延伸7分钟。然后凝胶提取所产生的含有thyA的1065bp片段并用XhoI和4vrII切割。将经扩增并经消化thyA与经消化pJT-CFA/l-Cm连接以产生pJT-CFA/I-ThyA(图1A)。该质粒随后电穿孔进入大肠杆菌C600-ΔthyA,并分离重组菌株(C600-ΔthyA/pJT-CFA/I-ThyA)。
然后以两个步骤构建质粒pJT-CS6-ThyA(图1B)。首先,用EcoRI和HindIII消化pJT-CFA/I-ThyA质粒。使用PCR从表达CS6的ETEC菌株GB35扩增CS6操纵子(NicklassonM,A,LebensM,TobiasJ,JanzonA,BriveL,SvennerholmA-M.MutationsintheperiplasmicchaperoneleadingtolossofsurfaceexpressionofthecolonizationfactorCS6inenterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC)clinicalisolates.MicrobPathog.2008;44:246-54)。分别使用正向和反向引物P3(SEQIDNO:3)和P4(SEQIDNO:4)(表1)和扩展高保真PCR系统(ExpandHighFidelityPCRSystem,RocheDiagnosticsGmbH)进行扩增。P3与cssA上游13bp位置起始的序列同源并且携带EcoRI和Eco31I的限制性位点,而P4与cssD下游2bp结束的序列同源,在5′端携带HindIII和Eeo311的限制性位点(图1B)。PCR条件如之前所述(TobiasJ,LebensM,S,NicklassonM,SvennerholmA-M.RoleofdifferentgenesintheCS6operonforsurfaceexpressionofenterotoxigenicEscherichiacolicolonizationfactorCS6.Vaccine2008;26:5373-80)。然后用Eco31I限制酶切扩增的CS6操纵子(4135bp),产生侧翼为EcoRI和HindIII的片段,其与经消化pJT-CFA/I-ThyA连接产生7973bp的pJT-CS6-ThyA质粒。将构建的质粒pJT-CS6-ThyA电穿孔入C600-ΔthyA菌株。所产生的菌落通过使用引物P3和P4的PCR筛选CS6操纵子的存在。通过经分离质粒的限制性酶切分析进一步分析阳性克隆,并且还通过在cFA培养基中的生长能力确认其的胸腺嘧啶不依赖性。一个这样的克隆被选择为CS6阳性且胸腺嘧啶不依赖性菌株,并且指定为C600-CS6(即C600-ΔthyA/pJT-CS6-ThyA)。
CS6的表达。在CFA培养基中在旋转式振荡器(150rpm)中于37℃过夜(16-18小时)培养表达CS6的菌株。过夜培养物的等分试样在CFA培养基中1/100稀释并且所产生的培养物如上孵育两小时。将IPTG添加到重组菌株的培养物至终浓度为1mM以诱导CS6的表达,然后进一步在相同条件下孵育培养物另外6小时。然后收获细菌并在PBS中重悬至密度为OD600=0.8(对应于大约109个细菌/ml)。
重组菌株上CS6的定量。如描述于(TobiasJ,HolmgrenJ,HellmanM,NygrenE,LebensM,SvennerholmA-M.Over-expressionofmajorcolonizationfactorsofenterotoxigenicEscherichiacoli,aloneortogether,onnon-toxigenicE.colibacteria.Vaccine2010;28:6977-84和TobiasJ,LebensM,I,WiklundG,SvennerholmA-M.Constructionofnon-toxicEscherichiacoliandVibriocholeraestrainsexpressinghighandimmunogeniclevelsofenterotoxigenicE.colicolonizationfactorIfimbriae.Vaccine2008;26:743-52.)的,使用斑点印迹和抑制ELISA法,使用针对CS6的特异性单克隆抗体(Mab2a:14)(HelanderA,GrewalHM,GaastraW,SvennerholmA-M.Detectionandcharacterizationofthecolisurfaceantigen6ofenterotoxigenicEscherichiacolistrainsbyusingmonoclonalantibodies.JClinMicrobiol1997;35:867-72)定量由重组体C600-CS6和ETEC参照E11881/23菌株表达的CS6水平。
灭活细菌的制备。测试并比较甲醛和苯酚对表达CS6的菌株的灭活。向PBS中密度为1010个细菌/ml的细菌培养物中添加终浓度为0.3%(重量/体积;0.1M)或0.6%(0.2M)的甲醛和终浓度为0.25%至1.6%(重量/体积,0.026M至0.17M)的苯酚。悬液在37℃以60rpm震荡孵育2小时,然后在4℃保持三天(无搅拌)。细菌悬液然后被离心、洗涤并在相同体积的PBS中重悬,并且保持在4℃直到使用。在两种灭活方法中,将0.1每种悬液涂在血琼脂上并在37℃孵育多至一周以检查生长缺乏。在用于口服免疫之前,通过抑制ELISA检查经灭活细菌上的CS6水平。
