CN102549010A - 由人参制备新型糖脂蛋白吉托宁的方法及由该方法制得的新型糖脂蛋白吉托宁 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从人参中分离鉴定并制备新型糖脂蛋白(glycolipopr otein)吉托宁(gintonin)的方法和根据上述方法从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白吉托宁及上述新型糖脂蛋白吉托宁的用途。本发明的新型糖脂蛋白吉托宁暂时地诱发细胞质内游离Ca2+(Free Ca2+)的增加，由于细胞内钙浓度增加，使非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)内在的钙依赖性氯离子通道(CaCC)活化，从而增加细胞内钙浓度，因此不仅能够有效地用于因钙浓度降低导致的疾病的预防及治疗，而且在强壮作用、免疫力增加、性功能强化、神经系统保护及活化、血管的新生、抗糖尿作用等细胞内钙依赖性的各种生理活性等方面也显示出了优异的效果。

Description

由人参制备新型糖脂蛋白吉托宁的方法及由该方法制得的新型糖脂蛋白吉托宁
技术领域
本发明涉及存在于人参中的新型糖脂蛋白(glycolipoprotein)，具体涉及从人参中分离鉴定并制备新型糖脂蛋白的方法和根据上述方法从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白及上述新型糖脂蛋白的用途。
背景技术
人参一般用作调理素(adaptogen)或为了延长寿命的强壮剂，对抗压力、疲劳、疾病、癌症、糖尿病，从而提高生命机能。数百年间，人参不仅在韩国，在中国和日本也一直被使用着。最近，世界范围内消费的草药中，人参就是最有名的草药中之一(泰勒，药物技术杂志，11，214-220，1995(Tyler，J.Pharm.Technol，11，214-220，1995))。
人参皂苷(Ginsenoside)是在1960年代初期分离而被特性化，因此在生理学、药理学方面的研究中作为代表性成分而被广泛利用(柴田，等人，四面体通讯1962，1239-1245，1963；瓦格纳-若雷格和罗斯，药物学报光触媒37，352-357，1962(Shibata，et al.Tetraheadron Letters1962，1239-1245，1963；Wagner-Jauregg and Roth，Pharm Acta Helv37，352-357，1962))。此外，在最近的研究中确认了人参中含有多糖类(polysaccharides)、聚乙炔类(polyacetylenes)、蛋白质(proteins)等未被公开过的其它成分(Nah，Kor.j.GinsengSci.21，1-12，1997))。
人参的人参皂苷成分量少，而且分离过程复杂，由于纯人参皂苷昂贵，因此一直使用根据丁醇提取法从人参根部获得的粗制总皂苷流分(粗制人参总皂苷流分(crude ginseng total saponin fraction)，CGSF)(神崎，等人英国药理学杂志125(2)，255-262，1998；崔，等人英国药理学杂志132，641-648，2001；崔，等人，生物学化学杂志276，48797-48802，2001；崔，等人欧洲药理学杂志468，83-92，2003；李，等人，生物学化学杂志.279，9912-9921，2004；Jeong，等人，英国药理学杂志142，585-593，2004；雷伊，等人，J精神药理学杂志19，357-365，2005；李，等人，主要药物研究杂志28，413-420，2005；魏，等人Ethnopharmacol杂志111，613-618，2007；埃里克森，等人Ethnopharmacol杂志119，17-23，2008(Kanzaki，et al.Br J Pharmacol.125(2)，255-262，1998；Choi，et al.Br J.Pharmacol.132，641-648，2001；Choi，et al.，J.Biol.Chem.276，48797-48802，2001；Choi，et al.Eur J Pharmacol 468，83-92，2003；Lee，et al，J Biol Chem.279，9912-9921，2004；Jeong，et al，Br J Pharmacol.142，585-593，2004；Reay，et al，J Psychopharmacol.19，357-365，2005；Lee，et al，Arch Pharm Res28，413-420，2005；Wei，et al J Ethnopharmacol.111，613-618，2007；Eriksson，et al J Ethnopharmacol.119，17-23，2008))。
已知粗制总皂苷流分(CGSF)通过细胞膜信号通路(signalpathway)显示其活性，例如，崔等人用粗制总皂苷流分处理非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)时，确认了通过连接在PLC β-IP3上的PTX-insentive(诱导)Gαq/11蛋白来使钙激活氯离子通道(Ca2+-activated Chloride Channel，CaCC)被活化(崔，等人，生物学化学杂志276，48797-48802，2001(Choi，et al.，J.Biol.Chem.276，48797-48802，2001))。并且，李等人报道了在非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)中用粗制总皂苷流分持续处理时，由粗制总皂苷流分活化的钙依赖性氯离子通道电流(CaCC电流)自发性地减小(李，等人，生物学化学杂志279，9912-9921，2004(Lee，et al，J BiolChem.279，9912-9921，2004))。
对非洲爪蟾卵母细胞直接注入钙调蛋白(Calmodulin)或使细胞内钙池枯竭时，依靠粗制总皂苷流分的钙激活氯离子通道的活性消失(李，等人，主要药物研究杂志28，413-420，2005(Lee，et al，Arch Pharm Res28，413-420，2005))。并且，已知在非洲爪蟾卵母细胞中用粗制总皂苷处理时，会诱发SOCE(钙池操纵的Ca2+通道进入(stored-operated Ca2+entry))(郑，等人，英国药理学杂志142，585-593，2004(Jeong，et al，Br J Pharmacol.142，585-593，2004))，从细胞外或在细胞内钙池中引起钙浓度增加，由此非洲爪蟾卵母细胞内的CaCC被活化(达斯卡尔，CRC生物化学评论杂志22，317-387，1987(Dascal，CRC Crit Rev Biochem22，317-387，1987))。
本发明人为了对人参皂苷活化CaCC进行确认，在从粗制总皂苷流分物(CGSF)中分离纯的人参皂苷的过程中发现，在较之CGSF，人参皂苷更为丰富的流分物的情况下，上述流分物对于CaCC活性的效果急剧消失或没有了。即，确认为，从CGSF中分离的纯人参皂苷在非洲爪蟾软母细胞中，没有CaCC活性效果，由此可知，CGSF中不仅存在人参皂苷，还有未知的某些物质，可知这些物质对存在于非洲爪蟾卵母细胞内的CaCC的活性有影响。
对此，为了分离CGSF中引起内在的CaCC活性的某些成分，经过深入努力研究的结果，分离鉴定了新的生理活性成分，从而完成了本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明最终的主要目的在于，提供将具有调理活性功能的新型生理活性物质从人参中分离并鉴定出来的方法和由上述方法分离并鉴定的生理活性物质及上述生理活性物质的用途。
解决技术问题的技术手段
为了实现上述目的，本发明提供将人参中存在的新型糖脂蛋白(glycolipoprotein)从人参中分离鉴定出来并制备的方法。
