BR112014005596B1

BR112014005596B1 - Método para aumentar a apresentação de antígeno cs6 de etec na superfície da célula, método para a fabricação de uma vacina de célula inteira morta, e, vacina para a imunização contra etec que expressa cs6

Info

Publication number: BR112014005596B1
Application number: BR112014005596-3A
Authority: BR
Inventors: Nils Carlin; Ann-Mari Svennerholm; Joshua Tobias
Original assignee: Scandinavian Biopharma Holding Ab
Priority date: 2011-09-12
Filing date: 2012-09-10
Publication date: 2020-03-24
Also published as: US20180079787A1; HK1199210A1; PT2750701E; ES2558454T3; CA2846279C; WO2013037718A1; CA2846279A1; US10851140B2; US20140178436A1; US10414806B2; AU2012307540A1; US20190389913A1; AU2012307540B2; US20160251401A1; BR112014005596A2; PL2750701T3; KR20140068187A; EP2750701A1; CN103917244B; US9273103B2

Abstract

método para aumentar a apresentação de antígeno cs6 de etec na superfície da célula, método para a fabricação de uma vacina de célula inteira morta, e, vacina para a imunização contra etec que expressa cs6 um método para aumentar a apresentação de antígeno etec cs6 na superfície da célula, que compreende a etapa de contato com as células que expressam o dito antígeno com uma solução aquosa que compreende de 0,6 a 2,2 por cento de fenol em peso, tal que a apresentação do dito antígeno é aumentada em pelo menos 100%. um método para a fabricação de uma vacina de célula inteira morta para a imunização contra etec que expressa cs6. células e vacinas obteníveis pelos métodos acima.

Description

“MÉTODO PARA AUMENTAR A APRESENTAÇÃO DE ANTÍGENO CS6 DE ETEC NA SUPERFÍCIE DA CÉLULA, MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE UMA VACINA DE CÉLULA INTEIRA MORTA, E, VACINA PARA A IMUNIZAÇÃO CONTRA ETEC QUE EXPRESSA CS6”

Campo da Invenção [0001] A presente invenção diz refere-se a métodos úteis na preparação de antígeno CS6 de ETEC, em particular para a fabricação de vacinas, assim como células e vacinas obteníveis através do método.

Fundamentos da invenção [0002] O antígeno de superfície Coli 6 (CS6) é um dos fatores de colonização não fimbrial mais prevalecente (CFs) de bactérias Escherichia coli enterotoxigênicas (ETEC), que são a causa mais comum de diarreia entre os bebês e crianças nos países em desenvolvimento e nos viajantes para tais áreas.

[0003] Visto que a proteção imune contra ETEC é principalmente mediada pelos anticorpos de IgA localmente produzidos no intestino, muitos esforços estão focalizados no desenvolvimento de uma vacina oral com base em CF. As vacinas candidatas contra ETEC que induzem respostas imunes anti-CF foram desenvolvidas, por exemplo, na forma de uma vacina oral CFETEC + CTB combinada que contém cinco cepas de ETEC mortas que expressam vários dos CFs mais habitualmente encontrados, isto é CFA/I, CS1, CS2, CS3, CS4, e CS5, junto com a subunidade da toxina do cólera B recombinante (CTB, que é altamente homóloga à subunidade B de ETEC LT) (Levine MM, Gferro JA, Noriega F. Fimbrial Vaccines. Em: P. Klemm editor. Fimbriae: adhesion, biogenics, genetics and vaccines, CRC Press, Boca Raton, Fla, 1994, p. 255-70; Svennerholm A-M, Tobias J. Vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli. Expert Rev Vaccines 2008; 7: 795-804).

[0004] Trabalho anterior tem descrito a preparação de cepas de vacina

Petição 870200006576, de 14/01/2020, pág. 7/12

2/21 contra a E.coli candidatas que expressam quantidades imunogênicas de antígenos de CF fimbriais tais como CFA/I e CS2, que são retidas depois do tratamento com formalina. Entretanto, tentativas para gerar quantidades imunogênica que expressam E. coli de CS6 e preservar a atividade imunológica da proteína CS6 em uma vacina de célula inteira morta tem falhado até agora.

[0005] E aqui descrita a construção de uma cepa da E. coli não toxigênica recombinante, com um marcador de seleção não antibiótico thyA, que expressa quantidades grandes de antígeno CS6 na superfície bacteriana, e mostram que a inativação com fenol das bactérias não destrói as propriedades antigênicas de CS6. Ao contrário, foi inesperadamente verificado que o tratamento com fenol signifícantemente aumentou a quantidade de antígeno apresentado na superfície da célula. Este aumento é muito relevante, visto que o número de células que podem ser incluídas em uma vacina de célula inteira oral é um fator limitante principal no desenvolvimento de vacina, devido ao fato de que números muito grandes de bactérias transmitidas oralmente dão origem a efeitos adversos tais como vômito, especialmente em indivíduos bebês. Aumentando-se a quantidade de antígeno apresentado por célula, a quantidade de antígeno(s) pode ser aumentada na vacina em aumentando o número global de células na vacina.

[0006] A imunização oral de camundongos com tais bactérias E.coli que super expressam CS6 morto por fenol induziu respostas de anticorpo de IgA fecal e intestinal e IgG+IgM séricas fortes ao CS6 que excedeu as respostas induzidas por uma cepa de referência de ETEC que naturalmente expressa CS6 e anteriormente usadas como uma cepa de vacina. Os dados indicam que a cepa de E. coli inativada por fenol não toxigênica e que super expressa CS6 descrita é um componente útil em uma vacina de ETEC oral.

Definições [0007] No contexto da presente divulgação, os termos abaixo têm os

3/21 significados que seguem. A abreviação ETEC refere-se às bactérias Escherichia coli enterotoxigênicas.

[0008] O termo antígeno CS6 significa o antígeno de superfície Coli 6, um dos fatores de colonização não fimbriais mais prevalecente de bactérias ETEC.O termo antígeno CS6 de ETEC é usado como sinônimo.

