JP5382969B2 - アルギナーゼ活性促進剤およびそれを含有する皮膚外用剤 - Google Patents
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Description
しかしながらこれらの保湿成分を用いた手法は皮膚表面においてその物質の物理化学的な保湿の性質を利用しているだけであり、その物質の皮膚細胞におよぼす生理的な機能に基づくものではない。また、多く配合すると不快なべたつきを有することとなり感触が好まれないことがある。さらに、これらの保湿成分は皮膚より除去されると効果は消失するため、その効果は一過性であると言わざるを得ない。そのため、皮膚細胞に働きかけ保湿成分の産生を促す薬剤の開発が望まれていた。
アルギナーゼはアルギニンをオルニチンと尿素に加水分解する尿素サイクル中の酵素であり、脊椎動物の肝臓、腎臓などをはじめ生物界に広く分布している。ヒト皮膚においてもその存在は古くから知られており、表皮細胞の増殖に関連したポリアミン生合成やプロリン生合成のためのオルニチン供給酵素として知られている。
“尿素”は高い保湿能を有するだけでなく、角質溶解剥離作用や角質柔軟化作用を有する皮膚にとって重要な成分であり、昔から化粧料、医薬品等の皮膚外用剤に多く配合されている成分である。しかし、水と反応して分解し易く、分解するとアンモニアと炭酸ガスを生じることから、臭気や安全性に問題を生じ易かった。さらに、尿素を配合した皮膚外用剤は特有の刺激感を有する為、使用部位が限定されるという欠点を有していた。
一方、このアルギナーゼ活性促進剤を使用すると“尿素”の皮膚内生成を高めることにより、これらの問題を解決しながら“尿素”自体の有効性を発揮することが可能であり、さらにはその効果の持続性が期待できることから、非常に有用な手段と考えられる。そのため、より少量でより高い効果を発揮でき、しかも安全性および安定性に優れた高いアルギナーゼ活性促進剤の開発が望まれていた。
すなわち本発明は、
(1)a.呉茱萸(ゴシュユ)の抽出エキスを有効成分として含有するアルギナーゼ活性促進剤である。
呉茱萸エキスの抽出方法としては、炭化水素、エステル、ケトン、エーテル、ハロゲン化炭化水素、アルコールおよび水から選ばれる1種または2種以上の溶媒と共に加熱還流あるいは浸漬して抽出するが、好ましくは水またはエタノール、プロピレングリコール、イソプロピルアルコール、1,3−ブチレングリコールの1種または2種以上の溶媒で抽出したものであり、更に好ましくは水で抽出したものである。なお、本発明の呉茱萸の抽出エキスとは抽出溶液そのもの、もしくはその濃縮物をいう。
本発明でいう乾燥残留物とは通常抽出エキスを105℃で乾燥するかまたは減圧乾固して溶媒を除去した時の残留物である溶質を指すが、抽出溶媒が不揮発性の場合にはガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により溶媒量を定量した値から溶質量を計算値として求め、乾燥残留物量と見なす。
b.成分として好ましいものは、炭素数6〜22のカルボン酸またはその誘導体がcis−9−オクタデセン酸80重量%でありかつcis−9−不飽和脂肪酸85重量%である脂肪酸またはその誘導体であり、更に好ましいものはcis−9−オクタデセン酸85重量%でありかつcis−9−不飽和脂肪酸90重量%である脂肪酸またはその誘導体である。cis−9−不飽和脂肪酸とは脂肪酸組成の骨格にcis−9−の二重結合を含むものである。
脂肪酸組成はガスクロマトグラフィー測定による面積比により求めることとする。
(呉茱萸抽出エキスの調製)
1.水抽出エキス
乾燥後粉砕した30gの呉茱萸に300mlの水を加え70℃で3時間加熱し、その後、濾過により抽出液から不溶物を除去し、得られた濾液を減圧乾固して呉茱萸水抽出エキスを得た。
2.エタノール水溶液による抽出エキス
