DE60115654T2 - Hochaktive immunstimulierende mittel aus mikroalgen - Google Patents

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Description

  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der provisorischen US-Anmeldung, Nr. 60/217,001, welche am 10. Juli 2001 eingereicht wurde und deren Inhalt hier unter Bezugnahme mit aufgenommen wird.
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von immunstimulatorischen Polysaccharid-Zubereitungen aus für Lebensmittel geeigneten Mikroalgen. Sie betrifft weiter die Identifizierung der strukturell komplexen, immunstimulatorischen, wasserlöslichen Polysaccharid-Zubereitungen, welche aus für Lebensmittel geeigneten Mikroalgen isoliert wurden, die aktive Polysaccharide mit einem augenscheinlichen Molekulargewicht von über 2 Millionen Dalton enthalten. Sie betrifft weiterhin Verfahren zur Behandlung und/oder Verhinderung einer Vielzahl von Erkrankungs-Zuständen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zubereitungen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Während der letzten 3 Jahrzehnte wurde die Immuntherapie ein wichtiger Weg für die Behandlung menschlicher Erkrankungen und Zustände durch die Verwendung von Verabreichungen, die zur Modulierung von Immunantworten ausgelegt sind. Dies ist insbesondere bei pathologischen Zuständen von Bedeutung, bei denen das Immunsystem geschwächt wird. In Erkrankungs-Modellen durchgeführte Studien und klinische Versuche zeigen, dass eine Verstärkung der Wirts-Abwehrmechanismen bei der Behandlung und Prophylaxe gegen mikrobielle Infektionen, Immunschwächen, Krebs und Autoimmunstörungen (1–5) von Nutzen sind. Immunverstärkenden Protokolle können auch zur Förderung der Wundheilung von Nutzen sein. Bei dem Verfahren der Wundheilung spielen Makrophagen eine wichtige Rolle, indem sie die zelluläre Proliferation und die Bildung/Regeneration von neuem Gewebe modulieren. Sie können darüber hinaus als Phagozyten, als Wundausschneidungs-Mittel wirken und Wachstumsfaktoren herstellen, welche die Angiogenese-Stufe der Wundheilung beeinflussen (6).
  • Historisch gesehen waren die ersten entwickelten Immunstimulantien bakterielle Pro dukte (Lysate und Rohfraktionen), attenuierte Mikroben oder durch Hitze abgetötete Bakterien. Diese umfassten Mittel wie Bazilli, Calmette-Guerin (BCG), Corynebakterium parvum und Lipopolysaccharide (1, 2). Obwohl diese Mittel auf Grund der Toxizitäten und Nebenwirkungen einen begrenzten Erfolg aufwiesen, wurden viele von der USDA zur Immunmodulierung in der Tiermedizin (3) erlaubt. Andere Substanzen wurden aus verschiedenen Quellen entwickelt, und beinhalten jene natürlichen Ursprungs, jene von chemischer Synthese abgeleitete, oder jene unter Verwendung von rekombinanten Technologien hergestellte. Die meisten Immunstimulantien natürlichen Ursprungs sind hochmolekulargewichtige Polysaccharide, Glycoproteine oder komplexe Peptide (1). So sind beispielsweise Polysaccharide aus drei Pilzen, welche von Schizophyllum commune (schizophyllan), Lentinus edodes (lentinan) und Coriolus versicolor (krestin) abgeleitet wurden, gegenwärtig in Japan als Modifizierungsmittel biologischer Antwort (4) in klinischer Verwendung. Ein weiteres Polysaccharid, Acemannan (von Aloe Vera isoliert), ist von dem Landwirtschafts-Ministerium der USA zur Behandlung von Fibrosarcomen in Hunden und Katzen (7) lizenziert worden. Es gibt wenige niedermolekulargewichtige Immunstimulantien, welche von natürlichen Produkten abgeleitet sind, wie das Glycosphingolipid KRN-7000. Eine klinische Studie unter Verwendung von KRN-7000 als Immunstimulans zur Behandlung von festen Tumoren ist gegenwärtig in Arbeit (8). Mehrere Immunstimulantien synthetischen Ursprungs wurden ebenfalls entwickelt, welche Verbindungen wie Isoprinosin- und Muramyl-Peptide (2) beinhalten. Kürzlich wurde unter Verwendung von rekombinanten Technologien eine Anzahl an Immunmodulatoren endogenen Ursprungs entwickelt, welche von der FDA erlaubt wurden. Diese Mittel umfassen Kolonie-Stimulierenden-Faktoren, Interferone und rekombinante Proteine (5). Diese Verbindungen weisen jedoch häufig kurze Halbwertszeiten auf, und es ist schwierig, eine optimale Dosierung und geeignete Kombinationen zu bestimmen.
  • Obwohl gegenwärtige Immunstimulantien vielversprechend erscheinen, gibt es immer noch Bedarf, wirksamere Mittel zu entwickeln und das Arsenal verfügbarer Arzneimittel für die Immuntherapie zu verstärken. Eine Quelle für chemisch unterschiedliche Verbindungen, welche zum Auffinden von Arzneimitteln als Immunstimulantien verwendet werden kann, sind natürliche Produkte. Seit Jahrhunderten wurden natürliche Produkte als therapeutisch nützliche Mittel eingesetzt, von denen viele heutzutage in klinischer Verwendung sind. Ein Interesse nach natürlichen Produkten als Mittel zum Auffinden von Arzneimitteln basiert auf deren unvergleichbarer, molekularer Diversifizierung und reichem Spektrum an biologischen Aktivitäten (9).
  • Seit Altershehr wurden Mikroalgen als nährstoffreiche Nahrungsquelle verwendet. Historische Aufzeichnungen zeigen, dass Mikroalgen wie Spirulina platensis, von Stämmen um in Afrika den Chad-See und von den Azteken, welche nahe am Texcoco-See in Mexiko lebten (10), konsumiert wurden. Während der letzten mehreren Jahrzehnten gab es ein steigendes Interesse nach der kommerziellen Produktion von für Nahrungsmittel geeigneten Mikroalgen für den menschlichen Verzehr und als Nahrungsmittel für Nutztiere. Unter den verschiedenen Mikroalgen, die auf ihr kommerzielles Potential untersucht wurden, sind Spirulina-Spezies, Chlorella-Spezies und Aphanizomenon flos-aquae (AFA) die drei Haupttypen, die erfolgreich hergestellt wurden und weit verbreitet zum Einsatz kommen.
  • Sowohl Anekdoten als auch kürzlich durchgeführte Studien über den Verzehr von Mikroalgen zeigten in Tieren als auch Menschen eine erhöhte Immunfunktion. Eine orale Verabreichung von Chlorella pyrenoidosa wurde mit einer verstärkten Aktivität von natürlichen Killerzellen (11) und Granulozyten-Makrophagen-Vorläuferzellen (12) in mit Listeria monocytogenes infizierten Mäusen in Verbindung gebracht. Mit der Nahrung verabreichtes Spirulina platensis erhöht die phagozytische Aktivität von Makrophagen in Hühnern (13) und Spirulina fusiformis zeigt chemo-präventive Auswirkungen in Menschen (14). Es wurde berichtet, dass der Verzehr von AFA durch Menschen Änderungen in der Bewegung/dem Transport von Immunzellen und eine erhöhte Immunüberwachung (15) bewirkt. Die aktiven Komponenten für alle diese Effekte wurden nicht schlüssig nachgewiesen.
  • Aus den hier untersuchten Mikroalgen wurden verschiedene Verbindungen isoliert. Eine Anzahl von Polysacchariden und Glycoproteinen von Chlorella- und Spirulina-Spezies wurde auf deren anti-Tumor, anti-virale und immunstimulierende Aktivität untersucht. Im Gegensatz dazu wurden keine derartigen Verbindungen, welche irgendeine biologische Aktivität aufweisen, von AFA isoliert.
  • Eine Anzahl von Polysacchariden, welche biologische Aktivität aufweisen, wurde aus Chlorella-Spezies identifiziert. In der US-P-4,533,548 wurde ein saures Polysaccharid aus Chlorella minutissima isoliert, welches anti-Tumor und anti-virale Aktivität (16) zeigt. Die Glycosyl-Zusammensetzung für dieses Polysaccharid war meistens Rhamnose mit geringen Mengen Galactose, Arabinose, Glucose und Glucoronsäure. Ein weiteres, in der US-P-4,831,020 offenbartes Polysaccharid, welches aus der im Meer lebenden Chlorella minutissima isoliert wurde, scheint Tumorwachstums-inhibierende Wirkungen aufzuweisen. Es wurde jedoch kein Molekulargewicht oder Glycosyl-Zusammensetzungen offenbart (17).
  • In der US-P-4,786,496 zeigte die Lipidfraktion (Glycolipid-Anteil) der Meeres-Chlorella-Spezies anti-Tumor-Eigenschaften (18). Darüber hinaus wurden auch mehrere Glycoproteine aus Chlorella-Spezies isoliert. So wird beispielsweise in der US-P-4,822,612 ein Glycoprotein mit 45.000 Dalton offenbart, das anti-Krebs Wirkungen (19) aufweist. Verschiedene andere Glycoproteine (20–23) und Glyceroglycolipide (24), welche immunverstärkende und anti-Tumor Eigenschaften aufweisen können, wurden auch in der wissenschaftlichen Literatur offenbart. Keine dieser Verbindungen sind Polysaccharide.
  • Mehrere unterschiedliche Typen an Polysacchariden, welche biologische Aktivität aufweisen, wurden aus Spirulina-Spezies isoliert. So inhibiert beispielsweise das sulfatierte Polysaccharid Calcium-Spirulan die Tumor-Invasion und Bildung von Metastasen (25). Calcium-Spirulan (Molekulargewicht 74.600 Dalton) besteht aus Rhamnose (52,3 %), 3-Methylrhamnose (32,5 %), 2,3-Di-O-methylrhamnose (4,4 %), 3-O-Methylxylose (4,8 %), Uronsäuren (16,5 %) und Sulfat (26).
  • Die US-P-5,585,365 offenbart, dass ein anti-virales Polysaccharid mit einem Molekulargewicht zwischen 250.000 und 300.000 Dalton aus Spirulina-Spezies unter Verwendung einer Heißwasser-Extraktion isoliert wurde (27). Dieses Polysaccharid ist aus Rhamnose, Glucose, Fructose, Ribose, Galactose, Xylose, Mannose, Glucoronsäure und Galacturonsäure zusammengesetzt. Eine Anzahl anderer, niedermolekulargewichtiger Polysaccharide, welche sich zwischen 12.600 und 60.000 Dalton bewegen, wurden kürzlich aus Spirulina-Spezies isoliert (28–30).
  • Die US-4,831,020 offenbart eine Zusammensetzung mit einem Polysaccharid als aktiven Inhaltsstoff, welches von der im Meer vorkommenden Chlorella minutissima abgeleitet wurde, worin die Zusammensetzung immunstimulierende und anti-Tumor-Aktivität aufweist. Die Polysaccharid-Zusammensetzung wird durch Heißwasser-Extraktion und unter Verwendung von Gel-Filtrationsmittel erhalten. In dem Patent wird ausgesagt, dass die von der Meeres-Chlorella-Spezies abgeleiteten Polysaccharide bei der Aktivierung der Immunität wirksamer sind, als die limnetische (im Frischwasser lebende) Chlorella-Spezies.
  • Die US-4,882,612 offenbart ein anti-Krebs-Mittel, welches ein von Chlorella abgeleitetes Glycoprotein ist. Das Glycoprotein weist ein Molekulargewicht von 4,5 × 10(4) auf. Die Proteingruppe des Glycoproteins besteht aus einer alfa-Helix und zufälligen Spirale, und die Zuckergruppe besteht aus beta-Polysaccharid.
  • Die US-3,462,412 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer aktiven Substanz aus grüner-Alge, beispielsweise Chlorella oder Scenedesmus, durch nacheinander erfolgende Extraktionen unter Verwendung mehrerer Lösungsmittel: einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch von Wasser und einer hydrophilen Substanz, Wasser, einer alkalischen, wässrigen Lösung und einer sauren wässrigen Lösung unter Erwärmen. Anschließend werden Verunreinigungen durch Ausfällen entfernt und der Extrakt wird weiter konzentriert, und die Polysaccharide des Extraktes werden schließlich unter Verwendung von Ethanol ausgefällt.
  • JP-09176022 offenbart einen Inhibitor für Tumor-Metastasierung, welcher ein mittels heißem Wasser aus einer Alge, beispielsweise Spirulina, Anabaena, Nostoc und anderen, extrahiertes, sulfatisiertes Polysaccharid enthält. Das sulfatisierte Polysaccharid weist ein Molekulargewicht im Bereich von 100.000 bis 500.000 Dalton auf und besteht hauptsächlich aus Rhamnose und Calcium.
  • JP-61167620 offenbart ein karcino-statisches Arzneimittel mit mindestens einem von Rhamnose, Fucose, Xylose, Galactose, Glucose, Mannose, Uronsäure und N-Acetyl-Zucker und Lambda-Spirulinan- und Kappa-Spirulinan-Polysacchariden von Spirulina subsalsa.
  • Ein Weg zur Bestimmung der immunstimulatorischen Aktivität besteht darin, einen biologischen Assay mit Makrophagen zu verwenden. Monocyten/Makrophagen sind in praktisch jedem Gewebe des Körpers zu finden, wo sie zur Koordinierung von Immunantworten und zahlreichen biologischen Prozessen von Bedeutung sind (31). Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Phagozytose, der Überwachung des Immunsystems, der Wundheilung, dem Abtöten von Mikroben und Tumorzellen, und der Antigen-Präsentation an T-Lymphozyten (32). Bei Krebs vermitteln Makrophagen Tumor-cytotoxische Funktionen durch die Produktion von Cytokinen und anderen Immunfaktoren (33). Damit die Makrophagen eine wichtige Rolle in dem adaptiven und angeborenen Immunsystem spielen, müssen sie auf in der Umwelt vorkommende Mittel wirksam reagieren, indem sie zu erst aktiviert werden (34). Eine Aktivierung von Makrophagen wird durch pro-inflammatorische Transkriptions-Faktoren vermittelt, wie den Kernfaktor-Kappa-B (NF-kappa B). Derartige Transkriptions-Faktoren steuern und modulieren dann die Aktivierung/Repression einer Anzahl von Genen, welche eine Vielzahl von Immunantworten vermitteln.
  • In nicht-stimmulierten Makrophagen liegt NF-kappa B als inaktive Heterodimere vor, welche von inhibitorisch wirkenden Kappa-B-Proteinen (I-kappa B) in dem Cytosol in Beschlag genommen sind. Mittel, welche dazu führen, dass I-kappa B Proteine dissoziieren und abgebaut werden, ermöglichen die Translokation von NF-kappa B-Dimeren in den Kern, wo sie die Transkription von stromabwärts liegenden Genen (35) aktivieren können. Durch NF-kappa B gesteuerte Zielgene umfassen pro-inflammatorische Cytokine, Chemokine, inflammatorische Enzyme, Adhesionsmoleküe und Rezeptoren (36).
  • In dieser Erfindung wurde ein auf Transkriptions-Faktor basierender Assay für NF-kappa B in humanen Monocyten verwendet, um die Extraktion, Isolierung, Charakterisierung und Entwicklung immunstimulatorischer Polysaccharid-Zubereitungen aus für Nahrungsmittel geeigneten Mikroalgen zu führen. Die erfindungsgemäßen Polysaccharide sind im Gegensatz zu den meisten, gegenwärtig verfügbaren Polysacchariden sowohl in Wasser als auch in wässriger Ethanollösung löslich.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Neue wasserlösliche Polysaccharid-Zubereitungen mit immunstimulatorischer Makrophagen-Aktivität enthaltend aktive Polysaccharide mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von über 2 Millionen Dalton wurden aus Aphanizomenon flos-aquae (AFA), Chlorella pyrenoidosa und Spirulina platensis isoliert. Die vorliegenden Polysaccharid-Zubereitungen sind bei der Aktivierung von Monocyten mindestens 1000 Mal aktiver, als Polysaccharid-Zubereitungen, die gegenwärtig für die Immuntherapie bei Krebspatienten klinisch zum Einsatz kommen.
  • Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, werden immunstimulatorische Zubereitungen aus Mikroalgen isoliert, welche Polysaccharide umfassen, die durch ein Lösungsmittel extrahierbar sind, welches Wasser oder ein Gemisch von Wasser mit mindestens einem niederen Alkylalkohol umfasst, wobei der Alkylteil von 1–4 Kohlenstoffatomen ist, und wobei die aktiven Polysaccharide ein offensichtliches/augenscheinliches Molekulargewicht von etwa 2 Millionen Dalton aufweisen. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die immunstimulatorische Aktivität der immunstimulatorischen Zube reitung durch die Aktivierung von Monocyten-Makrophagen gezeigt. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die immunstimulatorische Zubereitung aus den Mikroalgen Aphanizomenon flos-aquae extrahiert. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die immunstimulatorische Zubereitung aus den Mikroalgen Chlorella pyrenoidosa extrahiert. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die immunstimulatorische Zubereitung aus den Mikroalgen Spirulina platensis extrahiert. Gemäß einer anderen Ausführungsform sind die Glycosyl-Komponenten der aktiven Polysaccharide der immunstimulatorischen Zubereitung im Wesentlichen aus Mannose, Glucose, Rhamnose, Galactose, Fucose, methylierten Zuckern und N-actetylierten Aminozuckern zusammengesetzt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die Glycosyl-Komponenten der aktiven Polysaccharide der immunstimulatorischen Zubereitung im Wesentlichen von Arabinose, Rhamnose, Glucose und methylierten Zuckern umfasst. Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die Glycosyl-Komponenten der aktiven Polysaccharide der immunstimulatorischen Zubereitung im Wesentlichen aus Rhamnose, Glucoronsäure, Fucose, Galactose und methylierten Zuckern umfasst. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst eine pharmazeutische Zusammensetzung jede der vorstehend aufgeführten immunstimulatorischen Zubereitungen und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst ein Nahrungsergänzungsmittel jede der vorstehend aufgeführten immunstimulatorischen Zubereitungen und einen verträglichen Träger oder Exzipienten für Nahrungsergänzungsmittel.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der vorstehend aufgeführten immunstimulatorischen Zubereitungen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verstärkung der Immunfunktion in einem Individuum, der dies bedarf. Gemäß einer anderen Ausführungsform leidet das Individuum an einer viralen, bakteriellen oder Pilz-Infektion. Gemäß einer weiteren Ausführungsform leidet das Individuum an Krebs. Gemäß einer weiteren Ausführungsform leidet das Individuum an einer Immunschwäche. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das Individuum ein menschliches Wesen. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das Individuum ein Tier.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung der vorstehend aufgeführten immunstimulatorischen Zubereitungen zur Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels zur Verstärkung der Immunfunktion in einem Individuum, das dieses bedarf. Gemäß einer weiteren Ausführungsform leidet das Individuum an einer viralen, bakteriellen oder Pilz-Infektion. Gemäß einer weiteren Ausführungsform leidet das Individuum an Krebs. Gemäß einer weiteren Ausführungsform leidet das Individuum an einer Immunschwäche. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das Individuum ein menschliches Wesen. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das Individuum ein Tier.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Erhalt einer Zubereitung aus für Nahrungsmittel geeigneten Mikroalgen, welche an immunstimulatorischen Polysacchariden angereichert ist, die Schritte von: a) Herstellen eines Extrakts durch Extrahieren der Mikroalgen mit einem Lösungsmittel, welches Wasser oder ein Gemisch von Wasser mit mindestens einem Niederalkyl-Alkohol umfasst, wobei der Alkylteil von 1 bis 4 Kohlenstoffatome ist, wobei die Alkoholkonzentration des Gemisches von 0–100 Vol. % reicht, bei einer Extraktionstemperatur von zwischen 4 °C bis 100 °C; b) wahlweise Konzentrieren des Extrakts auf ein kleines Volumen, wobei ein großes Volumen einen Konzentrationsschritt wünschenswert macht; c) Ausfällen der Polysaccharid-Zubereitung aus dem Extrakt mit Ausfällungsmitteln; d) Trennen der ausgefällten Polysaccharid-Zubereitung durch Trennmittel; und e) Waschen der Ausfällung von (d) mit 95 % Alkohol. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist der Alkohol, der in dem Extraktionsverfahren zum Erhalt einer Zubereitung aus für Nahrungsmittel geeigneten Mikroalgen, welche an immunstimulatorischen Polysacchariden angereichert ist, verwendet wird, Ethanol. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der zum Erhalt einer Zubereitung aus für Nahrungsmittel geeigneten Mikroalgen, welche an immunstimulatorischen Polysacchariden angereichert ist, bei dem Extraktionsprozess verwendetes Alkohol Methanol. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist der zum Erhalt einer Zubereitung aus für Nahrungsmittel geeigneten Mikroalgen, welche an immunstimulatorischen Polysacchariden angereichert ist, bei dem Extraktionsprozess verwendete Alkohol Isopropanol oder Propanol. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die bevorzugte Alkoholkonzentration in Schritt a) von 20–80 %. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die bevorzugte Extraktionstemperatur zwischen 40 und 80 °C. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird das Verfahren zum Erhalt einer an immunstimulatorischen Polysacchariden angereicherten Zubereitung aus Aphanizomenon flos-aquae verwendet. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird das Verfahren zum Erhalt einer an immunstimulatorischen Polysacchariden angereicherten Zubereitung aus Chlorella pyrenoidosa verwendet. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird das Verfahren zum Erhalt einer an immunstimulatorischen Polysacchariden angereicherten Zubereitung aus Spirulina platensis verwendet. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird der Konzentrationsschritt (b) durch (wenn erforderlich) Verdampfen des Lösungsmittels durchgeführt, vorzugsweise bei vermindertem Druck. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird der Konzentrationsschritt (b) durch (wenn erforderlich) Gefriertrocknen durchgeführt. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird der Konzentrationsschritt (b) durch (wenn erforderlich) Dialyse durchgeführt.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Polysaccharid-Zubereitung im Schritt (c) durch Zugabe von Ethanol zu einer Endkonzentration von etwa 80 % Ethanol ausgefällt. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (c) durch Kühlen des Extraktes ausgefällt. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Polysaccharid-Zubereitung im Schritt (c) durch Zugabe eines Salzes ausgefällt.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das Salz Ammoniumsulfat. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die ausgefällte Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (d) durch Filtration abgetrennt. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die ausgefällte Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (d) durch Zentrifugation abgetrennt. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die ausgefällte Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (e) mit 95 % Ethanol gewaschen. Gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiter, Reinigen der Ausfällung durch Auflösung der Ausfällung in Wasser und Entfernen von in Wesentlichen allen Komponenten mit einer Molekülmasse von etwa unter 100.000 Dalton durch Ultra-Filtration. Gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiter, Reinigen der Ausfällung durch Auflösung der Ausfällung in Wasser und Entfernen vom in Wesentlichen allen Komponenten mit einer Molekülmasse von etwa unter 2 Millionen Dalton durch Größenaussschluss-Säulenchromatographie.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung von vorstehend beschriebenen immunstimulatorischen Zubereitungen, wobei die Verstärkung der Immunfunktion die Stimulierung der Monocyten/Makrophagen-Aktivität in einem Individuum, der diese bedarf, darstellt. Gemäß einer anderen Ausführungsform verstärkt die Stimulierung der Monocyten-Makrophagen-Aktivität die Wundheilung. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Stimulierung der Monocyten/Makrophagen-Aktivität in Verbindung mit Krebs verstärkt.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Monocyten/Makrophagen-Aktivität in Verbindung mit Immunschwäche verstärkt. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Stimulierung der Monocyten/Makrophagen-Aktivität in Verbindung mit viralen, bakteriellen oder Pilz-Infektionen verstärkt. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das Individuum ein Mensch. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das Individuum ein Tier. Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der vorstehend aufgeführten immunstimulatorischen Zubereitung, worin die Verstärkung der Immunfunktion die Stimulierung der Monocyten/Makrophagen-Aktivität in einem Individuum, welcher dieser bedarf, darstellt, worin die Mikroalgen jene von Aphanizomenora flos-aquae sind. Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der vorstehend aufgeführten immunstimulatorischen Zubereitung, wobei die Verstärkung der Immunfunktion die Stimulierung der Monocyten-/Makrophagen-Aktivität in einem Individuum, welcher dieser bedarf, darstellt, worin die Mikroalgen jene von Chlorella pyrenoidosa sind. Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der vorstehend aufgeführten immunstimulatorischen Zubereitung, wobei die Verstärkung der Immunfunktion die Stimulierung der Monocyten-/Makrophagen-Aktivität in einem Individuum, welcher diese bedarf, darstellt, worin die Mikroalgen jene von Spirulina platensis sind.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1. Größenausschluss-HPLC-Chromatogram der Polysaccharid-Zubereitung NP16847 (Beispiel 1), 75 μl Injektion bei 500 μg/mL.
  • 2. Größenausschluss-HPLC Chromatogram der Polysaccharid-Zubereitung NP16848 (Beispiel 2), 200 μl Injektion bei 125 μg/mL.
  • 3. Größenausschluss-HPLC Chromatogram der Polysaccharid-Zubereitung NP16846 (Beispiel 3), 200 μl Injektion bei 35 μg/mL.
  • 4. Mikroalgen-Polysaccharid-Zubereitungen NP16847, NP16848 und NP16846 verstärken die mRNA-Produktion pro-inflammatorischer Cytokine. RT-PCR Ergebnisse für IL-1β mRNA, TNF-α mRNA und GAPDH mRNA in THP-1 Zellen bei 2 Stunden: Kontrolle, bakterielles LPS bei 10 μg/mL, (1) Polysaccharid-Zubereitung NP16847 bei 0,5 μg/mL, (2) Poly-saccharid-Zubereitung NP16846 bei 0,5 μg/ml und (3) Polysaccharid-Zubereitung NP16848 bei 0,5 μg/mL.
  • 5. Flussdiagramm, welches ein Protokoll für die Heisswasser-Extraktion bei 40 °C gefolgt von Ausfällung mit 70 % Ethanol zur Entfernung von Phycocyanin-Material zeigt (Beispiel 4).
  • 6. Flussdiagramm, welches ein Protokoll für die Heisswasser-Extraktion bei 40 °C gefolgt von Ausfällung mit Ammoniumsulfat zur Entfernung von Phycocyanin-Material zeigt (Beispiel 5).
  • 7. Flussdiagramm, welches ein Protokoll für die Heisswasser-Extraktion bei 70 °C (Beispiel 6).
  • 8. Flussdiagramm, welches ein Protokoll zur Extraktion mit 70 % Ethanol bei 40 °C ohne Butanol-Aufteilung zeigt (Beispiel 7).
  • 9. Flussdiagramm, welches ein Protokoll zur Extraktion bei 70 % Ethanol bei 40 °C gefolgt von direkter Ethanol Ausfällung zeigt (Beispiel 8).
  • 10. Flussdiagramm, welches ein Protokoll zur Extraktion bei 70 % Ethanol bei 40 °C gefolgt von direkter Ausfällung mit 80 % Ethanol zeigt (Beispiel 9).
  • 11. SEC HPLC Analyse von pre- und Post-Ultrafiltrat NP16847-Zubereitungen unter Verwendung optimaler Extraktionsbedingungen bei 50 % Ethanol/60 °C (Beispiel 24).
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Zur Reinigung der immunstimulatorischen Polysaccharide und Optimierung deren Extraktion wurde der auf einem Transkriptions-Faktor basierende Assay zur Aktivierung von NF-kappa B in humanem THP-1 Monocyten/Makrophagen verwendet. Bei diesem Assay wird die immunstimulatorische Aktivität, gezeigt durch erhöhte Expression eines NF-kappa B getriebenen Luciferase-Reporters, gemessen. Humane THP-1 Monocyten (American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden in PPMI 1640 Medium, welches mit fötalem Kälberserum (10 % Vol./Vol.) und Amikacin (60 mg/L) ergänzt war, bei 37 °C unter 5 % CO2 und 95 % Luft gezüchtet. Aktiv wachsende Zellen wurden unter Verwendung von DEAE-Dextran (10 μg/1 × 106 Zellen) und dem pBIIXLUC Reporter-Plasmid (1 μg/1 × 106 Zellen) transient transfiziert. Dieses Plasmid, ein Geschenk von Dr. Ricardo Dalla-Favera, enthält zwei Kopien des NF-kappa B-Motivs von HIV/IgK (37). Eine Transfektions-Lösung mit THP-1 Zellen wurde für 7 Minuten in einem 37 °C Wasserbad inkubiert. Die transfizierten Zellen wurden dann in 10 % FBS, RPMI 1640 Medium wieder suspendiert und in 96-Wellplatten (Platten mit 96 Vertiefungen (Wells)) in einer Zelldichte von 1 × 105 Zellen pro Well ausplattiert. Nach 24 Stunden wurden zu den transfizierten Zellen Mikroalgen- Extrakte, Fraktionen und Polysaccharid-Zubereitungen zugesetzt. Die Zellen wurden geerntet und die Luciferase Aktivität wurde 4 Stunden nach Zugabe der Proben gemessen. Die Zellen wurden unter Verwendung von Packard-Filterplatten geerntet und unter Verwendung von 30 μL eines Luciferase-Gemisches (1:1, LucLiteTM Luciferase: 1 × PBS, 1 mM Ca und Mg) lysiert. Der LucLiteTM Luciferase-Reporter-Gen Assay Kit wurde von Packard (Downers Grove, IL) gekauft. Die Lichtemission wurde unter Verwendung eines Packard-Mikroplatten-Szintillations-Zählers in einem Einzel-Photonen-Modus gemessen. Die Aktivierung wird als Prozentsatz relativ zur maximalen Aktivierung von NF-kappa B durch 10 μg/mL LPS (E. coli, Serotyp 026:B6, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), welches als positive Kontrolle verwendet wurde, angegeben.
  • Die Analyse der Glycosyl-Zusammensetzung und Glycosyl-Bindungen wurde durch die Universität von Georgia, dem Complex Carbohydrate Research Center, durchgeführt. Die Glycosyl-Zusammensetzung wurde unter Verwendung von GC-Massenspektrometrie-Analyse der TMS-Methyl-Glycoside bestimmt. Um die O-methylierten Zucker, welche während des TMS-Methyl-Glycosid-Verfahrens nachgewiesen wurden, zu identifizieren, wurde die Glycosyl-Zusammensetzung auch unter Verwendung des Alditolacetet-Verfahrens (38) bestimmt. Eine Glycosyl-Bindung-Analyse wurde unter Verwendung des Hakomori-Verfahrens (39) durchgeführt, in Kombination mit Carboxy-Reduktion um Uronsäure-Bindungen nachzuweisen (40).
  • Beispiel 1 – Anfängliche Isolierung einer hochmolekulargewichtigen Polysaccharid-Zubereitung aus AFA (NP16847), welche wirksame Monocyten-Aktivitierungs-Eigenschaften aufweist.
  • Durch dreimaliges (jeweils 4 Stunden) Extrahieren des gefriergetrockneten Materials (125 g) mit 70 % Ethanol bei 40 °C wurde ein Rohextrakt von AFA (Lot Nr. 0110FA von Celltech, Klamath Falls, OR) hergestellt. Dieser Rohextrakt wies hier einen EC50-Wert von 10 μg/mL auf. Wässrige Ethanol-Extrakte wurden ins Trockene verdampft und dann zwischen Wasser und Chloroform (1:1) in Lösungsmittel aufgeteilt. Die Aktivität wurde ausschließlich in der Wasserschicht gefunden, welche weiter gegen n-Butanol (Wasser:Butanol, 63:37) aufgeteilt wurde. Die aktivere Wasserschicht (EC50 = 0,5 μg/mL) wurde einer Alkohol-Ausfällung (Wasser:Methanol:Ethanol, 1:2:3) bei –80 °C für 24 Stunden unterzogen. Das ausgefällte Material, das als die Pre-Ultrafiltrat-Zubereitung bezeichnet wird, wies einen EC50-Wert von 0,2 μg/mL auf und stellt eine Ausbeute von 3 % des AFA-Trockengewichts dar. Dieses Material wurde dann durch eine Ultrafiltrats-Einrichtung mit einer Polyethersulfon-Membran mit einem Molekulargewichts-Cut-Off Wert von 100.000 geleitet (Centricon Plus-20 von Millipore, Bedford, MA). Das Retenat wurde anschließend mehrmals mit 3 % KCl (Gew./Vol.) gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, welche (wahrscheinlich über ionische Interaktionen) an das Material mit hohem Molekulargewicht hafteten/adhärierten. Das Retentat, welches als das Post-Ultrafiltrat-Material bezeichnet wird, wies einen EC50-Wert von 0,1 μg/mL auf, was einer Ausbeute von 0,6 % entspricht.