具体地，本发明的由人参制备新型糖脂蛋白吉托宁(以下，称为‘吉托宁(gintonin)’)的方法包括：(1)从人参中制备甲醇提取物的步骤；(2)用水和正丁醇的混合溶剂分离上述甲醇提取物的步骤；(3)使用氯甲烷∶甲醇∶水的混合溶剂作为洗脱溶剂，对上述水流分物和正丁醇流分物中的正丁醇流分物实施硅胶柱层析法，分离成8个流分的步骤；(4)使用乙醇∶乙酸乙酯∶水的混合溶剂作为洗脱溶剂，对上述8个流分物中相对于CaCC(钙激活氯离子通道(Ca2+-activated Chloride Channel))的活性最高的第7流分物实施硅胶柱层析法，分离成2个流分的步骤；及(5)透析上述2个流分物中CaCC活性高的流分物II，获得最终产物的步骤。
此外，在上述步骤的基础上，本发明还可以包括：
(6)将最终流分物溶解于含有NaCl的pH7.2的磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline；PBS)溶液中，实施阴离子交换层析法及凝胶过滤层析法后，分离成2个流分的步骤；及(7)将上述2个流分物分别用含有NaCl的pH8.2的Tris-HCl和含有NaCl的pH7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液实施阴离子交换层析法，分离单独的吉托宁的步骤。
本发明还提供根据上述方法从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白(吉托宁)。
本发明中，上述糖脂蛋白(吉托宁)的特征在于，其分子量约为67kDa，其是表观分子量为13kDa的五聚体(pentarmer)，含有：作为氨基酸组成成分的半胱氨酸和胱氨酸(cysteine and cystine)、天冬酰胺和天冬氨酸(asparagine and aspartic acid)、谷氨酰胺和谷氨酸(glutamine and glutamic acid)、丝氨酸(serine)、甘氨酸(glycine)、精氨酸(arginine)、苏氨酸threonine)、丙氨酸(alanine)、脯氨酸(proline)、缬氨酸(valine)、异亮氨酸(isoleucine)、亮氨酸(leucine)、苯基丙氨酸(phenylalanine)、色氨酸(tryptophan)及赖氨酸(lysine)和；作为碳水化合物组成成分的鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabinose)、葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、木糖(xylose)、氨基葡萄糖(glucosamine)；及作为脂质组成成分的亚油酸(linoleic acid)、棕榈酸(palmitic acid)、油酸(oleic acid)及硬脂酸(stearicacid)等。
人参作为五加科药用植物，根据加工方法有：未加工的水参、将水参干燥了的白参、将水参蒸煮后干燥的红参等；根据栽培方法有：在人参地里人工栽培的栽培参、将人参种子撒在山里自然状态下栽培的长脑参、在自然状态下自然生长的山参等；本发明的人参包括上述所有的人参种类。此外，本发明的人参包括高丽人参(Panax ginsengC.A.Meyer)、西洋参及中国人参等。
下面，详细说明本发明。
通过下述方法可获得本发明的存在于人参中的新型糖脂蛋白吉托宁。
首先，将经过干燥的人参粉用极性溶剂或它们的混合溶剂进行提取；极性溶剂为按照试样重量的约1至20倍，优选约1至10倍量的水、甲醇、乙醇、丁醇等C1至C4的低级醇的极性溶剂；混合溶剂为，混合比约为1∶0.1至1∶10，优选为具有1∶0.2至1∶5的混合比(v/v)的水和甲醇的混合溶剂；提取过程在70至120℃下进行约0.1至48小时，优选为5至12小时；提取方法为搅拌提取、热水提取、冷浸提取、加温提取、回流冷凝提取或超声波提取等提取方法，优选为回流冷凝提取后过滤回收上清液，将上述过程反复进行数次，优选为2至5次，然后收集上清液并进行减压浓缩，然后用水和正丁醇等量混合的混合溶剂进行溶剂分离，从而获得水和正丁醇的流分物。
使用氯甲烷∶甲醇∶水(CHCl3∶MeOH∶H2O)的混合溶剂作为洗脱溶剂，对上述流分物中相当于粗制总皂苷流分(CGSF)的正丁醇流分物实施硅胶柱层析法，分离成8个流分后，对分离了的流分物实施非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)中的钙依赖性氯离子通道(CaCC)活性确认实验，检索流分物的活性，然后对活性最高的流分再使用乙醇∶乙酸乙酯∶水(EtOH∶EtOAc∶H2O)的混合溶剂，实施硅胶柱层析法，分离成2个流分，然后利用过量的蒸馏水和透析膜(dialysismembrane)对其中活性高的流分进行透析，从而能够获得本发明的粗制吉托宁。
这样获得的粗制吉托宁可通过根据电泳(SDS-PAGE)的分子量分析、蛋白质及氨基酸组成分析、碳水化合物组成分析、根据GC-MS的脂质组成分析等进行确认。
此外，本发明的单独的吉托宁可通过下述方法获得：将由上述工序获得的粗制吉托宁溶于含有NaCl的磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline；PBS)中实施阴离子交换层析法及凝胶过滤层析法，从而获得2个吉托宁流分物，将各个吉托宁流分物分别用含有NaCl的Tris-HCl(pH8.2)和含有NaCl的PBS(pH7.2)实施阴离子交换层析法而获得。
本发明中为了制备吉托宁可以使用山参、长脑参、栽培参、西洋参及中国人参等人参，可利用上述人参的水参、白参、红参等形态，优选用4至6年根的高丽人参(Panax ginseng C.A.Meyer)制备的红参，但不限于此。
本发明还提供将糖脂蛋白(吉托宁)用作因钙浓度降低引起的疾病的预防及治疗剂。
具体地，本发明提供含有上述方法制备的糖脂蛋白吉托宁作为有效成分的药物组合物，其用于预防及治疗因钙浓度降低引起的疾病。
本发明的上述吉托宁暂时诱发细胞质内游离Ca2+(Free Ca2+)的增加，由于细胞内钙浓度暂时增加，使得非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)内在的钙依赖性氯离子通道(CaCC)活化，从而增加细胞内钙浓度，其结果为在因钙浓度降低引起的疾病的预防及治疗方面显示出优异的效果，特别是通过改善因钙浓度降低引起的神经系统疾病的异常，而进行治疗及预防。
因钙浓度降低引起的神经系统疾病包括：精神分裂(Schizophrenia)、阿尔兹海默症(Alzheimer′s Disease)、亨廷顿病(Hungtington′s Disease)、遗传性偏瘫型偏头痛(Familial hemiplegic migraine)、癫痫(Eilepsy)、发作性共济失调(episodic ataxia)、脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxias)等，但不限于这些疾病。
此外，本发明的组合物对因钙不足引起的成长阻碍等也有效果，例如在强壮作用、免疫力增加、性功能强化、神经系统保护及活性、血管的新生、抗糖尿作用等细胞内钙依赖性的各种生理活性方面也显示出了效果。
此外，由于人参长期被用作生药，因此从人参中分离出的本发明的吉托宁同样完全没有毒性及副作用等问题。
本发明的用于因钙浓度降低引起的疾病的预防及治疗的药物组合物中，相对于组合物总重量，含有0.0001至10重量％的上述吉托宁，优选0.001至1重量％。
此外，含有本发明的吉托宁的组合物还可以包括在药物组合物的制备中通常使用的适当的载体、赋形剂及稀释剂，本发明的吉托宁的药学给药方式可以为单独给药或与其它药理活化合物结合使用，不仅如此还可以适当地组合使用。