[0009] O termo vacina de célula inteira morta refere-se à vacina que contém bactérias inteiras (intactas) porém mortas (não vivas).

[00010] O termo marcador de seleção não antibiótico refere-se aos marcadores de seleção genética para a seleção de plasmídeos que não requerem o uso de antibióticos no processo de seleção. Os exemplos incluem a complementação com thyA (timidinilato sintetase).

Breve descrição dos desenhos [00011] Fig. 1: Construção de pJT-CS6-thyA para a expressão de CS6. O plasmídeo pJT-CFA/I-ThyA foi primeiro construído (A), e depois o operon CFA/I foi substituído com o operon CS6 amplificado inteiro criando o pJTCS6-thyA (B).

[00012] Fig. 2: Expressão de superfície de CS6 na cepa recombinante C600-CS6 e a cepa de referência CS6 El 1881/23 examinada pelo dot blots (A) e ELISA de inibição (B). Ambas as cepas foram cultivadas em meio CFA líquido, a cepa recombinante induzida com IPTG, ambas lavadas e testadas em diluições em série em uma densidade inicial de 10⁹ bactérias/ml. **P<0,01 pelo teste t de Student, bi-caudado.

[00013] Fig. 3: IgG+IgM sérico, e títulos de IgA de ELISA de extrato fecal e intestinal contra CS6, depois da imunização oral de camundongos C57 BI/6 com os mesmos números de bactérias C600-CS6 e bactérias El 1881/23 mortas com fenol (n = 5 camundongos/grupo). Os títulos são mostrados como média geométrica (GM) + erro padrão (SE) para os camundongos em cada grupo; para os extratos fecal e intestinal os níveis são ajustados aos níveis de IgA totais nos extratos. Os controles referem-se aos níveis de anticorpo em

4/21 camundongos antes da imunização. **P<0,01, ***P<0,001, pelo teste t de Student, bi-caudado.

Sumário da Invenção [00014] Em um primeiro aspecto, é divulgado um método para aumentar a apresentação de antígeno CS6 de ETEC na superfície da célula, que compreende a etapa de contato as células que expressam o dito antígeno com uma solução aquosa que compreende de 0,6 a 2,2 por cento de fenol em peso, tal que a apresentação do dito antígeno seja aumentada em pelo menos 100 %, preferivelmente pelo menos 200 %, mais preferivelmente pelo menos 300 %.

[00015] Preferivelmente, a duração da etapa de contato é de 1 a 72 h. Mais preferivelmente, a duração da etapa de contato é de 1,5 a 42 h.

[00016] Preferivelmente, a temperatura durante a etapa de contato é de a 42 °C, mais preferivelmente de 18 a 38 °C, ainda mais preferivelmente de 18 a 22 °C ou de 36 a 38 °C.

[00017] Preferivelmente, a concentração de fenol é de 0,8 a 2,0 por cento em peso, mais preferivelmente de 1,0 a 2,0 por cento em peso.

[00018] Preferivelmente, as células compreendem células de Escherichia coli. Preferivelmente, o antígeno é recombinantemente super expressado pelas células.

[00019] Preferivelmente, o método do primeiro aspecto compreende ainda a etapa de comparar a apresentação do antígeno pelas células com a apresentação de antígeno CS6 pelas células não tratadas mas de outro modo comparáveis por meio de um ELISA de inibição ou ponto e manchas, preferivelmente ELISA de inibição.

[00020] Em um segundo aspecto, também é divulgado um método para a fabricação de uma vacina de célula inteira morta para a imunização contra ETEC que expressa CS6, que compreende o método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a concentração de fenol, a

5/21 temperatura de contato e o tempo de contato são escolhidos tal que inativação de pelo menos 10⁷ vezes das células ocorre concomitantemente com o aumento na apresentação de antígeno CS6.

[00021] Preferivelmente, no método do segundo aspecto, a concentração de fenol é de 0,6 a 2,0 por cento em peso, o tempo de contato é de 6 a 72 h e a temperatura de contato é de 18 a 22 °C. Mais preferivelmente, a concentração de fenol é de 0,75 a 0,85 por cento em peso, o tempo de contato é de 40 ± 2 h e a temperatura de contato é de 20 ± 1 °C.

[00022] Em um terceiro aspecto, é divulgada uma célula obtenível pelo método de acordo com o primeiro ou o segundo aspectos.

[00023] Em um quarto aspecto, é divulgada uma vacina para a imunização contra ETEC que expressa CS6, que compreende as células do terceiro aspecto.

Descrição detalhada

Método para aumentar a apresentação de antígeno CS6 [00024] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um método para aumentar a apresentação de antígeno CS6 de ETEC em uma superfície da célula, caracterizado em que o mesmo compreende a etapa de contato uma célula ou células que expressam o dito antígeno com uma solução aquosa que compreende de 0,6 a 2,2 por cento de fenol em peso, em uma temperatura adequada e durante um tempo adequado, tal que a apresentação do dito antígeno seja aumentada em pelo menos 20 %. Por pelo menos 20 % de aumento na apresentação de antígeno é intencionado que a quantidade de antígeno presente da superfície da célula e detectável pelos métodos adequados (ver abaixo para detalhes) é pelo menos duplicada comparada com as células que não foram individualizadas ao método mas que são de outro modo comparáveis. Preferivelmente, o aumento na apresentação de antígeno é de pelo menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, mais preferivelmente de pelo menos 100 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %,

6/21

250 % ou 300 %. O mais preferivelmente, o aumento é de pelo menos 100 %. [00025] A solução aquosa por exemplo, pode ser solução salina tamponada com fosfato (PBS) com fenol adicionado, mas muitos tampões aquosos diferentes são adequados. E preferível que o pH dos tampões seja de 5 a 9, mais preferivelmente de 6 a 8, o mais preferivelmente de 6,5 a 7,5. A concentração salina do tampão é preferivelmente de 50 a 200 mM, mais preferivelmente de 100 a 150 mM e o mais preferivelmente de cerca de 137 mM. Um tampão de PBS adequado pode ser como segue: 8 g de NaCI, 0,2 g de KC1, 1,44 g de Na₂HPO₄, 0,24 g de KH₂PO₄, em 1 litro, pH 7,4.

