KR102200015B1

KR102200015B1 - 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 배양물을 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR102200015B1
Application number: KR1020140109207A
Authority: KR
Inventors: 신동욱; 심중현; 이태룡
Original assignee: (주)아모레퍼시픽; 세명대학교 산학협력단
Priority date: 2014-08-21
Filing date: 2014-08-21
Publication date: 2021-01-08
Also published as: KR20160023224A

Abstract

본 명세서에는 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 배양물의 신규한 용도가 개시된다. 상기 인간 진피 유래 성체 줄기세포(human dermal stem/progenitor cells, 이하 hDSPCs)의 배양물을 유효성분으로 함유하는 조성물은, Wnt 유전자의 전사체 또는 Wnt 단백질을 인간 진피 유래 섬유아세포의 배양물에 비하여 증가된 양으로 포함할 수 있다. 이에, 상기 조성물은 Wnt/베타 카테닌(Wnt/β-catenin) 신호전달을 촉진할 수 있고, 진피 모유두 세포의 증식 또는 분화를 증진하거나 노화를 억제할 수 있으며, 성장인자 등의 발현 또는 활성을 증진시키므로, 탈모 방지 또는 발모 촉진의 효과를 가질 수 있다.

Description

인간 진피 유래 성체 줄기세포의 배양물을 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물{Composition for preventing hair loss or accelerating hair growth comprising adult stem cell culture derived from human skin dermis}

본 명세서에는 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 배양물의 신규한 용도가 개시된다.

모발은 생명유지에 중요한 기관은 아니지만, 건강의 상태를 나타내는 척도이자 외모를 결정짓는 신체의 중요한 일부분이다. 따라서 모발이 많은 일반인에게는 일상적인 탈모가 당연한 신체적 활동으로 여기지만, 탈모가 진행 중인 사람들은 우울, 수치심, 사회적 고립 등으로 인해 정신적 안녕과 삶의 질에 심각한 영향을 받을 수 있다.

예로부터, 발모, 양모 및 탈모예방에 대한 연구는 인류의 역사만큼이나 유구하지만, 아직까지 발모 및 탈모 기전에 대하여는 정확하게 밝혀져 있지 않은 상황이다. 그러나 최근에 전 세계적으로 많은 대학 및 기업 연구소 등에서 모발 성장과 탈모에 대한 세포학적, 생화학적 또는 분자생물학적 연구가 활발히 진행되고 있으며, 탈모 치료 및 모발 성장을 촉진시킬 수 있는 약물의 개발에도 많은 노력을 기울이고 있다.

현재 모발성장을 촉진하는 약물로 미국 FDA(Food and Drug Administration)에서 공인 받은 것은 미녹시딜(Minoxidil)과 피나스테리드(Finasteride) 및 프로페시아(Propecia) 등이 있다. 그러나 이들 약물은 약물의 효과 지속 기간이 짧고, 성욕감퇴, 임신여성의 위험성, 약물 투여 중단시 약물 투여전보다 병세가 악화되거나 호르몬의 불균형을 야기하는 등의 부작용이 있어서 새로운 치료제의 개발이 필요하다.

한국공개특허 제 10-2013-0022484호

Shim et al, J. Dermatol. Sci. 2012, Stem Cells & Development. 2013

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 진피 유래 성체 줄기세포의 배양물의 탈모 방지 또는 발모 촉진 용도를 제공하는 것이다.

다른 측면에서, 본 발명의 목적은, Wnt3a의 발현을 증진시켜 Wnt/베타 카테닌 신호전달을 촉진하는 것이다.

다른 측면에서, 본 발명의 목적은, Wnt/베타 카테닌 신호전달을 촉진하거나 SOX2, S100b, VCAN, CORIN 및 알칼리성 인산 가수분해 효소(alkaline phosphatase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현의 증진을 통해 진피 모유두 세포의 증식 또는 분화를 증진하거나 노화를 억제함으로써, 탈모를 방지하거나 발모를 촉진시키는 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 진피 유래 성체 줄기세포의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.