小鼠免疫和样品收集。雌性Balb/C和C57Bl/6小鼠的组(CharlesRiver;6-8周龄;5只小鼠/组)被用于口服(灌胃)免疫。通过婴儿喂食导管用0.3ml3%碳酸氢钠溶液灌胃间隔两天给予所有小鼠两剂量的3×108个苯酚杀死(使用0.8%浓度的苯酚灭活)的C600-CS6或参照菌株之细菌以及7.5μgCT(第一轮免疫接种),随后两周之后在第二轮免疫接种中进行间隔两天的两次相同的免疫接种。在第一次免疫接种之前和最后一次免疫接种后两周进行抽血,此时还收集粪便粒(fecalpellet,FP)并按照之前所述制备提取物(NygrenE,HolmgrenJ,AttridgeSR.MurineantibodyresponsesfollowingsystemicormucosalimmunizationwithviableorinactivatedVibriocholerae.Vaccine2008;26:6784-90)。此外,在之后处死小鼠的时间点,用肝素-PBS溶液灌注它们以从组织移除血液,以及收集小肠组织并按照之前所述用2%(重量/体积)皂角苷-PBS溶液(Perfext方法)提取(VillavedraM,CarolH,HjulstromM,HolmgrenJ,CzerkinskyC.″PERFEXT":adirectmethodforquantitativeassessmentofcytokineproductioninvivoatthelocallevel.ResImmunol1997;148:257-66)。
ELISA。通过之前所述的ELISA确定在血清、粪便和肠提取物中针对CS6的IgG+IgM和IgA抗体效价(RudinA,SvennerholmA-M.Colonizationfactorantigens(CFAs)ofenterotoxigenicEscherichiacolicanprimeandboostimmuneresponsesagainstheterologousCFAs.MicrobPathog1994;16:131-9)。在ELISA中用作包被抗原(终浓度为0.7μg/ml)的CS6从之前描述的过表达TOP10-CS6的菌株(TobiasJ,LebensM,KallgardS,NicklassonM,SvennerholmA-M.Vaccine2008;26:5373-80)通过连续的硫酸铵沉淀和凝胶过滤纯化。使用低结合微滴定板(Greiner)测试来自个体小鼠的血清,样品初始稀释1/100,随后系列三倍稀释。在高结合微滴定板(Greiner)中测试粪便粒提取物和小肠组织提取物(从起始1/3稀释的3倍系列稀释)。按照样品稀释的倒数计算抗体效价,其在背景值之上给出A450吸光度为0.4。在粪便和肠提取物样品中,还通过ELISA按照已描述的测量总IgA(NygrenE,HolmgrenJ,AttridgeSR.Vaccine2008;26:6784-90),并且抗原特异性IgA抗体值表示为每μg总IgA的IgA效价单位。
统计学分析。所有ELISA实验在不同情况下至少进行两次。通过Student'st检验进行统计学分析,并且认为P<0.05(双尾)为差异显著。
Claims (15)
1.用于提高细胞表面上的ETECCS6抗原呈递的方法,其包括以下步骤:将表达所述抗原的细胞与包含按重量计0.6%至2.0%苯酚的水溶液相接触,
选择接触的持续时间为1小时至72小时;
选择接触期间的温度为18℃至42℃;
其中选择苯酚浓度、接触的持续时间和温度以使得所述抗原的呈递提高至少100%。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述抗原的呈递提高至少200%。
3.根据权利要求1所述的方法,其中接触步骤的持续时间为1.5小时至42小时。
4.根据权利要求1所述的方法,其中苯酚浓度为按重量计0.8%至2.0%。
5.根据权利要求1所述的方法,其中苯酚浓度为按重量计0.6%至2.0%,接触时间为6小时至72小时并且接触温度为18℃至22℃。
6.根据权利要求5所述的方法,其中苯酚浓度为按重量计0.75%至0.85%,接触时间为40±2小时并且接触温度为20±1℃。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中接触步骤期间的温度为18℃至22℃。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中苯酚浓度为按重量计0.8%至2.0%。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述细胞包括大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述细胞重组过表达所述抗原。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其还包括以下步骤:通过抑制ELISA或斑点印迹,比较所述细胞的抗原呈递和未经处理但在其他方面可比较之细胞的CS6抗原呈递。
12.根据权利要求11所述的方法,其中通过抑制ELISA进行所述比较。
13.用于制造针对表达CS6之ETEC进行免疫接种的全细胞死疫苗的方法,其包括实施根据权利要求1至6中任一项所述方法的步骤,其中选择苯酚浓度、接触温度和接触时间以使得伴随CS6抗原呈递的提高发生至少107倍的细胞灭活。
14.细胞,其可通过根据权利要求1至6中任一项所述的方法获得。
15.用于针对表达CS6之ETEC进行免疫接种的疫苗,其包含根据权利要求14所述的细胞。
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