[00026] A variáveis de concentração de fenol, temperatura e tempo exibem um certo grau de interdependência. Se a temperatura é aumentada, a concentração de fenol mais baixa e/ou o tempo encurtado são requeridos para se obter a apresentação aumentada (e vice e versa). Se o tempo de tratamento é alongado, a concentração de fenol mais baixa e/ou a temperatura mais baixa podem ser utilizadas (e vice e versa). Auxiliado pela orientação das divulgações aqui, a pessoa habilitada será capaz de usar experimentação de rotina em carga significante para adaptar a combinação da concentração de fenol, tempo e temperatura para as necessidades à mão.

[00027] A duração adequada para o tratamento pode ser de 0,1 a 240 h ou de 1 a 240 h. Preferivelmente, o tempo de tratamento pode ser de 1 a 72 h. Mais preferivelmente, o tempo de tratamento pode ser de 1,5 a 42,0 h. O mais preferivelmente, o tempo de tratamento é de 2,0 a 40,0 h.

[00028] A temperatura adequada para o tratamento está na faixa de 1 a 45 °C ou de 4 a 45 °C. Preferivelmente, a temperatura pode ser de 18 a 42 °C. Do ponto prático de vista, pode ser preferível realizar o método na temperatura ambiente (sala) para evitar a necessidade quanto a equipamento especializado para manter a temperatura. Assim uma faixa de temperatura preferida é de 18 a 25 °C, ainda mais preferivelmente de 18 a 22 °C, o mais preferivelmente de cerca de 20 °C. Também pode ser preferível realizar o

7/21 método em uma temperatura elevada para encurtar a duração do processo e/ou para reduzir a concentração de fenol requerido. Assim uma outra faixa de temperatura preferida é de 35 a 42 °C, ainda mais preferivelmente de 36 a 38 °C, o mais preferivelmente de cerca de 37 °C.

[00029] A concentração de fenol preferivelmente pode estar na faixa de 0,7 a 2,0 por cento em peso, mais preferivelmente de 0,75 a 2,0 por cento em peso, ainda mais preferivelmente de 0,8 a 2,0 por cento em peso, ainda mais preferivelmente de 0,85 a 2,0 por cento em peso, ainda mais preferivelmente de 0,9 a 2,0 por cento em peso, e o mais preferivelmente de 1,0 a 2,0 por cento em peso. Em uma forma de realização preferida, a concentração de fenol é de 0,6 a 2,0 por cento em peso, o tempo de contato é de 6 a 72 h e a temperatura de contato é de 18 a 22 °C. Em uma outra forma de realização preferida, a concentração de fenol é de 0,6 a 2,0 por cento em peso, o tempo de contato éde2a4hea temperatura de contato é de 36 a 38 °C.

[00030] As células no método acima podem ser células de Escherichia coli. Isto pode ser vantajoso do ponto prático de vista visto que a E. coli é facilmente cultivada e geneticamente manipulada no laboratório. Além disso, o propósito principal do método é fornecer vacinas contra ETEC, por meio do qual pode ser vantajoso usar um hospedeiro da E. coli para o antígeno fornecer um contexto mais natural para o antígeno que é apresentado. Preferivelmente, as células não são células E. coli toxigênicas. Não obstante, deve ser entendido que o método pode ser usado também com outras células que expressam CS6.

[00031] A concentração de célula não é crucial dentro de limites razoáveis. Qualquer concentração até 10 células/ml é considerada praticável. Uma faixa de concentração de célula prática preferível pode ser de 10⁸ a 10¹² células/ml. A faixa mais preferível é de 10⁹ a 2· 10¹⁰ células/ml.

[00032] A produção de antígeno CS6 de ETEC pode ser recombinantemente induzida na célula, por via de engendramento genético

8/21 (ver o Exemplo 1). Isto facilita a produção de altos níveis do antígeno por célula, vantajoso para minimizar o número de células necessárias durante uma dose de vacina, levando aos efeitos adversos minimizados. Não obstante, o método também pode ser usado com células que nativamente (isto é em qualquer engendramento genético) expressam o antígeno CS6. Preferivelmente entretanto, as células do método são células hospedeiras da E. coli não toxigênicas que super expressam o antígeno CS6 como um resultado da transformação com um plasmídeo que expressa CS6. Preferivelmente, o plasmídeo tem um marcador de seleção não antibiótico, isto é um marcador de seleção que não requer o uso de antibióticos para a sua função. O mais preferivelmente, as células hospedeiras são auxotrópicas para timidina e o plasmídeo que super expressa CS6 carrega um fator de complementação da timidinilato sintetase (ThyA), por meio do qual a seleção pode ser realizada usando um meio destituído de timidina. Preferivelmente a super expressão de CS6 é direcionada por um promotor tac ou um promotor indutível forte similar bem conhecido na técnica.

[00033] Em termos de medir a apresentação aumentada do antígeno CS6 como um resultado do método da invenção, os métodos úteis são aqui divulgados e também são conhecidos da literatura. Preferivelmente, a determinação é realizada usando um ensaio de inibição de ELISA como aqui divulgado (ver o Exemplo 2 e o Materiais e Métodos associado), ou por meio de um mancha e pontos também aqui divulgado (ver o Exemplo 2). Preferivelmente, o método do primeiro aspecto compreende as etapas adicionais de analisar a quantidade de apresentação do antígeno CS6 pelas células (por exemplo, usando as técnicas acima) e comparando a quantidade apresentada com a quantidade de antígeno CS6 apresentada pelas células que não foram individualizadas para o tratamento com solução aquosa que compreende fenol mas que são de outro modo comparáveis. Adequadamente, uma porção de células é posta de lado e armazenada antes da etapa de contato

9/21 para servir como uma tal amostra de controle.