  • Der Kohlenhydrat-Gehalt der Post-Ultrafiltrat-NP16847-Zubereitung wurde mit zwischen 90 % und 100 % unter Verwendung eines kolorimetischen Assays (41) mit Phenol-Schwefelsäure bei 450 nm und 490 nm bewertet. Aus diesem Ergebnis wird geschlossen, dass dieses Material eine Zubereitung aus Polysacchariden ist. Eine von Galbraith Laboratories, Inc. (Knoxville, TN) durchgeführte Elementaranalyse zeigte, dass dieses Material die folgenden Elemente enthielt: 49,1 % Kohlenstoff, 40,8 % Sauerstoff, 7,62 % Wasserstoff, 2,46 % Stickstoff und Spurenmengen an Schwefel. Die Glycosyl-Zusammensetzung und Bindungs-Analyse des Post-Ultrafiltrats sind in Tabelle 1 gezeigt. NP16847 umfasst hauptsächlich Mannose, Glucose, 4-Methyl-mannose, Rhamnose und methylierte Zuckerreste zusammen mit einfachen Zuckern und acetylierten Aminozuckern. Dies ist der erste Bericht über ein Polysaccharid, welches aus AFA isoliert wurde und eine biologische Aktivität aufweist.
  • Das Post-Ultrafiltrat NP16847 wurde unter Verwendung von Größenausschluss-Chromatographie (SEC) analysiert. Der Aufbau bestand aus einem System Controller Modell 600 E, einem UK-6 Injektor, einem Lösungsmittel-Zuführsystem Modell 600, einem differenziellen Refraktometer Modell 401 und einem Hewlett-Packard Integrator Modell 3396A. Die Analysen wurden bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 mL/Minute unter Verwendung von HPLC geeignetem Wasser und einer Shodex Ohpak KB-805 SEC Säule (300 mm Länge × 8 mm ID) bei 30 °C durchgeführt. Diese Säule kann Moleküle bis zu einem geschätzten Molekülgewicht von 4 Millionen Dalton auftrennen. Eine Analyse des Post-Ultrafiltrats NP16847 zeigte 1 Peak, der in dem Leervolumen (1) eluierte und eine Retentionszeit aufwies, die mit einem offensichtlichem Molekulargewicht von über 2 Millionen Dalton, bezogen auf einen Vergleich mit Dextran-Standards, konsistent war.
  • Das in Beispiel 1 zur Reinigung von AFA-Polysacchariden beschriebene Isolierungs- Verfahren ist neu, da bei der anfänglichen Extraktion im Vergleich zu Verfahren des Standes der Technik, bei denen heißes Wasser zum Einsatz kommt, 70 % Ethanol verwendet wird. Zur Bestimmung, ob dieses Verfahren als ein allgemeines Verfahren zur Extraktion von immunstimulatorischen Polysacchariden aus anderen Nahrungsmittel geeigneten Mikroalgen geeignet sein könnte, wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren auf zwei andere Mikroalgen, die normalerweise als Nahrungsergänzungsmittel konsumiert werden, d.h. Chlorella pyrenoidosa und Spirulina platensis, eingesetzt.
  • Beispiel 2 – Anfängliche Isolierung einer hochmolekulargewichtigen Polysaccharid-Zubereitung aus Chlorella pyrenoidosa (NP16848), die starke Monocyten-Aktivierungs-Eigenschaften aufweist.
  • Durch dreimaliges Extrahieren (jeweils 4 Stunden) des gefriergetrockneten Materials (35 g) mit 70 % Ethanol bei 40 °C wurde ein Rohextrakt von Chlorella (Lot Nr. VP0978 von Sun Chlorella, Torrance, CA) hergestellt. Dieser Rohextrakt wies einen EC50-Wert von 25 μg/mL auf. Wässrige Ethanol-Extrakte wurden ins Trockene verdampft und dann zwischen Wasser und Chloroform (1:1) in Lösungsmittel aufgeteilt. Die Aktivität wurde ausschließlich in der Wasserschicht gefunden, welche weiter gegen n-Butanol (Wasser:n-Butanol, 63:37) aufgeteilt wurde. Die aktivere Wasserschicht wurde einer Alkohol-Ausfällung (Wasser:Methanol:Ethanol, 1:2:3) bei –80 °C für 24 Stunden unterzogen. Das ausgefällte Material wurde dann durch eine Ultrafiltrats-Einrichtung mit einer Polyethersulfon-Membran mit einem Molekulargewichts-Cut-Off Wert von 100.000 geleitet (Centricon Plus-20 von Millipore, Bedford, MA) geleitet. Das Retenat wurde anschließend mehrmals mit 3 % KCl (Gew./Vol.) gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, welche (wahrscheinlich über ionische Interaktionen) an das Material mit hohem Molekulargewicht hafteten. Das Post-Ultrafiltrat-Material wies einen EC50-Wert von 0,3 μg/mL auf und stellte eine Ausbeute von 0,6 % dar.
  • Der Kohlenhydrat-Gehalt der Post-Ultrafiltrats NP16848-Zubereitung wurde unter Verwendung eines kolorimetischen Assays (41) mit Phenol-Schwefelsäure bei 450 nm und 490 nm bei zwischen 90 % und 100 % bewertet. Aus diesem Ergebnis wird geschlossen, dass dieses Material eine Zubereitung aus Polysacchariden ist. Die Glycosyl-Zusammensetzung und Bindungs-Analyse für das Post-Ultrafiltrat ist in Tabelle 2 gezeigt. NP16848 ist hauptsächlich aus Arabinose, Galactose Rhamnose und methylierten Zuckerresten zusammen mit einfachen Zuckern und acetylierten Aminozuckern zusammengesetzt. Obwohl andere immunstimulatorische Polysaccharide und wasserlösliche Zubereitungen aus Chlorella-Spezies in der Literatur beschrieben sind, ist NP16848 eine neue Zusammensetzung. Das Post-Ultrafiltrat NP16848, das unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen HPLC-Größenausschluss-Chromatographie-Verfahrens analysiert wurde, wies einen Peak auf, der in dem Leervolumen (2) eluierte und eine Retentionszeit aufwies, die mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von über 2 Millionen Dalton, bezogen auf einen Vergleich mit Dextran-Standards, konsistent war.
  • Beispiel 3 Anfängliche Isolierung einer hochmolekulargewichtigen Polysaccharid-Zubereitung aus Spirulina platensis (NP16846) die starke Monocyten-Aktivierungs-Eigenschaften aufweist.
  • Durch dreimaliges Extrahieren (jeweils 4 Stunden) des gefriergetrockneten Materials (35 g) mit 70 % Ethanol bei 40 °C wurde ein Rohextrakt von Spirulina (Lot Nr. B16933 von Triarco Industries, Wayne, NJ) hergestellt. Dieses Rohextrakt wies einen EC50-Wert von 50 μg/mL auf. Wässrige Ethanol-Extrakte wurden ins Trockene verdampft und dann zwischen Wasser und Chloroform (1:1) in Lösungsmittel aufgeteilt. Die Aktivität wurde ausschließlich in der Wasserschicht gefunden, welche weiter gegen n-Butanol (Wasser:n-Butanol, 63:37) aufgeteilt wurde. Die aktivere Wasserschicht wurde einer Alkohol-Ausfällung (Wasser:Methanol:Ethanol 1:2:3) bei –80 °C für 24 Stunden unterzogen. Das ausgefällte Material wurde dann durch eine Ultrafiltrations-Einrichtung mit einer Polyethersulfon-Membran mit einem Molekulargewichts-Cut-Off Wert von 100.000 geleitet (Centricon Plus-20 von Millipore, Bedford, MA) geleitet. Das Retenat wurde anschließend mehrmals mit 3 % KCl (Gew./Vol.) gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, welche (wahrscheinlich über ionische Interaktionen) an das Material mit hohem Molekulargewicht hafteten. Das Post-Ultrafiltrat-Material wies einen EC50-Wert von 0,3 μg/mL auf und stellte eine Ausbeute von 0,6 % dar.
  • Der Kohlenhydrat-Gehalt der Post-Ultrafiltrat NP16846-Zubereitung wurde unter Verwendung eines kolorimetischen Assays (41) mit Phenol-Schwefelsäure bei 450 nm und 490 nm bei zwischen 90 % und 100 % bewertet. Aus diesem Ergebnis wird geschlossen, dass dieses Material eine Zubereitung aus Polysacchariden ist. Die Glycosyl-Zusammensetzung und Bindungs-Analyse für das Post-Ultrafiltrats ist in Tabelle 3 gezeigt. NP16846 ist haupt sächlich aus Arabinose, Galactose Rhamnose und methylierten Zuckerresten zusammen mit einfachen Zuckern und acetylierten Aminozuckern zusammengesetzt. Andere Polysaccharide mit vergleichbarere Glycosylzusammensetzungen aus Spirulina Spezies wurden in der Literatur beschrieben, sind jedoch viel kleiner als das NP16846.
  • Das Post-Ultrafiltrat NP16846, welches unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen HPLC-Größenausschluss-Chromatographie-Verfahrens analysiert wurde, wies einen Peak auf, der in dem Leervolumen (3) eluierte und eine Retentionszeit aufwies, die mit einem offensichtlichem Molekulargewicht von über 2 Millionen Dalton, bezogen auf einen Vergleich mit Dextran-Standards, konsistent war.
  • Monocyten/Makrophagen-Aktivierung
  • Boten-RNA (mRNA)-Mengen an den pro-inflammatorischen Cytokinen IL-1β und TNF-α wurden gemessen, um die Monocyten/Makrophagen-Aktivierung in THP-1 durch Mikroalgen-Polysaccharid-Zubereitungen zu bestätigen. Die mRNA-Mengen von GAPDH wurden ebenfalls als eine Kontrolle zur Bestimmung der Spezifität von Änderungen der mRNA-Mengen von IL-1β und TNF-α untersucht. Da GAPDH ein Housekeeping-Gen (ein für die Zelle zum normalen Metabolismus wesentliches Gen) ist, wird erwartet, dass die mRNA-Mengen konstant bleiben, außer wenn Änderungen künstlich induziert werden.
  • RT-PCR-Primer für IL-1β, TNF-α und GAPDH wurden von Integrated DNA-Technologies, Inc. (Coralville, IA) gekauft. Sequenzen für die Primer waren in Su et al. (42) beschrieben. IL-1β vorwärts (5'-ATG-GCA-GAA-GTA-CCT-AAG-CTC-GC-3'), IL-1β rückwärts (5'-ACA-CAA-ATT-GCA-TGG-TGA-AGT-CAG-TT-3'), TNF-α vorwärts (5'-GAG-TGA-CAA-GCC-TGT-AGC-CCA-TGT-TGT-AGC-3') TNF-α rückwärts (5'-GCA-ATG-ATC-CCA-AAG-TAG-ACC-TGC-CCA-GAC-T-3'), GAPDH vorwärts (5'-TGA-AGG-TCG-GAG-TCA-ACG-GAT-TTG-GT-3'), GAPDH rückwärts (5' CAT-GTG-GGC-CAT-GAG-GTC-CAC-CAC-3').
  • Aktiv wachsende THP-1 Zellen (3 mL, 1 × 106 Zellen/mL) wurden für 2 Stunden in Anwesenheit von Testmaterial inkubiert. Unter Verwendung des TRI Reagenz®-Kit (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH), bei dem Zellen unter Verwendung einer Kombination von Phenol und Guanidinthiocynat lysiert werden, wurde Gesamt-RNA isoliert. Nach der Zugabe von Bromchlorpropan wird die RNA in die wässrige Phase abgetrennt und anschließend mit Isopropanol ausgefällt. Die unter Verwendung dieses Verfahren gewonnene Gesamt-RNA betrug etwa 30 μg. Elektrophorese von isolierter RNA unter Verwendung von 0,8 % Agarosegel zeigte keine Anzeichen an kontaminierender DNA.
  • RT-PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von Kit-Reagenzien von Promega (Madison, WI) durchgeführt. Bei jeder Reaktion wurden die folgenden Komponenten eingesetzt: (Gesamt-Volumen von 30 μL): 6 μL AMV/Tfl 5× Reaktionspuffer, 0,6 μL dNTP Gemisch (10 mM), 1,2 μL MgSO (25 mM), 0,6 μL AMV Reverse Transkriptase (5 Einheiten/μL), 0,6 μL Tfl DNA-Polymerase (5 Einheiten/μL), 1,2 μL eines jeden Primers (15 pmol/μL) und 2 ng Gesamt-RNA (IL-1β, TNF-α) oder 5 ng Gesamt-RNA (GAPDH). Das RT-PCR-Protokoll verwendete einen automatischen, thermischen Zykler von Techne Unit Progene. Der erste Zyklus bestand aus 45 Minuten bei 48 °C, gefolgt von 2 Minuten bei 94 °C. Die Amplifizierung wurde unter Verwendung von 35 Zyklen erreicht: Denaturierung bei 94 °C für 45 Sekunden, Annealen bei 60 °C für 1 Minute und Verlängerung bei 68 °C für 2 Minuten. Der abschließende Zyklus hielt die Proben bei 68 °C für 7 Minuten. Eine Elektrophorese von RT-PCR-Produkten (mRNA IL-1β, TNF-α und GAPDH) wurde unter Verwendung von 12 μL des Reaktionsgemisches auf 5 % Polyacrylamid-Gelen mit Ethidiumbromid als das Färbemittel erreicht.
  • Die Behandlung von THP-1-Zellen mit LPS oder Mikroalgen-Polysaccharid-Zubereitungen führte im Vergleich zu der Kontrolle zu einem starken Anstieg von sowohl IL-1β-mRNA (810 bp) als auch TNF-α-mRNA (444 bp). Die mRNA-Mengen des Housekeeping-Gens Glyceraldehydphosphat-Dehydrogenase (GAPDH, 1000 bp) war für alle Proben die gleichen (4).
  • Die beobachtete NF-kappa B Aktivierung durch NP16847, NP16848 und NP16846 erfolgt nicht auf Grund einer Verunreinigung der Zubereitungen durch Endotoxin. Dies wurde durch Ergebnisse der folgenden zwei Experimente bestätigt, welche durchgeführt wurden, um diese Möglichkeit auszuschließen. Zuerst wurde Polymyxin B (10 μg/mL, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) einer jeden Polysaccharid-Zubereitung (0,1–1 μg/mL) zugesetzt, um festzustellen, ob eine Änderung der NF-kappa B Aktivierung auftrat. Polymyxin B ist ein polykationisches Antibiotikum, welches bekanntermaßen viele der biologischen Wirkungen von LPS durch Bindung an den Lipid A Bereich des Moleküls blockiert. Alle drei Mikroalgen-Polysaccharid-Zubereitungen waren gegenüber Polymyxin B-Zugabe (Daten nicht gezeigt) unempfindlich. Die Zugabe von Polymyxin B zu LPS (10 μg/mL) supprimierte die NF-kappa B Aktivierung um 75 %. Das zweite, zur Überprüfung möglicher Endotoxin-vermittelter Wirkungen verwendete Experiment bestand darin, nach dem Vorhandensein von β-Hydroxymyristat in der Glycosyl-Zusammensetzungs-Analyse zu suchen. Es gab keine nachweisbaren Mengen an β-Hydroxymyristat in Proben-Zubereitung von NP16848 und NP16846. Es ist daher unwahrscheinlich, dass die verzeichnete Makrophagen-Aktivierung durch NP16848 und NP16846 durch Endotoxine erfolgte.
  • In zwei unterschiedlichen Proben-Zubereitungen von NP16847 wurden jedoch kleine Mengen an β-Hydroxymyristat (0,6 % des Gesamt-Peakbereichs) nachgewiesen. Um zu bestimmen, in welcher Menge "Endotoxin-ähnliches" Material vorhanden war, wurden 6 AFA-Proben unter Verwendung des Limulus Amebocyten Lysat (LAL) Assays (Analyse von Bio-Whittaker, Walkersville, MD) analysiert. Die Menge an unter Verwendung dieses Assays festgestellten LAL-positiven Materials betrug 0,002 % des Mikroalgen-Trockengewichts. Im Vergleich dazu ist die prozentuale Ausbeute von NP16847 etwa 300-mal größer (0,6 % des Mikroalgen-Trockengewichts). Dies bedeutet, dass bei der Konzentration, die erforderlich ist, um 50 % der maximalen NF-kappa B Aktivierung durch NP16847 zu bewirken (100 ng/mL), die Gesamtmenge an möglichem LAL-positiven Material 300 pg/mL betragen würde. Diese Konzentration an Endotoxin wäre unter Verwendung des Makrophagen-Assay-Systems nicht nachweisbar. Eine mögliche Endotoxin-Kontaminierung kann daher für die stimulatorische Wirkung von NP16847 auf die Aktivierung von Makrophagen nicht verantwortlich sein.
