FR2682599A1 - Procede pour l'obtention d'extraits parietaux de nocardia, purifies et non pyrogenes, utiles notamment comme reactifs de diagnostic en imagerie medicale. - Google Patents
Procede pour l'obtention d'extraits parietaux de nocardia, purifies et non pyrogenes, utiles notamment comme reactifs de diagnostic en imagerie medicale. Download PDFInfo
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Abstract
l'invention a pour objet un procédé pour l'obtention d'extraits pariétaux de Nocardia, purifiés et non pyrogènes. Ce procédé consiste: 1) à délipider des parois de Nocardia; 2) à effectuer la lyse des parois délipidées; 3) à purifier l'extrait résultant par chromatographie. Application: Obtention de réactifs de diagnostic en imagerie médicale.
Description
Procédé-pour-l'obtention-d'extraits-pariétaux-de-Nocardia,-purifiés et -non -pyrogènes, -utiles -notamment -comme -réactifs -de -diagnostic - -en imagerie médicale.
La présente invention a pour objet un nouveau procédé pour l'obtention d'extraits pariétaux de Nocardia purifiés et non pyrogènes, qui conviennent en imagerie médicale in vivo, notamment en scintigraphie, comme réactifs de diagnostic pour la mise en évidence de petites tumeurs ou métastases et de certains foyers inflammatoires. Elle concerne également les extraits de Nocardia susceptibles d'être obtenus par ce procédé dans leur utilisation comme réactifs de diagnostic.
On a déjà décrit l'utilisation d'extraits de Nocardia comme réactifs biologiques de recherche et de diagnostic. A cet effet, on peut se référer par exemple au brevet FR 2 268 531 et à son certificat d'addition NO 2 345 159, qui ont pour objet des agents solubles dans l'eau ayant des propriétés mitogènes et/ou immunostimulantes, obtenus à partir de cellules de Nocardia.
Selon le procédé décrit dans le brevet FR 2 268 531, ces agents mitogènes sont obtenus par le procédé qui consiste à cultiver des Nocardia, à recueillir les cellules de la souche cultivée et à les traiter avec des solvants de délipidation, à soumettre les cellules délipidées à l'action d'une enzyme murolytique, tel que le lysozyme, au sein d'un milieu aqueux, à recueillir la fraction solubilisée, à séparer les fragments de peptidoglycanes contenus dans cette fraction et à recueillir la fraction restante contenant les agents mitogènes.
Selon FR-B-2 345 159, les agents mitogènes sont obtenus par le procédé qui consiste à soumettre des cellules entières de
Nocardia à un traitement visant à la rupture de leurs parois, au sein d'un milieu aqueux, notamment de l'eau distillée, à séparer les cellules non rompues et les fragments des parois des cellules rompues, par exemple par centrifugation et à recueillir la phase aqueuse contenant les agents mitogènes qui possèdent également des propriétés adjuvantes.
Nocardia à un traitement visant à la rupture de leurs parois, au sein d'un milieu aqueux, notamment de l'eau distillée, à séparer les cellules non rompues et les fragments des parois des cellules rompues, par exemple par centrifugation et à recueillir la phase aqueuse contenant les agents mitogènes qui possèdent également des propriétés adjuvantes.
On a également décrit d'autres agents mitogènes provenant d'extraits de Nocardia. Il s'agit des agents mitogènes directement dérivés des peptidoglycanes des parois bactériennes, notamment de
Nocardia, tels que décrits dans le brevet FR 2 345 158.
Nocardia, tels que décrits dans le brevet FR 2 345 158.
Par ailleurs, on sait que les fractions de Nocardia dénommées NSPD (Nocardia soluble peptidoglycan derivatives/dérivés solubles de peptidoglycanes de Nocardia) sont utiles comme agents de diagnostic in vivo en imagerie médicale ou ex vivo pour le diagnostic des tumeurs.
Ces fractions NSPD sont obtenues par exemple par le procédé décrit dans la demande de brevet EP 221 821, qui consiste à délipider les cellules bactériennes, à mettre les cellules delipidées en suspension dans de l'eau en présence de DNase pour détruire l'acide désoxyribonucléique, à centrifuger, puis à remettre les cellules en suspension dans de l'acétate d'ammonium en présence de lysozyme, à soumettre les extraits obtenus après centrifugation à une autre délipidation par extraction à l'éther, puis à chromatographier les extraits obtenus sur colonne de
Sephadex G.75 en éluant avec une solution d'acide acétique.
Sephadex G.75 en éluant avec une solution d'acide acétique.
Ces fractions NSPD peuvent être encapsulées dans des liposomes et administrées sous forme d'aérosol pour le diagnostic ex vivo de tumeurs ou l'imagerie médicale.
Cependant, ces extraits de Nocardia ainsi préparés présentent l'inconvénient d'âtre le plus souvent pyrogènes, ce qui limite leur utilisation médicale.
Toutefois, ces fractions NSPD se fixent sélectivement sur les macrophages et sont donc des outils très utiles pour certaines applications médicales, pour le diagnostic précoce des cancers, à un stade infraclinique pour lequel les autres techniques d'imagerie ne sont pas suffisamment sensibles.
Il s'est donc avéré essentiel de rechercher des extraits de Nocardia dépourvus de ces inconvénients grâce à une plus grande pureté.