Método para fabricação de uma vacina [00034] Em um segundo aspecto, a presente divulgação fornece um método para a fabricação de uma vacina de célula inteira morta para a imunização contra ETEC que expressa CS6, que compreende o método de acordo com o primeiro aspecto, em que a concentração de fenol, a temperatura de contato e o tempo de contato são escolhidos tal que pelo menos 10 vezes de inativação das células ocorra concomitantemente com o aumento na apresentação de antígeno CS6. Preferivelmente, O grau de inativação é de pelo menos 10 vezes, mais preferivelmente de 10 vezes, ainda mais preferivelmente 10¹⁰ vezes e o mais preferivelmente não há nenhuma células viável presente depois do tratamento, a inativação da célula pode ser determinada por qualquer meio comum bem conhecido na técnica. Um método adequado é aqui divulgado na seção intitulada Materiais e Métodos.

[00035] A utilização de fenol para a inativação de célula assim como aumentar a apresentação de antígeno pode ser vantajosa visto que isto reduz o número de etapas de processo na fabricação de vacina. A inativação pelo fenol também resolve o problema que resulta da propensão do antígeno CS6 de ser destruído no método de inativação normalmente preferível, o tratamento com formalina (ver o Exemplo 2).

[00036] Preferivelmente, no método do segundo aspecto, a concentração de fenol é de 0,6 a 2,0 por cento em peso, o tempo de contato é de 6 a 72 h e a temperatura de contato é de 18 a 22 °C. O conjunto preferido alternativo de condições é onde a concentração de fenol é de 0,6 a 2,0 por cento em peso, o tempo de contato éde2a4hea temperatura de contato é de 36 a 38 °C. Já um outro conjunto preferido de condições é onde a concentração de fenol é de 1,1 a 1,3 por cento em peso, o tempo de contato é de 16 ± 3 h e a temperatura de contato é de 20 ± 2 °C. Ainda um outro

10/21 conjunto preferido de condições é onde a concentração de fenol é de 1,1 a 1,3 por cento em peso, o tempo de contato é de 40 ± 8 h e a temperatura de contato é de 20 ± 2 °C. Outro conjunto preferido de condições é onde a concentração de fenol é de 1,4 a 1,6 por cento em peso, o tempo de contato é de 6 ± 2 h e a temperatura de contato é de 20 ± 2 °C. Ainda um outro conjunto preferido de condições é onde a concentração de fenol é de 0,75 a 0,85 por cento em peso, o tempo de contato é de 40 ± 2 h e a temperatura de contato é de 20 ± 1 °C.

Células e vacinas obteníveis através do método da invenção [00037] Em um terceiro aspecto, uma célula obtenível pelo método de acordo com o primeiro ou segundo aspectos é fornecida. O tratamento com fenol resulta em uma mudança aparente na estrutura da parede da célula e/ou o antígeno tal que mais do antígeno está mais disponível para a detecção (tanto in vitro por exemplo, pelos anticorpos quanto in vivo pelo sistema imune). Em outras palavras, a célula bacteriana assim tratada adquiriu uma nova estrutura por via do método do primeiro ou segundo aspectos, embora não seja praticável descrever a mudança na estrutura em termos estruturais.

[00038] Em um quarto aspecto é fornecida uma vacina para a imunização contra ETEC que expressa CS6, que compreende as células de acordo com o terceiro aspecto.

Exemplos [00039] Para detalhes sobre os procedimentos experimentais que referem-se aos exemplos, o leitor é encaminhado para a seção intitulada Materiais e Métodos.

Exemplo 1: Expressão de CS6 na E. coli C600-CS6.

[00040] Um fragmento de DNA que carrega os genes estruturais (cssA, cssB, cssC, cssD) para CS6, preparado a partir de uma cepa ETEC do tipo selvagem com expressão de superfície de CS6, foi amplificado pela PCR e clonado para construir o vetor de expressão pJT-CS6-ThyA, como

11/21 representado nas Figs. IA e IB. Este plasmídeo foi depois eletroporado dentro da cepa C600-AthyA da E. coli dependente de timina, não toxigênica, e a expressão de superfície de CS6 foi induzida pela adição de IPTG ao meio de cultivo, como mostrado em um ensaio de imuno-pontos e manchas (Fig. 2A). Nenhuma expressão de CS6 foi observada na ausência do indutor (dados não mostrados). Quando da examinação da expressão de CS6 pela cepa C600-CS6 recombinante usando o ensaio de pontos e manchas, verificou-se que esta cepa expressou níveis pelo menos 8 vezes mais altos de CS6 comparada com a cepa de referência de CS6 El 1881/23, que foi anteriormente usada como cepa de vacina CS4+CS6 na vacina CF-CTB-ETEC (Fig. 2A). Do mesmo modo, também quando especificamente da determinação da expressão de superfície de CS6 usando um ensaio ELISA de inibição, uma quantidade aproximadamente 10 vezes maior de CS6 foi verificada na cepa recombinante quando comparada com a cepa de referência (Fig. 2B).

Exemplo 2: Inativação de bactérias na destruição das propriedades do antígeno CS6.

[00041] Com o objetivo de matar as bactérias que expressam CS6 enquanto se preserva as propriedades do antígeno CS6 na sua superfície, os efeitos do formaldeído e do fenol foram comparados. Estudos preliminares mostraram que tratar as bactérias com 0,3 % ou 0,6 % de formaldeído, embora seguramente matasse as bactérias, resultou em uma perda completa do antígeno CS6 detectável (dados não mostrados). Ao contrário, tratando as bactérias com 0,5 % de fenol não apenas matou as bactérias testadas, mas também preservou o antígeno CS6 (dados não mostrados); uma concentração de teste mais baixa de fenol, 0,25 %, por outro lado não resultou na morte completa das bactérias. Estes resultados indicam que o tratamento com fenol pode ser útil para inativar as bactérias enquanto se preserva o antígeno CS6. Para desenvolver um método de inativação ideal, concentrações diferentes de fenol foram portanto testadas quanto à inativação tanto da cepa C600-CS6