  • Die Beispiele 1 bis 3 zeigen, dass Polysaccharid-Zubereitungen mit starker immunstimulatorischer Aktivität aus für Nahrungsmittel geeigneten Mikroalgen unter Verwendung von 70 % Ethanol bei 40 °C extrahiert werden können. Nachfolgende Schritte bei der Isolierung dieser Polysaccharid-Zubereitungen beinhalteten ein komplexes Protokoll und die Verwendung von organischen Lösungsmitteln. Polysaccharide werden herkömmlicherweise aus natürlichen Quellen auf Grund deren hohen Wasserlöslichkeit unter Verwendung von heißem Wasser extrahiert. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass dieses Heißwasser-Isolierungsverfahren im Vergleich zu der anfänglichen Extraktion unter Verwendung von 70 % Ethanol eine höhere prozentuale Ausbeute an diesen Polysacchariden ergeben würde. Darüber hinaus wäre es nicht erforderlich, organische Lösungsmittel-Auftrennungen zu verwenden wenn sich dieses Verfahren als erfolgreich erweisen würde, da ein Heißwasser-Extrakt nicht-polares Material wohl weniger wahrscheinlich enthält. Im Gegensatz zu dem vorhergesagten Verhalten ergab Wasser-Extraktion (Beispiele 4 bis 6) jedoch Zubereitungen, welche im Wesentlichen weniger aktiv waren als das Verfahren unter Verwendung anfänglicher Extraktion mit wässrigem Ethanol (Beispiel 1) und warf weiter zusätzliche Probleme auf.
  • Sowohl die HPLC-Größenausschluss-Chromatographie-Analyse als auch die immunstimulatorische Aktivität (Makrophagen-Aktivierung) wurden wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben bestimmt. Die in jedem Beispiel verwendeten Mikroalgen waren gefriergetrocknetes AFA (Lot. 041900 Merc), welches von Klamath Algae Products Inc., Klamath Falls, OR, erhalten wurde. Eine Ultrafiltration (wenn durchgeführt) wurde unter Verwendung einer Einrichtung mit einer Polyethersulfon-Membran mit einem Molekulargewichts-Cut-Off-Wert von 100.000 (Centricon Plus-20 von Millipore, Bedford, MA) durchgeführt. In jedem Experiment wurde das Retentat-Material der Ultrafiltration mehrere Male mit 3 % KCl (Gew./Vol.) gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, die (möglicherweise über ionische Interaktionen) an dem hochmolekulargewichtigen Material hafteten.
  • Beispiel 4–40°C Wasserextraktion Phycocyanin Entfernungen mit Alkohol-Ausfällungen
  • Eine Wasserextraktion von AFA bei 40 °C war problematisch, da dieser Rohextrakt große Mengen an Phycocyanin aufwies (ein blaues, proteinartiges Pigment). Versuche zur Entfernung von Phycocyanin durch Ultrafiltration waren nicht erfolgreich, da dieses Material zusammen mit der NP16847 Polysaccharid-Zubereitung im Cut-Off-Filter mit einem Molekulargewicht von 100.000 Dalton zurückgehalten wurde. Eine vollständige Ausfällung des Phycocyanin-Materials durch Alkohol erfordert eine Lösung von 70 % Ethanol oder mehr (Daten nicht gezeigt). Um dieses Verfahren zu bewerten wurden 10 g gefriergetrocknetes AFA 3-mal mit Wasser (jeweils 62,5 mL) bei 40 °C jeweils zwischen 4 und 8 Stunden extrahiert. Der Wasser-Rohextrakt wurde lyophilisiert und in 40 mL Wasser erneut gelöst. Ethanol (92 mL) wurde bei Raumtemperatur zugesetzt, um eine Endkonzentration von 70 % Ethanol zu erhalten. Ausgefällte Materialien (Phycocyanin enthaltende) wurden entfernt und der Überstand wurde durch eine Ultrafiltrations-Einrichtung geleitet. Das Material wurde bei jedem Schritt in dem Isolierungs-Verfahren auf Makrophagen-Aktivierung (5) bewertet. Die Mehrheit der immunstimulatorischen Aktivität ging während der 70 % Ethanol-Ausfällung in der Ausfällung (welche auch Phycocyanin enthielt) klar verloren. Die prozentuale Ausbeute an Post-Ultrafiltrat-Material (über 100.000 Dalton) unter Verwendung dieses Verfahrens betrug 1,0 %. Obwohl diese prozentuale Ausbeute über der bei Verwendung des 70 % Ethanol-Extraktionsverfahrens von Beispiel 1 lag, Ausbeute 0,6 %, enthielt dieses Material neben NP16847 andere Substanzen, da es einen EC50-Wert von 1000 ng/mL aufwies. Im Vergleich dazu wies das Material von Beispiel 1 einen EC50-Wert von 100 ng/mL auf.
  • Beispiel 5 – 40°C Wasserextraktion und Phycocyanin Entfernungen mit Ammoniumsulfat
  • Bei Verfahren zur Isolierung von Phycocyanin (43, 44) wird gewöhnlich eine Ammoniumsulfat-Ausfällung verwendet (40–65 % Sättigung). Dieses Protokoll wurde befolgt, um festzustellen, ob mit Ammoniumsulfat-Ausfällung Phycocyanin selektiv aus dem Rohextrakt entfernt werden könnte. Gefriergetrocknetes AFA (10 g) wurde 3-mal mit Wasser (jeweils 62,5 mLs) bei 40°C jeweils zwischen 4 und 8 Stunden extrahiert. Der Wasser-Rohextrakt wurde lyophilisiert und in 40 mL Wasser, das 48 g Ammoniumsulfat enthielt (50 % Sättigung), erneut gelöst. Ausfällbare Materialien (enthalten Phycocyanin) wurden entfernt und der Überstand wurde durch eine Ultrafiltrations-Einrichtung geleitet. Die prozentuale Ausbeute an Post-Ultrafiltrat-Material betrug 1,32 %, enthielt jedoch wahrscheinlich wenig NP16847, da dessen spezifische Aktivität niedrig war (EC50 > 1000 ng/mL). 6 fasst die immunstimulatorische Aktivität des Materials bei jedem Schritt in dem Isolierungs-Verfahren zusammen. Vergleichbar zu dem vorigen Verfahren wurde die Mehrheit von NP16847 zusammen mit Phycocyanin durch Zugabe von Ammoniumsulfat ausgefällt.
  • Die Versuche zur Abtrennung von Phycocyanin von NP16847 in dem Wasser-Rohextrakt waren klar nicht erfolgreich. Darüber hinaus führte eine erneute Extraktion des Marc-Materials (Rest aus der 40 °C Wasserextraktion) unter Verwendung von wässrigem Ethanol bei höheren Temperaturen (beispielsweise 50 % Ethanol/60 °C) zur Isolierung einer erheblichen Menge an NP16847 (siehe Beispiel 43). Eine Extraktion mit Wasser bei 40 °C führte daher nicht zu einer vollständigen Gewinnung von NP16847.
  • Beispiel 6 – 70°C Heißwasser-Extraktion
  • Eine Wasserextraktion bei höheren Temperaturen, wie 70 °C, würde zur Denaturierung und Ausfällung von Phycocyanin führen, während NP16847 und andere polare Moleküle in Lösung verbleiben. Um diese Vorgehensweise zu überprüfen wurden 20 g gefriergetrocknetes AFA (10 g) wurde 3-mal mit Wasser (jeweils 125 mL) bei 40 °C zwischen 4 und 8 Stunden jeweils extrahiert. Dieser Rohextrakt schien kein Phycocyanin-Material aufzuweisen, wie durch das Fehlen der blauen Farbe gezeigt. Der Wasser-Rohextrakt wurde lyophilisiert und in 80 mL Wasser erneut gelöst. NP16847 wurde unter Verwendung von Alkohol (Wasser:Methanol:Ethanol, 1:2:3) bei –20 °C für 24 Stunden ausgefällt. Ausfällbare Materialien wurden durch eine Ultrafiltrations-Einrichtung geleitet. 7 fast die immunstimulatorische Aktivität des Materials bei jedem Schritt in dem Isolierungs-Verfahren zusammen. Der EC50-Wert für die Makrophagen-Aktivierung des Post-Ultrafiltrat-Materials (200 ng/mL) war leicht höher als das in Beispiel 1 erhaltene Material (100 ng/mL). Die prozentuale Ausbeute an Post-Ultrafiltrat-Material) unter Verwendung dieses Verfahrens betrug 1,74 %, was wesentlich höher ist, als die 0,6 % NP16847 Ausbeute, welche mit dem 70 % Ethanol-Verfahren in Beispiel 1 erhalten wurden. Mit einer Extraktion mit 70 °C Wasser werden daher etwa 3-Mal mehr an NP16847 gewonnen, wie durch vergleichbare EC50-Werte des Post-Ultrafiltrat-Materials gezeigt ist.
  • Eine Isolierung von NP16847 durch Heißwasser-Extraktion (bei 70 °C) bietet gegenüber dem Isolierungs-Verfahren von Beispiel 1 mehrere Vorteile. Keine organischen Lösungsmittel werden verwendet, nur wenige Schritte sind erforderlich, um das Endmaterial zu erhalten, und etwa 3-Mal mehr NP16847 wird extrahiert. Es gibt jedoch mehrere Nachteile. Zuerst muss der Wasser-Rohextrakt lyophilisiert werden, um diesen zu konzentrieren um zu große Volumina an Alkohol-Ausfällungen zu vermeiden. Zweitens enthält das Pre-Ultafiltrat eine wesentlich Menge an inaktivem Material (wie durch einen geringen EC50-Wert von 500 ng/mL und das HPLC-Chromatogram in 7 gezeigt), was zu einer sehr langsamen Aufreinigung unter Verwendung der Ultrafiltrations-Einrichtung führt.
  • Mehrere zusätzliche Verfahren wurden, basierend auf Modifikationen des in Beispiel 1 beschriebenen 70 % Ethanol-Extraktions-Verfahrens untersucht. Die folgenden Beispiele beschreiben Isolierungs-Verfahren, bei denen die Verwendung organischer Lösungsmittel nicht erforderlich war und bei denen die Isolierung in einer begrenzten Anzahl von Schritten erreicht wird. Ein einfaches, ökonomisches und wirksames Verfahren wurde entwickelt, mit dem alle mit Heißwasser Extraktion assoziierten Probleme gelöst werden können.
  • Beispiel 7–70 % Ethanol-Extraktion bei 40 °C mit Chloroform-Aufteilung
  • Bei der Extraktion von NP16847 in Beispiel 1 führte der zweite Lösungsmittel-Aufteilschritt zwischen n-Butanol und Wasser zu einem wesentlichem Verlust der immunstimulatorischen Aktivität in die Butanol-Schicht. Das Protokoll von Beispiel 1 wurde daher modifiziert, um den n-Butanol-Lösungsmittel-Aufteilschritt zu umgehen. Dieses neue Ver fahren ist mit dem Verfahren von Beispiel 1 identisch mit der Maßgabe, dass nur ein Lösungsmittel-Aufteilschritt zwischen Chloroform und Wasser (1:1) durchgeführt wurde. Die 8 fasst das Isolierungs-Schema und die immunstimulatorische Aktivität bei jedem Schritt im Isolierungs-Verfahren zusammen. Der EC50-Wert für das unter Verwendung dieses Verfahrens erhaltene Post-Ultrafiltrat-Materials (200 ng/mL) war geringfügig höher als für das in Beispiel 1 (100 ng/mL) erhaltene Material. Die prozentuale Ausbeute des unter Verwendung dieses Verfahrens verwendeten Post-Ultrafiltrats NP16847 betrug 1,97 %. Das Weglassen des Butanol-Lösungsmittel-Aufteilschritts aus dem 70 %-Ethanol-Extraktions-Verfahren (Beispiel 1) verbesserte die Gewinnung des Post-Ultrafiltrats NP16847 um mehr als 3-mal. Der hauptsächliche Nachteil dieses Verfahrens besteht jedoch in der Verwendung von Chloroform bei der Aufteilung mit organischem Lösungsmittel.
  • Beispiel 8–70 % Ethanol-Extraktion bei 40 °C und direkte Alkohol-Ausfällung
  • Um eine Vorgehensweise zu bewerten, bei der sowohl die Butanol- als auch die Chloroform-Aufteilung nicht durchgeführt wird, wurden 10 g gefriergetrocknetes AFA 2-mal mit 70 % Ethanol (jeweils 125 mL) bei 40 °C extrahiert. Die erste Extraktion erfolgte für 3 Stunden und die zweite Extraktion erfolgte für 12 Stunden. 70 % Ethanol-Rohextrakt wurde bei –20°C für mehrere Stunden gelagert und ausfällbares Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Die Ausfällung wurde mit kaltem 95 % Ethanol gewaschen (um verbleibendes nicht-polares Material zu entfernen), in Wasser gelöst und dann durch eine Ultrafiltrations-Einrichtung geleitet. Die 9 fasst die immunstimulatorische Aktivität des Materials bei jedem Schritt in dem Isolierungs-Verfahren zusammen. Der EC50-Wert des Post-Ultrafiltrat-Materials war etwas höher (200 ng/mL) als bei dem in Beispiel 1 erhaltenen Material (100 ng/mL). Die prozentuale Ausbeute des Post-Ultrafiltrats in NP16847 betrug 1,2 %. Obwohl diese Ausbeute 2-mal höher ist als die unter Verwendung in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren Erhaltene, ist sie etwa 30 % geringer als die unter Verwendung des Protokolls in Beispiel 7 erhaltene Ausbeute. Die geringere Ausbeute geht wahrscheinlich auf eine unvollständige Ausfällung in 70 % Ethanol zurück.
  • Beispiel 9 – 70 % Ethanol-Extraktion bei 40 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • Das vorstehende Verfahren (Beispiel 8) wurde leicht modifiziert, um eine größere Ausbeute an NP16847 zu erhalten. Der Rohextrakt aus der 70 % Ethanol-Extraktion wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt, und bei –20°C für mehrere Stunden gelagert. Ausfällbares Material wurde wie vorstehend gleich verarbeitet. Die 10 fasst das Isolierungs-Schema und die immunstimulatorische Aktivität bei jedem Schritt in dem Isolierungs-Verfahren zusammen. Dieses modifizierte Verfahren führte zu einer Ausbeute der Pre-Ultarfiltrat NP16847-Zubereitung von 5,7 % und zu einem EC50-Wert von 200 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay. Die prozentuale Ausbeute an Post-Ultrafiltrat-Material betrug 1,8 %. Der EC50-Wert für das Post-Ultrafiltrat-Material (200 ng/mL) war leicht höher als das für das in Beispiel 1 erhaltene Material verzeichnete (100 ng/mL), jedoch identisch mit den Beispielen 6 und 7 erhaltenen Post-Ultrafiltrat-Werten.
  • Mit dem Verfahren der direkten Ausfällung der NP16847 Polysaccharid-Zubereitung aus dem 70 % Ethanol-Rohextrakt (Beispiel 9) werden die ursprünglichen Ziele erfolgreich erreicht. Keine organischen Lösungsmittel (oder Methanol) werden verwendet, es gibt keinen Lyophilisierungs-/Lösungsmittel-Verdampfungs-Schritt und nur wenige Schritte sind erforderlich, um eine relativ reine Zubereitung von NP16847 zu erhalten. Eine halbreine Zubereitung von NP16847 (70 % davon ist weniger als 100.000 Dalton) kann durch Eliminierung des Ultrafiltrations-Reinigungsschrittes (siehe HPLC-Chromatogramme für das Pre- und Post-Ultrafiltrat in 10) erhalten werden. Diese Pre-Ultrafiltrat NP16847-Zubereitung wäre für einen (botanischen) Nahrungsergänzungsmittel-Extrakt ausreichend. Die Isolierung dieses Materials würde lediglich eine direkte Alkohol-Ausfällung aus einem 70 % Ethanol-Rohextrakt erfordern.
  • Die folgenden Punkte fassen zusammen, warum das Isolierungs-Verfahren (Beispiel 9) den anderen Versuchen überlegen war.
    • 1. Wasserextraktion bei 40 °C
    • a. Enthält hohe Mengen an Phycocyanin welches aus NP16847 weder durch Ultrafiltration noch durch Ethanol- oder Ammoniumsulfat-Ausfällung entfernt werden kann.
    • b. Das nach Ultrafiltration erhaltene NP16847 wies eine geringe spezifische Aktivität auf, EC50 ~ 1000 ng/mL gegen 200 ng/mL (Beispiel 9).
    • c. Das Marc-Material enthielt eine erhebliche Menge an NP16847 dass unter Verwendung von Wasser-Extraktion bei dieser Temperatur nicht wieder gewonnen werden konnte (siehe Beispie1 43).
    • 2. Wasserextraktion bei 70 °C
    • a. Wasser-Extraktion bei dieser Temperatur ergab erhebliche Mengen an inaktivem polarem Material in dem Pre-Ultrafiltrat. Dies ist aus zwei Gründen unerwünscht. Erstens, die Herstellung einer Pre-Ultrafiltrations-Zubereitung würde geringe Mengen an NP16847 enthalten. Zweitens, eine Ultrafiltration ist extrem langsam, um eine Post-Ultrafiltrat NP16847-Zubereitung zu erhalten.