本发明的含有吉托宁的组合物分别可通过常用的方法制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液剂、糖浆剂、悬浮颗粒(aerosol)等经口型剂型或剂型化成外用剂、栓剂及灭菌注射溶液的形态进行使用。上述组合物中可以含有的载体、赋形剂及稀释剂例如有：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等。在制成制剂时，使用一般使用的填充剂、增量剂、结合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂进行制备。经口给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这样的固体制剂在上述吉托宁或流分物中至少混合一种以上的赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等而制得。此外，除了单纯的赋形剂之外也使用硬脂酸镁、滑石等润滑剂。经口给药的液状制剂相当于悬浮剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除了通常使用的作为单纯稀释剂的水、液体石蜡之外，还可以含有各种赋形剂，例如有湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。非经口给药的制剂包括灭菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥制剂、栓剂。非水性溶剂、悬浮剂可以使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物性油，油酸乙酯等可以注射的酯等，栓剂的基质可以使用脂肪酸甘油三酯(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温(tween)61、可可脂、水石梓(laurinum)、甘油明胶等。
本发明组合物的优选给药量根据患者的状态及体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及时间有所不同，但本领域技术人员可适当地选择。但是为了获得好的效果，本发明的组合物优选1日给药0.0001至100mg/kg。可以1天给药一次，也可以分几次给药。上述给药量从任何方面都不能限制本发明的范围。
本发明的药物组合物可对大鼠、小鼠、家畜、人等哺乳动物以各种方式进行给药。可预想到所有的给药方式，例如可以通过经口、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内硬膜或脑血管内(intracerebroventricular)注射进行给药。
本发明的含有吉托宁的组合物可以以上述剂型的方式被用于预防及治疗因钙浓度降低引起的疾病的药剂、食品及饮料等多方面。可添加上述吉托宁的食品例如有，各种食品类、饮料、口香糖、茶、维生素复合剂、健康功能性食品类等。
本发明的吉托宁几乎没有毒性及副作用，因此可以以预防为目的长期放心使用。
本发明的吉托宁可以以预防因钙浓度降低引起的疾病为目的，加入到食品或饮料中，此时，上述吉托宁加入到食品或饮料中的量可以占食品重量的0.01至15重量％，健康饮料组合物以100ml为基准加入0.02至5g，优选可以以0.3至1g的比例添加。
本发明的健康功能性饮料组合物除了按规定比例含有吉托宁作为必要成分外，对于其他成分没有特别的限制，通常用的饮料一样还可以加入各种增香剂或天然碳水化合物等。此时，上述天然碳水化合物例如有葡萄糖、果糖等单糖；麦芽糖、蔗糖等多糖；及糊精、环糊精等多聚糖等通常的糖以及木糖醇、山梨醇、赤藓糖醇等糖醇等。此外，作为调味剂可以有利地使用天然增香剂(奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物，例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等)及合成增香剂(糖精、阿斯巴甜等)。上述天然碳水化合物的添加比例为：在每100ml本发明组合物中一般加入1至20g，优选约为5至12g。
除了上述之外，本发明的提取物还可以含有各种营养剂、维生素、矿物质(电解质)、合成增味剂及天然增味剂等增味剂、着色剂及增强剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶质增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。除此之外，本发明的提取物还可以含有用于制备天然果汁、果汁饮料及蔬菜饮料的果肉，这样的成分可以独自或组合使用。此外，上述添加剂的比例不是那么重要，但是对于每100重量份的本发明提取物，一般在0至20重量份的范围内选择。
发明的效果
本发明具有如下效果，本发明提供对存在于人参中的新型糖脂蛋白吉托宁进行分离鉴定并制备的方法，以及由上述方法制备的新型糖脂蛋白吉托宁，以及上述新型糖脂蛋白吉托宁作为预防及治疗因钙浓度降低引起的疾病药物的用途。
本发明的吉托宁暂时地诱发细胞质内游离Ca2+(Free Ca2+)的增加，由于细胞内钙浓度暂时增加，使得非洲爪蟾卵母细胞(Xenopusoocytes)内在的钙依赖性氯离子通道(CaCC)活化，从而增加细胞内钙浓度，因此能够有效地用于因钙浓度降低导致的疾病的预防及治疗。
此外，本发明的吉托宁在强壮作用、免疫力增加、性功能强化、神经系统保护及活性、血管的新生、抗糖尿作用等细胞内钙依赖性的各种生理活性等方面也显示出了优异的效果。
附图说明
图1的A为从人参中分离并鉴定新型糖脂蛋白吉托宁的方法的示意图，图1的B为在含有吉托宁流分物的非洲爪蟾卵母细胞中确认了CaCC活性的层析谱图，图1的C为粗制吉托宁的SDS-PAGE结果。
图2为示出了从粗制吉托宁中分离鉴定单独的吉托宁的方法的图。
图3为单独的吉托宁的阴离子交换及凝胶层析谱图，A为从粗制吉托宁中分离的吉托宁E和吉托宁L流分的阴离子交换层析谱图，B为从上述(A)中获得的吉托宁L流分的凝胶过滤层析谱图，C为吉托宁E流分的阴离子交换层析谱图，D为吉托宁L流分的阴离子交换层析谱图。
图4示出了根据凝胶或连续阴离子交换层析法的单独的吉托宁的洗脱形式，A和C为纯化的吉托宁E1～E3及吉托宁L1～L3的凝胶过滤层析谱图，B和D为纯化的吉托宁E1～E3及吉托宁L1～L3的阴离子交换层析谱图。
图5为通过凝胶过滤层析法确定吉托宁分子量的校正曲线，各个点为使用的标准蛋白质(IgG：160kDa；BSA：67kDa；β-乳球蛋白：35kDa；细胞色素C：12kDa；抑肽酶：6.5kDa)，箭头为吉托宁。
图6的A为单独的吉托宁的SDS-PAGE，B为上述单独的吉托宁的碳水化合物成分的凝胶染色SDS-PAGE结果。
图7为根据HPAED-PAD层析谱图对单独的吉托宁的碳水化合物成分分析的结果，A为中性糖(Neutral sugar)的成分分析(标准物质：1.L-果糖；2.L-鼠李糖；3.D-阿拉伯糖；4.D-半乳糖；5.D-葡萄糖；6.D-甘露糖；7.D-木糖)，B为氨基糖(Amino sugar)的成分分析(标准物质：1.D-半乳糖胺；2.D-葡萄糖胺)。
图8为单独的吉托宁E1～E3及L1～L3的脂质成分的GC-MS光谱分析结果。
图9示出了处理吉托宁时，在小鼠EAT细胞中的内在的内向性CaCC电流的流动，A示出了在-80mV支持电位下的吉托宁和人参皂苷的电流流动，B和C分别示出了粗制吉托宁和浓度不同的单独的吉托宁的电流流动。
图10为确认了在处理吉托宁时小鼠EAT细胞中细胞内钙的增加的图表，A确认了在Ca2+缓冲液中培养的混合于Fura-2的EAT细胞中的细胞内的钙随时间增加，B确认了在Ca2+缓冲液或Ca2+游离缓冲液中培养的混合在Fura-2的EAT细胞中的细胞内的钙随吉托宁浓度增加。
图11示出了根据吉托宁的CaCC活性以及小鼠EAT细胞中与对细胞内钙增加有关的PLC抑制剂、IP3受体拮抗剂及Ca2+螯合剂的效果，A为确认了CaCC活性根据PLC抑制剂(U-73343/U-73122)而减少了的电流流动柱状图，B和C分别为确认了CaCC活性根据IP3受体拮抗剂(2-APB)及Ca2+螯合剂(BAPTA-AM)而减少了的电流流动柱状图。
图12为在小鼠EAT细胞中，因吉托宁而增加的细胞内钙浓度所相关的活性型或非活性型PLC抑制剂的效果，A为确认了在Ca2+缓冲液中培养的混合在Fura-2的EAT细胞中，细胞内钙的增加被抑制的图表，B为确认了在Ca2+游离缓冲液中培养的混合于Fura-2的EAT细胞中，根据吉托宁的浓度的不同，细胞内钙的增加被抑制的图表。
具体实施方式
下面，通过实施例更加详细地说明本发明。这些实施例仅是为了例示本发明，本发明的范围不受这些实施例的限制，没有做出解释的部分是本领域技术人员显而易见的。
实施例1 从人参中分离粗制吉托宁(crude gintonin)