12/21 recombinante quanto para a comparação com uma outra cepa que super expressa CS6 (TOPlO-CS6-Amp). Como observado na Tabela 2, com ambas as cepas testadas com 0,5 %, 0,8 %, 1 %, e 1,6 %, mas não com 0,25 %, de fenol inativou as bactérias e também preservou o CS6 da superfície, como testado pelo ELISA de inibição. O nível máximo de CS6 foi encontrado quando as bactérias foram inativadas com 0,8 % de fenol, tratamento este que de fato reprodutivelmente aumentou as quantidades estimadas de superfície de antígeno CS6 comparado com as bactérias não tratadas (Tabela 2). Com base nestes resultados, o fenol na concentração de 0,8 % foi portanto usado para inativar tanto C600-CS6 quanto a cepa de referência cepa El 1881/23, que resultou nas bactérias mortas com quantidades 6 vezes maiores de CS6 na cepa recombinante do que na cepa de referência, como testado pelo ELISA de inibição. Estas bactérias inativadas foram depois usadas para as imunizações orais de camundongos.

Tabela 2 — Níveis de CS6 de superfície e falta de crescimento das cepas C600-CS6 e TOP10-CS6-Amp, depois da inativação com concentrações diferentes de fenol.

	CS6 (ug/10⁹ bactérias) ’	Crescimento ^b
Fenol	C600-CS6	TOPlO-CS6-Amp	C600-CS6	TOPlO-CS6-Amp
0	0,61 ±0,038	0,39 ± 0,054	+	+
0,25 %	0,55 ± 0,037	0,30 ± 0,06	+	+
0,5 %	0,53 ± 0,046	0,77 ± 0,084	-	-
0,8 %	2,03 ± 0,23	2,36 ± 0,206	-	-
1,0 %	1,92 ±0,18	1,87 ± 0,13	-	-
1,6 %	1,15 ± 0,11	0,89 ± 0,082	-	-

^a Os níveis de CS6 de superfície foram medidos pelo ELISA de inibição como descrito em materiais e métodos; valores da média + SE de quatro determinações.

^b A seguir da inativação com fenol, as bactérias tratadas foram testadas quanto à esterilidade (isto é falta de crescimento) como descrito em materiais e métodos; — indica nenhum crescimento, e + indica crescimento.

Exemplo 3: Imunogenicidade de C600-056 morta com fenol em camundongos.

[00042] Em um primeiro teste da imunogenicidade da cepa recombinante C600-CS6 grupos de camundongos tanto Balb/C quanto C57 BI/6 com o mesmo número de bactérias mortas por fenol foram imunizados, e as respostas de anticorpo sérico ao CS6, como medido pelo ELISA, foram

13/21 comparados. Embora respostas anti-CS6 significantes fossem induzidas em ambos os tipos de camundongos, as respostas de anticorpo nos camundongos C57 BI/6 foram substancialmente mais altas do que nos camundongos Balb/C (dados não mostrados). Usaram-se os camundongos C57 BI/6 para outros estudos de imunização oral em que a imunogenicidade da preparação de vacina morta por fenol oralmente administrada de C600-CS6 e da cepa de referência El 1881/23 foram comparadas. Os resultados mostraram que todos os camundongos imunizados responderam com a produção de anticorpos IgG+IgM séricos contra CS6, e que os títulos de anticorpos contra CS6 em média foram mais do que 60 vezes mais altos nos camundongos imunizados com as bactérias C600-CS6 do que aqueles em camundongos imunizados com a cepa de referência El 1881/23 (Fig. 3). As respostas de anticorpo IgA fecal e intestinal contra CS6 também foram examinadas (Fig. 3). Em ambos os casos a cepa C600-CS6 recombinante induziu significantemente, em média níveis 75 vezes mais altos de anticorpos IgA fecal e intestinal contra CS6 quando comparados com os níveis em camundongos imunizados com a cepa de referência correspondente; a última cepa induziu apenas níveis de IgA antiCS6 mucósico marginalmente mais altos do que aqueles observados em camundongos de controle não imunizados.

Exemplo 4: Otimização do tratamento com fenol que aumenta a apresentação de antígeno CS6 a 20 °C [00043] A cepa C600-CS6 foi cultivada durante a noite (16 a 18h) em um agitador rotativo (150rpm) a 37°C. As alíquotas da cultura durante a noite foi diluída 1/100 e a cultura resultante incubada por 2 h como acima, depois que IPTG foi adicionado a uma concentração final de 1 mM para induzir a expressão de CS6. A cultura foi depois incubada ainda nas mesmas condições durante um adicional de 6 h. As bactérias foram depois colhidas, lavadas duas vezes com PBS (para evitar a presença de quaisquer resíduos do meio), e recolocadas em suspensão em PBS a uma densidade de OD₆₀q ⁼ 16 (que

14/21 corresponde a aproximadamente 2 x IO¹⁰ bactérias/ml).

[00044] A cultura bacteriana induzida, ajustada na OD foi dividida em 8 frascos de 250 ml, cada um contendo 25 ml da cultura bacteriana. Como tempo zero (isto é bactérias não tratadas) uma porção foi tirada para a contagem viável. Vinte e cinco (25) ml de fenol na concentração final (por cento em peso) de 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,5, ou 2,0 foram adicionados dentro dos frascos, seguido pela incubação de todos os frascos por 1 h, 2 h, 6 h, 16 h, e 40 h, na temperatura ambiente com 80 rpm. Depois de cada ponto de tempo, 1 ml de cada suspensão bacteriana (com fenol) foi removido de cada frasco para um tubo ependorf. As bactérias foram colhidas, lavadas completamente duas vezes com PBS (para evitar a presença de quaisquer resíduos do fenol), e recolocadas em suspensão com 1 ml de PBS. As suspensões foram armazenadas a 4 °C e usadas para o ELISA de inibição. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3 — Níveis de CS6 na superfície na cepa C600-056, depois da inativação com concentrações diferentes de fenol durante tempos diferentes a 20 °C.