    • b. Obwohl bei dem Verfahren keine toxischen, organischen Lösungsmittel zum Einsatz kommen, ist ein Lyophilisierungs-Schritt des Roh-Extrakts erforderlich.
    • 3. 70 % Ethanol-Extraktion gefolgt von Aufteilung mit organischem Lösungsmittel
    • a. Der klare größte Nachteil dieses Schritts besteht in der Verwendung eines organischen Lösungsmittels (beispielsweise Chloroform) zur Entfernung von nicht polarem Material.
  • Unter den vorstehend aufgeführten Beispielen beinhaltet das optimale, allgemeine Verfahren (Beispiel 9) zwei anfängliche Extraktionen von gefriergetrocknetem AFA mit 70 % Ethanol bei 40 °C. Der Rohextrakt wird auf 80 % Ethanols-Gehalt eingestellt und auf –20°C gekühlt. Die Ausfällung wird gewonnen, mit kalten 95 % Ethanol gewaschen um verbleibendes lipophiles Material zu entfernen. Das Material mit hohem Molekulargewicht (über 100.000 Dalton), welches ~ 30 % der Pre-Ultrafiltrat-Polysaccharid-Zubereitung ausmacht, kann unter Verwendung von Ultrafiltration isoliert werden. Das Folgende liefert einen Vergleich zwischen der NP16847-Zubereitung gemäß Beispiel 9 und NP16847, hergestellt durch Extraktion mit 70 % Ethanol/40 °C (Beispiel 1):
  • Figure 00240001
  • Diese Daten zeigen, dass eine Extraktion von AFA unter Verwendung des Verfahrens in Beispiel 9 zu 2-mal mehr Pre-Ultrafiltrat und 3-mal mehr Post-Ultrafiltrat NP16847 führt. Der EC50-Wert der mit diesen Verfahren erhaltenen Post-Ultrafiltrations-Zubereitung ist etwas höher als der in Beispiel 1 Erhaltene, was zeigt, das ein Teil der verbesserten Ausbeute auf inaktives Material zurückgeht. Die in Beispiel 9 verwendeten Bedingungen wurden daher auf Grund der folgenden Vorteile, die durch dieses neue Isolierungs-Verfahren geboten werden, als Ausgangspunkt für eine weitere Optimierung zur Verbesserung der spezifischen Aktivität der NP16847-Zubereitung gewählt:
    • 1. Optimale Ausbeute und gute spezifische Aktivität von sowohl der Pre- als auch der Post-Ultrafiltration-NP16847 Polysaccharid-Zubereitung.
    • 2. Keine toxischen, organischen Lösungsmittel werden verwendet.
    • 3. Keine Dreh-Verdampfungen oder Lyophilisierung großer Volumina an Wasser oder Lösungsmittel ist vorgesehen.
  • Die Beispiele 10–38 liefern eine genaue Analyse der Änderung von sowohl der Extraktions-Temperatur als auch der Ethanol-Konzentration, um die in Beispiel 9 verwendeten Bedingungen zu optimieren.
  • Beispiel 10 – 70 % Ethanol-Extraktion bei 50 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 50 °C mit 70 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,2 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden, wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 6,5 % und einem EC50-Wert von 100 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 11 – 70 % Ethanol-Extraktion bei 60 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 60 °C mit 70 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,2 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 7,1 % und einem EC50-Wert von 100 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 12 – 70 % Ethanol-Extraktion bei 70 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 70 °C mit 70 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,4 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20°C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 7,1 % und einem EC50-Wert von 100 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4). Eine Entfernung von niedermolekulargewichtigem Material (< 100.000 Daltons) führte zu einer Ausbeute von 2,7 % der Post-Ultrafiltrats NP16847-Zubereitung und einem EC50-Wert von etwa 35 ng/mL.
  • Beispiel 13 – 70 % Ethanol-Extraktion bei 80 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 80 °C mit 70 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,2 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20°C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 7,6 % und einem EC50-Wert von 50 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 14 – 70 % Ethanol-Extraktion bei 23 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 23 °C mit 70 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,5 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20°C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847- Zubereitung von 4,5 % und einem EC50-Wert von > 250 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 15 – 60 % Ethanol-Extraktion bei 23 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 23 °C mit 60 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,3 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20°C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 7,0 % und einem EC50-Wert von > 250 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 16 – 60 % Ethanol-Extraktion bei 40 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 40 °C mit 60 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,2 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20°C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 8,4 % und einem EC50-Wert von 200 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 17 – 60 % Ethanol-Extraktion bei 50 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 50 °C mit 60 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,0 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20°C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 9,4 % und einem EC50-Wert von 100 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 18 – 60 % Ethanol-Extraktion bei 60 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 60 °C mit 60 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,4 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 9,5 % und einem EC50-Wert von 100 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4). Eine Entfernung von niedermolekulargewichtigem Material (< 100.000 Daltons) führte zu einer Ausbeute von 3,5 % der Post-Ultrafiltrats NP16847-Zubereitung und einem EC50-Wert von etwa 75 ng/mL.
  • Beispiel 19 – 60 % Ethanol-Extraktion bei 70 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 70 °C mit 60 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,2 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 10,0 % und einem EC50-Wert von 50 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 20 – 60 % Ethanol-Extraktion bei 80 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 80 °C mit 60 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Ex traktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,2 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 11,2 % und einem EC50-Wert von 25 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 21 – 50 % Ethanol-Extraktion bei 23 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 23 °C mit 50 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,3 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20°C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen durch Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltrations NP16847-Zubereitung von 9,1 % und einem EC50-Wert von 200 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 22 – 50 % Ethanol-Extraktion bei 40 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 40 °C mit 50 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,3 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20°C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 8,9 % und einem EC50-Wert von 100 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 23 – 50 % Ethanol-Extraktion bei 50 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 50 °C mit 50 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,1 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 9,4 % und einem EC50-Wert von 75 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 24 – 50 % Ethanol-Extraktion bei 60 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 60 °C mit 50 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,4 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 10,8 % und einem EC50-Wert von 25 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4). Eine Entfernung von niedermolekulargewichtigem Material (< 100.000 Daltons) führte zu einer Ausbeute von 4,5 % der Post-Ultrafiltrats NP16847-Zubereitung und einem EC50-Wert von etwa 20 ng/mL.
  • Beispiel 25 – 50 % Ethanol-Extraktion bei 70 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 70 °C mit 50 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,4 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 10,2 % und einem EC50-Wert von 25 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4). Eine Entfernung von niedermolekulargewichtigem Material (< 100.000 Daltons) führte zu einer Ausbeute von 5,6 % der Post-Ultrafiltrats NP16847-Zubereitung und einem EC50-Wert von etwa 20 ng/mL.
  • Beispiel 26 – 50 % Ethanol-Extraktion bei 80 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 80 °C mit 50 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,2 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zen-trifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 11,7 % und einem EC50-Wert von 25 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 27 – 40 % Ethanol-Extraktion bei 23 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 23 °C mit 40 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,3 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen durch Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltrations NP16847-Zubereitung von 11,4 % und einem EC50-Wert von > 250 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 28 – 40 % Ethanol-Extraktion bei 40 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 40 °C mit 40 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Ex traktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,4 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 10,7 % und einem EC50-Wert von 100 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 29 – 40 % Ethanol-Extraktion bei 50 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 50 °C mit 40 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,0 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 10,3 % und einem EC50-Wert von 100 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 30 – 40 % Ethanol-Extraktion bei 60 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 60 °C mit 40 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,4 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 10,8 % und einem EC50-Wert von 50 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4). Eine Entfernung von niedermolekulargewichtigem Material (< 100.000 Daltons) führte zu einer Ausbeute von 3,3 % der Post-Ultrafiltrats NP16847-Zubereitung und einem EC50-Wert von etwa 25 ng/mL.
  • Beispiel 31 – 40 % Ethanol-Extraktion bei 70 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 70 °C mit 40 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,4 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 11,1 % und einem EC50-Wert von 50 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 32 – 40 % Ethanol-Extraktion bei 80 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 80 °C mit 40 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,3 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 12,6 % und einem EC50-Wert von 50 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4). Eine Entfernung von niedermolekulargewichtigem Material (< 100.000 Daltons) führte zu einer Ausbeute von 6,2 % der Post-Ultrafiltrats NP16847-Zubereitung und einem EC50-Wert von etwa 30 ng/mL.
  • Beispiel 33 – 30 % Ethanol-Extraktion bei 23 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 23 °C mit 30 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,2 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen durch Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltrations NP16847-Zubereitung von 13,7 % und einem EC50-Wert von > 200 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 34 – 30 % Ethanol-Extraktion bei 40 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 40 °C mit 30 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,3 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 13,8 % und einem EC50-Wert von 100 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 35 – 30 % Ethanol-Extraraktion bei 50 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 50 °C mit 30 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,1 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 10,9 % und einem EC50-Wert von 100 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 36 – 30 % Ethanol-Extraktion bei 60 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 60 °C mit 30 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,2 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach In kubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 10,5 % und einem EC50-Wert von 100 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 37 – 30 % Ethanol-Extraktion bei 70 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 70 °C mit 30 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,1 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 11,0 % und einem EC50-Wert von 75 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Beispiel 38 – 30 % Ethanol-Extraktion bei 80 °C und direkte 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 80 °C mit 30 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für 3 Stunden und dann mit 6,25 mL für 12 Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,0 mL). Die Ethanol-Konzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem 100 % Ethanol auf 80 % Ethanol eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen mittels Zentrifugation gewonnen und anschließend mit 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/ml gelöst. Dieses Extraktions-Verfahren führte zu einer Ausbeute in der Pre-Ultrafiltration NP16847-Zubereitung von 11,9 % und einem EC50-Wert von 75 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay (Tabelle 4).
  • Die Tabelle 4 fasst den Einfluss der während der anfänglichen Extraktion an den vorstehend beschriebenen Eckpunkten verwendeten Temperatur und der Ethanol-Konzentration zusammen. Die zur Bewertung der Wirksamkeit jeder Extraktions-Bedingung verwendeten Eckpunkte waren prozentuale Gewinnung/Ausbeute des Pre-Ultrafiltrats und dessen EC50-Wert. Das Pre-Ultrafiltrat-Material wurde auf Grund dessen möglicher Verwendung als ent weder Nahrungsergänzungsmittel oder als pharmazeutische-Zubereitung für diese Analysen verwendet. Die Eliminierung des Ultrafiltrations-Schrittes würde eine erhebliche Vereinfachung des Isolierungs-Verfahren bedeuten.
  • Die in Beispiel 9 verwendeten Bedingungen (70 % Ethanol/40 °C) führten zu einer Ausbeute des Pre-Ultrafiltrats NP16847 von 5,7 % mit einem EC50-Wert von 200 ng/mL. Ansteigende Extraktions-Temperaturen über 40 °C, verbunden mit der Anwesenheit von 70 % Ethanol während der anfänglichen Extraktion verbesserte die Ausbeute und spezifische Aktivität der NP16847 Polysaccharid-Zubereitung. Eine Senkung der Extraktions-Temperatur von 40 °C auf 23 °C mit 70 % Ethanol, oder jede andere Konzentration an Ethanol führte jedoch nicht zu geringeren EC50-Werten. Bei dieser Temperatur (23 °C) waren die Ausbeuten bei geringerer Ethanol-Konzentration erhöht. Ein Teil dieser gestiegenen Ausbeute ging wahrscheinlich auf eine wirksamere Extraktion von Phycocyanin zurück, wie durch die stärkere blaue Farbe des Materials gezeigt. Eine Extraktion bei höheren Temperaturen (unter Verwendung von 70 % Ethanol) erhöhte die Ausbeute leicht und erhöhte die spezifische Aktivität stark (beispielsweise 70 % Ethanol/80 °C) Eine Extraktion mit 50 % Ethanol bei jeder Temperatur über 40 °C führte im Vergleich mit anderen Ethanol-Konzentration zu geringeren EC50-Werten. Bei Ethanol-Konzentrationen über und unter 50 % Ethanol sank die spezifische Aktivität im Allgemeinen bei jeder Temperatur-Bedingung. Ethanol-Konzentration über und unter 50 % hatten gegenteilige Auswirkungen auf die Ausbeute: Die Ausbeuten sanken mit höherer Ethanol-Konzentration, stiegen jedoch leicht bei geringeren Konzentrationen (bei Temperaturen über und unter 50 °C). Die geringeren Ausbeuten verbunden mit geringerer spezifischer Aktivität bei Ethanol-Konzentrationen über 50 % weisen darauf hin, dass unter diesen Bedingungen weniger NP16847 extrahiert wird. Bei Ethanol-Konzentrationen unter 50 % weisen höhere Ausbeuten verbunden mit geringeren spezifischen Aktivitäten darauf hin, dass zusammen mit NP16847 mehr inaktives Material extrahiert wird. Bei Temperaturen unter 60 °C mit 30 % und 40 % Ethanol geht ein Teil dieses inaktiven Materials sehr wahrscheinlich auf eine wirksamere Extraktion von Phycocyanin zurück, erneut durch die stärkere blaue Farbe der Ausfällung gezeigt.
  • Der Bereich von Tabelle 4 von 60 °C–80 °C bei 50 % Ethanol zeigte Bedingungen für eine sowohl optimale Ausbeute als auch optimale spezifische Aktivität. Der bevorzugte Temperaturbereich liegt zwischen 60 °C und 70 °C (Beispiele 24 und 25) da eine weitere Analyse von sowohl dem Pre- als auch dem Post-Ultrafiltrat-Material das von den 80 °C/40 % bis 60 % Ethanol-Extraktions-Bedingungen abgeleitet war, erhebliche Mengen an wasserunlöslichem Material zeigte. Diese optimalen Bedingungen ergeben Ausbeuten im Post-Ultrafiltrat zwischen 4,5 % und 5,6 % (7,5 bis 9,3 mal mehr als die vorstehende 70 % Ethanol/40 °C Bedingung von Beispiel 1) und einen EC50-Wert von etwa 20ng/mL (5-mal weniger als die 70 % Ethanol/40 °C Bedingung).
  • Beispiel 39 – Kürzere Extraktionszeiten
  • Die Daten in Tabelle 4 wurden von 2-mal extrahiertem Material gewonnen, zuerst für 3 Stunden und dann für 12 Stunden unter jeder Bedingung. Zur Optimierung für Extraktion von NP16847 im großen Maßstab wurden jeweils kürzere Extraktionszeiten von 1 Stunde untersucht und hinsichtlich Ausbeute als auch spezifischer Aktivität als equivalent befunden.
  • Beispiel 40 – Eine Heißwasser-Extraktion bei 95 °C für 30 Minuten
  • Verfahren des Standes der Technik zur Isolierung von immunstimulatorischen Polysacchariden aus anderen Mikroalgen-Typen (17, 27) beinhalten gewöhnlich eine Heißwasser-Extraktion bei 95 °C für 30 Minuten. Zur Bewertung dieses Verfahren wurde 1 g gefriergetrocknetes AFA einmal mit 20 mL Wasser bei 95 °C für 30 Minuten extrahiert. Der Wasser-Extrakt wurde auf 80 % Ethanol eingestellt und bei –20 °C für mehrere Stunden inkubiert. Die gewonnene Ausfällung ergab eine Ausbeute von 12,1 %, enthielt jedoch sehr geringe Mengen an NP16847, da der EC50-Wert des Materials etwa 500 ng/mL betrug. Eine Ultrafiltration führte zu einer Ausbeute von 5,1 % und keiner Veränderung der spezifischen Aktivität. Diese Bedingungen sind ganz offensichtlich nicht für eine Extraktion von NP16847 aus AFA geeignet.
  • Beispiel 41 – Wasser-Extraktion bei 4 °C gefolgt von erneuter Extraktion mit 50 % Ethanol/60 °C
  • Es ist möglich, dass kontaminierendes, polares Material durch eine anfängliche Wasser-Extraktion ohne erheblichen Verlust an NP16847 selektiv entfernt werden kann. Ein Zwei-Schritt-Extraktions-Verfahren wurde getestet, um diese Vorgehensweise zu bewerten. Der erste Schritt beinhaltete eine anfängliche Wasser-Extraktion von AFA von bei 4 °C gefolgt von einem zweiten Schritt einer erneuten Extraktion von AFA bei optimalen Bedingungen (50 % Ethanol/60 °C). Obwohl die spezifische Aktivität von NP16847 unter Verwendung dieses Verfahrens mit den optimalen Bedingungen allein vergleichbar war, betrug die Ausbeute für sowohl das Pre- als auch das Post-Ultrafiltrat etwa 70 % weniger.
