WO2011062354A2 - 인삼으로부터 신규 당지질단백질 진토닌을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 신규 당지질단백질 진토닌 - Google Patents

인삼으로부터 신규 당지질단백질 진토닌을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 신규 당지질단백질 진토닌 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a novel glycolipid protein (glycolipoprotein) present in ginseng, and more specifically, to isolate and identify from ginseng to prepare a novel glycolipid protein and the novel glycolipid protein separated from ginseng by the method and the novel It relates to the use of glycolipid protein.
  • glycolipid protein glycolipid protein
  • Ginseng is generally used as an tonic (adaptogen) or tonic for life extension and improves biological function against stress, fatigue, disease, cancer and diabetes. This ginseng has been used for hundreds of years in China and Japan as well as in Korea, and recently ginseng is one of the most famous herbs consumed in the world (Tyler, J. Pharm. Technol. 11 , 214-220, 1995).
  • Ginsenosides were isolated and characterized in the early 1960s, and thus are widely used in physiological and pharmacological studies (Shibata, et al. Tetraheadron Letters 1962 , 1239-1245, 1963; Wagner-Jauregg and Roth). , Pharm Acta Helv 37 , 352-357, 1962). In addition, recent studies have found that ginseng contains other unknown components such as polysaccharides, polyacetylenes, and proteins (Nah, Kor. J. Ginseng Sci. 21, 1-12, 1997).
  • the ginsenoside component of ginseng is low in quantity, complex in the separation process, and expensive for pure ginsenoside. Therefore, the crude ginseng total saponin fraction (CGSF) obtained from the extract of butanol from the root of ginseng has been used.
  • CGSF crude ginseng total saponin fraction
  • Crude saponin fraction (CGSF) is known to exhibit its activity through a cell membrane signal pathway.
  • CGSF Crude saponin fraction
  • Choi et al. Xenopus PLC ⁇ -IP when treated with crude total saponin fraction in oocytes 3 on Connected PTX-insentive G ⁇ q / 11 Calcium-dependent Chloride Ion Channels (Ca) 2+ activated Chloride Channel (CaCC) was found to be activated (Choi, et al., J. Biol. Chem . 276 , 48797-48802, 2001).
  • these lamps have frog eggs ( Xenopus In the oocytes, it was reported that spontaneous reduction of the calcium-dependent CaCC currents activated by the ROS saponin fractions continued (Lee, et al. J Biol Chem. 279 , 9912-9921, 2004).
  • ginsenosides activate CaCC
  • the inventors of the present invention showed that the ginsenoside-rich fractions of CGSF had a sharp effect on CaCC activity during the separation of pure ginsenosides from crude gross saponin fraction (CGSF). Found disappearing or disappearing.
  • CGSF crude gross saponin fraction
  • the main object of the present invention is to provide a method for isolating and identifying a new bioactive material that plays a tonic activity in ginseng and the use of the bioactive material and the bioactive material separated and identified by the method.
  • the present invention provides a method for separating and identifying a novel glycolipid protein (glycolipoprotein) present in ginseng from ginseng.
  • the method for preparing a new glycolipid protein gintonin (hereinafter, referred to as 'gintonin') from ginseng of the present invention comprises the steps of: (1) preparing a methanol extract from ginseng; (2) fractionating the methanol extract with a mixed solvent of water and n-butanol; (3) separating the n-butanol fraction of the water fraction and the n-butanol fraction into eight fractions by performing silica gel column chromatography using a mixed solvent of chloromethane: methanol: water as an eluting solvent; (4) Silica gel column chromatography was performed on the seventh fraction having the highest activity for CaCC (Ca 2+ -activated Chloride Channel) among the eight fractions using a mixed solvent of ethanol: ethyl acetate: water as elution solvent. Separating into two fractions; And (5) dialysis of the fraction II having high CaCC activity in the two fractions to obtain a final product.
  • the present invention also provides a novel glycolipid protein (gintonin) isolated and identified from ginseng by the above method.