On a maintenant trouvé un nouveau procédé qui permet l'obtention d'extraits pariétaux de Nocardia purifiés et non pyrogènes. Par extraits pariétaux on désigne les extraits issus des parois de Nocardia.
Ce procédé consiste 1) à délipider des parois de Nocardia 2) à effectuer la lyse des parois délipidées 3) à purifier l'extrait résultant par chromatographie.
La première étape de ce procédé consiste donc à délipider les parois de Nocardia. Cette délipidation peut être réalisée par différents procédés de délipidation bien connus de l'homme de métier.
Cependant, on indiquera ci-après le procédé de délipidation préféré aux fins de l'invention.
Ce procédé de délipidation consiste 1) à mettre en suspension les cellules de Nocardia dans une
solution de saccharose à 300 g/l pendant une durée d'environ
30 minutes 2) à rompre les cellules par passage de la suspension résultante
dans un homogénéisateur haute pression 3) à collecter les parois des cellules par centrifugation 4) à laver les parois, puis à les extraire avec du méthanol et
ensuite de l'acétone.
solution de saccharose à 300 g/l pendant une durée d'environ
30 minutes 2) à rompre les cellules par passage de la suspension résultante
dans un homogénéisateur haute pression 3) à collecter les parois des cellules par centrifugation 4) à laver les parois, puis à les extraire avec du méthanol et
ensuite de l'acétone.
Les cellules mises en oeuvre sont avantageusement recueillies par centrifugation de la culture inactivée par traitement thermique à 100 C pendant environ 5 minutes.
De façon avantageuse les parois délipidées de cellules de Nocardia peuvent âtre ensuite soumises à au moins une extraction aqueuse. Cette extraction aqueuse est réalisée à une température comprise de préférence entre 600C et 100 C.
On effectue avantageusement cette extraction aqueuse deux fois de suite, de préférence sous azote.
La seconde étape du procédé de l'invention est la lyse des parois bactériennes délipidées, qui peut être réalisée par voie enzymatique ou par voie chimique.
Lorsquton procède à la lyse des parois bactériennes par voie enzymatique, on utilise avantageusement une enzyme murolytique, telle que le lysozyme d'oeuf de poule.
La lyse par voie chimique peut être réalisée à chaud, à l'aide d'un acide tel que l'acide chlorhydrique. On opère de préférence sous azote et à la même température que celle utilisée pour l'extraction aqueuse, par exemple à 800C.
L'extrait de lyse est ensuite neutralisé puis clarifié dans des conditions classiques couramment utilisées dans ce domaine.
La troisième étape du procédé consiste en une purification par chromatographie. Lorsque la lyse est une lyse enzymatique on purifie extrait résultant par chromatographie sur phase échangeuse d'anions. Par contre, lorsque la lyse est une lyse chimique, la purification est réalisée par chromatographie sur phase inverse.
La chromatographie sur phase inverse est avantageusement réalisée sur colonne d'octadécysilane.
Dans le cas où l'on utilise la chromatographie d'échange d'anions, on emploie avantageusement une colonne d'échange d'anions équilibrée avec une solution d'acétate d'ammonium à pH alcalin, par exemple à pH 8,5, obtenu par addition de NaOH. L'élution est réalisée avec des solutions de différentes forces ioniques.
Selon une première variante préférée (Procédé A), le procédé de l'invention consiste a) à délipider des parois de Nocardia b) à soumettre lesdites parois délipidées à au moins une
extraction aqueuse à une température comprise entre 60 C et 100 C, de préférence à 80 C ; c) à effectuer, après refroidissement des extraits aqueux jusqu'à
la température ambiante, la lyse des parois bactériennes à
l'aide d'une enzyme murolytique, par exemple le lysozyme d'oeuf
de poule d) à purifier l'extrait résultant par chromatographie sur colonne
échangeuse d'anions équilibrée avec une solution d'acétate
d'ammonium à pH alcalin, l'élution étant réalisée avec la
solution d'équilibration additionnée de NaCl.
extraction aqueuse à une température comprise entre 60 C et 100 C, de préférence à 80 C ; c) à effectuer, après refroidissement des extraits aqueux jusqu'à
la température ambiante, la lyse des parois bactériennes à
l'aide d'une enzyme murolytique, par exemple le lysozyme d'oeuf
de poule d) à purifier l'extrait résultant par chromatographie sur colonne
échangeuse d'anions équilibrée avec une solution d'acétate
d'ammonium à pH alcalin, l'élution étant réalisée avec la
solution d'équilibration additionnée de NaCl.
Selon une seconde variante préférée (Procédé B), le procédé de l'invention consiste a) à délipider des parois de Nocardia b) à soumettre lesdites parois délipidées à au moins une
extraction aqueuse, sous azote, à une température comprise
entre 60 et 1000C, de préférence à 800C.
extraction aqueuse, sous azote, à une température comprise
entre 60 et 1000C, de préférence à 800C.
c) à effectuer à la même température et sous azote une hydrolyse à
l'aide d'acide chlorhydrique d) à purifier l'extrait resultant par chromatographie sur phase
inverse.
l'aide d'acide chlorhydrique d) à purifier l'extrait resultant par chromatographie sur phase
inverse.