  • Beispiel 42 – Wasser-Extraktion bei 23 °C gefolgt von erneuter Extraktion mit 50 % Ethanol/60 °C
  • Das Verfahren von Beispiel 41 wurde leicht modifiziert, in dem die Extraktions-Temperatur von 4 °C auf 23 °C erhöht wurde. Die erste Extraktion beinhaltete daher eine anfängliche Wasser-Extraktion von AFA bei 23 °C, gefolgt von einem zweiten Schritt einer erneuten Extraktion von AFA bei optimalen Bedingungen (50 % Ethanol/60 °C). Die Ergebnisse waren mit denen von Beispiel 41 vergleichbar (d.h. die spezifische Aktivität war mit den optimalen Bedingungen vergleichbar, die Ausbeute war jedoch für sowohl das Pre- als auch das Post-Ultrafiltrat um 70 % geringer).
  • Beispiel 43 – Wasser-Extraktion bei 40°C gefolgt von erneuter Extraktion mit 50 % Ethanol/60 °C
  • Das Verfahren von Beispiel 41 wurde leicht modifiziert, indem die Extraktions-Temperatur von 4 °C auf 40 °C erhöht wurde. Die erste Extraktion beinhaltete daher eine anfängliche Wasser-Extraktion von AFA bei 40 °C, gefolgt von einem zweiten Schritt einer erneuten Extraktion von AFA bei optimalen Bedingungen (50 % Ethanol/60 °C). Die Ergebnisse waren mit denen in Beispiel 41 vergleichbar (d.h. die spezifische Aktivität war mit den optimalen Bedingungen vergleichbar, die Ausbeute war jedoch für sowohl das Pre- als auch das Post-Ultrafiltrat um 70 % geringer).
  • Beispiel 44 – Extraktion mit 70 % Ethanol/40 °C gefolgt von erneuter Extraktion mit 50 % Ethanol/60 °C
  • Es ist möglich, kontaminierendes, nicht-polares Material durch eine anfängliche Ethanol-Extraktion ohne wesentlichen Verlust von NP16847 selektiv zu entfernen. Um diese Vorgehensweise zu bewerten, wurde ein 2-Schritt-Extraktions-Verfahren getestet. Der erste Schritt beinhaltete eine anfängliche Extraktion von AFA mit 70 % Ethanol bei 40 °C gefolgt von einem zweiten Schritt einer erneuter Extraktion bei optimalen Bedingungen (50 % Ethanol/60 °C). Obwohl dieses Verfahren im Vergleich zu den Beispielen 24 und 25 für das Post-Ultrafiltrat NP16847 einen etwas besseren EC50-Wert ergab (10 mg/mL), betrug die Ausbeute lediglich 1,0 %. Das Pre-Ultrafiltrat wies eine Ausbeute von 2,2 % mit einem EC50-Wert von 20 ng/ml auf.
  • Eine Eigenschaft von gereinigtem NP16847 war, dass es an Polypropylen-Pipetten spitzen zu haften/adhärieren schien. Um übermäßige EC50-Werte zu vermeiden, welche durch eine Übertragung von Material während serieller Verdünnungen verursacht wurden, wurden die Pipettenspitzen zwischen jeder Verdünnung gewechselt.
  • Eine chromatographische Analyse von NP16847 vor und nach Ultrafiltration ist in den 5–11 gezeigt. Eine NP16847-Zubereitung, welche unter Verwendung des Beispiel 1 gezeigten Verfahren isoliert wurde, eluierte im Allgemeinen als ein einzelner breiter Peak (1). Bei Verwendung der modifizierten Verfahren (Beispiele 4–9), eluierte das Post-Ultrafiltrat NP16847 jedoch als ein breiter Bereich, welcher anscheinend 3 Peaks zu enthalten schien (siehe 5–10). Diese 3-fach-Peak-Charakteristik kann jedoch durch Lösungsmittel-Aufteilung dieser Post-Ultrafiltrat NP16847-Zubereitung zwischen Wasser:Chloroform (1:1) in einen einzigen breiten Peak umgewandelt werden. Die 9 und 10 zeigen die Form des Peaks des gereinigten NP16847-Polysaccharids nach Aufteilung mit Chloroform. Der große Peak weit rechts eines jeden Chromatograms tritt auch in der leeren Kontrolle auf und geht daher auf Chloroform zurück. Es gibt mehrere mögliche Erklärungen für die Transformation des komplexen Peaks in einen einzelnen Peak. Es ist möglich, dass es Spuren von nicht-polarem oder Fett-ähnlichem Material gibt, welches mit NP16847 assoziiert ist und für die intermolekulare Assoziation von NP16847-Polysacchariden verantwortlich ist. Diese größeren Komplexe würden zu mehreren Peaks führen. Eine Entfernung des nicht-polaren Materials mit Chloroform würde diese Assoziationen aufbrechen und zu dem einzelnen chromatographischen Peak führen. Die mögliche Assoziierung eines Fett-ähnlichen oder nicht-polaren Materials mit NP16847 könnte erklären, warum dieses Polysaccharid-Material unter Verwendung hoher Konzentrationen an wässrigem Ethanol extrahierbar ist. Ob NP16847 ein einzelnes Polysaccharid oder ein Gemisch verwandter Polysaccharide darstellt ist auf Grund des sehr hohen Molekulargewichts dieses Materials schwierig festzustellen. Das Phänomen multipler Peaks tritt weder in den Pre- noch in den Post-Ultrafiltrat NP16847-Zubereitungen auf, welche unter Verwendung optimaler Extraktions-Bedingungen (50 % Ethanol/60 °C–70 °C, siehe 11) erhalten wurden. Dies kann von geringeren Ethanol-Konzentrationen oder Extraktions-Temperaturen oder einer Kombination dieser zwei Faktoren herrühren.
  • Eine Kohlenhydrat-Zusammensetzung aus unterschiedlichen NP16846-Zubereitungen wurde unter Verwendung von GC-Massenspektrometrie-Analyse oder TMS-Methyl Glycosi den (Tabelle 5) bewertet. Eine erneute Analyse des NP16847-Material aus Beispiel 1 (NP 1) ergab, dass es ein identisches Kohlenhydrat-Zusammensetzungsprofil, wie vorstehend bestimmt, aufwies. Da in den Beispielen 4–44 eine unterschiedliche AFA-Charge eingesetzt wurde (von einer anderen Firma gekauft) wurde eine NP16847-Zubereitung aus diesem neuen Material unter Verwendung des Extraktionsverfahrens von Beispiel 1 (NP 2) isoliert. Sowohl diese NP16847-Zubereitung als auch NP 1 weisen eine vergleichbare Glycosyl-Zusammensetzung auf, was eine Konsistenz zwischen den unterschiedlichen AFA-Chargen zeigt. Die NP 2-Zusammensetzung war jedoch 5-mal weniger aktiv als NP 1 (Tabelle 5), was von einem teilweisen Verlust der aktiven Polysaccharide in die n-Butanol-Phase während der Aufteilung n-Butanol/Wasser herrührte. Im Allgemeinen wurden in den Pre- und Post-Ultrafiltrat NP16847-Zubereitungen (NP 3–NP 6), welche unter Verwendung optimaler Extraktionsbedingungen (50 % Ethanol bei 60 °C und 70 °C) erhalten wurden, vergleichbare Kohlenhydrat-Zusammensetzungen gefunden. Das Pre-Ultrafiltrat NP16847 wies jedoch immer eine höhere Glucose-Zusammensetzung und weniger N-acetylierte Zuckereinheiten auf, als die Post-Ultrafiltrat Zusammensetzungen. Basierend auf der Übereinstimmung der Kohlenhydrat-Zusammensetzung zwischen diesen unterschiedlichen NP16847-Zubereitungen (NP 1–NP 7) ist klar, dass die hauptsächlichen Glycosyl-Reste in diesem Material Mannose, Rhamnose, Arabinose und Glucose sind. Um die O-methylierten Zuckern zu identifizieren, welche während des TMS-methyl-Glycosid-Verfahrens nachgewiesen wurden, wurde die Glycosyl-Zusammensetzung auch unter Verwendung einer Alditolacetat-Analyse bestimmt. Methylierte Zucker-Reste in diesen Zubereitungen umfassen 2-Methyl-rhamnose, 3-Methyl-rhamnose, 4-Methyl-rhamnose, 2-Methyl-fucose, 3-Methyl-arabinose und 3-Methyl-mannose. Interessanterweise enthalten diese NP16847-Zubereitungen 5,1–12,5 % methylierte Kohlenhydrat-Reste und einen hohen Prozentsatz an Deoxyhexosen (beispielsweise Rhamnose und Fucose). Diese beiden Eigenschaften können die ungewöhnliche Extrahierbarkeit von NP16847-Polysaccharidmaterial unter Verwendung von relativ hohen Konzentrationen am wässrigem Ethanol erklären.
  • Da die untersuchten Proben (NP 1–NP 7) einen bis zu 50-fachen Unterschied bei den EC50-Werten aufwiesen, ist bei diesen von einer unterschiedlichen Kohlenhydrat-Zusammensetzung auszugehen. Da dies nicht der Fall ist, ist klar, dass die Reinheit oder Aktivität von NP16847-Zubereitungen unter Verwendung dieser Parameter nicht bestimmt werden kann.
  • Infolgedessen wäre es zweckmäßiger, die NP16847-Zubereitungen durch biologische Aktivität, Größe und Extrahierbarkeit im wässrigem Ethanol zu kennzeichnen. Es ist möglich, dass eher ein einziges strukturales Merkmal für die Fähigkeit von NP16847 zur Aktivierung von Monocyten/Macrophagen verantwortlich zeichnet, als eine spezifische Kohlenhydrat-Zusammensetzung. Es ist weiter möglich, dass die Kohlenhydrat-Zusammensetzung von NP 1–NP 7 die Polysaccharide darstellt, welche mit wässrigen Ethanollösungen extrahierbar sind, wobei die Immunstimulatorischen als eine strukturale Klasse in diese Gruppe vorhanden wären. Diese Interpretation wird durch die Beobachtung gestützt, dass mit Heißwasser-Extraktion (NP 8 und NP 9) erhaltenes Material ein äußerst unterschiedliches Kohlenhydratprofil aufweist, als die unter Verwendung von wässriger Ethanol-Extraktion (NP 1–NP 7) isolierten NP16847-Zubereitungen. Der hauptsächlich Glycosyl-Rest aus sowohl Pre- und Post-Ultrafiltrat-Material, welches aus der Heißwasser-Extraktion von AFA erhalten wird, war Glucose (Tabelle 5). Ein anderes Unterscheidungsmerkmal von NP 8 und NP 9 besteht darin, dass Rhamnose im Vergleich mit NP16847-Material, welches unter Verwendung von wässriger Ethanol-Extraktion isoliert wurde, zu einem geringeren Prozentsatz vorhanden ist.
  • Beispiel 45 – Extraktion mit 60 % Methanol bei 65 °C und direkter 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 65 °C mit 60 % Methanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für eine Stunde und dann mit 6,25 mL für eine Stunde. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,5 mL). Die Methanolkonzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem, 100 % Methanol auf 80 % eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen durch die Zentrifugation gewonnen und anschließend mit kaltem 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/mL gelöst. Dieses Extraktionsverfahren führte bei der Pre-Ultrafiltrat NP16847-Zubereitung zu einer Ausbeute von 1,8 % und einem EC50-Wert von 75 ng/mL bei dem Monocyten-Aktivierungs-Assay.
  • Beispiel 46 – Extraktion mit 40 % Isopropanol bei 65 °C und direkter 80 % Alkohol-Ausfällung
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei 65 °C mit 40 % Isopropanol extrahiert, zuerst mit 7,5 mL für eine Stunde und dann mit 6,25 mL für eine Stunde. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,5 mL). Die Isopropanolkonzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem, 100 % Isopropanol auf 80 % eingestellt. Nach Inkubation bei –20°C für mehrere Stunden wurden die Ausfällungen durch Zentrifugation gewonnen und anschließend mit kaltem 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/mL gelöst. Dieses Extraktionsverfahren führte bei der Pre-Ultrafiltrat NP16847-Zubereitung zu einer Ausbeute von 12,0 % und einem EC50-Wert von 100 ng/mL bei dem Monocyten-Aktivierungs-Assay.
  • Beispiel 47 – Extraktion mit 100 % Ethanol bei Rückfluss und Ausfällung durch Kühlen auf –20 °C
  • 1 g gefriergetrocknetes AFA wurde bei Rückfluss unter Verwendung von 100 % Ethanol extrahiert, zuerst mit 8,0 mL für eine Stunde und dann mit 6,50 mL für eine Stunde. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,5 mL). Der vereinigte Überstand wurde dann bei –20° C für mehrere Stunden gelagert und ausfällbares Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Die Ausfällung wurde anschließend mit kaltem 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und im Wasser bei 10 mg/nL gelöst. Dieses Extraktionsverfahren führte bei in der Pre-Ultrafiltrat NP16847-Zubereitung zu einer Ausbeute von 0,68 % und einem EC50-Wert von etwa 75 ng/mL in dem Monocyten-Aktivierungs-Assay.
  • Beispiel 48 – Extraktion von immunstimulatorischem Polysaccharid-Material aus anderen nahrungsmittelgeeigneten Mikroalgen (Chlorrela und Spirulina) unter Verwendung von wässrigem Alkohol
  • Das Verfahren zum Erhalt von NP16847 aus AFA unter Verwendung einer anfänglichen Extraktion mit wässrigen Alkohol unter optimalen Bedingungen führte zu einer Zubereitung, die 20-mal aktiver ist, als Material, das unter Verwendung einer Heißwasser-Extraktion erhalten wurde (EC50-Werte für Monocyten-Aktivierung von 25 ng/mL gegenüber 500 n/mL).
  • Das gleiche Extraktionsverfahren mit wässrigem Alkohol kann auch auf andere, Nahrungsmittel-geeignete Mikroalgen angewendet werden, um Zubereitungen zu erhalten, die an immunstimulatorischen Polysacchariden angereichert sind. So berichteten beispielsweise bereits offenbarte Patente (16, 17, 27), dass Chlorella-Spezies und Spirulina-Spezies immunstimulatorische Polysaccharide enthalten, die unter Verwendung von Heißwasser extrahiert werden. Eine Extraktion mit wässrigen Alkohol (anstelle von heißem Wasser) führt jedoch zu einer selektiven Anreicherung von Polysacchariden, die immunstimulatorisch sind, und dadurch zu Zubereitungen aus diesen Organismen, welche überlegene biologische Aktivität aufweisen sowie eine höhere prozentuale Ausbeute des aktiven Materials ergeben (siehe nachstehende Experimente).
  • Die folgenden, für Nahrungsmittel-geeigneten Mikroalgen wurden in diesen Experimenten verwendet: Chlorella pyrenoidosa (San Chlorella, Lot. Nr. WS 1422) und Spirulina platensis (Nature's Way, Lot. Nr. 912091). Alle Polysaccharid-Zubereitungen stellen Pre-Ultrafiltrat-Material dar. Zur Herstellung von Heißwasser-Extrakten wurde 1 g gefriergetrocknete Mikroalgen 1-mal mit 20 mL Wasser bei 95 °C für 30 Minuten extrahiert. Heißwasser-Extrakte wurden auf 80 % Ethanol eingestellt und bei –20 °C über Nacht inkubiert. Die von Chlorella gewonnene Ausfällung stellte eine Ausbeute von 13,2 % dar und wies einen EC50-Wert von 1.000 ng/mL auf. Die von Spirulina gewonnene Ausfällung stellte eine Ausbeute von 16,5 % dar und wies einen EC50-Wert von 10.000 ng/mL eine für Monocyten/Macrophagen-Aktivierung auf.
  • Durch systematische Veränderung von sowohl der Temperatur als auch der Lösungsmittelkonzentration (% Ethanol in Wasser), welches während der anfänglichen Extraktion verwendet wurde, wurden wässrige Ethanol-Extrakte hergestellt. Die Eckpunkte, prozentuale Ausbeute und der EC50-Wert für Macrophagen-Aktivierung, wurden dazu verwendet, die optimalen Bedingungen zur Herstellung von immunstimulatorischem Polysaccharid-Material zu bestimmen. Chlorella- und Spirullina-Extrakte wurden unter Verwendung des folgenden Verfahrens hergestellt. 1 g gefriergetrocknete Mikroalgen wurde bei der entsprechenden Temperatur extrahiert, zuerst mit 7,5 mL wässrigem Ethanol-Lösungsmittel für zwei Stunden und dann mit 6,25 mL wässrigem Ethanol-Lösungsmittel für zwei Stunden. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden nach Zentrifugation vereinigt (11,3 mL). Die Ethanolkonzentration des Überstandes wurde durch Zugabe von kaltem, 100 % Ethanol auf 80 % eingestellt. Nach Inkubation bei –20 °C für mehrere Stunden, wurden die Ausfällungen durch Zentrifugation gewonnen und nachfolgend mit kaltem, 95 % Ethanol gewaschen. Das isolierte Material wurde bei vermindertem Druck getrocknet und in Wasser bei 10 mg/mL gelöst.