일 측면에 있어서, 본 발명의 인간 진피 유래 성체 줄기세포(human dermal stem/progenitor cells, 이하 hDSPCs)의 배양물을 유효성분으로 함유하는 조성물은, Wnt 유전자의 전사체 또는 Wnt 단백질을 인간 진피 유래 섬유아세포의 배양물에 비하여 증가된 양으로 포함할 수 있다. 이에, 상기 조성물은 Wnt/베타 카테닌(Wnt/-catenin) 신호전달을 촉진할 수 있고, 진피 모유두 세포의 증식 또는 분화를 증진하거나 노화를 억제할 수 있으며, 성장인자 등의 발현 또는 활성을 증진시키므로, 탈모 방지 또는 발모 촉진의 효과를 가질 수 있다.

도 1은 피부 진피 유래 성체 줄기세포와 인간 진피 유래 섬유아세포의 각각의 배양액의 성분을 분석한 것이다(non hDSPC-CM : 음성 대조군, hDSPC-CM : 실험군).
도 2는 피부 진피 모유두 세포에 진피 유래 성체 줄기세포의 배양액(hDSPC-CM, 실험군), 진피 유래 섬유아세포의 배양액(non hDSPC-CM, 음성 대조군 2), 미녹시딜(MNX, 양성 대조군 1), 발프로익산(VPA, 양성 대조군 2)을 처리하거나, 아무 처리도 하지 않았을 때(음성 대조군 1)의 SOX2(A), S100b(B), VCAN(C), CORIN(D) 및 CTNNB1(E)의 발현 양상을 확인한 것이다.
도 3은 피부 진피 모유두 세포에 진피 유래 성체 줄기세포의 배양액(실험군), 진피 유래 섬유아세포의 배양액(음성 대조군 2), 미녹시딜(MNX, 양성 대조군 1), 발프로익산(VPA, 양성 대조군 2)을 처리하거나, 아무 처리도 하지 않았을 때(음성 대조군 1) 알칼리성 인산 가수분해효소(alkaline phosphatase, ALP)의 발현을 관찰한 것(A)과, 발현하는 세포의 백분율을 나타낸 것(B)이다.
도 4는 각종 성장인자 또는 단백질과 Wnt3a를 피부 진피 모유두 세포에 처리한 후, 알칼리성 인산 가수분해효소(ALP)의 발현 변화를 관찰한 것(A : 음성 대조군, B : bFGF, C : HFG, D : IGFBP-1, E : IGFBP-2, F :IGF-1, G : VEGF, H : Wnt3a)과 발현하는 세포의 백분율을 나타낸 것(I)이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은, 인간 진피 유래 성체 줄기세포를 연구하던 중, 인간 진피로부터 유래한 줄기세포(human dermal stem/progenitor cells, hDSPCs)를 분리하는 데 성공하였고(Shim et al, J. Dermatol. Sci. 2012, Stem Cells & Development. 2013), 본 발명의 일 측면인 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 배양물에 Wnt3a 단백질이 많음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 일 관점에서, 진피 유래 성체 줄기세포의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 진피 유래 성체 줄기 세포의 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 Wnt 신호전달 경로 활성화용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서, "피부 진피 유래 성체 줄기세포"는 피부 진피를 구성하는 섬유아세포로부터 유래된 성체 줄기세포를 의미할 수 있다.

또한, 본 명세서에서, "진피 유래 성체 줄기세포의 배양물"은 진피 유래 성체 줄기세포를 배지에서 배양한 배양물을 의미할 수 있다. 또한, 진피 유래 섬유아세포를 배양하여 수득한 진피 유래 성체 줄기세포의 배양물을 의미할 수 있다. 예컨대, 본 명세서에서, “진피 유래 성체 줄기세포의 배양물”은 진피 유래 섬유아세포를 배양하여 수득한 줄기세포를 세럼없는 DMEM 배지에서 부유배양하여 얻은 것일 수 있다. 또한, 진피 유래 성체 줄기세포의 배양물은 액체 배양물 또는 고체 배양물일 수 있다.