Dans les deux variantes ci-dessus il est sans inconvénient de congeler puis décongeler l'extrait clarifié avant l'étape de purification.
Le procédé de l'invention permet d'obtenir des extraits pariétaux de Nocardia qui sont actifs en scintigraphie et dont le rapport scintigraphique selon le test défini ci-après est d'au moins 1,2.
Par ailleurs, on précisera que les extraits obtenus par le procédé B sont de plus caractérisés par leurs temps de rétention, rapportés à celui de la thymine, sur une colonne d'octadécylsilane Hypersil éluée avec le mélange Tris pH 7,4 (100 volumes)/méthanol (1 volume), de 0,65 et 1,5.
Les extraits de Nocardia selon l'invention sont non pyrogènes et se fixent sélectivement sur les macrophages présents dans le microenvironnement des foyers néoplasiques et/ou inflammatoires.
L'activité scintigraphique et l'absorption pulmonaire des extraits de Nocardia selon l'invention ont été déterminées selon les protocoles ci-après
ACTIVITE SCINTIGRAPHIQUE DES EXTRAITS DE NOCARDIA MARQUES
L'activité scintigraphique des extraits de
Nocardia marqués est évaluée sur le modèle expérimental d'arthrite immunologique unilatérale induite chez le lapin par injection intra-articulaire d'ovalbumine selon la technique de
CONSDEN Ann. Rheum. Dis. 1971, 30, 307, modifiée comme indiqué ci-après dans la partie expérimentale.
ACTIVITE SCINTIGRAPHIQUE DES EXTRAITS DE NOCARDIA MARQUES
L'activité scintigraphique des extraits de
Nocardia marqués est évaluée sur le modèle expérimental d'arthrite immunologique unilatérale induite chez le lapin par injection intra-articulaire d'ovalbumine selon la technique de
CONSDEN Ann. Rheum. Dis. 1971, 30, 307, modifiée comme indiqué ci-après dans la partie expérimentale.
Ce modèle permet d'obtenir une arthrite chronique localisée, recrutant des cellules immunocompétentes et en particulier de nombreux macrophages (et ceci sans oedème associé) dès que l'arthrite est en phase chronique (2 à 3 semaines après induction) HEYMER et al. Curr. Top. Pathol. 1982, 71, 123
BROUILHET H. et al. p.47 in Physiopathologie de l'articulation,
INSERM 1976.
BROUILHET H. et al. p.47 in Physiopathologie de l'articulation,
INSERM 1976.
On dispose ainsi chez le même animal d'un foyer pathologique et d'une zone anatomique identique saine permettant la détermination précise du rapport scintigraphique pour l'évaluation de l'activité scintigraphique des extraits de Nocardia marqués. La détermination du rapport scintigraphique est obtenue par le rapport de l'activité de la zone fixant le produit marqué au niveau du genou pathologique sur celle d'une zone de surface strictement égale localisée au niveau du genou sain.
La mise en place de l'arthrite chronique est contrôlée par la détermination du rapport scintigraphique obtenu 1 h 30 après injection intraveineuse du produit de référence : le médronate marqué au technetium 99m (trousse TCK14 - Cis bio international), selon le protocole détaillé dans la partie expérimentale ci-après.
Seuls les animaux ayant un rapport scintigraphique supérieur à 1,2 sont retenus pour la sélection des extraits de
Nocardia. Cette valeur est conventionnellement reconnue en médecine nucléaire comme la limite inférieure à partir de laquelle un rapport scintigraphique est significativement augmenté.
Nocardia. Cette valeur est conventionnellement reconnue en médecine nucléaire comme la limite inférieure à partir de laquelle un rapport scintigraphique est significativement augmenté.
La sélection des extraits de Nocardia est déterminée à partir de leur activité scintigraphique dans ce modèle, après injection intraveineuse de 500 pg de produit radiomarqué par 74 MBq de technétium 99m selon le protocole décrit ci-après dans la partie expérimentale.
L'examen scintigraphique est réalisé 1 h 30 après l'injection intraveineuse du produit radiomarqué, sur les animaux non anesthésiés, avec une gamma caméra équipée d'un collimateur haute résolution, réglée sur le pic photoélectrique de 140 keV du technétium 99m et connectée à un système informatique de traitement du signal.
L'examen est réalisé 1 h 30 après l'injection intraveineuse ; en effet à ce moment la fixation hépatosplénique couramment observée avec ces produits, lorsqu'ils sont injectés par voie intraveineuse, est complète, l'imager-ie de foyers pathologiques est alors optimale du fait d'une concentration sanguine dont le maximum est atteint à ce moment et du début de l'élimination urinaire ; tous ces paramètres permettent d'avoir, 1 h 30 après administration des fractions à tester, un rapport signal/bruit compatible avec la mise en évidence d'une activité scintigraphique rendant compte de la spécificité de la fixation du produit au niveau de foyers pathologiques.
ABSORPTION PULMONAIRE DES EXTRAITS DE-NOCARDIA
L'absorption des extraits de Nocardia, après administration par voie pulmonaire (inhalation), est étudiée chez le singe babouin (Papio papio) de 10 kg environ.
L'absorption des extraits de Nocardia, après administration par voie pulmonaire (inhalation), est étudiée chez le singe babouin (Papio papio) de 10 kg environ.