  • Die Extraktionsbedingungen für sowohl eine optimale Ausbeute als auch optimale spezifische Aktivität von immunstimulatorischen Polysaccharid-Zubereitungen aus Chlorella und Spirulina waren vergleichbar mit den optimalen Bedingungen (60 °C–70 °C bei 50 % Ethanol) für die Extraktion von NP16847 aus AFA. Für Chlorella beinhalten optimale Bedingungen für die Herstellung von immunstimulatorischem Polysaccharid-Material eine anfängliche Extraktion mit 50 % Ethanol bei 70 °C. Diese Bedingung liefert eine Ausbeute im Pre-Ultrafiltrat von 6,5 % mit einem EC50-Wert von 25 ng/mL. Für Spirulina beinhalten optimale Bedingungen zur Herstellung von immunstimulatorischem Polysaccharid-Material eine anfängliche Extraktion mit 40 %–50 % Ethanol bei Temperaturen zwischen 50 °C und 70 °C. Diese Bedingungen liefern Pre-Ultrafiltrat-Ausbeuten von etwa 9,0 % mit einem EC50-Wert von 500 ng/mL. Im Vergleich dazu sind, obwohl Heißwasser-Extrakte zu Ausbeuten von 2-mal mehr Material führen, diese 20 bis 40-mal weniger aktiv, als die unter Verwendung optimaler Extraktionsbedingungen mit wässrigen Alkohol erhaltenen Zubereitungen.
  • Zusammengefasst, ein einfaches und wirksames Isolierungsverfahren für eine optimale Gewinnung von NP16847 aus AFA wurde entwickelt. Das optimale Extraktions-Verfahren für die Pre-Ultrafiltrat NP16847-Zubereitung ist eine direkte Alkohol-Ausfällung (80 % bei –20 °C) von zwei vereinigten Extraktionen, die unter Verwendung von 50 % Ethanol bei 60 °C–70 °C für jeweils eine Stunde durchgeführt wurden. Diese Pre-Ultrafiltrat NP16847-Zubereitung stellt eine Ausbeute von 11 %, bezogen auf das AFA-Trockengewicht dar. Unter Verwendung eines zusätzlichen Schrittes, welcher Ultrafiltration beinhalten, zum Ausschluss allen Materials unter 100.000 Dalton, kann eine relativ reine Zubereitung von NP16847-Polysacchariden mit Ausbeuten zwischen 4,5 % und 5,6 % erhalten werden. Sowohl die Pre- als auch Post-Ultrafiltrat-Zubereitungen weisen annähernd die gleichen EC50-Werte auf (25 ng/mL für das Pre-Ultrafiltrat und 20 ng/mL für das Post-Ultrafiltrat). Im Vergleich mit dem NP16847-Material von Beispiel 1 (70 % Ethanol-Extraktion bei 40 °C) enthält diese optimierte Post-Ultrafiltrat-Zubereitung zwischen 7,5 und 9,3 mal mehr an NP16847 mit einer 5-mal stärkeren Aktivität. Dieses Verfahren ist sowohl für eine Zubereitung eines (botanischen) Nahrungsergänzungsmittel-Extrakts, sowie eines pharmazeutischen Massenproduktes geeignet.
  • Das gleiche Verfahren, wie zum Erhalt von immunstimulatorischen Polysaccharid-Zusammensetzungen (NP16847) aus AFA-Mikroalgen beschrieben, kann zum Erhalten von Zusammensetzungen aus anderen Mikroalgen verwendet werden, die an immunstimulatorischen Polysacchariden angereichert sind (beispielsweise welche Monocyten/Macrophagen aktivieren). Die einzigartige Kohlenhydrat-Zusammensetzung von allen 3 Mikroalgen-Polysaccharid-Zubereitungen ermöglicht die Verwendung eines Verfahrens, mit dem selektiv jene angereichert werden können, die immunstimulatorisch sind. Diese Polysaccharide werden unter Verwendung des herkömmlichen Heißwasser-Extraktionsverfahrens nur schlecht extrahiert. Heißwasser-Zubereitungen sind 20 bis 40 mal weniger aktiv als solche, bei denen die optimierten Verfahren zum Einsatz kommen.
  • Pharmazeutische Formulierungen
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet weiter kostengünstige Massen-Polysaccharid-Zubereitungen. Die Mikroalgen, aus denen diese Polysaccharid-Zubereitungen isoliert werden, können in Behältern, vergleichbar zu den gegenwärtigen kommerziellen Verfahren, bei denen diese Mikroalgen zum menschlichen Verzehr gezüchtet werden, vermehrt werden. D.h. es gäbe kein Nachschubproblem, was für die Entwicklung von Arzneimitteln aus aus natürlichen Produkten isolierten Verbindungen häufig ein größeres Problem darstellt. Die vorliegenden Polysaccharid-Zubereitungen kommen in hohen Konzentrationen vor (zwischen 6,5 % und 11 % des Trockengewichts der Mikroalgen) und können unter Verwendung der einfachen, schnellen und kostengünstigen Techniken der vorliegenden Erfindung isoliert werden.
  • Da die vorliegenden Polysaccharid-Zubereitungen als Mittel für die Immuntherapie bei der Behandlung von Immunschwäche-Erkrankungen, Krebs, Wundheilung und infektiösen Erkrankungen nützlich sind, umfasst die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die vorliegenden Polysaccharid-Zubereitungen, wahlweise in Kombination mit annehmbaren pharmazeutischen Trägern oder Exzipienten, enthalten.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Zusammensetzungen, bei denen die aktiven Inhaltsstoffe zum Ereichen des beabsichtigten Zwecks in einer wirksamen Menge enthalten sind. Eine Bestimmung der wirksamen Mengen liegt innerhalb der Fähigkeit des Durchschnittsfachmanns, insbesondere im Lichte der hier gelieferten ausführlichen Beschreibung.
  • Die Menge der verabreichten Zusammensetzungen wird von dem zu behandelnden Zustand, dem zu behandelnden Subjekt, von dem Gewicht des Subjekts, von der Schwere des Zustands, dem Verabreichungsweg und der Beurteilung des betreuenden Arztes abhängen.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in einer an sich bekannten Art und Weise hergestellt werden, beispielsweise mittels herkömmlicher Misch-, Auflös-, Granulierungs-, Dragee-Herstellungs-, Verreibungs-, Emulgierungs-, Verkapselungs-, Ver packungs- und Lyophilisierungs-Verfahren.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können daher in herkömmlicher Art und Weise unter Verwendung einer oder mehrerer physiologisch verträglicher Träger formuliert werden, welche Exzipienten und Hilfsmittel enthalten, welche die Verarbeitung der Zusammensetzungs-Verbindungen in pharmazeutisch einsetzbare Zubereitungen erleichtern. Eine geeignete Formulierung ist von dem gewählten Verabreichungsweg abhängig.
  • Zur Injektion können die erfindungsgemäßen Mittel in wässrigen Lösungen formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern, wie Hanks-Lösung, Ringer's-Lösung, oder physiologischem Salz-Buffer. Zur Verabreichung über die Mukosa werden in den Formulierungen Eindring-Mittel verwendet, welche für die zu permeierende/durchdringende Barriere geeignet sind. Derartige Eindring-Mittel sind im Stand der Technik wohlbekannt.
  • Zur oralen Verabreichung können die Zusammensetzungen durch Kombinieren der aktiven Zusammensetzungen mit pharmazeutisch verträglichen, im Stand der Technik wohlbekannten Trägern formuliert werden. Derartige Träger ermöglichen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gels, Sirups, Aufschlämmungen, Suspensionen und dergleichen für die orale Aufnahme durch einen zu behandelnden Patienten formuliert werden können. Pharmazeutische Zubereitungen zur oralen Verwendung können mit einem festen Exzipienten erhalten werden, wahlweise durch Mahlen eines so erhaltenen Gemisches und Verarbeiten des Gemisches zu Granulaten nach Zugabe geeigneter Hilfsmittel, wenn er wünscht, um Tabletten- oder Dragee-Kerne zu erhalten. Geeignete Exzipienten sind insbesondere Füllmittel, wie Zucker, einschließlich Lactose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol, Zellulose-Zubereitungen, wie beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Gum-Tragacanth, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP).
  • Wenn gewünscht können Desintergrierungsmittel zugesetzt werden, wie das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie Natriumalginat.
  • Dragee-Kerne werden mit geeigneten Beschichtungen versehen. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen eingesetzt werden, welche wahlweise Gum Arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethyleneglycol und/oder Titandioxid, Lacquer-Lösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittel-Gemische enthalten. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten- oder Dragee-Beschichtungen zur Identifizierung oder zur Charakterisierung unterschiedlicher Kombinationen der aktiven Verbindungs-Dosen zugesetzt werden.
  • Pharmazeutische Zubereitungen, die oral eingesetzt werden können, beinhalten Drück-Pass-Kapseln aus Gelatine, sowie passende, versiegelte Kapseln aus Gelatine und einem Weichmacher, wie Glycerin oder Sorbitol. Die Drück-Pass-Kapseln können die aktiven Inhaltsstoffe in Mischung mit Füllstoffen, wie Lactose, Bindemitteln, wie Stärke und/oder Schmiermittel, wie Talk oder Magnesiumstearat, und wahlweise Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen gelöst oder in geeigneten Flüssigkeiten suspendiert werden, wie Fett-Ölen, flüssigen Paraffin oder flüssigen Polyethylen-Glycol. Darüber hinaus können Stabilisatoren zugesetzt werden. Alle Formulierungen zur oralen Verabreichungen sollten in Dosierungsformen vorliegen, welche zur Verabreichung geeignet sind.
  • Für eine buccale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen aufweisen, die in herkömmlicher Art und Weise formuliert wurden.
  • Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung zweckmäßigerweise in der Form eines Aerosol-Sprays aus unter Druck stehenden Packungen oder einem Vernebler geliefert, wobei ein geeignetes Treibmittel, beispielsweise Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas verwendet wird. Im Fall eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosis-Einheit durch Bereitstellen eines Ventils festgelegt werden, um eine abgemessene Menge zu liefern. Kapseln und Kartuschen aus beispielsweise Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator (Inhalator-Pumpsystem) können formuliert werden, so dass diese ein Pulvergemisch der Verbindung und eine geeignete Pulver-Basis, wie Lactose oder Stärke, enthalten.
  • Die Zusammensetzungen können für die parenterale Verabreichung durch Injektion formuliert werden, beispielsweise mittels Bolus-Injektion oder kontinuierlicher Infusion. Formulierungen für eine Injektion können in einer Einheit-Dosis-Form geliefert werden, beispielsweise in Ampullen oder in Multidosis-Behältern mit einem zugesetzten Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen können Formen, wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in Ölen oder wässrigen Trägern annehmen, und können Formulierungsmittel, wie Suspendierungs- , Stabilisierungs- und/oder Dispergierungsmittel enthalten.
  • Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form. Darüber hinaus können Suspensionen der aktiven Verbindung als geeignete ölige Injektions-Suspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Träger umfassen Fett-Öle wie Sesam-Öl, oder synthetische Fettsäure, wie Ester, Ethyloleat, Triglyceride oder Liposome. Wässrige Injektions-Suspensionen können Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran. Die Suspension kann wahlweise auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, welche die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, damit die Zubereitung als hochkonzentrierte Lösungen dargestellt werden kann.
  • Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff in Pulverform zur Wiederherstellung mit einem geeigneten Träger, beispielsweise sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor Verwendung bereit gestellt werden.
  • Die Zusammensetzungen können auch in rektalen Zusammensetzungen, wie Suppositorien oder Retentions-Darmspüllungen formuliert werden, und enthalten beispielsweise herkömmliche Suppositorien-Basen, wie Kakaobutter oder andere Glyceride.
  • Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Formulierungen können die Zusammensetzungen auch als eine Depot-Zubereitung formuliert werden. Derartige langwirkende Formulierungen können durch Implantation verabreicht werden (beispielsweise subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion. So können die Zusammensetzungen daher beispielsweise mit geeigneten Polymeren oder hydrophoben Materialien formuliert werden (beispielsweise als eine Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder als Ionenausstauschharze oder als schwer lösliche Derivate, beispielsweise als schwerlösliche Salze.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete Fest- oder Gel-Phasen-Träger oder Exzipienten umfassen. Beispiele derartiger Träger oder Exzipenten umfassen ohne darauf beschränkt zu sein, Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere wie Polyethylenglycole.
  • Geeignete Verabreichungsrouten können beispielsweise orale, rektale, transmukosale, transdermale oder intestinale Verabreichung, parenterale Lieferung, einschließlich intramuskuläre, subkutane, intramedullare Injektionen, sowie intrathekale, direkte intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intronasale, oder intraoculare Injektionen umfassen.
  • Alternativ kann die Zusammensetzung in einer lokalen, anstelle einer systemischen Art und Weise verabreicht werden, beispielsweise über Injektion der Verbindung direkt in eine betroffenen Bereich, häufig in einer Depot-, oder sich langsam auflösenden Formulierung.
  • Darüber hinaus kann das Arzneimittel in einem System für eine gezielte Lieferung des Arzneimittels verabreicht werden, beispielsweise in einem mit einem Antikörper beschichteten Liposom, welcher spezifisch ist für betroffene Zellen. Die Liposomen werden selektiv zu den Zellen geführt und von diesen aufgenommen.
  • Die Zusammensetzungen können, nach Bedarf, in einer Packung oder einem Dispenser, welcher ein oder mehrere Einheits-Dosis-Formen mit dem aktiven Inhaltsstoff enthalten kann, geliefert werden. Die Packung kann beispielsweise Metall- oder Kunststoff-Folie umfassen, wie eine Blister-Packung. Die Packung oder der Dispenser kann von Verabreichungsinstruktionen begleitet sein. Zusammensetzungen, welche eine in einem verträglichen pharmazeutischen Träger formulierte erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält, können ebenfalls hergestellt, in einen geeigneten Behälter überführt und zur Behandlung eines angezeigten Zustandes markiert werden. Geeignete, auf dem Marker angezeigte Bedingungen können die Behandlung einer Erkrankung umfassen.
  • Nahrungsergänzungsmittel
  • Nahrungsergänzungsmittel, die zur Verwendung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Zusammensetzungen, bei denen die aktiven Inhaltsstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um den beabsichtigten Zweck zu erreichen. Eine wirksame Menge bedeutet insbesondere eine Menge, welche wirksam ist, eine Verhinderung der Entwicklung oder eine Erleichterung bestehender Symptome des zu behandelten Subjekts herbeizuführen. Die Bestimmung der wirksamen Mengen liegt im Bereich des Durchschnittfachmans, insbesondere im Licht der hier gelieferten ausführlichen Offenbarung. Die Menge der verabreichten Zusammensetzung wird von dem zu behandelnden Zustand, dem zu behandelnden Subjekt, dem Gewicht des Subjekts, der Schwere des Zustandes, dem Verabreichungsweg und der Bewertung durch den betreuenden Arztes abhängen.
  • Die Inhaltsstoffe der erfindungsgemäßen Nahrungsergänzungsmittel sind in annehm baren Exzipienten und/oder Trägern für den oralen Konsum enthalten. Die tatsächliche Form des Trägers und daher des Nahrungsergänzungsmittels selbst, muss nicht kritisch sein. Der Träger kann eine Flüssigkeit, ein Gel, ein Gelcap, eine Kapsel, ein Pulver, eine Tablette (beschichtet oder nichtbeschichtet), Tee oder dergleichen sein. Geeignete Exzipienten und/oder Träger umfassen Maltodextrin, Calciumcarbonat, Dicalciumphosphat, Tricalciumphosphat, mikrokristalline Zellulose, Dextrose, Reismehl, Magnesiumstearat, Stearinsäure, Natrium-Kroskarmelose, Natriumstärkeglycolat, Krospovidon, Saccharose, Gemüse-Gums, Agar, Lactose, Methylcellulose, Povidon, Carboxymethylcellulose, Weizenstärke und dergleichen (einschließlich Gemische davon). Die verschiedenen Inhaltsstoffe und der Exzipient und/oder Träger werden vermischt und unter Verwendung herkömmlicher Techniken in die gewünschte Form gebildet. Dosis Mengen/Einheiten können eingestellt werden, um die angeratenen Mengen der Inhaltsstoffe pro Tag in einer vernünftigen Anzahl von Einheiten zu liefern.