또한, 본 명세서에서, "진피 유래 성체 줄기세포의 배양물의 추출물"은 상기 진피 유래 성체 줄기세포 배양물의 여과액, 원심분리한 후의 상등액 또는 상기 배양물을 초음파 처리하거나 상기 배양물에 용해효소(lypozyme)을 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등을 포함하는 것을 의미할 수 있고, 세포 내 성분을 함유할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 "탈모"는 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 의미할 수 있고, 예컨대 두피의 성모가 빠지는 것을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 “Wnt 신호전달 경로”는 Wnt에 의해 Wnt 수용체가 활성화되고 이에 따라 세포 내에서 순차적인 반응이 일어나는 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 진피 유래 성체 줄기세포는 인간의 진피 유래 성체 줄기세포일 수 있고, 구체적으로 기탁번호 KCTC11995B의 줄기세포일 수 있다. 상기 줄기세포 KCTC11995B는 본 발명의 발명자들이 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 동정 및 수득율을 높이는 방법을 고안하는 과정 중, 이를 바탕으로 완성한 발명이다.본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 상기 배양물은 상기 진피 유래 성체 줄기세포를 i)세럼이 없고, ii) 2 내지 5일간, iii) 1 내지 5%의 CO2 및 iv) 20 내지 40℃의 환경에서 배양한 것인 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 배양물은 Wnt 유전자의 전사체 및 Wnt 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 인간 진피 유래 섬유아세포의 배양물에 비해 증가된 양으로 포함할 수 있다. 상기와 같은 관점에서 상기 배양물은 Wnt 유전자의 전사체 및 Wnt 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 인간 진피 유래 섬유아세포의 배양물에 비해 중량 기준으로 2배 이상으로 포함할 수 있다. 상기와 같은 관점에서, 상기 배양물은 Wnt 유전자의 전사체 및 Wnt 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 인간 진피 유래 섬유아세포의 배양물에 비해 중량 기준으로 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상 또는 9배 이상으로 포함할 수 있다. 아울러 상기와 같은 관점에서 상기 배양물은 Wnt 유전자의 전사체 및 Wnt 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 인간 진피 유래 섬유아세포의 배양물에 비해 중량 기준으로 9.5배 이상으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 Wnt는 Wnt3a인 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 탈모 방지 또는 발모 촉진은 Wnt/베타 카테닌(Wnt/β-catenin) 신호전달 촉진에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, Wnt 단백질에 의해 활성화된 신호 전달이 베타 카테닌으로 이어져 모낭기(hair follicle fate)로 들어서면서, 모낭형성이 이루어질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 배양물은 진피 모유두 세포의 증식 또는 분화를 증진하거나 노화를 억제하는 조성물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "진피 모유두 세포"는 진피 세포층에서 나온 것으로, 모유두 세포의 표면에 수많은 모모 세포로 덮어져 있는 모발 생장에 중요한 역할을 하는 세포를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 "모모 세포"는 모유두 세포 조직 내에 있으면서 모발을 만들어 내는 세포를 의미할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 SOX2(SRY(sex determining region Y)-box 2), S100b(S100 calcium binding protein B), 베르시칸(vercican, VCAN), CORIN, 알칼리성 인산 가수분해 효소(alkaline phosphatase), CTNNB1, 케라틴 세포 생장인자(keratinocyte growth factor, KGF), 노긴(noggin), 골 형태 발생 단백질 수용기 1A(bone morphogenetic protein receptor 1A), 간세포 생장인자(hepatocyte growth factor, HGF), FOXN1(forkhead box protein N1), 신경세포 부착분자(neural cell adhesion molecule, NCAM), 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 줄기세포 인자(stem cell factor, SCF), 섬유아세포 증식인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현 또는 활성을 증진시키는 조성물일 수 있다. 구체적으로, 진피 모유두 세포(Promocell GmbH, Heidelberg, Germany)에 상기 조성물을 처리하여, SOX2, S100b, VCAN, CORIN, CTNNB1, 알칼리성 인산 가수분해 효소(alkaline phosphatase) 등의 발현을 증가시켜 진피 모유두 세포의 모발 생성을 촉진시킬 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 관점에서, 상기 조성물은 Wnt의 발현을 증진시켜, 알칼리성 인산 가수분해 효소 (alkaline phosphatase)의 발현을 증진시킬 수 있으나 이제 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

구체적으로, 화장료 조성물로는 예를 들어, 기초 화장료, 메이크업 화장료, 모발용 화장료, 바디용 화장료 등이 있을 수 있고, 그 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다.