Les extraits sont radiomarqués par le technetium 99m selon le protocle décrit ci-après dans la partie expérimentale.
Les animaux vigiles inhalent un aérosol composé de 1 mg de fraction marquée par 740 MBq de 99m Tc sous un volume total de 5 ml, sous une hotte (ESI-France) spécialement conçue pour éviter toute contamination de l'environnement ; ils sont assis dans un siège permettant simultanément l'inhalation de l'aérosol radioactif et l'examen scintigraphique des poumons en face postérieure.
L'aérosol est nébulisé par un inhalateur à ultrasons délivrant des particules dont 65 % ont moins de 10 ym de diamètre (par exemple le système TV6000 Siemens).
La dose effectivement délivrée au niveau pulmonaire est quantifiée par gamma scintigraphie dynamique en face postérieure, pendant l'inhalation (15 min) et les 5 heures suivantes. Les mesures établies sur une minute sont corrigées de la décroissance du traceur ; la dose exacte délivrée au niveau pulmonaire et son évolution dans le temps ont pu être déterminées en tenant compte du rendement de comptage de la gamma caméra qui est de 10 4, comme indiqué ci-après.
La dose de produit absorbée est estimée par la dose de produit présent dans la circulation sanguine lorsque la radioactivité sanguine est maximale. L'activité sanguine est déterminée par comptage de la radioactivité d'aliquotes de sang veineux périphérique prélevées en fin d'inhalation et 30 min, 1 h, 1 h 30, 2 h, 2 h 30, 3 h, 3 h 30, 4 h, 4 h 30 et 5 h après la fin de l'inhalation. Après correction de la décroissance, les concentrations sanguines sont déterminées pour chaque prélèvement et les doses circulantes calculées pour chaque animal à partir du volume sanguin total qui est égal à 6 % du poids corporel.
Il pourra être nécessaire d'adjoindre au produit radiomarqué une préparation présentant une activité surfactante pour optimiser l'absorption pulmonaire des extraits de Nocardia.
Une préparation liposomale stable dans le temps peut être retenue par exemple on peut utiliser une préparation composée de petits liposomes unilamellaires de 50 nm de diamètre moyen, composés de
D-Dipalmitoylphosphatidylcholine (Sigma) et préparés par enlèvement de détergents KAGAWA Y. et al. J. Biol. Chem. 1971, 246, 5477 utilisant le système Liposomat (Braun-Scientec), le détergent utilisé étant le N-Octylglucoside (Boerhinger).
D-Dipalmitoylphosphatidylcholine (Sigma) et préparés par enlèvement de détergents KAGAWA Y. et al. J. Biol. Chem. 1971, 246, 5477 utilisant le système Liposomat (Braun-Scientec), le détergent utilisé étant le N-Octylglucoside (Boerhinger).
L'invention va être maintenant décrite plus en détail par la partie expérimentale ci-après qui comprend des exemples de préparation des extraits de Nocardia, les protocoles expérimentaux utilisés ainsi que les résultats obtenus, montrant l'intérêt des composés obtenus selon l'invention.
EXEMPLE 1 : Obtention -de -parois -délipidées -de -Nocardia
I - Préparation des cellules
Nocardia opaca est cultivé à 280C dans le milieu Tryptone
Caseine Soja (Diagnostics Pasteur) dans 4 erlenmeyers de 5 1 con tenant 1,3 1 de milieu. On obtient une biomasse correspondante à un poids sec de 10 g après 45 heures de culture, puis on porte la culture à 100 C pendant 5 min. On collecte les cellules par centrifugation, on les lave dans une solution de NaCl 9 g/l puis on les met en suspension dans 37 ml de saccharose 300 g/l pendant 30 min. La suspension est congelée.
I - Préparation des cellules
Nocardia opaca est cultivé à 280C dans le milieu Tryptone
Caseine Soja (Diagnostics Pasteur) dans 4 erlenmeyers de 5 1 con tenant 1,3 1 de milieu. On obtient une biomasse correspondante à un poids sec de 10 g après 45 heures de culture, puis on porte la culture à 100 C pendant 5 min. On collecte les cellules par centrifugation, on les lave dans une solution de NaCl 9 g/l puis on les met en suspension dans 37 ml de saccharose 300 g/l pendant 30 min. La suspension est congelée.
II - Préparation-des parois délipidées
La suspension décongelée est diluée avec 75 ml de solution de méthanol (1 volume pour 20 volumes d'eau) puis passée quatre fois dans un homogéneisateur à haute pression (Minilab
Rannie à 950 bars), en refroidissant la suspension à moins de 400C entre les passages.
La suspension décongelée est diluée avec 75 ml de solution de méthanol (1 volume pour 20 volumes d'eau) puis passée quatre fois dans un homogéneisateur à haute pression (Minilab
Rannie à 950 bars), en refroidissant la suspension à moins de 400C entre les passages.
Les parois sont collectées par centrifugation (14000 g pendant 30 min) puis lavées quatre fois avec la solution de méthanol 1/20.
Les parois sont ensuite extraites par le méthanol (750 ml) par agitation magnétique pendant 2 heures, puis collectées par centrifugation. On réextrait de même 2 h, 16 h et 4 h par le méthanol.