  • the glycolipid protein has a molecular weight of about 67 kDa and an apparent molecular weight of about 13 kDa, characterized in that (pentarmer), cysteine and cystine (cysteine and cystine) as an amino acid composition , Asparagine and aspartic acid, glutamine and glutamic acid, serine, glycine, arginine, threonine, alanine, proline ), Valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, tryptophan and lysine; Carbohydrate composition components include rhamnose, arabinose, glucose, mannose, xylose and glucosamine; And linoleic acid, palmitic acid, oleic acid, stearic acid, and the like as lipid composition components.
  • Ginseng is the medicinal plant of the elm tree, and there are fresh ginseng, white ginseng, dried ginseng, red ginseng, dried ginseng, etc., depending on the processing method. There are camphor ginseng, sprinkled in a natural state, wild ginseng grown in a natural state, and ginseng in the present invention is used in the sense including all the ginseng species.
  • ginseng includes Panax ginseng CA Meyer, Western ginseng and Chinese ginseng.
  • Gintonin a novel glycolipid protein present in ginseng of the present invention, can be obtained as follows.
  • the dried ginseng powder is a polar solvent of C1 to C4 lower alcohol, such as water, methanol, ethanol, butanol, or the like, in a volume of about 1 to 20 times the sample weight, preferably about 1 to 10 times the sample weight.
  • C1 to C4 lower alcohol such as water, methanol, ethanol, butanol, or the like
  • a mixed solvent having a mixing ratio of 1: 0.1 to 1:10 preferably a mixed solvent of water and methanol having a mixing ratio (v / v) of 1: 0.2 to 1: 5, at about 0.1 to about
  • Extraction method such as stirring extraction, hot water extraction, cold leaching extraction, warm extraction, reflux cooling extraction or ultrasonic extraction for 48 hours, preferably 5 to 12 hours, preferably reflux cooling extraction, and then filtered to recover the supernatant, The process was repeated several times, preferably 2 to 5 times, and the supernatant was collected and concentrated under reduced pressure, and the solvent was fractionated with a mixed solvent in which water and n-butanol were mixed in the same amount to obtain a fraction of water and n-butanol. .
  • N-butanol fraction corresponding to crude total saponin fraction (CGSF) in the fraction was subjected to silica gel column chromatography using a mixed solvent of chloromethane: methanol: water (CHCl 3 : MeOH: H 2 O) as an elution solvent. After separation into three fractions, the separated fractions were subjected to calcium-dependent chlorine ion channel (CaCC) activity identification experiments in Xenopus oocytes to detect the activity of the fractions, and then to the fraction with the highest activity.
  • CaCC calcium-dependent chlorine ion channel
  • the crude gintonin thus obtained can be confirmed by molecular weight analysis by electrophoresis (SDS-PAGE), protein and amino acid composition analysis, carbohydrate composition analysis, lipid composition analysis by GC-MS.
  • the individual gintonins of the present invention were dissolved in NaCl-containing phosphate buffer saline (PBS) obtained by the above process, and subjected to anion exchange chromatography and gel filtration chromatography. Gintonin fractions are obtained, and each gintonin fraction can be obtained by anion exchange chromatography using NaCl-containing Tris-HCl (pH 8.2) and NaCl-containing PBS (pH 7.2).
  • PBS phosphate buffer saline
  • ginseng such as wild ginseng, camphor ginseng, cultivated ginseng, western ginseng, and Chinese ginseng may be used for the preparation of gintonin, and the ginseng may be used in the form of ginseng, white ginseng, red ginseng, and preferably 4 to 6 Red ginseng manufactured with Panax ginseng CA Meyer is recommended, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides the use of glycolipid protein (gintonin) as a prophylactic and therapeutic agent for diseases caused by lowering calcium concentrations.
  • glycolipid protein gintonin
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of diseases caused by lowering the calcium concentration comprising gintonin, a glycolipid protein prepared by the above method as an active ingredient.
  • the gintonin temporarily causes an increase in free cytoplasmic free Ca 2+ (Free Ca 2+ ), and due to a transient increase in intracellular calcium concentration, calcium-dependent presence in endogenous in frog eggs ( Xenopus oocytes ) It activates the chlorine ion channel (CaCC) to increase the intracellular calcium concentration, and as a result has an excellent effect on the prevention and treatment of diseases caused by lower calcium concentration, especially by improving the abnormalities of neurological diseases caused by lower calcium concentration Treatment and prevention are possible.