乾燥後粉砕した30gの呉茱萸に300mlのエタノールを加え、4日放置後濾過した。次に、エタノールで膨潤した呉茱萸に対して300mlの水を加えて70℃で3時間加熱し、その後、濾過により抽出液から不要物を除去し、得られた濾液を減圧乾固して呉茱萸エタノール水溶液抽出エキスを得た。
以下、本法による抽出エキスを水/EtOH抽出エキスと称する。
(木通抽出エキスの調整)
1.水抽出エキス
乾燥後粉砕した30gの木通に300mlの水を加えて70℃で3時間加熱し、その後、濾過により抽出液から不溶液を除去し、得られた濾液を減圧乾固して得られた木通抽出エキスを得た。
マウス表皮細胞(PAM212)を直径10cmの培養皿内に蒔き、培養皿内が細胞で完全に覆われる程度まで培養を継続した(培地:ダルベッコ変性イーグル培地+牛胎児血清10%)。その後、各植物の抽出エキスを培地(培地:ダルベッコ変性イーグル培地+牛胎児血清1%)中濃度が抽出エキス乾燥残留物として0〜0.05重量%となるように添加し、3日間培養した。培養後、その培地と細胞を回収し、培地中のアルギナーゼの反応により生じた尿素量と、細胞中のアルギナーゼ活性量を測定した。各濃度ポイントはすべて5点づつ行った。
細胞中のアルギナーゼ活性量の測定は細胞を1mLの25mMトリス−塩酸緩衝液(pH=7.5)中でホモジナイズしたホモジネートを用いて測定した。ホモジネート0.05mlを1.5mLの栓付きのマイクロチューブに移し取り、0.04mLの0.1M L−アルギニン溶液を添加し37℃にて3時間インキュベートした。インキュベート終了後0.01mLの60%過塩素酸を添加、混和し酵素反応を停止させ10000Gで遠心分離を行い得られた上清の尿素量を培地中の尿素量と同様の方法にて測定し、1時間当たり1マイクロモルの尿素を産生する量をアルギナーゼ1ユニットとした。培地中の尿素量、細胞内のアルギナーゼ活性とも無添加の場合を100として5点の平均値を算出した。結果を表1に示す。
次に動物を使用した試験においても同様の作用を示すかどうかを調べるために、次のような試験を行った。
星野実験動物より購入した6週齢の雄性ヘアレスマウス(各群10匹)を用い0.01%の呉茱萸水抽出エキスを含む50%エタノール溶液200μLを塗布し、その後この塗布を1日2回の頻度で30日間連続して行った。塗布期間終了後、SKICON−200(IBS社製)を用いて皮表角層水分含量を測定した後、マウス皮膚を採取し0.24M塩化アンモニウム(pH=9.4)中に0℃で30分間浸した後、ピンセットを用いて真皮より剥離し表皮のみを採取した。採取した表皮を湿重量の19倍量の生理緩衝食塩水でホモジナイズした後、遠心分離を行い、その上清の尿素量とアルギナーゼ活性量を測定した。
尿素量は和光純薬工業株式会社製の尿素窒素−テストワコーを用い取り扱い説明書通りに使用した。培地0.02mLと発色試液(発色原液Aと発色原液Bを5:1で混合したもの)5mLを混和し沸騰水浴中で25分間加熱後、流水中で冷却し分光光度計を用い530nmの吸光度を測定し、別に求めた尿素の検量線より培地中の尿素量を算出した。
アルギナーゼ活性量の測定は培養細胞のアルギナーゼ活性の測定と同様の方法で行った。
同様に0.01%の呉茱萸水/EtOH抽出エキスを含む50%エタノール溶液の塗布群も試験した。さらに、抽出エキスを含まない50%エタノールのみの塗布群と疑似操作だけ群を比較例として用い、疑似塗布群を100として各群の皮表角層水分含量と表皮ホモジネート中の尿素量とアルギナーゼ活性量をもとめた。結果を表2に示す。
本試験において呉茱萸の抽出エキスを塗布した部位に、たとえば炎症性の過敏反応の発生、例えば紅斑の発生等の副作用は全く見られなかった。そのことから呉茱萸の抽出エキスが副作用を呈さない範囲内で有効にアルギナーゼ活性を促進し、尿素量の産生を増大させて角層水分含量を増大させることが確認された。
表3に示すクリームである皮膚外用剤を調製し、下記の方法により評価を行った。結果を表3に示す。
