JP6527385B2 - 血管内皮細胞増殖因子の産生促進剤 - Google Patents
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(1)血管内皮細胞増殖因子の産生を促進するための促進剤であって、レピディウム メイエニイ ワルプ(Lepidium meyenii Walp.)由来成分を有効成分として含有していることを特徴とする血管内皮細胞増殖因子の産生促進剤、および
(2)前記レピディウム メイエニイ ワルプ由来成分が、レピディウム メイエニイ ワルプの植物体、前記植物体の一部、またはレピディウム メイエニイ ワルプ抽出物である前記(1)に記載の血管内皮細胞増殖因子の産生促進剤
に関する。
(A)被験試料の存在下および非存在下において、血管内皮細胞増殖因子を産生する細胞を培養して得られる培養物中における血管内皮細胞増殖因子の含有量を測定すること〔以下、「評価法(A)」という〕、
(B)被験試料の存在下および非存在下において、血管内皮細胞増殖因子を産生する細胞を培養して得られる細胞の核酸中における血管内皮細胞増殖因子をコードする核酸の含有量を測定すること〔以下、「評価法(B)」という〕
などによって評価することができる。
(B1)血管内皮細胞増殖因子をコードする核酸を増幅するためのプライマーセットを用いて血管内皮細胞増殖因子をコードする核酸を増幅し、増幅産物の量を定量すること、
(B2)血管内皮細胞増殖因子をコードする核酸を検出するためのプローブを用いて血管内皮細胞増殖因子をコードする核酸を定量すること
などによって測定することができる。前記評価法(B)では、被験試料の存在下に培養して得られた細胞の核酸中における血管内皮細胞増殖因子をコードする核酸の含有量(以下、「含有量a」という)と、被験試料の非存在下に培養して得られた細胞の核酸中における血管内皮細胞増殖因子をコードする核酸の含有量(以下、「含有量b」という)とを比較することによって血管内皮細胞増殖因子の産生促進効果を評価することができる。含有量a/含有量bが、好ましくは1.2/1以上、より好ましくは1.5/1以上である場合、被験試料が血管内皮細胞増殖因子の産生促進効果を有することの指標となる。なお、前記含有量a/含有量bの上限は、血管内皮細胞増殖因子の産生促進剤の用途などによって異なるので、一概に決定することができないことから、血管内皮細胞増殖因子の産生促進剤の用途などに応じて適宜決定することが好ましい。
新生児由来線維芽細胞TIG−121〔(財)ヒューマンサイエンス振興財団製〕を、細胞密度が3000細胞/cm2となるように10cm径ディッシュ中のダルベッコ改変イーグル培地〔和光純薬工業(株)製、商品名:D−MEM〕15mLに播種した。つぎに、ディッシュ中の新生児由来線維芽細胞TIG−121を5体積%二酸化炭素下、37℃で24時間培養した。その後、ダルベッコ改変イーグル培地を、被験培地1 15mLに置換した。さらに、被験培地1中の新生児由来線維芽細胞TIG−121を5体積%二酸化炭素下に37℃で48時間培養した。得られた培養物から細胞を回収した。得られた細胞から全RNAを抽出した。得られた全RNAを全RNAの濃度が5.0μg/μLとなるように精製水〔invitrogen社製、商品名:UltraPure DNase/RNase−Free Distilled Water〕を添加し、測定試料を得た。
実験例1において、被験培地1を用いる代わりに、被験培地2を用いたことを除き、実験例1と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実験例1において、被験培地1を用いる代わりに、対照培地(ダルベッコ改変イーグル培地)を用いたことを除き、実験例1と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実験例1〜3で得られた各測定試料を鋳型とし、PCR用キット〔SAバイオサイエンス社製、商品名:RT2 First strand kit〕とリアルタイムPCR装置〔アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製、商品名:ViiA7〕と、細胞増殖に関連する因子の遺伝子またはハウスキーピング遺伝子を増幅するためのプライマー対とを用い、細胞増殖に関連する因子の遺伝子またはハウスキーピング遺伝子それぞれのmRNAレベルでの発現量が閾値に達するまでのサイクル数(以下、「Ct値」という)を測定した。つぎに、細胞増殖に関連する因子について、遺伝子の相対発現量を、式(I):
遺伝子の相対発現量
=〔2−(CtA−CtB)〕/〔2−(CtC−CtD)〕 (I)
(式中、CtAは被験培地を用いたときの細胞増殖に関連する因子の遺伝子のCt値、CtBは被験培地を用いたときのハウスキーピング遺伝子のCt値、CtCは対照培地を用いたときの細胞増殖に関連する因子の遺伝子のCt値、CtDは対照培地を用いたときのハウスキーピング遺伝子のCt値を示す)
に基づいて算出した。
新生児由来線維芽細胞TIG−121〔(財)ヒューマンサイエンス振興財団製〕を、細胞密度が3000細胞/cm2となるように10cm径ディッシュ中のダルベッコ改変イーグル培地〔和光純薬工業(株)製、商品名:D−MEM〕15mLに播種した。つぎに、ディッシュ上の新生児由来線維芽細胞TIG−121を5体積%二酸化炭素下、37℃で24時間培養した。その後、ダルベッコ改変イーグル培地を、被験培地1 15mLに置換し、24時間培養し、測定試料を得た。