  • Free Ca 2+ free Ca 2+
  • CaCC chlorine ion channel
  • Nervous system disorders due to lower calcium levels include Schizophrenia, Alzheimer's Disease, Hungtington's Disease, Familial hemiplegic migraine, Eilepsy, and episodic ataxia. And spinocerebellar ataxias, but are not limited to these diseases.
  • composition of the present invention is effective in inhibiting growth due to calcium deficiency, etc.
  • intracellular calcium-dependent various physiological activities such as tonic action, increased immunity, enhanced sexual function, nervous system protection and activity, angiogenesis, antidiabetic The effect is also exhibited.
  • ginseng has been used as a herbal medicine for a long time, the gintonin of the present invention isolated from ginseng also has no problems such as toxicity and side effects.
  • the gintonin is contained in an amount of 0.0001 to 10% by weight, preferably 0.001 to 1% by weight based on the total weight of the composition.
  • composition comprising gintonin of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions, and the pharmaceutical dosage form of gintonin of the present invention may be used alone or in other forms. It can be used in an appropriate combination as well as in combination with pharmacologically active compounds.
  • compositions containing gintonin according to the present invention respectively, in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to a conventional method. Can be formulated and used.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alzenate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl Cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrididone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, humectants, disintegrating agents and surfactants are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, It is prepared by mixing gelatin.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate can be used, and suppository bases such as witepsol, macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like can be used.
  • compositions of the present invention vary depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the composition of the present invention is preferably administered at 0.0001 to 100 mg / kg per day. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to various mammals such as rats, mice, livestock, humans, and the like. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • composition containing the gintonin of the present invention can be used in various formulations, such as drugs, foods and beverages for the prevention and treatment of diseases caused by lowering calcium concentration, the gintonin is a food that can be added Examples thereof include various foods, drinks, gums, teas, vitamin complexes, and health functional foods.
  • Gintonin of the present invention has little toxicity and side effects, and therefore can be used safely even for prolonged administration for prophylactic purposes.
  • Gintonin of the present invention may be added to foods or beverages for the purpose of preventing diseases caused by lowering calcium concentration, wherein the amount of gintonin in the food or beverage may be added to 0.01 to 15% by weight of the total food weight ,
  • the health beverage composition may be added at a ratio of 0.02 to 5 g, preferably 0.3 to 1 g based on 100 ml.
  • the health functional beverage composition of the present invention is not particularly limited to other ingredients except for containing the gintonin as an essential ingredient in the indicated ratio, and may further include various flavors or natural carbohydrates, such as ordinary drinks.
  • the natural carbohydrate is, for example, monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents such as tauumatin, stevia extract, for example rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the proportion of said natural carbohydrates is generally about 1-20 g, preferably about 5-12 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the extract of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and enhancers (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof. , Organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the extracts of the present invention may contain flesh for the production of natural fruit juices and fruit juice drinks and vegetable drinks, and these ingredients may be used independently or in combination.
  • the ratio of the additive is not so important, but is generally selected from the range of 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the extract of the present invention.
  • the present invention provides a method for the isolation and identification of a novel glycolipid protein, gintonin, which is present in ginseng, and the prevention of diseases caused by lowering calcium concentrations of the novel glycolipid protein gintonin and the novel glycolipid protein gintonin prepared by the above method. It has the effect of providing for use as a therapeutic agent.
  • Gintonin of the present invention temporarily causes an increase in free cytoplasmic free Ca 2+ (Free Ca 2+ ) and is a calcium-dependent goat ion present endogenously in Xenopus oocytes due to a transient increase in intracellular calcium concentration.
  • By activating the channel (CaCC) to increase the intracellular calcium concentration can be usefully used for the prevention and treatment of diseases caused by lowering the calcium concentration.
  • the gintonin of the present invention exhibits excellent effects in tonic action, increased immunity, enhanced sexual function, nervous system protection and activity, intracellular calcium-dependent various physiological activities such as angiogenesis and antidiabetic action.