  • Das Nahrungsergänzungsmittel kann auch wahlweise Inhaltsstoffe enthalten einschließlich beispielsweise Kräuter, Vitamine, Mineralien, Verstärker, Färbemittel, Süßstoffe, Geschmacksstoffe, inerte Inhaltsstoffe, und dergleichen. Derartige wahlweise Inhaltsstoffe können entweder natürlich vorkommen oder in konzentrierten Formen vorliegen. Eine Wahl von einem oder mehreren dieser Inhaltsstoffe ist eine Frage der Formulierung, des Designs, der Vorliebe des Konsumenten und Endverbrauchers. Die Mengen dieser Inhaltsstoffe, die zu die Nahrungsergänzungsmittel der Erfindung zugesetzt werden, sind dem Durchschnittsfachman bekannt. Ein Leitfaden für derartige Mengen können von der U.S. RDA Dosis für Kinder und Erwachsene geliefert werden.
  • Dokumente
  • Alle Dokumente und Zitate, welche in dieser Anmeldung gemacht oder auf die hier Bezug genommen wurden, werden in der Beschreibung explizit durch Inbezugnahme darauf mitaufgenommen.
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  • Tabelle 1 Glycosyl Zusammensetzung und Bindung-Analyse für die isolierte Polysaccharid-Zusammensetzung NP16847 aus AFA-Mikroalgen, welche unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Extraktionsverfahrens erhalten wurde. Die Daten wurden aus einem Experiment erhalten.
    Figure 00550001
    • zu beachten: Methylgruppen sind durch "Me" dargestellt. Alle Glycosyl-Bindungen sind weiter 1-verbunden wenn nicht anders angegeben. Die Glycosyl-Abkürzungen stellen das folgende dar: "T" für Terminale-Bindungen, "f" für Furanose, und "p" für Pyranose. Die Anwesenheit von zwei Glycosyl-Einheiten zeigt die Co-Eluierung der Komponenten während der Analyse.
  • Tabelle 2: Glycosyl-Zusammensetzung und Bindung-Analyse für die isolierte Polysaccharid-Zusammensetzung NP16848 aus Chlorella pyrenoidosa Mikroalgen, welche unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Extraktionsverfahrens erhalten wurde. Die Daten wurden aus einem Experiment erhalten.
    Figure 00560001
    • zu beachten: Methylgruppen sind durch "Me" dargestellt. Alle Glycosyl-Bindungen sind auch 1-verbunden wenn nicht anders angegeben. Die Glycosyl-Abkürzungen stellen das folgende dar: "Rha" für Rhamnose, "Ara" für Arabinose, "T" für Terminale-Bindungen, "f" für Furanose, und "p" für Pyranose. Die Anwesenheit von zwei oder drei-Glycosyl-Einheiten zeigt eine Co-Eluierung von Komponenten während der Analyse.
  • Tabelle 3: Glycosyl-Zusammensetzung und Bindung-Analyse für die isolierte Polysaccharid-Zusammensetzung NP16846 aus Spirulina platensis Mikroalgen, welche unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Extraktionsverfahrens erhalten wurde. Die Daten wurden aus einem Experiment erhalten.
    Figure 00570001
    • zu beachten: Methylgruppen sind als "Me" dargestellt und Terminale Glycosyl-Verbindungen sind durch "T" dargestellt. Glycosyl-Bindungen sind auch 1-verbunden wenn nicht anders angegeben. Die Anwesenheit von zwei oder Glycosyl-Einheiten zeigt eine Co-Eluierung von Komponenten während der Analyse.
  • Tabelle 4: Einfluss von Temperatur- und Ethanol-Konzentration welche während der anfänglichen Extraktion von AFA verwendet wurde auf die prozentuale Ausbeute und die spezifische Aktivität der NP16847-Polysaccharid-Zubereitung.
    Figure 00580001
  • Tabelle 5: Glycosyl-Zusammensetzung-Analyse für unterschiedliche NP16847-Zubereitung, welche aus AFA isoliert wurden. Die Daten wurden aus einem Experiment erhalten.
    Figure 00590001

Claims (90)

  1. Immunstimulatorische Zubereitungen, welche von Mikroalgen isoliert wurden und Polysaccharide enthalten, die mit einem Lösungsmittel extrahierbar sind, welches Wasser oder ein Gemisch von Wasser und mindestens einem Niederalkyl-Alkohol umfasst, wobei der Alkylteil von 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist, und wobei die aktiven Polysaccharide ein scheinbares Molekulargewicht über etwa 2 Millionen Dalton aufweisen.
  2. Immunstimulatorische Zubereitung nach Anspruch 1, worin die immunstimulatorische Aktivität durch Aktivierung von Monocyten/Macrophagen manifestiert ist.
  3. Immunstimulatorische Zubereitung nach Anspruch 1, worin die Mikroalgen jene von Aphanizomenon flos-aquae sind.
  4. Immunstimulatorische Zubereitung nach Anspruch 2, worin die Mikroalgen jene von Aphanizomenon flos-aquae sind.
  5. Immunstimulatorische Zubereitung nach Anspruch 1, worin die Mikroalgen jene von Chlorella pyrenoidosa sind.
  6. Immunstimulatorische Zubereitung nach Anspruch 2, worin die Mikroalgen jene von Chlorella pyrenoidosa sind.
  7. Immunstimulatorische Zubereitung nach Anspruch 1, worin die Mikroalgen jene von Spirulina platensis sind.
  8. Immunstimulatorische Zubereitung nach Anspruch 2, worin die Mikroalgen jene von Spirulina platensis sind.
  9. Immunstimulatorische Zubereitung nach Anspruch 3, worin die Glycosylkomponenten der aktiven Polysacchariden im Wesentlichen umfassen, Mannose, Glucose, Rhamnose, Galactose, Fucose, methylierte Zucker und N-acetylierte Aminozucker.
  10. Immunstimulatorische Zubereitung nach Anspruch 4, worin die Glycosylkomponenten der aktiven Polysacchariden im Wesentlichen umfassen, Mannose, Glucose, Rhamnose, Galactose, Fucose, methylierte Zucker und N-acetylierte Aminozucker.
  11. Immunstimulatorische Zubereitung nach Anspruch 5, worin die Glycosylkomponenten der aktiven Polysacchariden im Wesentlichen umfassen, Arabinose, Galactose, Rhamnose, Glucose und methylierte Zucker.
  12. Immunstimulatorische Zubereitung nach Anspruch 6, worin die Glycosylkomponenten der aktiven Polysacchariden im Wesentlichen umfassen, Arabinose, Galactose, Rhamnose, Glucose und methylierte Zucker.
  13. Immunstimulatorische Zubereitung nach Anspruch 7, worin die Glycosylkomponenten der aktiven Polysacchariden im Wesentlichen umfassen, Rhamnose, Glucuronsäure, Fucose, Galactose und methylierte Zucker.
  14. Immunstimulatorische Zubereitung nach Anspruch 8, worin die Glycosylkomponenten der aktiven Polysacchariden im Wesentlichen umfassen, Rhamnose, Glucuronsäure, Fucose, Galactose und methylierte Zucker.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche die immunstimulatorischen Zubereitungen nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten umfasst.
  16. Dietätisches Ergänzungsmittel, welches die immunstimulatorischen Zubereitungen nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und einen für dietätische Ergänzungsmittel verträglichen Träger oder Exzipienten umfasst.
  17. Verwendung einer immunstimulatorischen Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Steigerung der Immunfunktion in einem diese erfordernden Individuum.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Individuum an einer viralen, bakteriellen oder Pilz-Infektion leidet.
  19. Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Individuum an Krebs leidet.
  20. Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Individuum an einer Immunschwäche leidet.
  21. Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Individuum ein Mensch ist.
  22. Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Individuum ein Tier ist.
  23. Verwendung einer immunstimulatorischen Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines dietätischen Ergänzungsmittels zur Steigerung der Immunfunktion in einem diese erfordernden Individuum.
  24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Individuum an einer viralen, bakteriellen oder Pilz-Infektion leidet.
  25. Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Individuum an Krebs leidet.
  26. Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Individuum an einer Immunschwäche leidet.
  27. Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Individuum ein Mensch ist.
  28. Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Individuum ein Tier ist.
  29. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 28, wobei die Steigerung der Immun funktion die Stimulierung der Monozyten-/Macrophagen-Aktivität in einem diese erfordernden Individuum ist.
  30. Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Stimulierung der Monozyten-/Macrophagen-Aktivität die Wundheilung fördert.
  31. Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Stimulierung der Monozyten-/Macrophagen-Aktivität in Bezug auf Krebs erhöht wird.
  32. Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Stimulierung der Monozyten-/Macrophagen-Aktivität in Bezug auf Immunschwäche erhöht wird.
  33. Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Stimulierung der Monozyten-/Macrophagen-Aktivität in Bezug auf eine virale, bakterielle oder Pilz-Infektion erhöht wird.
  34. Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Individuum ein Mensch ist.
  35. Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Individuum ein Tier ist.
  36. Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Mikroalgen jene von Aphanizomenon flos-aquae sind.
  37. Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Mikroalgen jene von Chlorella pyrenoidosa sind.
  38. Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Mikroalgen jene von Spirulina platensis sind.
  39. Verfahren zum Erhalt einer Zubereitung aus für Nahrungsmittel geeigneten Mikroalgen, die angereichert sind mit immunstimulatorischen Polysacchariden, wie in einem der Ansprüche 1 bis 38 definiert, welches die Schritte umfasst: (a) Herstellen eines Extrakts durch Extrahieren der Mikroalgen mit einem Lösungsmittel, welches Wasser oder ein Gemisch von Wasser mit mindestens einem Niede ralkyl-Alkohol umfasst, wobei der Alkylteil von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, bei einer Extraktionstemperatur von zwischen 4 °C bis 100 °C; (b) wahlweise Konzentrieren des Extrakts auf ein kleines Volumen, wobei ein großes Volumen einen Konzentrationsschritt wünschenswert macht; (c) Ausfällen der Polysaccharid-Zubereitung aus dem Extrakt mit Ausfällungsmitteln; (d) Trennen der ausgefällten Polysaccharid-Zubereitung durch Trennmittel; und (e) Waschen der Ausfällung von (d) mit 95 % Alkohol.
  40. Verfahren nach Anspruch 39, wobei der bei der Extraktion verwendete Alkohol Ethanol ist.
  41. Verfahren nach Anspruch 39, wobei der bei der Extraktion verwendete Alkohol Methanol ist.
  42. Verfahren nach Anspruch 39, wobei der bei der Extraktion verwendete Alkohol Isopropanol oder Propanol ist.
  43. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei die bevorzugte Alkoholkonzentration in (a) von 20–80 % ist.
  44. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei die bevorzugte Extraktionstemperatur zwischen 40 und 80 °C liegt.
  45. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei die Mikroalgen jene von Aphanizomenon flos-aquae sind.
  46. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei die Mikroalgen jene von Chlorella pyrenidosa sind.
  47. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei die Mikroalgen jene von Spirulina platensis sind.
  48. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei der Konzentrationsschritt (b) (wenn erforderlich) durch Verdampfen des Lösungsmittels, vorzugsweise bei vermindertem Druck, durchgeführt wird.
  49. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei der Konzentrationsschritt (b) (wenn erforderlich) durch Gefriertrocknen durchgeführt wird.
  50. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei der Konzentrationsschritt (b) (wenn erforderlich) mittels Dialyse durchgeführt wird.
  51. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei die Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (c) durch Zusetzen von Ethanol auf eine Endkonzentration von etwa 80 % Ethanol ausgefällt wird.
  52. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei die Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (c) durch Kühlen des Extrakts ausgefällt wird.
  53. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei die Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (c) durch Zusatz eines Salzes ausgefällt wird.
  54. Verfahren nach Anspruch 53, wobei das Salz Ammoniumsulfat ist.
  55. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei die ausgefällte Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (d) durch Filtration getrennt wird.
  56. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei die ausgefällte Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (d) durch Zentrifugation getrennt wird.
  57. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, wobei die ausgefällte Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (e) mit 95 % Ethanol gewaschen wird.
  58. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, weiter umfassend, Reinigen der Ausfällung durch Lösen der Ausfällung in Wasser und Entfernen von im Wesentlichen allen Kompo nenten mittels Ultrafiltration mit einer Molekularmasse von unter etwa 100.000 Dalton.
  59. Verfahren nach einem der Ansprüche 39–42, weiter umfassend, Reinigen der Ausfällung durch Lösen der Ausfällung in Wasser und Entfernen von im Wesentlichen allen Komponenten mittels Größenausschluss-Säulenchromatographie mit einer Molekularmasse von unter etwa 2 Millionen Dalton.
  60. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die Mikroalgen jene von Aphanizomenon flos-aquae sind.
  61. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die Mikroalgen jene von Chlorella pyrenoidosa sind.
  62. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die Mikroalgen jene von Spirulina platensis sind.
  63. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die bevorzugte Extraktionstemperatur zwischen 40 und 80 °C liegt.
  64. Verfahren nach Anspruch 43, wobei der Konzentrationsschritt (b) (wenn erforderlich) durch Verdampfen des Lösungsmittels, vorzugsweise bei vermindertem Druck durchgeführt wird.
  65. Verfahren nach Anspruch 43, wobei der Konzentrationsschritt (b) (wenn erforderlich) durch Gefriertrocknen durchgeführt wird.
  66. Verfahren nach Anspruch 43, wobei der Konzentrationsschritt (b) (wenn erforderlich) mittels Dialyse durchgeführt wird.
  67. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (c) durch Zusatz von Ethanol zu einer Endkonzentration von etwa 80 % Ethanol ausgefällt wird.
  68. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (c) durch Zusatz von einem Salz ausgefällt wird.
  69. Verfahren nach Anspruch 68, wobei das Salz Ammoniumsulfat ist.
  70. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (c) durch Kühlen des Extrakts ausgefällt wird.
  71. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die ausgefällte Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (d) durch Filtration getrennt wird.
  72. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die ausgefällte Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (d) durch Zentrifugation getrennt wird.
  73. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die ausgefällte Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (e) mit 95 % Ethanol gewaschen wird.
  74. Verfahren nach Anspruch 43, weiter umfassend, Reinigen der Ausfällung durch Auflösen der Ausfällung in Wasser und Entfernen von im Wesentlichen allen Komponenten mittels Ultrafiltration mit einer Molekularmasse von weniger als etwa 100.000 Dalton.
  75. Verfahren nach Anspruch 43, weiter umfassend, Reinigen der Ausfällung durch Auflösen der Ausfällung in Wasser und Entfernen von im Wesentlichen allen Komponenten mittels Größenausschluss-Säulenchromatographie mit einer Molekularmasse von weniger als etwa 2 Millionen Dalton.
  76. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Mikroalgen jene von Aphanizomenon flos-aquae sind.
  77. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Mikroalgen jene von Chlorella pyrenoidosa sind.
  78. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Mikroalgen jene von Spirulina platensis sind.
  79. Verfahren nach Anspruch 44, wobei der Konzentrationsschritt (b) (wenn erforderlich) durch Verdampfen des Lösungsmittels, vorzugsweise bei vermindertem Druck, durchgeführt wird.
  80. Verfahren nach Anspruch 44, wobei der Konzentrationsschritt (b) (wenn erforderlich) durch Gefriertrocknen durchgeführt wird.
  81. Verfahren nach Anspruch 44, wobei der Konzentrationsschritt (b) (wenn erforderlich) mittels Dialyse durchgeführt wird.
  82. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (c) durch Zusatz von Ethanol zu einer Endkonzentration von etwa 80 % Ethanol ausgefällt wird.
  83. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (c) durch Zusatz eines Salzes ausgefällt wird.
  84. Verfahren nach Anspruch 83, wobei das Salz Ammoniumsulfat ist.
  85. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (c) durch Kühlen des Extrakts ausgefällt wird.
  86. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die ausgefällte Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (d) durch Filtration ausgefällt wird.
  87. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die ausgefällte Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (d) durch Zentrifugation abgetrennt wird.
  88. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die ausgefällte Polysaccharid-Zubereitung in Schritt (e) mit 95 % Ethanol gewaschen wird.
  89. Verfahren nach Anspruch 44, weiter umfassend, Reinigen der Ausfällung durch Auflösen der Ausfällung in Wasser und Entfernen von im Wesentlichen allen Komponenten mittels Ultrafiltration mit einer Molekularmasse von weniger als etwa 100.000 Dalton.
  90. Verfahren nach Anspruch 44, weiter umfassend, Reiniger der Ausfällung durch Auflösung der Ausfällung in Wasser und Entfernen von im Wesentlichen allen Komponenten mittels Größenausschluss-Säulenchromatographie mit einer Molekularmasse von weniger als etwa 2 Millionen Dalton.
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