De la même façon on pratique les extractions par l'acétone, successivement 3 h, 16 h, 3 h et 3 h.
Les parois délipidées obtenues sont stockées en suspension dans l'acétone.
EXEMPLE 2 : Obtention d'extraits de Nocardia selon-le procédé-A
Extraction aqueuse et lyse
Les parois délipidées de Nocardia-opaca obtenues comme dans l'exemple 1 sont extraites par l'eau à 100 C pendant 20 min avec agitation magnétique, puis collectées par centrifugation (14 000 g, 30 min). Les parois sont réextraites de la même façon.
Extraction aqueuse et lyse
Les parois délipidées de Nocardia-opaca obtenues comme dans l'exemple 1 sont extraites par l'eau à 100 C pendant 20 min avec agitation magnétique, puis collectées par centrifugation (14 000 g, 30 min). Les parois sont réextraites de la même façon.
Les parois en suspension dans 375 ml d'eau sont autoclavées dans un récipient fermé par un filtre 0,2 fm dans le récipient refroidi on ajoute stérilement 19 ml d'une solution de lysozyme d'oeuf de poule à 4 mg/ml dans de l'acétate d'ammonium 0,1 M amené à pH 6,2 avec de l'acide acétique. On ajoute ensuite de même 375 1 d'acétate d'ammonium 0,2 M pH 6,2. On incube à 370C pendant 24 heures, puis on clarifie l'extrait par centrifugation (14 000 g, 30 min.), et on congèle l'extrait.
I - Chromatographie
L'extrait décongelé est amené à pH 8,5 par addition de
NaOH puis chargé sur une colonne échangeuse d'anions de 16 X 100 mm contenant 20 ml de Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia) préalablement équilibré avec une solution d'acétate d'ammonium 0,1 M amenée à pH 8,5 par addition de NaOH.
L'extrait décongelé est amené à pH 8,5 par addition de
NaOH puis chargé sur une colonne échangeuse d'anions de 16 X 100 mm contenant 20 ml de Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia) préalablement équilibré avec une solution d'acétate d'ammonium 0,1 M amenée à pH 8,5 par addition de NaOH.
La colonne est lavée avec la solution d'équilibration (200 ml). On élue la fraction EI 3 avec la solution d'équilibration additionnée de 1 M Na Cl.
EXEMPLE 3 : Obtention d'extraits de Nocardia-selon le-Procédé B
Les parois délipidées de Nocardia opaca obtenues comme dans l'exemple 1 sont extraites sous azote et agitation magnétique par l'eau à 80 C, deux fois 15 min.
Les parois délipidées de Nocardia opaca obtenues comme dans l'exemple 1 sont extraites sous azote et agitation magnétique par l'eau à 80 C, deux fois 15 min.
Les parois sont lysées dans 90 ml d'HCl 2 N à 800C pendant 15 min sous azote avec agitation magnétique.
L'extrait neutralisé et clarifié par centrifugation (14 000 g 30 min) est congelé.
Chromatographie
L'extrait est chromatographié sur une colonne octadécylsilane (Hypersil 5 jim) ; phase mobile : 100 volumes de tampon Tris 50 mM HCl pH 7,4 + 1 volume de méthanol.
L'extrait est chromatographié sur une colonne octadécylsilane (Hypersil 5 jim) ; phase mobile : 100 volumes de tampon Tris 50 mM HCl pH 7,4 + 1 volume de méthanol.
On obtient le chromatogramme représenté sur la figure 1 annexée (après adjonction d'un étalon interne, la thymine).
Les pics 3 et 5 sont caractéristiques respectivement des fractions EI 14 et EI 15 et le pic 4 correspond à la thymine (étalon interne).
RESULTATS-EXPERIMENTAUX
Les fractions EI 13 et EI 15 ainsi obtenues ont été testées sur le modèle d'arthrite expérimentale du lapin.
Les fractions EI 13 et EI 15 ainsi obtenues ont été testées sur le modèle d'arthrite expérimentale du lapin.
On a également déterminé leur absorption pulmonaire chez le singe. Les protocoles expérimentaux sont explicités ci-après
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
A) INDUCTION DE L'ARTHRITE IMMUNOLOGIQUE
L'induction de l'arthrite immunologique est réalisée selon le protocole ci-après
JO = sensibilisation des lapins de race "Néo-Zélandais blanc" d'un poids d'environ 2 kg avec 20 mg d'ovalbumine par voie sous-cutanée en injection multipoint sur le dos (1 ml de solution contenant 20 mg d'ovalbumine dissoute en eau physiologique stérile apyrogène est émulsifié avec 1 ml d'adjuvant complet de Freund (Mycobactérium tuberculosis H37-RA)).
PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
A) INDUCTION DE L'ARTHRITE IMMUNOLOGIQUE
L'induction de l'arthrite immunologique est réalisée selon le protocole ci-après
JO = sensibilisation des lapins de race "Néo-Zélandais blanc" d'un poids d'environ 2 kg avec 20 mg d'ovalbumine par voie sous-cutanée en injection multipoint sur le dos (1 ml de solution contenant 20 mg d'ovalbumine dissoute en eau physiologique stérile apyrogène est émulsifié avec 1 ml d'adjuvant complet de Freund (Mycobactérium tuberculosis H37-RA)).