Fenol	CS6 (14/10⁹ bactérias)^a
Tempos de Incubação
0 h	6 h	16 h	40 h
0	0,3
0,6 %		0,17	0,28	0,73
0,8 %	0,28	0,77	0,89
1,0%	1,1	0,93	1,06
1,2 %	1,67	2,2	1,36
1,5 %	2,75	1,71	1,14
2,0 %	1,57	0,91	0,37

^a Os níveis de CS6 de superfície foram medidos pelo ELISA de inibição como descrito em materiais e métodos. Os valores são a média de duas determinações.

Exemplo 5: Tratamento com fenol aumentando a apresentação do antígeno CS6 e simultaneamente inativando as bactérias em escala industrial [00045] Um fermentador de 500 litros foi inoculado com uma cepa da E. coli que super expressa o antígeno CS6 (ETEX 24). Depois da indução da expressão pelo IPTG a fermentação foi continuada por 8 horas. As bactérias

15/21 foram colhidas e lavadas em um ultrafíltro de 500 kD e fmalmente dispensadas em uma concentração de 20 χ 10⁹ bactérias/ml. Fenol foi adicionado a uma concentração final de 0,8 % (p/v) e a suspensão foi mantida a 20 °C por 40 horas sob agitação constante. A suspensão foi lavada em uma membrana de ultrafiltração de 500 kD em solução salina tamponada com fosfato e armazenada a 4 °C.

[00046] Durante o procedimento de inativação as amostras foram tiradas antes da inativação depois de 1, 2, 18 e 40 horas de inativação para testar quanto à viabilidade. Em resumo, as amostras tiradas foram lavadas pela centrifugação e recolocadas em suspensão no volume original em PBS depois do que as diluições foram feitas em PBS e plaqueadas no Fator de Colonização Agar (CFA ágar). As placas foram incubadas a 37 °C e contadas no dia seguinte.

[00047] O ELISA de inibição para quantificar a quantidade de antígeno de CS6 foi feita em material fresco antes da inativação e material inativado lavado.

[00048] Está claramente evidente que a inativação de célula eficiente e a apresentação de antígeno CS6 aumentada podem ser obtidas simultaneamente na escala de produção industrial (Tabela 4).

Tabela 4: Curso de tempo para a inativação a 20 °C
Tempo de inativação (h)	0	1	2	18	40
CS6 Total (pg/10⁹ células)	2,51	Nd	Nd	Nd	5,36
CS6 Ligado (gg/10⁹ células)	1,01	Nd	Nd	Nd	2,90
Células Viáveis (cfu/ml)	1,64 x 10'°	1,5 χ 10⁵	1,2 χ 10³	0	0
Nd = não determinados
Materiais e Métodos
[00049] Cepas	e cultura bacterianas. As	cepas	bacterianas usadas

neste estudo são listadas na Tabela 1. Uma cepa da E. coli C600-AthyA não toxigênica, que é auxotrófica para timina (N.I.A. Carlin e M. Lebens, não publicado) foi usada para a construção da cepa candidata à vacina C600-CS6. A ETEC cepa El 1881/23, que foi anteriormente usado como uma cepa que expressa CS4+CS6 na vacina CF-ETEC + CTB, foi usada como uma cepa de

16/21 referência. Para a expressão de CS6, as bactérias foram cultivadas em meio CFA (Evans DG, Evans DJ Jr., Clegg S, Pauley JA. Purification and characterization of the CFA/I antigen of enterotoxigenic Escherichia coli. Infect Immun 1979; 25: 738-48), suplementado com ampicilina (100 gg/ml) quando necessário.

Tabela 1 — Lista de cepas, plasmídeos, e iniciadores usados neste estudo

Cepas, plasmídeos e iniciadores	Características Relevantes	Referência/Fonte
Cepas: ETEC GB35	CS6\ LT\	Nicklasson et al. Microb Pathog. 2008; 44: 24654.
£. coli El 1881/23	CS4⁺ CS6⁺, LT, ST	Fobias et al. Vaccine 2008; 26: 5373-80
TOPlO-CS6-Amp	TOP 10 que expressa CS6, Amp' Auxotrófica para timina; Kan^r	NLA Carlin e M Lebens
E. coli C600-4thyA	Este estudo
C600-CFA/I	C600-4thyA/pJT-CFA/I-ThyA	Este estudo
C600-CS6	C600-AthyA/p 1 T-CS6-ThyA
Plasmídeo: pJT-CFA/I-Cm	9041 pares de base	Fobias et al. Vaccine 2010; 28: 6977-84.
pNC-4	5086 pares de base; thyA	NLA Carlin
pJT-CFA/I-ThyA	8879 pares de base; thyA	Este estudo
pJT-CS6-ThyA	7973 pares de base, thyA	Este estudo
Iniciadores: PI	5’-CGGTCTCCCTAGGCCTCCTTACCTATGGTGATC (SEQ ID NO: 1)
P2	5’-CGGTCTCCTCGAGCGACTCTAGACCTAACCG (SEQ ID NO: 2)
P3	5’-CGGTCTCGAATTCTAATGGTGTTATATGAAGAAAACAATTG (SEQ ID NO: 3)
P4	5’-CGGTCTCAAGCTTAACATTGTTTATTTACAACAGATAATTGTTTG (SEQ ID NO: 4)

[00050] Construção do vetor de expressão pJT-CS6-ThyA. Para a construção da cepa C600-CS6 recombinante, o plasmídeo pJT-CFAJI-ThyA foi primeiro gerado. O plasmídeo pJT-CFA/I-Cm (Tobias J, Holmgren J, Hellman M, Nygren E, Lebens M, Svennerholm A-M. Over-expression of major colonization factors of enterotoxigenic Escherichia coli, alone or together, on non-toxigenic E. coli bactérias. Vaccine 2010; 28: 6977-84). foi digerido com Xhol e Avril para remover o gene de resistência ao cloranfenicol (cat). O plasmídeo pNC-4 (N.I.A. Carlin; não publicado) foi depois usado em uma reação de PCR para amplificar o gene thyA (da Vibrio choleraé). O iniciador avançado Pl (SEQ ID NO: 1) foi homólogo a uma sequência que começa com em 98 pares de base a montante de thyA e teve os sítios de restrição para Eco31I e Avrll, e o iniciador reverso P2 (SEQ ID NO: 2) foi homólogo a uma sequência que termina com 75 pares de base a jusante de thyA, e teve os sítios de restrição para Eco31I e Xhol, na extremidade 5’ (Tabela 1). As condições de PCR foram como segue: 95 °C por 5 min, 31