実施例1において、培地の置換後24時間培養を行なう代わりに、培地の置換後72時間培養を行なったことを除き、実施例と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例1において、被験培地1を用いる代わりに、対照培地〔ダルベッコ改変イーグル培地〕を用いたことを除き、実施例1と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例2において、被験培地1を用いる代わりに、対照培地〔ダルベッコ改変イーグル培地〕を用いたことを除き、実施例2と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例1において、被験培地1を用いる代わりに、被験培地2を用いたことを除き、実施例1と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例2において、被験培地1を用いる代わりに、被験培地2を用いたことを除き、実施例2と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例1〜2、比較例1〜4で得られた各測定試料と、ELISAキット〔アール・アンド・ディー・システムズ(R&D systems)社製、商品名:VEGF ELISA kit〕とを用い、血管内皮細胞増殖因子の産生量を測定した。
毛乳頭細胞〔タカラバイオ(株)製〕を、細胞密度が20000細胞/cm2となるように48ウェルプレート中のダルベッコ改変イーグル培地〔和光純薬工業(株)製、商品名:D−MEM〕0.3mLに播種した。つぎに、ディッシュ上の毛乳頭細胞を5体積%二酸化炭素下、37℃で24時間培養した。その後、ダルベッコ改変イーグル培地を、被験培地3 0.3mLに置換した。さらに、被験培地3中の毛乳頭細胞を5体積%二酸化炭素下に37℃で24時間培養し、測定試料を得た。
実施例3において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地4(実施例4)、被験培地5(実施例5)または被験培地6(実施例6)を用いたことを除き、実施例3と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例3において、被験培地3を用いる代わりに、対照培地(ダルベッコ改変イーグル培地)を用いたことを除き、実施例3と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例3において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地7(比較例6)、被験培地8(比較例7)または被験培地9(比較例8)を用いたことを除き、実施例3と同様の操作を行ない、測定試料を得た。なお、前記被験培地7に含まれるジメチルスルホキシドは、アデノシンの溶媒として用いられたジメチルスルホキシドが毛乳頭細胞に影響を与えないことを確認するための対照である。また、前記被験培地8に含まれるアデノシンおよび前記被験培地9に含まれるミノキシジルは、VEGF産生効果を有する物質として、試験方法の妥当性を検証するための対照である。
実施例3〜6、比較例5〜8で得られた各測定試料と、ELISAキット〔アール・アンド・ディー・システムズ(R&D systems)社製、商品名:VEGF ELISA kit〕とを用い、被験試料と24時間接触させたときの毛乳頭細胞による血管内皮細胞増殖因子の産生量を測定した。
実施例3において、培地の置換後24時間培養を行なう代わりに、培地の置換後72時間培養を行なったことを除き、実施例3と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例7において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地4(実施例8)、被験培地5(実施例9)または被験培地6(実施例10)を用いたことを除き、実施例7と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例7において、被験培地3を用いる代わりに、対照培地(ダルベッコ改変イーグル培地)を用いたことを除き、実施例7と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例7において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地7(比較例10)、被験培地8(比較例11)または被験培地9(比較例12)を用いたことを除き、実施例7と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例7〜10、比較例9〜12で得られた各測定試料と、ELISAキット〔アール・アンド・ディー・システムズ(R&D systems)社製、商品名:VEGF ELISA kit〕とを用い、被験試料と72時間接触させたときの毛乳頭細胞による血管内皮細胞増殖因子の産生量を測定した。