J15 = seconde sensibilisation dans les mêmes conditions.
J29 = test cutané avec 20 mg d'ovalbumine dans 100 tel de sérum physiologique en intradermique. Lecture à 4 h.
J30 = lecture à 24 h de l'érythème, seuls les lapins réagissant fortement (érythème 3 2 cm) sont retenus.
J31 = déclenchante en intra-articulaire avec 10 mg d'ovalbumine dans 1 ml de sérum physiologique.
Arthrite chronique en 3 semaines - 1 mois1 stable pendant 3 - 4 mois au moins.
B) TEST SCINTIGRAPHIQUE DE REFERENCE
1 flacon de TCK 14 (CIS bio international) contenant
10 mg acide médronique (DCI)
1 mg SnCl2, 2H20
1,8 mg acide ascorbique est repris par 4 ml de NaCl stérile apyrogène et marqué avec 296 MBq (8 mCi) de technétium 99m (TC04 ) en solution saline stérile apyrogène délivré par un générateur Elumatic III (CIS bio international), le volume est ajusté à 8 ml avec du sérum physiologique.
1 flacon de TCK 14 (CIS bio international) contenant
10 mg acide médronique (DCI)
1 mg SnCl2, 2H20
1,8 mg acide ascorbique est repris par 4 ml de NaCl stérile apyrogène et marqué avec 296 MBq (8 mCi) de technétium 99m (TC04 ) en solution saline stérile apyrogène délivré par un générateur Elumatic III (CIS bio international), le volume est ajusté à 8 ml avec du sérum physiologique.
Chaque lapin recoit une injection intraveineuse de 2 ml de solution soit 2,5 mg de médromate et 74 MBq (2 mCi) de 99m Tc.
Ce protocole de marquage des protéines est basé sur les travaux de
LIN MS et Coll. J. Nucl. Med. 1971, 12, 204.
LIN MS et Coll. J. Nucl. Med. 1971, 12, 204.
C) RADIOMARQUAGE DES FRACTIONS DE NOCARDIA
1 mg de produit lyophilisé est repris dans 1 ml de NaC1 0,9 % stérile apyrogène (ou d'eau pour préparation injectable), réduit sous azote par 200 ug de SnCl2 (préparé selon le protocole décrit ci-après) et marqué sous azote dans le même flacon par 74 MBq de technétium 99m élué stérilement à partir d'un générateur
Elumatic III (CIS bio international). Ce protocole basé sur le marquage des fonctions NH2 s'inspire de la technique d'Osborne (Int. J. Nucl. Med. Biol. 1982, 9, 47).
1 mg de produit lyophilisé est repris dans 1 ml de NaC1 0,9 % stérile apyrogène (ou d'eau pour préparation injectable), réduit sous azote par 200 ug de SnCl2 (préparé selon le protocole décrit ci-après) et marqué sous azote dans le même flacon par 74 MBq de technétium 99m élué stérilement à partir d'un générateur
Elumatic III (CIS bio international). Ce protocole basé sur le marquage des fonctions NH2 s'inspire de la technique d'Osborne (Int. J. Nucl. Med. Biol. 1982, 9, 47).
La qualité du marquage est contrôlée au cours du test scintigraphique par l'absence d'activité thyroïdienne.
D) PREPARATION DU KIT DE CHLORURE D'ETAIN
La solution réductrice de chlorure d'étain est préparée dans un flacon stérile sous atmosphère d'azote par attaque de grenaille d'étain par une solution d'acide chlorhydrique 2N préparée avec de l'eau stérile apyrogène préalablement dégazée à l'hélium.
La solution réductrice de chlorure d'étain est préparée dans un flacon stérile sous atmosphère d'azote par attaque de grenaille d'étain par une solution d'acide chlorhydrique 2N préparée avec de l'eau stérile apyrogène préalablement dégazée à l'hélium.
Après 3 semaines, la solution de chlorure d'étain d'une concentration de 1 mg/ml à 5 % près (Service central d'analyse du
CNRS.) est répartie sous atmosphère d'azote dans des flacons stériles, à -200C, à raison de 200nul permettant la congélation immédiate du SnCl2. La lyophilisation est mise en oeuvre immédiatement pour une durée de 12 à 18 h et les flacons sont scellés sous atmosphère d'azote.
CNRS.) est répartie sous atmosphère d'azote dans des flacons stériles, à -200C, à raison de 200nul permettant la congélation immédiate du SnCl2. La lyophilisation est mise en oeuvre immédiatement pour une durée de 12 à 18 h et les flacons sont scellés sous atmosphère d'azote.
La qualité des flacons de SnCl2 lyophilisé est contrôlée selon l'annexe "Contrôle de la qualité du kit d'étain" et ils sont conservés à +4 0C (actuellement, pour une durée de 4 à 6 mois maximum).
E) CONTROLE DE LA QUALITE DU KIT D'ETAIN
5 ml de solution liposomale sont réduits avec un flacon d'étain lyophilisé, marqué par 185 MBq (SmCi) de technétium 99m.
5 ml de solution liposomale sont réduits avec un flacon d'étain lyophilisé, marqué par 185 MBq (SmCi) de technétium 99m.