将购自韩国人参公社(大田，韩国)的20kg的6年根红参(Panax ginseng C.A.Meyer)粉碎成细粉(＞3mm)，加入30L的80％甲醇，在80℃下回流冷凝提取8小时，然后真空过滤回收上清液。重复3次该过程，收集上清液后进行减压浓缩(总共获得6.2kg的甲醇提取物)，用水和正丁醇的混合溶剂(1∶1)进行溶剂分离，从而获得水和正丁醇的流分物。(总共获得908g正丁醇流分物)。
浓缩上述正丁醇流分物(粗制总皂苷流分，CGSF)，使用氯甲烷∶甲醇∶水(CHCl3∶MeOH∶H2O＝13∶7∶2)的混合溶剂洗脱，实施硅胶柱层析法，分离成8个流分后，对各个流分物实施非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)内在的钙依赖性氯离子通道(Ca2+-activatedChloride Channel；CaCC)的活性实验，对显示出CaCC活性最高的第7流分(参照图1的B)再使用乙酸乙酯∶乙醇∶水(EtOAc∶EtOH∶H2O＝1∶3∶0.5)的混合溶剂洗脱，实施硅胶柱层析法，获得2个流分。
然后利用过量的蒸馏水(distilled water，DW)和Spectra/Por透析膜(分子量减少6,000～8,000)(光谱实验室，公司.，加利福尼亚，USA(Spectrum Laboratories，Inc.，Califoinia，USA))对上述2个流分物中的在EAT(埃利希腹水瘤，Ehrlich Ascites Tumor)细胞中的细胞内钙释放实验评价和在非洲爪蟾卵母细胞中显示出强的CaCC活性的流分物II在4℃下实施透析8小时，然后去除人参皂苷及其它低分子物质，最终获得流分物。
对上述获得的流分物实施电泳(SDS-PAGE)的结果，染成考马斯亮蓝，确认了其表观(apparent)分子量约为13kDa。这暗示了在EAT细胞中的细胞内钙释放实验评价和在非洲爪蟾卵母细胞中引起CaCC活性的新型物质为一种并非人参皂苷的蛋白质，将上述蛋白质命名为吉托宁(gintonins)，将由此获得的最终流分物称为粗制吉托宁(crude gintonis)。
但是含有人参的蛋白质或多糖类的水流分物和含有脂质(lipid)成分的石油醚流分物，在EAT细胞中的细胞内钙释放实验和非洲爪蟾卵母细胞中完全没有CaCC活性效果(未图示)。
实施例2.分离单独的吉托宁(gintonin)
为了从粗制吉托宁(crude gintonin)中分离出单独的吉托宁(gintonins)，将上述实施例1中获得的粗制吉托宁溶解于磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline，PBS)(pH7.2)中，实施装有DEAE琼脂糖CL-6B柱的阴离子交换树脂层析法(GE医疗保健，乌普萨拉，瑞典(GE Healthcare，Uppsala，Sweden))，获得2个主要的峰(major peak)。此时，溶剂使用溶解有0至2M的NaCl的PBS，以1ml/分钟的流速在280nm处边监测边采用线性梯度(linear gradient)方式进行分离，获得2个峰，将上述2个峰分别命名为吉托宁E(初期的洗脱吉托宁(early eluted gintonin))和吉托宁L(后期的洗脱吉托宁(late eluted gintonin))。
用CentriVap DNA真空浓缩仪(Labconco，密苏里(Missouri)，USA)浓缩上述吉托宁E和吉托宁L流分物，然后将PBS(pH7.2)作为洗脱液，利用休珀代克斯(Superdex)75凝胶过滤柱以0.5ml/分钟的流速在280nm处边监测边实施层析法，获得分子量大的主峰(major peak)和副峰(minor peak)(参照图3的B)。
在确认了这样获得的吉托宁E和L在非洲爪蟾卵母细胞中显示CaCC活性后，再使用20mM的Tris-HCl(pH8.2)，其含有100、150、200、250mM的NaCl，以不连续梯度(step gradient)DEAE阴离子交换柱(anion exchange columm；HiTrapTM DEAE FF，1ml)，并以1ml/分钟的流速进行装载，从而获得4个峰(参照图3的C)。其中，对100、150及200nM的NaCl洗脱液的流分物进行大量透析(extensivedialysis)和浓缩，然后再使用20mM的Tris-HCl(pH8.2)，其含有0至1M的NaCl，实施不连续梯度DEAE阴离子交换柱，最后实施休珀代克斯75凝胶过滤层析法，分别获得3.7、26.7及13.5mg的最终流分物，将它们分别命名为吉托宁E1、E2及E3。
此外，对于吉托宁L流分，采用同上述相同的方法，使用含有150、200、250、300、400mM的NaCl的PBS(pH7.2)获得5个峰(参照图3的D)。对于上述5个峰中的150、200及250mM的NaCl洗脱液的流分物，分别获得7.4、17.6及6.6mg的最终流分物，分别将它们命名为吉托宁L1、L2及L3。
此外，由908g粗制总皂苷流分(CGSF)获得它们的收率分别如下：吉托宁E1为0.0004％(3.7mg)、吉托宁E2为0.0029％(26.7mg)、吉托宁E3为0.0015％(13.5mg)、吉托宁L1为0.0008％(7.4mg)、吉托宁L2为0.0019％(17.6mg)及吉托宁L3为0.007％(6.6mg)。
实施例3.确定吉托宁的分子量
以山本等的方法(山本，Y.，布目，T.，雅谋之，R.，加藤，K.，和宋，Y.(1995)碳水化合物研究杂志275，319-332(Yamamoto，Y.，Nunome，T.，Yamauchi，R.，Kato，K.，and Sone，Y.(1995)Carbohydr Res.275，319-332))为准，对上述方法获得的各自不同的6个吉托宁实施凝胶过滤层析法来确定它们的分子量，使用装有用PBS(pH7.2)维持了平衡的休珀代克斯(Superdex)75柱(10×300mm)的生物DuoFlowTM层析法系统(BioLogic DuoFlowTM Chromatograpgy；BIO-RAD，加利福尼亚洲，USA))，在280nm处边监测边以0.5ml/分钟的的流速收集流分物之后，利用由免疫球蛋白G(IgG；160,000Da)、牛血清白蛋白(BSA；67,000Da)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin；35,000Da)、细胞色素C(cytochrome C；12,327Da)及抑肽酶(aprotinin；6,512Da)等标准蛋白质组成的校正曲线(calibration curve)确定分子量。
其结果为，吉托宁所带的电荷不同，因此随NaCl梯度的洗脱，显示出不同的洗脱形式，在凝胶过滤层析法中几乎同时洗脱，且分子量几乎相同(参照图4的B及D)。
此外，利用标准蛋白质确定吉托宁L2的天然(native)分子量仍然是约67kDa(参照图5)，其它吉托宁的分子量也确认是约67kDa(未图示)。
此外，SDS-PAGE的结果，6个吉托宁虽然宽(broad)，但是显示出了单一的主带(single major band)，已确认其表观分子量(apparent molecular weight)约为13kDa。
上述结果暗示了本发明的吉托宁为五聚体(pentamer)(参照图6的A)。
实施例4.确定吉托宁的纯度
此外，为了确定上述粗制吉托宁及单独的吉托宁的纯度，使用了12.0％的分离凝胶(separating gel)实施了电泳(SDS-PAGE)(蛋白分离，U.K.(1970)自然227，680-685(Laemmli，U.K.(1970)Nature227，680-685))。
具体地，分别取100μg的粗制吉托宁和单独的吉托宁E1～E3，L1～L3，加载到各个泳道(lane)上实施电泳后，将吉托宁条带进行考马斯亮蓝R-250染色，使其可见。此外，为了检测出糖蛋白(glycoprotein)将凝胶采用PAS染色(过碘酸-雪夫染色(periodicacid-schiff based staining))法染色，在40％的乙醇-7％醋酸水溶液中培养30分钟，然后在1％过碘酸-3％醋酸中培养1小时，然后去除过碘酸添加雪夫(Schiff)试剂培养1小时。被染色的糖蛋白条带呈粉红色，用7.5％的醋酸将PAS染色的凝胶进行浸湿(soaking)后保存。