(1)保湿効果の持続性
20名の女性(21才〜35才)をパネラーとし、洗顔した後に皮膚外用剤を使用し、2時間後の肌のうるおいについて下記のように判定し、20名の平均値を求めて、平均値1.5点以上を保湿効果の持続性の良好な化粧料であると評価した。
2点:使用直後と変わらず肌が十分うるおっていると感じた場合。
1点:使用直後と比べてやや肌のうるおいが足りないと感じた場合。
0点:使用直後と比べて肌のうるおいが足りないと感じた場合。
(2)肌荒れ改善効果
肌荒れを生じた10名の女性(25才〜35才)をパネラーとし、皮膚外用剤を一日2回ずつ連続2週間使用した時の肌の状態について下記のように判定し、10名の平均値を求めて、平均値1.5点以上を肌荒れ改善効果のある化粧料であると評価した。
2点:肌荒れが明らかに治ってきたと感じた場合。
1点:肌荒れがやや治ってきたと感じた場合。
0点:肌荒れ改善効果が全くないと感じた場合。
(3)経時安定性
皮膚外用剤を透明ガラス容器に密封して−5℃、25℃および40℃で3ヶ月間保存したときの状態を調査し、下に示す3段階で評価した。
○:安定性良好(いずれの温度においても外観の変化がなくブツ等も生じない。)
△:安定性やや不良(いずれかの温度において僅かに沈殿を生じるか僅かに分離が見られる。または僅かにブツ、ダマを生じている。)
×:安定性不良(いずれの温度においても明らかに沈殿を生じるか分離する。またはブツやダマを生じる。)
(4)臭気安定性
皮膚外用剤を透明ガラス容器に密封して−5℃、25℃および40℃で3ヶ月間保存したときの臭気変化を調査し、下記に示す3段階で評価を行った。
○:安定性良好(臭気の変化がほとんどない。)
△:安定性やや不良(やや臭気が変化し、若干異臭が発生している。)
×:安定性不良(明らかに臭気が変化し、異臭が発生している。)
注2;NOFABLE EO−85S(日本油脂(株)製)<脂肪酸組成:cis−9−ヘキサデセン酸1重量%、cis−9−オクタデセン酸88重量%、cis−9、cis−12−オクタデセン酸2重量%、ヘキサデカン酸4重量%、オクタデカン酸5重量%>
実施例3〜5より、本発明の皮膚外用剤は肌の保湿効果の持続性および肌荒れ改善効果に優れるとともに安定性にも優れていた。
比較例2では呉茱萸抽出エキスの代わりに木通抽出エキスを配合してことから肌荒れ改善効果、経時安定性および臭気安定性が悪くなっている。
表4に示す化粧水である皮膚外用剤を調製し、評価(1)、(2)および(4)は実施例3〜5の方法により、そして(3)経時安定性については下記の方法により評価を行なった。結果を表4に示す。
(3)経時安定性
化粧水を透明ガラス容器に密封して0℃、25℃および40℃で3ヶ月間保存し、その外観を観察して、下に示す3段階で評価した。
○:安定性良好(いずれの温度でも外観の変化がない。)
△:安定性やや不良(いずれかの温度において若干おり、沈殿を生じるかまたは若干着色を生じる。)
×:安定性不良(いずれかの温度においてもおり、沈殿を生じるかまたは分離する。もしくは着色が著しい。)
注2;NOFABLE EO−85S(日本油脂(株)製)<脂肪酸組成:cis−9−ヘキサデセン酸1重量%、cis−9−オクタデセン酸88重量%、cis−9、cis−12−オクタデセン酸2重量%、ヘキサデカン酸4重量%、オクタデカン酸5重量%>
実施例6〜8より、本発明の皮膚外用剤は肌の保湿効果の持続性および肌荒れ改善効果に優れるとともに安定性にも優れていた。
比較例3では呉茱萸抽出エキスの代わりに木通抽出エキスを配合していることから肌荒れ改善効果と臭気安定性が悪くなっている。
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- a.呉茱萸(ゴシュユ)の抽出エキスを有効成分として含有するアルギナーゼ活性促進剤。
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