17/21 ciclos de 94 °C por 15 s, 58 °C por 30 s e 72 °C por 50 s, com uma extensão final de 7 min a 72 °C. O fragmento resultante de 1065 pares de base que contém thyA foi depois extraído em gel e clivado com Xhol e Avril. A ligação da thyA amplificada e digerida com a pJT-CFA/I-Cm digerida resultou em plT-CFA/I-ThyA (Fig. 1 A). Este plasmídeo foi depois eletroporado na E. coli C600-AthyA, e uma cepa recombinante (C600-AthyA/pJT-CFA/I-ThyA) foi isolada.

[00051] O plasmídeo pJT-CS6-ThyA foi depois construído em duas etapas (Fig. 1B). Primeiro, o plasmídeo pJT-CFA/IThyA foi digerido com EcoRI e HindlII. A PCR foi usada para amplificar o operon CS6 da cepa GB35 da ETEC que expressa CS6 (Nicklasson M, Sjõling A, Lebens M, Tobias J, Janzon A, Brive L, Svennerholm A-M. Mutations in the periplasmic chaperone leading to loss of surface expression of the colonization factor CS6 in enterotoxigenic Escherichia coil (ETEC) clinical isolates. Microb Pathog. 2008; 44: 246-54). A amplificação foi realizada usando os iniciadores avançado e reverso P3 (SEQ ID NO: 3) e P4 (SEQ ID NO: 4), respectivamente (Tabela 1) e o Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics GmbH). P3 é homólogo a uma sequência que começa com 13 pares de base a montante de CSí/4 e carrega sítios de restrição para EcoRI e Eco3H, ao passo que P4, que é homólogo a uma sequência que termina com 2 pares de base a jusante do cssD, carrega sítios de restrição para HindlII e Eco31I, na extremidade 5’ (Fig. IB), as condições de PCR foram como descritas anteriormente (Tobias J, Lebens M, Kãllgârd S, Nicklasson M, Svennerholm A-M. Role of different genes in the CS6 operon for surface expression of enterotoxigenic Escherichia coil colonization factor CS6. Vaccine 2008; 26: 5373-80). O operon CS6 amplificado, 4135 pares de base, foi depois restringida com Eco31I, resultando em um fragmento com EcoRI e HindlII flanqueador, que foi ligado com a pJT-CFA/l-ThyA digerida resultando em um plasmídeo de 7973 pares de base pJT-CS6-ThyA. O

18/21 plasmídeo construído pJT-056-ThyA foi eletroporado dentro da cepa C600LthyA. As colônias resultantes foram tríadas quanto a presença de operon CS6 pela PCR usando os iniciadores P3 e P4. Os clones positivos foram analisados ainda pela análise de restrição de plasmídeos isolados, e também pela capacidade para crescer em meio CFA confirmando a sua independência de timina. Um tal clone foi selecionado como uma cepa positiva em CS6 e independente de timina, e designada C600-CS6 (isto é, C600-AthyA/pJTCS6ThyA).

[00052] Expressão de CS6. As cepas que expressam CS6 foram cultivadas em meio CFA, durante a noite (16 a 18 h) em um agitador rotativo (150 rpm) a 37 °C. As alíquotas das culturas durante a noite foram diluídas 1/100 em meio CFA e as culturas resultantes foram incubadas por 2 h como acima. Dentro da cultura da cepa recombinante, IPTG foi adicionado a uma concentração final de 1 mM para induzir a expressão de CS6, e depois as culturas foram incubadas ainda nas mesmas condições durante um adicional de 6 h. As bactérias foram depois colhidas e recolocadas em suspensão em PBS a uma densidade de OD₆₀o = 0,8 (que corresponde a aproximadamente 10⁹ bactérias/ml).

[00053] Quantificação de CS6 na cepa recombinante. Um anticorpo monoclonal específico (MAb 2a: 14) contra CS6 (Helander A, Grewal HM, Gaastra W, Svennerholm A-M. Detection and characterization of the coli surface antigen 6 of enterotoxigenic Escherichia coli strains by using monoclonal antibodies. J Clin Microbiol 1997; 35: 867-72) foi usado para quantificar o nível de expressão de CS6 pela C600-CS6 recombinante e as cepas El 1881/23 de referência da ETEC, usando os métodos de dot blot e ELISA de inibição, como descritos (Tobias J, Holmgren J, Hellman M, Nygren E, Lebens M, Svennerholm A-M. Over-expression of major colonization factors of enterotoxigenic Escherichia coli, alone or together, on non-toxigenic E. coli bacteria. Vaccine 2010; 28: 6977-84 e Tobias J, Lebens

19/21

M, Bolin I, Wiklund G, Svennerholm A-M. Construction of non-toxic Escherichia coli and Vibrio cholerae strains expressing high and immunogenic levels of enterotoxigenic E. coli colonization factor I fimbriae. Vaccine 2008; 26: 743-52).

[00054] Preparação de bactérias inativadas. Formaldeído e fenol foram testados e comparados quanto à inativação das cepas que expressam CS6. Formaldeído, nas concentrações finais de 0,3 % (p/v; 0,1 M) ou 0,6 % (0,2 M), e fenol nas concentrações finais de 0,25 % a 1,6 % (p/v; 0,026 a 0,17 M), foram adicionados às culturas bacterianas em uma densidade de 10¹⁰bactérias/ml em PBS. As suspensões foram incubadas por 2h a 37°C com agitação a 60 rpm, e depois mantidas a 4°C por 3 dias em agitação. As suspensões bacterianas foram depois centrifugadas, lavadas, e recolocadas em suspensão no mesmo volume de PBS e mantidas a 4°C até o uso. Em ambos os métodos de inativação, 0,1 ml de cada suspensão foi espalhado sobre sangue ágar e incubado a 37 °C por até uma semana para checar quanto à falta de crescimento. Antes de serem usadas para a imunização oral, o nível de CS6 nas bactérias inativadas foi checado pelo ELISA de inibição.