实施例5.分析吉托宁的氨基酸组成
为了分析基本氨基酸(general amino acid)，将30μg的吉托宁在真空下(in vacuo)用6N的HCl于110℃水解24小时。此外，为了分析半胱氨酸(cysteine)，使吉托宁进行过氧化反应(peroxidation)，然后用6N的HCl于110℃下水解24小时，然后用甲酸∶过氧化氢(10∶1)溶液进行处理，为了分析色氨酸(trypophan)，将试样用4M的甲磺酸(methanesulfonic acid)溶液处理进行水解，然后加入4M的KOH。
此外，委托大田的韩国基础科学支援研究院，使用装有沃特世Nova-PakC18柱(Waters Nova-Pak C18 column；3.9×300mm)的HPLC(休利特帕卡德1100系列(Hewlett Packard 1100 series))，对隐藏在异硫氰酸苯酯(Phenylisothiocyanate，PITOC)衍生物中的氨基酸进行分析。
按照标准采用使用了牛血清白蛋白(BSA)的布拉德福德法(布拉德福德，M，M.(1976)分析生物化学杂志72，248-254(Bradford，M.M.(1976).Anal.Biochem.72，248-254))确定了蛋白质成分。
实施例6.吉托宁的部分氨基酸序列
吉托宁的N-末端氨基酸序列使用自动化埃德曼分解应用生物系统模型477A气象蛋白序列(automated Edman degration on an Applied Biosystem model 477A gas-phase protein sequence)及密里根6600固相序列(MilliGen 6600solid-phase sequence)来实施。
使用12％的分离凝胶对100μg的吉托宁实施SDS-PAGE，蛋白条带用考马斯亮蓝R-250进行染色，使其可见。切断上述条带，从胰蛋白酶(trypsin)中蒸解(digesting)出来，将上述蒸解产品(digestion product)进行脱盐(desalt)及浓缩。
这样诱导出的所有肽的MS/MS在韩国基础科学支援研究所中使用装有纳米-ESI的质谱仪(Mass spectrometer；QTOF II，Micromass，UK)来实施。此时，使用反射器(reflector)、微通道板检测器(microchannel plate detector)及固定有时间-数字转换器(time-to-digital converter)的直角TOF分析器(orthogonal TOFanalyzer)对产生的离子(product ion)进行分析。，在WindowsNT环境下，使用能够驱动Mass Lynx软件的电脑对数据进行处理，使用BLAST(www.ncbi.nln.nih.gov/BLAST.cgi)对序列同族体进行了检索。
表1显示出了吉托宁重新合成(de novo)氨基酸序列和组成，已确认纯分离的吉托宁是由经自动埃德曼降解的N-末端氨基酸序列组成。但是，吉托宁的N-末端阻塞(blocking)，不能够获得全部序列，因此采用MALDI-TOF-MS/MS，由使用胰蛋白酶处理的吉托宁推定出18个内部肽序列(internal peptide sequence)的结果为：6个单独的吉托宁一般含有几个肽，氨基酸序列与人类葡糖激酶(humanglucokinase)及葡糖激酶同工酶2(glucokinase isoform 2)显示出了部分的相同性(未图示)。
此外，根据Braford法(考马斯亮蓝法)测定的吉托宁总蛋白质的含量在E1、E2、E3、L1、L2及L3中分别显示为9.4、24.1、20.5、35.8、37.1及39.6％。吉托宁L1～L3的蛋白质含量比吉托宁E1约高3倍。
此外，吉托宁中的疏水性氨基酸(hydrophobic amino acid)比亲水性氨基酸(hydrophilic amino acid)更多，未检测出组氨酸(His)和酪氨酸(Tyr)及蛋氨酸(Met)。其中认为未检测出蛋氨酸是因为吉托宁的N-末端阻塞。
此外，E1～E3及L1～L3中共同地显示出苯丙氨酸(Phe)的含量最高。此外，显示出吉托宁L1～L3中的赖氨酸(Lys)比E1～E3要高(参照表1)。
表1 本发明吉托宁的氨基酸组成(％)
Figure BDA0000137432480000181
实施例7.分析吉托宁的碳水化合物组成
如图6的A所示，SDS-PAGE中吉托宁的条带是单一(single)的，但宽(broad)，没有被考马斯亮蓝染成很深的颜色，因此有可能含有碳水化合物。
因此，为了确认吉托宁的碳水化合物组成，用2M的三氟醋酸(trifluoroacetic acid)在100℃下水解4小时，然后获得中性糖(neutralsugar)，并且将吉托宁在玻璃安瓿(ampule)中用6N的HCl在100℃下水解4小时，获得氨基糖(amino sugar)和酸性糖(acid sugar)。
委托位于首尔的世宗大学碳水化合物材料研究所，采用PAS染色(过碘酸-雪夫染色(periodic acid-schiff based staining))法进行染色后，使用装有CarboPacTMPA1柱的HPAEC-PAD系统(高效阴离子交换色谱法-脉冲安培检测系统((high performance anion exchangechromatography-plused amphermetric dectection system)；离子色谱仪(Dionex)，加利福尼亚，USA)，对吉托宁的碳水化合物组成进行分析。单糖类的摩尔重量(molar weight)由峰的面积(peak area)计算，中性糖的情况下，用苯酚-磺酸法(亨赛尔，E.F.，戴维斯，M.J.，和史密斯，K.D.(1997)蛋白质实验指南手册，胡玛纳出版社，Totawa，803-804(Hounsell，E.F.，Davies，M.J.，and Smith，K.D.(1997)Proteinprotocol handbood，Humanna press，Totawa，803-804))确定碳水化合物的含量，对于酸性糖，则使用蒽酮(Anthrone)法确定碳水化合物的含量(斯科特，T.A.，和梅尔文，E.H.(1953)分析生物化学.25，1656-1660(Scott，T.A.，and Melvin，E.H.(1953)Anal.Biochem.25，1656-1660))。
其结果，确认了吉托宁由鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabinose)、葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、木糖(xylose)等5个其它种类的中性糖(neutral sugar)和葡萄糖胺(glucosamine)等1个氨基糖(amino sugar)构成，6个吉托宁相互具有几乎类似的碳水化合物组成(参照表2及表7)。但在吉托宁E1～E3中未检测出甘露糖。
此外，未检测出1-N-乙酰基-神经氨酸(1-N-acetyl-neuramic acid)、2-半乳糖醛酸(2-galactouronic acid)、3-葡萄糖醛酸(3-glucouronicacid)等酸性糖(未图示)。
最后，吉托宁的总碳水化合物含量在吉托宁E1、E2、E3、L1、L2及L3分别显示为约34.3、45.3、38.1、36.0、29.8及45.2％。由上述结果可以再次确认本发明的吉托宁为糖蛋白质。
表2 本发明吉托宁的碳水化合物组成(％)
  碳水化合物   E1   E2   E3   L1   L2   L3
  鼠李糖   0.86   1.02   0.91   1.11   0.93   1.09
  阿拉伯糖   5.66   5.10   5.66   9.11   8.32   7.36
  葡萄糖   84.84   84.41   83.97   77.16   74.64   71.59
  甘露糖   -   -   -   1.76   2.30   3.37
  木糖   1.12   0.94   0.95   2.73   2.55   2.50