200 jil de solution (7,4 MBq de 99m Tc) sont injectés par voie intraveineuse chez le rat. L'imagerie scintigraphique réalisée 1 h plus tard ne doit pas montrer de fixation thyroïdienne, cette dernière étant obtenue avec moins de 1 % de technétium libre.
F) MARQUAGE DES FRACTIONS DE NOCARDIA POUR L'INHALATION
1 mg de fraction lyophilisée est repris par 1 ml de solution saline à 0,9 % stérile et apyrogène, et réduite sous atmosphère d'azote par 200 > ig de SnCl2 lyophilisé. Le marquage est réalisé dans le même flacon sous atmosphère d'azote par 740 MBq de technétium 99m.
1 mg de fraction lyophilisée est repris par 1 ml de solution saline à 0,9 % stérile et apyrogène, et réduite sous atmosphère d'azote par 200 > ig de SnCl2 lyophilisé. Le marquage est réalisé dans le même flacon sous atmosphère d'azote par 740 MBq de technétium 99m.
Le volume est complété à 5 ml avec du sérum physiologique apyrogène ou une préparation à activité surfactante.
G) CALIBRATION DE LA GAMMA CAMERA
Le rendement de comptage de la gamma caméra a été déterminé avec un fantôme d'activité connue, de surface et volume équivalents aux poumons des singes entrant dans l'expérimentation et dans les mêmes conditions que lors des examens scintigraphiques. Le rendement ainsi déterminé est de 1 pour 10 000.
Le rendement de comptage de la gamma caméra a été déterminé avec un fantôme d'activité connue, de surface et volume équivalents aux poumons des singes entrant dans l'expérimentation et dans les mêmes conditions que lors des examens scintigraphiques. Le rendement ainsi déterminé est de 1 pour 10 000.
La caméra a été réglée sur le pic photoélectrique de 140 Kev du technetium 99 m avec une fenêtre spectacle de 10 á et équipée d'un collimateur parallèle à haute résolution.
RESULTATS
ACTIVITE DES FRACTIONS EI 3 ET EI 15 SUR LE MODELE D'ARTHRITE
EXPERIMENTALE DU LAPIN
La produit EI 15 a été administrée trois fois, mais à deux dates différentes à deux lapins selon le protocole décrit précédemment. La fraction El 3 a été également administrée selon le protocole décrit précédemment à deux lapins différents.
ACTIVITE DES FRACTIONS EI 3 ET EI 15 SUR LE MODELE D'ARTHRITE
EXPERIMENTALE DU LAPIN
La produit EI 15 a été administrée trois fois, mais à deux dates différentes à deux lapins selon le protocole décrit précédemment. La fraction El 3 a été également administrée selon le protocole décrit précédemment à deux lapins différents.
Les rapports scintigraphiques (articulation pathologique/ articulation saine) obtenus sont les suivants
Produit Animal Rapport
EI 15 21 1,48
EI 15 21 1,61
EI 15 14 1,33
EI 3 16 1,43
EI 3 21 1,48
Ces résultats montrent que la fraction EI 3 et EI 15 se fixent significativement sur le foyer pathologique et permettent donc sa détection.
Produit Animal Rapport
EI 15 21 1,48
EI 15 21 1,61
EI 15 14 1,33
EI 3 16 1,43
EI 3 21 1,48
Ces résultats montrent que la fraction EI 3 et EI 15 se fixent significativement sur le foyer pathologique et permettent donc sa détection.
ADMINISTRATION PAR VOIE PULMONAIRE DES FRACTIONS EI 3 ET EI 15
CHEZ LE SINGE, AVEC ET SANS LIPOSOMES.
CHEZ LE SINGE, AVEC ET SANS LIPOSOMES.
L'administration est réalisée selon le protocole précédemment indiqué, le volume nébulisé est de 5 ml dont 2 à 3 ml d'une suspension liposomale de type SUV (Small Unilamellar liposomes) composée de DPPC (dipalmytoyl phosphatidylcholine) à la concentration de 3 mg/ml de phospholipides, dans le cas de l'administration avec liposomes.
<tb>
Sans <SEP> liposomes <SEP> Avec <SEP> liposomes
<tb> Dose <SEP> pulmonaire <SEP> Dose <SEP> sanguine <SEP> fraction <SEP> Dose <SEP> pulmonaire <SEP> Dose <SEP> sanguine
<tb> <SEP> délivrée <SEP> maximale <SEP> délivrée <SEP> maximale
<tb> <SEP> 135 <SEP> ng <SEP> 57 <SEP> ng <SEP> EI <SEP> 15 <SEP> 570 <SEP> ng <SEP> 250 <SEP> ng
<tb> <SEP> 50 <SEP> ng <SEP> 14 <SEP> ng <SEP> EI <SEP> 3 <SEP> - <SEP>
Ces résultats montrent que l'extrait EI 15 est bien absorbé au niveau des poumons et que son passage dans le compartiment sanguin permet la visualisation potentielle de foyers pathologiques à distance du lieu d'aministration.