예를 들면, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연화장수, 영양화장수, 로션, 바디로션, 영양 크림, 마사지 크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 젤, 패치, 수중유(O/W)형, 유중수(O/W)형 등의 기초 화장료, 샴푸, 린스, 바디클렌저 등의 세정료, 헤어토닉, 젤 또는 무스 등의 정발제, 양모제 또는 염모제 등의 모발용 화장료 조성물로 제형화 될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 일 실시태양에서, 상기 화장료 조성물에 추가적으로 점증제를 함유할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 점증제는 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 하이드록시 구아닌, 하이드록시 메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄, 세테아릴 알콜, 스테아릭산, 카라기난 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄 중에서 1종 이상을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 카르복시 비닐 폴리머가 될 수 있다.

본 발명의 일 실시태양에서 상기 화장료 조성물은 필요에 따라 적절한 각종의 기제와 첨가제를 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 필요에 따라 허용 가능한 첨가제를 함유할 수 있으며, 예를 들면, 당업계에 통상적인 방부제, 색소, 첨가제 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다.

방부제는 구체적으로 페녹시에탄올(Phenoxyethanol) 또는 1,2-헥산디올 (1,2-Hexanediol) 등이 될 수 있고, 향료는 인공향료 등이 될 수 있다.

그리고, 본 발명의 일 실시태양에서 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.

또한, 본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 측면에서 약학 조성물은 상기 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체, 부형제 및 희석제를 가하여 고체, 반고체 도는 액상의 형태로 경구 또는 비경구 투여제로 제제화 할 수 있다. 상기 경구 투여를 위한 고형제재로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등 일수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 패취, 스프레이, 현탁제 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물오를 들 수 있다.

각 제형에 의한 조성물에 있어서, 상기 본 발명의 조성물 이외의 다른 성분들은 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 조성물이 약학 조성물로 사용될 경우에, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염 또는 완충제 등의 약학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화 할 수 있다.

유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.

일반적으로 유효성분의 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 대략 2000mg/kg/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.5mg/kg/일 내지 2.5mg/kg/일이다. 외용투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 일 관점인 조성물에 있어서, 상기 조성물은 건강식품 조성물일 수 있다.

본 명세서에서 "건강식품"은 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분(기능성원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 건강기능식품은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조, 가공될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 법률에 따라 어떤 형태로든지 제조, 가공될 수 있다.

본 명세서의 일 측면에서 약학 조성물은 상기 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 하여 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 배양물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 그러나 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 일 측면에서 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드 폴리사카라이드, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

일반적으로 건강식품 조성물에 의해 여되는 유효성분량은 0.001mg/kg/일 내지 대략 2000mg/kg/일의 범위일 수 있다. 더 바람직한 투여량은 0.5mg/kg/일 내지 2.5mg/kg/일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.

[ 실시예 1] 제4형 콜라겐를 이용한 피부 섬유아세포에서 RA / SA 세포의 분리

피부 섬유아세포 (Normal human dermal fibroblasts, NHDF)를 론자(Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA, NHDF-Ad-Der Fibroblasts, CC-2511)에서 구입하였다. 상기 피부 섬유아세포를 75 ㎠ T-플라스크에서 계대배양하여, CO2배양기 (CO2Incubator)에서 37℃, 5% CO2조건하에서 배양을 하였다. 75 ㎠ T-플라스크에 피부 섬유아세포를 배양하여 가득차면, trypsin/EDTA로 처리하여 세포를 떼어내어 1:4로 계대배양하는 것을 3차례까지 하고, 이렇게 해당 세포의 양을 충분히 늘려서 RA/SA세포로 분리를 시도하였다.