  葡萄糖胺   7.52   8.53   8.51   8.13   11.26   14.09
实施例8.分析吉托宁的脂质成分
由于本发明的吉托宁通过提取正丁醇得到人参皂苷等流分，因此可预测吉托宁也含有脂质成分(lipid moiety)。
为了确认这一点，用6N的HCl将吉托宁在100℃下水解4小时，或吸收到脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase)中，从而确认了脂质(lipid)及疏水部分(hydrophobic moiety)。
具体地，将粗制总皂苷流分(CGFS)进行酸解或吸收得到的物质进行浓缩，再用水和正已酸进行分离后，用装有DB5-MS毛细管柱(capillary column；30cm×250μm×0.25μm)的安捷伦6890N GC-MS系统(加利福尼亚，USA)在韩国基础科学支援研究所中对正丁醇流分物的脂质(lipid)及疏水性成分(hydrophobic moiety)进行了分析。此时，GC(6890N)装有火焰离子化检测器(flame ionization detector)和分离注入系统(split injection system)，并固定了supelco SPB-1毛细管柱(内径：15m×0.32mm；厚度：0.25m)。
结果如表3和图8所示，已确认吉托宁含有酯型(ester form)或自由型(free form)的软脂酸(palmitic acid)、硬脂酸(stearic acid)、油酸(oleic acid)、亚油酸(linoleic acid)等。
此外，在吉托宁E1或L1中，作为多元不饱和脂肪酸的亚油酸的比例高于作为饱和脂肪酸的软脂酸、硬脂酸或油酸，在吉托宁E2、E3、L1、L2中含有大量的软脂酸。
此外，根据GC测定的吉托宁中含有的总脂质含量在吉托宁E1、E2、E3、L1、L2及L3分别显示为约34.3、45.3、38.1、36.0、29.8及45.2％。其中吉托宁E1的脂质含量最高。
上述结果暗示本发明的吉托宁为新型糖脂蛋白(glycolipoprotein)。
表3 本发明吉托宁的脂质组成(％)
  脂质   E1   E2   E3   L1   L2   L3
  软脂酸(16:0)，酯型   29.82   57.39   56.59   36.48   41.78   39.5
  硬脂酸(18:0)，酯型   4.22   8.73   8.20   4.74   5.49   5.44
  油酸(18:1)，或油酸酯型   7.08   26.06   27.52   14.32   30.04   26.64
  亚油酸(18:2)或亚油酸酯型   58.88   7.82   7.69   44.46   22.69   28.42
测定例1.测定非洲爪蛙卵母细胞(Xenopus laevis oocytes)中CaCC活性
1-(1)准备卵母细胞
将由Xenopus(非洲爪蟾属)I(Ann Arbor，MI，USA(安娜堡，MI，USA))中获得的非洲爪蛙(Xenopus laevis)按照最好的规格标准进行保管及处理，为了分离卵母细胞(卵子)，将蛙用3-氨基苯甲酸乙酯(3-amino benzoic acid ethyl ester)的充气溶液(aerated solution)进行麻醉手术后，用胶原酶(collagenase)进行处理，然后在含有82.5mM的NaCl、2mM的KCl、1mM的MgCl2、5mM的HEPES、2.5mM的丙酮酸钠(sodium pyruvate)、100单位/ml青霉素及100μg/ml链霉素的Ca2+游离培养基中搅拌2小时并进行分离。
收集V-VI阶段的卵子，在进一步加入了50μg/ml庆大霉素(gentamicin)的ND96(96mM NaCl、2mM的KCl、1mM的MgCl2、1.8mM的CaCl2及5mM的HEPES；pH7.4)中保存，将上述含有卵子的溶液连续轻轻地振荡，维持在18℃，每天进行更换。
1-(2)CaCC的测定
由放在小型树脂玻璃(plexiglass)网室(net chamber)(0.5ml)中的个别卵子中获得2-电极电压钳(two-electrode voltage clamp)记录，使用装满3M KCl的微电极(电阻：0.2～0.7MΩ)和卵子箝位放大器(Oocyte Clamp amplifier；OC-725C，华纳仪器，CT，USA)在室温下进行电生理学实验(electrophysiological experiments)，然后在-80mV的支持电位(holding potential)下记录CaCC。
吉托宁根据浴灌注(bath perfusion)应用于卵子中(李，J.H.，Jeong，S.M.，李，B.H.，Noh，H.S.，金，B.K.，金，J.I.，Rhim，H.，金，H.C.，金，K.M.，和Nah，S.Y.(2004)化学杂志279，9912-9921(Lee，J.H.，Jeong，S.M.，Lee，B.H.，Noh，H.S.，Kim，B.K.，Kim，J.I.，Rhim，H.，Kim，H.C.，Kim，K.M.，and Nah，S.Y.(2004)J Biol Chem279，9912-9921))。
测定例2.小鼠EAT细胞中细胞内游离钙([Ca2+]i)的测定
2-(1).EAT(埃利希腹水瘤(Ehrlich Ascites Tumor))细胞的准备
EAT细胞根据
Figure BDA0000137432480000221
等人的方法(
Figure BDA0000137432480000222
N.K.，彼得森，S.F.，霍夫曼，E.K.(1999)美国生理学杂志276.C26？？C37(
Figure BDA0000137432480000224
N.K.，Pedersen，S.F.，Hoffmann，E.K.(1999)Am JPhysiol 276.C26？？C37))从ICR小鼠的腹腔内移植(interaperitoneal transplantation)中每周进行收集。
具体地，将腹水(ascites fluid)从小鼠的腹膜腔(peritoneal cavity)收集到含有2.5U/ml肝素的Hank’s溶液中，为了从RBC中分离EAT细胞，将EAT细胞加载到含有10及20％的聚蔗糖(Ficoll solution)的两层的离心分离管中，以1,800rpm离心分离20分钟，仅获得EAT细胞。将上述细胞进行浮游，使细胞数达到希望的细胞数后，在实验开始前培养约30分钟。
2-(2).Fura2和EAT细胞的混合
目前已公开有，在Fura2-载入小鼠(loaded mouse)EAT细胞中，用G-蛋白质耦合受体拮抗剂(G-protein coupled receptor receptoragonist)进行处理，能够诱导细胞内游离钙([Ca2+]i)的暂时增加(斯科特和梅尔文分析生物化学，25，1656-1660，1953(Scott and Melvin.Anal.Biochem，25，1656-1660，1953))。
本发明中为了确认吉托宁或人参皂苷Ra、Rb1、Rb2、Rc、Rg1是否对Fura2-载入小鼠EAT细胞中的[Ca2+]i的暂时性增加显示出效果，将混合在Fura2中的EAT细胞(2～4×106/ml)在1.5mM的Ca2+缓冲液(buffer)或Ca2+游离缓冲液(free buffer)中培养10分钟后，加入吉托宁和人参皂苷，在EAT细胞中确认了对细胞内钙浓度具有效果。但，由于可以利用的纯分离的单独的吉托宁的量有限，因此作为具有代表性的吉托宁使用了吉托宁E2，对小鼠EAT细胞(日本理化学研究所(Riken BRC Cell Bank)，筑波市，日本)中的[Ca2+]i增加进行了实验。
具体地，根据等人的方法使用由120mM的NaCl、5mM的KCl、1mM的MgCl2、1.5mM的CaCl2、10mM的葡萄糖及25mM的HEPES组成的Ca2+缓冲液(pH 7.2)和由120mM的NaCl、5mM的KCl、1mM的MgCl2、0.2mM的EGTA、10mM的葡萄糖、25mM的HEPES组成的Ca2+游离缓冲液(pH7.4)，在37℃的水浴槽(water bath)中边振荡30分钟边在2μN的Fura 2-AM中混合EAT细胞(2～4×106/ml)，将细胞用Ca2+缓冲液和Ca2+游离缓冲液清洗3次，以去除过量的fura-2。