実施例3において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地10(実施例11)、被験培地11(実施例12)または被験培地12(実施例13)を用いたことを除き、実施例3と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例3において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地13(実施例14)、被験培地14(実施例15)および被験培地15(実施例16)を用いたことを除き、実施例3と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例3において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地16(実施例17)、被験培地17(実施例18)または被験培地18(実施例19)を用いたことを除き、実施例3と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例3において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地1(実施例20)を用いたことを除き、実施例3と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例3において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地19(比較例13)、被験培地20(比較例14)または被験培地21(比較例15)を用いたことを除き、実施例3と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例4、11〜20、比較例5、8、13〜15で得られた各測定試料と、ELISAキット〔アール・アンド・ディー・システムズ(R&D systems)社製、商品名:VEGF ELISA kit〕とを用い、被験試料を24時間接触させたときの毛乳頭細胞による血管内皮細胞増殖因子の産生量を測定した。
実施例7において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地10(実施例21)、被験培地11(実施例22)または被験培地12(実施例23)を用いたことを除き、実施例7と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例7において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地13(実施例24)、被験培地14(実施例25)または被験培地15(実施例26)を用いたことを除き、実施例7と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例7において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地16(実施例27)、被験培地17(実施例28)または被験培地18(実施例29)を用いたことを除き、実施例3と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例7において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地1(実施例30)を用いたことを除き、実施例7と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例7において、被験培地3を用いる代わりに、被験培地19(比較例16)、被験培地20(比較例17)または被験培地21(比較例18)を用いたことを除き、実施例7と同様の操作を行ない、測定試料を得た。
実施例8、21〜30、比較例9、12、16〜18で得られた各測定試料と、ELISAキット〔アール・アンド・ディー・システムズ(R&D systems)社製、商品名:VEGF ELISA kit〕とを用い、被験試料と72時間接触させたときの毛乳頭細胞による血管内皮細胞増殖因子の産生量を測定した。
Claims (2)
- 血管内皮細胞増殖因子の産生を促進するための促進剤であって、レピディウム メイエニイ ワルプ(Lepidium meyenii Walp.)由来成分を有効成分として含有しており、
前記促進剤を被験試料として用い、当該被験試料の存在下に培養して得られた培養物中における血管内皮細胞増殖因子の含有量Aと、被験試料の非存在下に培養して得られた培養物中における血管内皮細胞増殖因子の含有量Bとの比(含有量A/含有量B)が2/1以上である、又は、
前記促進剤を被験試料として用い、当該被験試料の存在下に培養して得られた細胞の核酸中における血管内皮細胞増殖因子をコードする核酸の含有量aと、被験試料の非存在下に培養して得られた細胞の核酸中における血管内皮細胞増殖因子をコードする核酸の含有量bとの比(含有量a/含有量b)が1.2/1以上であることを特徴とする血管内皮細胞増殖因子の産生促進剤。 - 前記レピディウム メイエニイ ワルプ由来成分が、レピディウム メイエニイ ワルプの植物体、前記植物体の一部およびレピディウム メイエニイ ワルプ抽出物からなる群より選ばれた少なくとも1種である請求項1に記載の血管内皮細胞増殖因子の産生促進剤。
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