  • FIG. 1A is a diagram illustrating a method for isolating and identifying a new glycolipid protein, gintonin
  • FIG. 1B is a chromatogram confirming CaCC activity in frog eggs of the gintonin fraction
  • FIG. 1C Is the result of SDS-PAGE of crude gintonin.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a method for separating and identifying individual gintonin from crude gintonin.
  • A is an anion exchange chromatogram of gintonin E and gintonin L fraction isolated from crude gintonin
  • B is gintonin L fraction obtained in (A) above Is a gel filtration chromatogram of C
  • C is an anion exchange chromatogram of the Gintonin E fraction
  • D is an anion exchange chromatogram of the Gintonin L fraction.
  • Figure 4 shows the elution pattern of individual gintonin by gel or continuous anion exchange chromatography, where A and C are gel filtration chromatograms of purified gintonin E1 to E3 and gintonin L1 to L3, and B and D are Anion exchange chromatograms of purified Gintonin E1-E3 and Gintonin L1-L3.
  • FIG. 5 is a calibration curve of the molecular weight determination of gintonin via gel filtration chromatography, each point being the standard protein used (IgG: 160 kDa; BSA: 67 kDa; ⁇ -lactoglobulin: 35 kDa; cytochrome C: 12 kDa; aprotinin: 6.5 kDa), the arrow is gintonin.
  • FIG. 6A is SDS-PAGE of individual gintonin
  • B is gel staining SDS-PAGE of the carbohydrate component of the individual gintonin.
  • Figure 7 shows the carbohydrate component analysis of individual gintonin by HPAED-PAD chromatogram, where A is the component analysis of neutral sugar (standard: 1. L-fructose; 2. L-rhamnose; 3 D-arabinose; 4. D-galactose; 5. D-glucose; 6. D-mannose; 7. D-xylose), B is the component analysis of amino sugars (standards: 1. D-galactosamine; 2. D-glucosamine).
  • A is the component analysis of neutral sugar (standard: 1. L-fructose; 2. L-rhamnose; 3 D-arabinose; 4. D-galactose; 5. D-glucose; 6. D-mannose; 7. D-xylose)
  • B is the component analysis of amino sugars (standards: 1. D-galactosamine; 2. D-glucosamine).
  • Figure 9 shows the endogenous introverted CaCC current flow in mouse EAT cells when Gintonin treatment
  • A represents the current flow of gintonin and ginsenoside at -80 mV support potential
  • B and C are crude gintonin
  • This graph shows the current flow by concentration of and individual gintonins.
  • Figure 10 is a graph confirming the increase in intracellular calcium in mouse EAT cells when treated with gintonin
  • A is the increase in intracellular calcium with time in EAT cells mixed in Fura-2 cultured in Ca 2+ buffer
  • B shows the increase of intracellular calcium according to the concentration of gintonin in EAT cells mixed in Fura-2 cultured in Ca 2+ buffer or Ca 2+ free buffer.
  • FIG. 11 shows the effects of PLC inhibitors, IP 3 receptor antagonists and Ca 2+ chelators on CaCC activity by gintonin and increase in intracellular calcium in mouse EAT cells, where A is a PLC inhibitor (U-73343 / U-). 73122), B and C are current flow histograms confirming that CaCC activation is reduced by IP 3 receptor antagonist (2-APB) and Ca 2+ chelator (BAPTA-AM), respectively.
  • A is a PLC inhibitor (U-73343 / U-).
  • B and C are current flow histograms confirming that CaCC activation is reduced by IP 3 receptor antagonist (2-APB) and Ca 2+ chelator (BAPTA-AM), respectively.
  • Figure 12 shows the effect of active or inactive PLC inhibitors on intracellular calcium concentrations increased by gintonin in mouse EAT cells, where A is in EAT cells mixed with Fura-2 cultured in Ca 2+ buffer. Intracellular calcium increase inhibition was confirmed, B is a graph confirming the inhibition of intracellular calcium increase according to the concentration of gintonin in EAT cells mixed in Fura-2 cultured in Ca 2+ free buffer.