2-(3)细胞浮游物内[Ca2+]i的荧光测定
使用RF-5300PC细胞内离子测定系统(Intracellular Ion Measurement System；岛津公司，日本)在Fura 2-载入细胞中测定了[Ca2+]i。具体地，将Fura 2-载入细胞最终在实验培养基中稀释至2～4×106/ml，然后移入聚苯乙烯比色皿(cuvette)(Elkay Ultra-UV)。细胞使用涂布有聚四氟乙烯的磁石进行搅拌，将比色皿外壳调至37℃。在电脑控制下，激发波长(excitation wavelengths)交替控制在340及380nm之间，在510nm处检测出发射(emission)。此时，将激发和发射之间的宽度控制为5nm，以等人的方法为准进行了背景补正，洋地黄皂苷(digitonin)及EGTA作为浓缩反应试剂(concentration adjustment reagent)，用于使fura-2与Ca2+完全化合并制成从Ca2+解离的状态。
2-(4).由Fura2测定值推定[Ca2+]i
使用亨赛尔等人的数学式(亨赛尔，E.F.，戴维斯，M.J.，和史密斯，K.D.(1997)蛋白质实验指南手册，胡玛纳出版社，Totawa，803-804(Hounsell，E.F.，Davies，M.J.，and Smith，K.D.(1997)Protein protocol handbood，Humanna press，Totawa，803-804))来将测定的340nm比380nm的比值(ratio value)转换为[Ca2+]i的值。
[Ca2+]＝Kd[(R-Rmin)/(Rmax-R)](Sf380/Sb380)
但，Kd是解离常数(224nM)，R为测定的340nm比380nm的荧光比(fluorescence ratio)，Rmax及Rmin为在加入了50μg/ml的洋地黄皂苷的饱和浓度下的R值及在加入了20mM的EGTA的游离培养基中的R值。此外，Sf380和Sb380为加入洋地黄皂苷和EGTA时在380nm处的荧光强度(fluorescene intensity)，比率为表示它们的值时的最大及最小值(Grynkiewicz，G.，M.Poenie，和R.Y.钱.(1985)J生物学化学杂志260：3440-3450(Grynkiewicz，G.，M.Poenie，andR.Y.Tsien.(1985)J Biol Chem260：3440-3450))。
2-(5).数据分析
为了得到含有InsP6的浓度反应曲线，将观察到的峰(peak)的振幅进行标准化及图示化后，使用Origin软件(北安普顿(Northampton)，MA)与下述Hill式进行对应。
y/ymax＝[A]n/([A]n+[EC50]n)
但，上述y为吉托宁在给出浓度下的％活性，ymax为最大峰电流(maximum peak current)，[EC50]为能够显示出最大反应的50％的吉托宁浓度，[A]为吉托宁的浓度。并且，n为交互作用系数(interaction coefficient)，所有的值显示为平均±标准误差，使用未配对样本T检验(unpaired Student’s t-test)对对照组和吉托宁处理组的数据之间的平均差进行分析。鉴定为统计学显著性P＜0.05。
实验例1.粗制吉托宁及单独的吉托宁对于非洲爪蛙卵母细胞(Xenopus laevis oocytes)内在的CaCC活性的效果确认
为了确认粗制吉托宁及单独的吉托宁对于非洲爪蛙卵母细胞(Xenopus laevis oocytes)内在的CaCC的效果，使用上述参照例1的各个方法来测定被记录为CaCC活性增加的支持电位。
其结果，用粗制吉托宁处理的组中，在-80mV支持电位(holding potential)诱导了内向性(inward)Cl-电流，但人参皂苷的诱导效果完全没有确认，ED50显示为4.4±0.5μg/ml(参照图9的A和B)。
此外，对于单独的吉托宁也做了在非洲爪蛙卵中的CaCC活性效果实验，结果为吉托宁E1～E3及L1显示出了几乎相同程度的CaCC活性，但吉托宁L2和L3显示出了相对较弱的CaCC活性(参照图9的C)，此时的ED50分别如下，E1～E3分别为1.5±0.1、2.3±0.1、1.5±0.1，吉托宁L1～L3分别为1.0±0.1、3.2±0.2、4.3±0.2μg/ml。
实验例2.对于小鼠EAT细胞中细胞内游离钙([Ca2+]i)的效果确认
根据上述测定例2的各个方法，在小鼠EAT细胞中对细胞内[Ca2+]i进行测定的结果，分别用100mM的人参皂苷单独对浮游的EAT细胞进行处理时，实验中的任一个人参皂苷也没有对EAT细胞引起反应，与此相反，作为对照使用100ng/ml的吉托宁E2进行处理的实验组中，确认了[Ca2+]i暂时性地增加(参照图10的A)。
由图10的B可以看出，根据吉托宁E2诱导的[Ca2+]i的增加具有处理浓度依赖性。有趣的是，根据吉托宁E2诱导的[Ca2+]i的暂时性增加，在去除了外部的Ca2+(含有0.2mM的EGTA的Ca2+游离缓冲液)后大大减小了(P＜0.001，与细胞外存在Ca2+对比)。这说明在用吉托宁处理时，细胞外Ca2+也进入细胞内。但是用吉托宁E2进行处理时，[Ca2+]i浓度仍然随着浓度而增加了，这说明根据吉托宁E2诱导的[Ca2+]i的增加是依靠细胞内储存Ca2+的释放和由细胞外流入的Ca2+而增加的。
此时，EC50的值根据细胞外存在Ca2+和不存在Ca2+分别为33.6±8.2ng/ml和43.6±14.2ng/ml(平均±平均误差，n＝5～6)，上述结果说明在哺乳动物细胞中引起[Ca2+]i增加的并非是人参皂苷，而是吉托宁。
实验例3.根据粗制吉托宁的CaCC活性和在EAT细胞中PLC抑制剂、IP3受体拮抗剂及Ca2+螯合剂对于[Ca2+]i上升效果的效果确认
为了说明促进细胞质的[Ca2+]i和CaCC活化的吉托宁-诱导信号传递通路中的磷脂酶C(phospholipase C，PLC)所可能起到的作用，首先利用非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)和小鼠EAT细胞确认了作为活性PLC抑制剂U-73122和作为非活性衍生物U-73343的效果。
非洲爪蟾卵母细胞中，粗制吉托宁-诱导CaCC电流在U-73122中为对照组(control)的3.9±0.3％，但在U-73343中为对照组的97.2±0.2％(参照图11的A)。这样的结果说明，根据吉托宁诱导的[Ca2+]i上升和根据吉托宁介导的CaCC活化是通过活化PLC来介导的。
下一步骤，检查通过IP3受体(receptor)的细胞内Ca2+释放是否引起吉托宁-诱导CaCC活化(Grynkiewicz，等人.，生物学化学杂志260：3440-3450，1985；Parekh，A.B.Pflugers Arch.-Eur.J.Physiol.，430，954-963，1995；布罗德，等人.，生物学化学杂志276，15945-15952，2001(Grynkiewicz，et al.，J.Biol.Chem.260：3440-3450，1985；Parekh，A.B.Pflugers Arch.-Eur.J.Physiol.，430，954-963，1995；Broad，et al.，J.Biol.Chem.276，15945-15952，2001))。
为此，鉴定了作为IP3受体拮抗剂(IP3 receptor antagonist)的膜透过性2-APB(2-氨基乙氧基苯硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate))对于吉托宁-诱导CaCC活性的效果。
如图11的B所示，加入2-APB几乎完全消除了根据吉托宁诱导的内向性Cl-电流(1.3±0.2至0.03±0.01μA的对照电流，P＜0.01)，并且使用膜透过性BAPTA(1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸四钠盐(1，2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N，N，N′，N′-tetraacetic acid))-AM(10μM最终)进行处理来去除细胞内游离Ca2+，也同样几乎消除了CaCC活化(参照图11的C)。