20 μg/ml의 제4형 콜라겐을 100 mm 배양접시에 5ml씩 넣어주어 4℃에서 24시간 동안 코팅하였다. 인간 진피유래 섬유아세포를 0.25% 트립신(Trypsin/EDTA)으로 100 mm 배양접시로부터 분리한 뒤, 1200rpm에서 원심분리시켜 5분간 세포를 가라앉힌 다음, 상층액을 제거한 뒤에 5ml의 DMEM배지를 넣어주어 세포를 현탁하고, 제4형 콜라겐이 코팅된 배양접시에서 5분간 배양하여 배양접시에 붙은 세포(RA; Rapidly Adhering) 와 초기 5분 내에 배양접시에 붙지는 않지만 4시간 이내에 붙는 세포(SA; Slowly Adhering)로 각각 분리하였고, 상기 RA 세포를 기탁하였다(한국생명공학연구원(KRIBB:Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 내의 KCTC(미생물자원센터:Korean Collection for Type Cultures)에 2011년 8월 8일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC11995BP이다). 상기 RA 세포가 본 발명의 피부 진피 성체 줄기세포이고, 상기 SA 세포가 본 발명의 인간 진피유래 섬유아세포이다.

[ 실시예 2] 분리한 RA / SA 세포로부터 배양액 확보

실시예 1에서 얻은 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포(RA)와 인간 진피 유래 섬유아세포를 분리한 후, 세럼이 없는 DMEM 배지 상태에서 2일간 CO2배양기(CO2Incubator)에서 37℃, 5% CO2조건하에서 부유배양한 후 각각의 배양액을 확보하였다.

[ 실시예 3] 인간 Wnt3a 항체를 이용한 인간 피부 진피 성체 줄기세포의 분석

Wnt3a-ELISA(CUSABIO Biotech, Wuhan, China)를 사용하여, 실시예 2에 따른 세럼이 없는 상태에서의 인간 피부 진피 성체 줄기세포 및 실시예 1의 인간 진피유래 섬유아세포(이하, 음성 대조군이라 한다)의 배양액 성분을 비교하였다. 어레이 멤브레인(Array membrane)을 plate에 상온에서 30분 동안 블로킹 버퍼(blocking buffer)에서 인큐베이션(incubation) 시킨 후, 각각의 세포를 키운 인간 피부 진피 성체 줄기세포 및 음성 대조군의 배양액 (conditioned medium) 1 ml를 상기 plate에 1시간 동안 각각 처리하였다. 상기 plate을 3번 세척한 후, 비오틴-결합된(biotin-conjugated) 항체를 1-2시간 동안 상온에서 처리하고, 기질인 HRP-결합된 스트렙타비딘(HRP-conjugated streptavidin) 2ml을 첨가한 후 2시간 동안 기다렸다. 그 후, 디텍션 버퍼(detection buffer)를 2분 동안 처리하여 microplate reader로 분석하여, 인간 피부 진피 성체 줄기세포의 배양액 성분으로서 Wnt3a를 동정한 결과, 도 1을 얻었다.

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예 1의 인간 피부 진피 성체 줄기세포의 배양액은 인간 진피유래 섬유아세포에 비해 Wnt3a의 발현이 증가하는 것을 알 수 있었다.

[ 실시예 4] 인간 피부 진피 성체 줄기세포의 배양액의 피부 진피 모유두 세포의 표지인자의 발현 회복 효과

음성 대조군 1(control)은 피부 진피 모유두 세포(Promocell GmbH, Heidelberg, Germany)에 어떠한 처리도 하지 않은 군, 음성 대조군 2(non-hDSPC-CM)는 상기 피부 진피 모유두 세포에 실시예 1의 진피 유래 섬유아세포 배양액을 처리한 군, 양성 대조군 1은 상기 피부 진피 모유두 세포에 미녹시딜(minoxidil)을 처리한 군, 양성 대조군 2는 상기 피부 진피 모유두 세포에 발프로익산(valproic acid)을 처리한 군으로 하였고, 실험군은 상기 실시예 2에 따른 피부 진피 모유두 세포에 인간 피부 진피 성체 줄기세포 배양액을 처리한 군으로 하였다.