<tb> Dose <SEP> pulmonaire <SEP> Dose <SEP> sanguine <SEP> fraction <SEP> Dose <SEP> pulmonaire <SEP> Dose <SEP> sanguine
<tb> <SEP> délivrée <SEP> maximale <SEP> délivrée <SEP> maximale
<tb> <SEP> 135 <SEP> ng <SEP> 57 <SEP> ng <SEP> EI <SEP> 15 <SEP> 570 <SEP> ng <SEP> 250 <SEP> ng
<tb> <SEP> 50 <SEP> ng <SEP> 14 <SEP> ng <SEP> EI <SEP> 3 <SEP> - <SEP>
Ces résultats montrent que l'extrait EI 15 est bien absorbé au niveau des poumons et que son passage dans le compartiment sanguin permet la visualisation potentielle de foyers pathologiques à distance du lieu d'aministration.
Claims (6)
1. Procédé pour l'obtention d'extraits pariétaux de
Nocardia, non pyrogènes, utiles notamment comme réactifs de diagnostic en imagerie médicale, caractérisé en ce qu'il consiste 1) à délipider des parois de Nocardia 2) à effectuer la lyse des parois délipidées 3) à purifier l'extrait résultant par chromatographie.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte en autre une étape d'extraction aqueuse avant la lyse des parois délipidées.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes qui consistent a) à délipider les parois de Nocardia b) à soumettre lesdites parois délipidées à au moins une
extraction aqueuse à une température comprise entre 60 0C et
1000C, de préférence à 800C c) à effectuer la lyse des parois bactériennes à l'aide d'une
enzyme murolytique, par exemple le lysozyme d'oeuf de poule d) à purifier l'extrait résultant par chromatographie sur colonne
échangeuse d 'anions équilibrée avec une solution d'acétate
d'ammonium à pH alcalin, l'élution étant réalisée avec des
solutions de différentes forces ioniques.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes qui consistent a) à délipider des parois de Nocardia b) à soumettre lesdites parois délipidées à au moins une
extraction aqueuse, sous azote, à une température comprise
entre 60 C et 100 C, de préférence à 80 C ; c) à effectuer à la même température et sous azote une hydrolyse à
l'aide d'acide chlorhydrique d) à purifier l'extrait résultant par chromatographie sur phase
inverse.
5. Extraits pariétaux de Nocardia non pyrogènes susceptibles d'être obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
6. Utilisation des extraits pariétaux de Nocardia obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comme réactifs de diagnostic en imagerie médicale.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9112777A FR2682599A1 (fr) | 1991-10-16 | 1991-10-16 | Procede pour l'obtention d'extraits parietaux de nocardia, purifies et non pyrogenes, utiles notamment comme reactifs de diagnostic en imagerie medicale. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9112777A FR2682599A1 (fr) | 1991-10-16 | 1991-10-16 | Procede pour l'obtention d'extraits parietaux de nocardia, purifies et non pyrogenes, utiles notamment comme reactifs de diagnostic en imagerie medicale. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2682599A1 true FR2682599A1 (fr) | 1993-04-23 |
Family
ID=9417992
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9112777A Pending FR2682599A1 (fr) | 1991-10-16 | 1991-10-16 | Procede pour l'obtention d'extraits parietaux de nocardia, purifies et non pyrogenes, utiles notamment comme reactifs de diagnostic en imagerie medicale. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2682599A1 (fr) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2256838A1 (de) * | 1971-11-19 | 1973-05-24 | Anvar | Wasserloesliches immunologisches adjuvans |
| FR2184531A1 (fr) * | 1972-05-19 | 1973-12-28 | Anvar | |
| FR2268531A1 (fr) * | 1974-04-25 | 1975-11-21 | Anvar | |
| FR2345158A1 (fr) * | 1976-03-26 | 1977-10-21 | Anvar | Agents mitogenes, provenant notamment de peptidoglycanes bacteriens |
| FR2345159A2 (fr) * | 1976-03-26 | 1977-10-21 | Anvar | Agents solubles dans l'eau ayant des proprietes mitogenes et/ou immuno-stimulantes, obtenus a partir de cellules de nocardia, et leurs procedes de preparation |
| EP0221821A2 (fr) * | 1985-11-01 | 1987-05-13 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Composition d'aérosol pour l'imagerie et thérapie in vivo |
-
1991
- 1991-10-16 FR FR9112777A patent/FR2682599A1/fr active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| DE2256838A1 (de) * | 1971-11-19 | 1973-05-24 | Anvar | Wasserloesliches immunologisches adjuvans |
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| EP0221821A2 (fr) * | 1985-11-01 | 1987-05-13 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Composition d'aérosol pour l'imagerie et thérapie in vivo |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 79, 1973, Columbus, Ohio, US; abstract no. 30388F, ADAM ET AL: 'PREPARATION AND BIOLOGICAL PROPERTIES OF WATER-SOLUBLE ADJUVANT FRACTIONS FROM DELIPIDATED CELLS OF MYCOBACTERIUM SMEGMATIS AND NOCARDIA OPACA' page 323 ;colonne 1 ; * |
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 82, 1975, Columbus, Ohio, US; abstract no. 137479A, ADAM ET AL: 'WATER-SOLUBLE IMMUNOADJUVANTS FROM THE CELL WALL OF MYCOBACTERIUM SMEGMATIS' page 426 ;colonne 1 ; * |
| FILE SERVER STN KARLSRUHE,FILE BIOSIS ABSTRACT NO.91:4756;BIOLOGICAL ABSTRACTS 91:4756 * |
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