与细胞外是否存在Ca2+而无关，在小鼠EAT细胞的情况下用U-73122处理也同样显示为几乎消除了吉托宁的作用，但U-73343并非如此(参照图12)。
这样的结果再次确认，在非洲爪蟾卵母细胞和小鼠EAT细胞中通过PLC-IP3-Ca2+通路而引起CaCC活性的粗制总皂苷流分(CCSF)的主要活性物质为吉托宁。
结论性地，可知本发明的吉托宁不仅具有增加细胞内钙浓度的作用，而且可知的是，诱发由细胞外的钙流入的增加，并通过使细胞内的钙浓度增加的信号传递通路来显示其效能。
本发明的含有吉托宁的药物组合物的制备例如下，本发明并不是为了限定于此，而仅用于具体说明。
制备例1.片剂的制备
100mg吉托宁
100mg乳糖
100mg淀粉
2mg硬脂酸镁
混合上述成分并根据常规片剂的制备方法压片制成片剂。
制备例2.散剂的制备
100mg吉托宁
100mg乳糖
10mg滑石粉
混合上述成分并填充到气密布中制成散剂。
制备例3.胶囊剂的制备
100mg吉托宁
3mg晶状纤维素
14.8mg乳糖
0.2mg硬脂酸镁
根据常规胶囊的制备方法混合上述成分，并填充到明胶胶囊中，制成胶囊。
制备例4.注射剂的制备
20mg吉托宁
适量的注射用灭菌蒸馏水
适量的pH调节剂
根据常规注射剂的制备方法，每1安瓿(2ml)以上述成分的含量来制备。
制备例5.液体剂的制备
1000mg吉托宁
10g异构化葡萄糖
5g甘露醇
适量的精制水
根据常规液体剂的制备方法，在精制水中加入各个成分溶解，加入适量的柠檬香，然后混合上述成分加入精制水，再对整体加入精制水，调节为共100ml，然后填充到褐色瓶子中进行灭菌，制得液体剂。
制备例6.健康食品的制备
100mg吉托宁
适量的维生素混合物
70μl的醋酸维生素A
1.0mg维生素E
0.13mg维生素B1
0.15mg维生素B2
0.5mg维生素B6
0.2μg维生素B12
10mg维生素C
10μg生物素
1.7mg烟酰胺
50μg叶酸
0.5mg泛酸钙
适量的矿物质混合物
1.75mg硫酸亚铁
0.82mg氧化锌
25.3mg碳酸镁
15mg磷酸钾
55mg磷酸氢二钾
90mg柠檬酸钾
100mg碳酸钙
24.8mg氯化镁
上述的维生素及矿物质混合物的组成比是将较为适合健康食品的成分作为优选实施例来进行混合，将上述配比进行任意的变形也无妨，根据通常的健康食品制备方法混合上述成分后，制成颗粒，可根据通常的方法用于健康食品组合物的制备中。
制备例7.健康饮料的制备
100g吉托宁
15g维生素C
100g维生素E(粉末)
19.75g乳酸铁
3.5g氧化锌
3.5g烟酰胺
1.0g维生素A
0.13g维生素B1
0.15g维生素B2
根据常规健康饮料的制备方法混合上述成分后，在85℃下约搅拌加热1小时，然后将制得的溶液过滤回收到灭菌了的2L的容器中，进行密封灭菌后冷藏保存，用来制备本发明的健康饮料组合物。
上述组成比是将较为适合喜好饮料的成分作为优选实施例来进行混合，但可以根据需求人群、需求国家、使用用途等地区和民族的喜好度而对其配比进行任意的变形也无妨。
以上部分对本发明内容的特定部分进行了详细说明，但对于本领域技术人员来说这样的具体说明仅是优选的实施方式，应当知道本发明的范围并不受此限制。并且，本发明的实质范围由附加的权利要求和与其等同的内容而定义。

Claims (9)

1.新型糖脂蛋白(glycolipoprotein)吉托宁(gintonins)的制备方法，其包括：
1)从人参中制备甲醇提取物的步骤；
2)用水和正丁醇的混合溶剂分离上述甲醇提取物的步骤；
3)使用氯甲烷∶甲醇∶水的混合溶剂作为洗脱溶剂，对上述水流分物和正丁醇流分物中的正丁醇流分物实施硅胶柱层析法，分离成8个流分的步骤；
4)使用乙醇∶乙酸乙酯∶水的混合溶剂作为洗脱溶剂，对上述8个流分物中相对于CaCC(钙激活氯离子通道(Ca2+-activated Chloride Channel))的活性最高的第7流分物实施硅胶柱层析法，分离成2个流分的步骤；及
5)透析上述2个流分物中CaCC活性高的流分物II，获得最终产物的步骤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在上述步骤5)之后，还包括下列步骤的单独的吉托宁(gintonin)E1、E2、E3、L1、L2及L3的制备方法：
6)将最终流分物溶解于含有NaCl的pH7.2的磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline；PBS)溶液中，实施阴离子交换层析法及凝胶过滤层析法后，分离成2个流分的步骤；及
7)将上述2个流分物分别用含有NaCl的pH8.2的Tris-HCl和含有NaCl的pH7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液实施阴离子交换层析法，分离单独的糖脂蛋白的步骤。
3.根据权利要求1所述的新型糖脂蛋白(glycolipoprotein)吉托宁(gintonins)的制备方法，其特征在于，所述人参选自红参、水参、白参、栽培参、长脑参及山参。
4.从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白吉托宁E1、E2、E3、L1、L2及L3，其特征在于，由权利要求2的方法制得，分子量为67kDa，是表观分子量为13kDa的五聚体(pentamer)。
5.根据权利要求4所述的从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白吉托宁，其特征在于，所述糖脂蛋白含有作为氨基酸组成成分的半胱氨酸和胱氨酸(cysteine and cystine)、天冬酰胺和天冬氨酸(asparagineand aspartic acid)、谷氨酰胺和谷氨酸(glutamine and glutamic acid)、丝氨酸(serine)、甘氨酸(glycine)、精氨酸(arginine)、苏氨酸threonine)、丙氨酸(alanine)、脯氨酸(proline)、缬氨酸(valine)、异亮氨酸(isoleucine)、亮氨酸(leucine)、苯基丙氨酸(phenylalanine)、色氨酸(tryptophan)及赖氨酸(lysine)。
6.根据权利要求4所述的从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白吉托宁，其特征在于，所述糖脂蛋白含有作为碳水化合物组成成分的鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabinose)、葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、木糖(xylose)、氨基葡萄糖(glucosamine)。
7.根据权利要求4所述的从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白吉托宁，其特征在于，所述糖脂蛋白含有作为脂质组成成分的亚油酸(linoleic acid)、棕榈酸(palmitic acid)、油酸(oleic acid)及硬脂酸(stearic acid)。
8.含有权利要求4的糖脂蛋白作为有效成分、用于对因钙浓度降低而引起的疾病的预防及治疗的药物组合物，其中，所述因钙浓度降低而引起的疾病选自：精神分裂(Schizophrenia)、阿尔兹海默症(Alzheimer′s Disease)、亨廷顿病(Hungtington′s Disease)、遗传性偏瘫型偏头痛(Familial hemiplegic migraine)、癫痫(Eilepsy)、发作性共济失调(episodic ataxia)、脊髓小脑共济失调(spinocerebellarataxias)及因钙不足引起的成长阻碍。
9.含有权利要求4的糖脂蛋白及食品学上允许的食品辅助添加剂的健康功能食品。
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