상기 5개의 군의 세포 각각을 2ml의 PBS로 세척한 후, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kit, QIAGEN, Valencia, CA, USA)로 한번 더 정제한 후, 바이오어낼라이저 2100 모델(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 이후, 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)을 통해 정량적으로 분석하였다.

진피의 세포외 기질 유전자의 발현 패턴 변화를 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용(SOX2는 Hs01053049_s1로, S100b는 Hs00389217_m1로, VCAN은 Hs00171642_m1로, CORIN은 Hs00198141_m1로, CTNNB1은 Hs00355049_m1(Human GAPDH, 43333764F)로 탐지)하여 평가하였으며, 그 결과를 도 2 에 나타내었다.

그 결과, 실험군은 인간 피부 진피 성체 줄기세포 배양액을 처리한 결과, SOX2, S100b, VCAN, CORIN 및 CTNNB1의 발현이 증가되었다(도 2). 이러한 증가는 통계적으로 유의하였으며, 통계는 양측 스튜던트 t 테스트로 검증하였으며, p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 표시하였다.

[ 실시예 5] 알칼리성 인산 가수분해 효소 ( alkaline phosphatase )의 발현 관찰

실험군 및 대조군은 상기 실시예 4와 동일하게 구성하였다. 구체적으로, 음성 대조군 1, 양성 대조군 1, 2 및 실험군은 각각 인간 진피 유래 섬유아세포의 배양액, 미녹시딜, 발프로익산, 인간 진피 성체 줄기세포의 배양액을 48 시간 처리한 후, 배양 배지를 걷어내고 고정 용액을 5분 동안 처리하였다. 한편, 음성 대조군 1은 진피 모유두 세포에 고정 용액을 5분 동안 처리하였다.

이후 각각의 군에서 상기 고정 용액을 제거한 후, 각각의 군에 알칼리성 인산 가수분해 효소 기질(alkaline phosphatase substrate(TAKARA))을 30분간 처리한 후 3차 증류수로 염색된 세포를 씻어주고, 현미경(Phase contrast microscopy)으로 푸른 색으로 염색된 세포를 관찰하였다.

그 결과 (도 3), 음성대조군에 비해 실험군인 인간 피부 진피 성체 줄기세포의 배양액을 처리한 경우, 푸른 색을 띠는 세포의 수가 현저하게 증가되어, 알칼리성 인산 가수분해 효소(alkaline phosphatase)가 증가한 결과를 관찰할 수 있었다.

[ 실시예 6] Wnt 와 알칼리성 인산 가수분해 효소( alkaline phosphatase )의 발현의 상관 관계 분석

항노화와 관련이 있다고 알려진 성장인자(bFGF; basic Fibroblast growth factor, HGF; Hepatocyte growth factor, IGFBP-1/2; Insulin-like growth factor binding protein-1/2, IGF-1; Insulin-like growth factor-1, 및 VEGF; Vascular endothelial growth factor)와 Wnt3의 모발생성능 효능을 비교하기 위해 각각의 성장인자 혹은 단백질을 피부 진피 모유두 세포에 처리하였다. 상기 각각의 성장인자 또는 단백질을 처리한 후, 각각에 고정 용액을 5분간 처리하고 상기 고정 용액을 제거한 후, 각각의 군에 알칼리성 인산 가수분해 효소 기질(alkaline phosphatase substrate(TAKARA))을 30분간 처리한 후 3차 증류수로 염색된 세포를 씻어주고, 현미경(Phase contrast microscopy)으로 푸른 색으로 염색된 세포를 관찰하였다.

그 결과, Wnt3a를 처리한 피부 진피 모유두 세포에서 푸른 색을 띠는 세포의 수가 현저하게 증가되었는바, Wnt3a의 처리에 의해 알칼리성 인산 가수분해 효소 (alkaline phosphatase)가 증가함을 알 수 있었으나, Wnt3a를 제외한 군에서는 푸른 색을 띠는 세포의 수가 증가하지 않아 Wnt3a를 제외한 성장 인자 또는 단백질들은 알칼리성 인산 가수분해 효소(alkaline phosphatase)의 분비와 관련이 없음을 알 수 있었다(도 4).