[00055] Imunizações de camundongo e coleta de amostra. Grupos de camundongos Balb/C e C57 BI/6 fêmeas (Charles River; 6 a 8 semanas de idade; 5 camundongos/grupo) foram usados para as imunizações orais (intragástricas). Todos os camundongos foram ministrados com duas doses de o

3x10 bactérias mortas com fenol (inativadas, usando 0,8 % de concentração de fenol) da C600-CS6 ou da cepa de referência junto com 7,5 pg de CT dois dias separadamente em 0,3 ml de solução a 3 % de bicarbonato de sódio intragastricamente através de um cateter de alimentação de bebê (primeira rodada de imunização), seguidas duas semanas mais tarde por duas imunizações idênticas dois dias separadamente em uma segunda rodada de imunização. As sangrias foram realizadas antes da primeira imunização e duas semanas depois da última imunização, tempo no qual as pelotas fecais

20/21 (FPS) também foram coletadas e os extratos preparados como descrito anteriormente (Nygren E, Holmgren J, Attridge SR. Murine antibody responses following systemic or mucosal immunization with viable or inactivated Vibrio cholerae. Vaccine 2008; 26: 6784-90). Além disso, no último ponto de tempo quando os camundongos foram sacrificados, eles foram perfundidos com uma solução de heparina-PBS para remover sangue dos tecidos, e o tecido do intestino delgado coletado e extraído com uma solução a 2 % (p/v) de Saponina-PBS (o método Perfext) como descrito anteriormente Villavedra M, Carol H, Hjulstrom M, Holmgren J, Czerkinsky C. “PERFEXT”: a direct method for quantitative assessment of cytokine production in vivo at the local level. Res Immunol 1997; 148: 257-66).

[00056] ELISAs. Os títulos de anticorpo de IgG+IgM e IgA contra CS6 foram determinados nos soros, extratos fecais e intestinais, pelo ELISA, como descrito anteriormente (Rudin A, Svennerholm A-M. Colonization factor antigens (CFAs) of enterotoxigenic Escherichia coli can prime and boost immunes response against heterologous CFAs. Microb Pathog 1994; 16: 131-9). CS6, para o uso como antígeno de revestimento (na concentração final de 0,7 pg/ml) nos ELISAs, foi purificado a partir da cepa que super expressa TOP1O-CS6 descrita anteriormente (Tobias J, Lebens M, Kallgard S, Nicklasson M, Svennerholm A-M. Vaccine 2008; 26: 5373-80), pela precipitação com sulfato de amônio sequencial e filtração em gel. Os soros de camundongos individuais foram testados usando placas microtituladoras de ligação baixa (Greiner), e as amostras foram inicialmente diluídas 1/100 seguido pelas diluições limítrofes em série. Os extratos de pelota fecal e extratos de tecido do intestino delgado foram testados em placas microtituladoras de alta ligação (Greiner) em diluições em série de 3 vezes a partir de uma diluição de partida de 1/3. Os títulos de anticorpo foram calculados como as recíprocas das diluições de amostra que deram uma absorbância A450 de 0,4 acima do valor de fundo. Nas amostras de extrato

21/21 fecal e intestinal, IgA total foi também medido pelo ELISA como descrito (Nygren E, Holmgren J, Attridge SR. Vaccine 2008; 26: 6784-90), e os valores de anticorpo IgA específico de antígeno foram expressados como unidades de título de IgA por kg de IgA total.

[00057] Análise estatística. Todos os experimentos de ELISA foram feitos pelo menos duas vezes em ocasiões diferentes. As análises estatísticas foram conduzidas pelo teste t de Student, e P<0,05 (bi-caudado) foi considerado como uma diferença signifícante.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para aumentar a apresentação de antígeno CS6 de ETEC na superfície da célula, o método caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contato com as células que expressam o dito antígeno com uma solução aquosa que compreende de 0,6 a 2,2 por cento de fenol em peso, tal que a apresentação do dito antígeno seja aumentada em pelo menos 100%.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a apresentação do dito antígeno é aumentada em pelo menos 200 %.
3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a duração da etapa de contato é de 1 a 72h.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a duração da etapa de contato é de 1,5 a 42h.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a temperatura durante a etapa de contato é de 18 a 42°C.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a temperatura durante a etapa de contato é de 18 a 38°C.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a concentração de fenol é de 0,8 a 2,0 por cento em peso.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células compreendem células de Escherichia coli.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o antígeno é recombinantemente super expressado pelas células.

Petição 870200006576, de 14/01/2020, pág. 8/12

2 / 2
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de comparar a apresentação do antígeno pelas células com a apresentação do antígeno CS6 pelas células não tratadas mas de outro modo comparáveis por meio de um ELISA de inibição ou dot blot.
11. Método para a fabricação de uma vacina de célula inteira morta para a imunização contra ETEC que expressa CS6, que compreende o método como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a concentração de fenol, a temperatura de contato e o tempo de contato são escolhidos tal que pelo menos 107 vezes a inativação das células ocorre concomitantemente com o aumento na apresentação do antígeno CS6.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a concentração de fenol é de 0,6 a 2,0 por cento em peso, o tempo de contato é de 6 a 72 h e a temperatura de contato é de 18 a 22°C.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a concentração de fenol é de 0,75 a 0,85 por cento em peso, o tempo de contato é de 40 ± 2 h e a temperatura de contato é de 20 ± 1 °C.
14. Vacina para a imunização contra ETEC que expressa CS6, a vacina caracterizada pelo fato de que compreende células obtidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.