이하, 본 발명에 따른 조성물의 제형 예를 설명하나, 약학 조성물 및 화장료 조성물은 여러 가지 제형으로 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 샴푸

배합 성분	함량 (중량%)
KCTC11995BP 의 배양액	0.1
암모늄라우레스설페이트	10.0
글라이콜디스테아레이트	2.0
세틸알코올	0.6
코카마이드 MEA	0.5
암모늄라우릴설페이트	6.0
구아 히드록시프로필트리모늄 클로라이드	0.15
폴리쿼터늄-10	0.1
실리콘	0.5
염화디스테아릴디메틸암모늄	0.2
소듐코코암포아세테이트	4.0
향료	1.0
방부제	0.03
구연산	적량
정제수	잔량

[제형예 2] 린스

배합 성분	함량 (중량%)
KCTC11995BP 의 배양액	0.1
세틸알코올	3.0
글리세린모노스테아테이	1.0
하이드록시에틸셀룰로오스	1.0
프로필렌글리콜	4.0
메틸파라하이드록시벤조에이트	0.2
스테아릴디메틸벤질암모니움클로라이드25%	10.0
향료	적량
색소	적량
구연산	적량
정제수	잔량

[제형예 3] 연고

배합 성분	함량 (중량%)
KCTC11995BP 의 배양액	0.1
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
밀납	4.0
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 4] 마사지크림

배합 성분	함량(중량%)
KCTC11995BP 의 배양액	1.5
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	45.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
밀납	4.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
세스퀴 올레인산 소르비탄	0.9
바세린	3.0
파라핀	1.5
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 5] 헤어(hair)팩

배합 성분	함량(중량%)
KCTC11995BP 의 배양액	0.1
글리세린	4.0
폴리비닐알콜	15.0
히알루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
알란토인	0.1
노닐 페닐에테르	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
에탄올 방부제	6.0적량
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 6] 연고

배합 성분	함량(중량%)
KCTC11995BP 의 배양액	0.1
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
밀납	4.0
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 7] 유연화장수(스킨로션)

배합 성분	함량 (중량%)
KCTC11995BP의 배양액	0.1
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
피이지-12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 8] 영양화장수(밀크로션)

배합 성분	함량 (중량%)
KCTC11995BP 의 배양액	0.5
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	5.0
스쿠알란	5.0
솔비타세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제제예 1] 연질캅셀제

KCTC11995BP의 배양액 0.0025g, 홍삼추출물 50 mg, 팜유 2 mg, 팜경화유 8 mg, 황납 4 mg 및 레시틴 6 mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 1 캡슐당 400 mg씩 충진하여 연질캅셀을 제조하였다.

[제제예 2] 정제

KCTC11995BP의 배양액 0.0025g, 포도당 100 mg, 홍삼추출물 50 mg, 전분 96 mg 및 마그네슘 스테아레이트 4 mg을 혼합하고 30% 에탄올을 40 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하고 타정기를 이용하여 정제로 타정하였다.

[제제예 3] 과립제

KCTC11995BP의 배양액 150 mg, 포도당 100 mg, 홍삼추출물 50 mg 및 전분 600 mg을 혼합하고 30% 에탄올을 100 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 다음 포에 충진하였다. 내용물의 최종 중량은 1 g으로 하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC11995BP

20110808

Claims

진피 유래 성체 줄기세포의 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
진피 유래 성체 줄기세포의 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 Wnt 신호전달 경로 활성화용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 진피 유래 성체 줄기세포는, 인간의 진피 유래 성체 줄기세포(human dermal stem/progenitor cells : 이하 hDSPCs)인 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 진피 유래 성체 줄기세포는, 기탁번호 KCTC11995BP의 줄기세포인 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 배양물은,
상기 진피 유래 성체 줄기세포를 하기의 환경에서 배양한 것인 조성물:
i) 세럼이 없고, ii) 2 내지 5일간, iii) 1 내지 5%의 CO₂ 및 iv) 20 내지 40℃.
제 1항에 있어서,
상기 배양물은,
wnt 유전자의 전사체 및 wnt 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 인간 진피 유래 섬유아세포의 배양물에 비해 증가된 양으로 포함하는 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 배양물은,
wnt 유전자의 전사체 및 wnt 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 인간 진피 유래 섬유아세포의 배양물에 비해 중량 기준 2배 이상으로 포함하는 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 배양물은,
wnt 유전자의 전사체 및 wnt 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 인간 진피 유래 섬유아세포의 배양물에 비해 중량 기준 9.5배 이상으로 포함하는 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 wnt는, wnt3a인 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 wnt/베타 카테닌(wnt/β-catenin) 신호전달을 촉진하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은, 진피 모유두 세포의 증식 또는 분화를 증진하거나 노화를 억제하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은,
SOX2(SRY(sex determining region Y)-box 2), S100b(S100 calcium binding protein B), 베르시칸(vercican, VCAN), CORIN, 알칼리성 인산 가수분해 효소(alkaline phosphatase), CTNNB1, 케라틴 세포 생장인자(keratinocyte growth factor, KGF), 노긴(noggin), 골 형태 발생 단백질 수용기 1A(bone morphogenetic protein receptor 1A), 간세포 생장인자(hepatocyte growth factor, HGF), FOXN1(forkhead box protein N1), 신경세포 부착분자(neural cell adhesion molecule, NCAM), 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 줄기세포 인자(stem cell factor, SCF), 섬유아세포 증식인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현 또는 활성을 증진시키는 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 진피 유래 성체 줄기세포는, 인간의 진피 유래 성체 줄기세포(human dermal stem/progenitor cells : 이하 hDSPCs)인 조성물.
제 13항에 있어서,
상기 진피 유래 성체 줄기세포는, 기탁번호 KCTC11995BP의 줄기세포인 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 배양물은,
상기 진피 유래 성체 줄기세포를 하기의 환경에서 배양한 것인 조성물:
i) 세럼이 없고, ii) 2 내지 5일간, iii) 1 내지 5%의 CO₂ 및 iv) 20 내지 40℃.
제 2항에 있어서,
상기 배양물은,
wnt 유전자의 전사체 및 wnt 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 인간 진피 유래 섬유아세포의 배양물에 비해 증가된 양으로 포함하는 조성물.
제 16항에 있어서,
상기 배양물은,
wnt 유전자의 전사체 및 wnt 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 인간 진피 유래 섬유아세포의 배양물에 비해 중량 기준 2배 이상으로 포함하는 조성물.
제 16항에 있어서,
상기 배양물은,
wnt 유전자의 전사체 및 wnt 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 인간 진피 유래 섬유아세포의 배양물에 비해 중량 기준 9.5배 이상으로 포함하는 조성물.
제 16항에 있어서,
상기 wnt는, wnt3a인 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 조성물은 wnt/베타 카테닌(wnt/β-catenin) 신호전달을 촉진하는 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 조성물은, 진피 모유두 세포의 증식 또는 분화를 증진하거나 노화를 억제하는 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 조성물은,
SOX2(SRY(sex determining region Y)-box 2), S100b(S100 calcium binding protein B), 베르시칸(vercican, VCAN), CORIN, 알칼리성 인산 가수분해 효소(alkaline phosphatase), CTNNB1, 케라틴 세포 생장인자(keratinocyte growth factor, KGF), 노긴(noggin), 골 형태 발생 단백질 수용기 1A(bone morphogenetic protein receptor 1A), 간세포 생장인자(hepatocyte growth factor, HGF), FOXN1(forkhead box protein N1), 신경세포 부착분자(neural cell adhesion molecule, NCAM), 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 줄기세포 인자(stem cell factor, SCF), 섬유아세포 증식인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현 또는 활성을 증진시키는 조성물.