  • the highest CaCC activity was obtained by testing the activity of Ca 2+ -activated Chloride Channel (CaC), which is endogenous in Xenopus oocytes (frogs) for each fraction.
  • CaC Ca 2+ -activated Chloride Channel
  • water fraction containing ginseng protein or polysaccharide and petroleum ether fraction containing lipid component had no effect on intracellular calcium release from EAT cells and CaCC activity on frog eggs (not shown). No).
  • Example 1 In order to separate individual gintonins from crude gintonin, the crude gintonin obtained in Example 1 was dissolved in phosphate buffer saline (PBS) (pH 7.2) and DEAE sepharose. Anion exchange resin chromatography (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) equipped with a CL-6B column was performed to obtain two major peaks.
  • PBS phosphate buffer saline
  • Anion exchange resin chromatography GE Healthcare, Uppsala, Sweden
  • the solvent used was 0 to 2 M NaCl dissolved in PBS, two main peaks obtained by separating in a linear gradient method while monitoring at 280 nm at a flow rate of 1 ml / min, respectively, is the gintonin E (early eluted gintonin) and gintonin L (late eluted gintonin).
  • the gintonin E and gintonin L fractions were concentrated using a CentriVap DNA vacuum concentrator (Labconco, Missouri, USA), followed by PBS (pH 7.2) as an eluent, and 0.5 mL / min using a Superdex 75 gel filtration column. Chromatography was performed while monitoring at a flow rate of 280 nm to obtain major and minor peaks having a large molecular weight (see FIG. 3B).
  • the gintonin E fraction was again subjected to 20 mM Tris-HCl (pH 8.2) containing 100, 150, 200, and 250 mM NaCl.
  • 20 mM Tris-HCl pH 8.2
  • Tris-HCl pH 8.2
  • Four gradients were obtained by loading a step gradient DEAE anion exchange column (HionTrap TM DEAE FF, 1 mL) at a flow rate of 1 mL / min (see C in FIG. 3).
  • Fractions of 100, 150, and 200 mM NaCl eluents were concentrated by extensive dialysis and then step gradient DEAE anion exchange using 20 mM Tris-HCl (pH 8.2) containing 0 to 1 M NaCl.
  • the column was then subjected to Superdex 75 gel filtration chromatography to give final fractions of 3.7, 26.7 and 13.5 mg, respectively, which were named gintonin E1, E2 and E3, respectively.
  • the gintonin L fraction is 150, 200, among the five peaks (see D in FIG. 3) obtained by the same method using PBS (pH 7.2) containing 150, 200, 250, 300, 400 mM NaCl. And for the fractions of 250 mM NaCl eluate, the final fractions were obtained by 7.4, 17,6 and 6.6 mg, which were named gintonin L1, L2 and L3, respectively.
  • Fractions were collected at a flow rate of 0.5 ml / min monitoring at 280 nm using DuoFlow TM Chromatograpgy (BIO-RAD, California, USA), followed by immunoglobulin G (IgG; 160,000 Da), bovine serum albumin (BSA; 67,000 Da) molecular weight using a calibration curve of standard proteins such as ⁇ -lactoglobulin ( ⁇ -lactoglobulin (35,000 Da), cytochrome C (12,327 Da), and aprotinin (6,512 Da) was determined.
  • IgG immunoglobulin G
  • BSA bovine serum albumin
  • the elution pattern was different according to the elution of NaCl gradient due to different charges of the gintonin, but in gel filtration chromatography, the elution pattern was eluted at the same time (see FIG. 4B and D).
  • the native molecular weight of gintonin L2 determined using standard protein was also about 67 kDa (see FIG. 5), and the molecular weight of other gintonins was also confirmed to be about 67 kDa (not shown).
  • crude gintonin and individual gintonin E1 ⁇ E3, L1 ⁇ L3 were taken 100 ⁇ g and loaded in each lane, and after electrophoresis, the gintonin band was visualized by Coomassie Brilliant Blue R-250 staining.
  • gels were stained using PAS staining (periodic acid-schiff based staining), incubated in 40% ethanol-7% acetic acid solution for 30 minutes, and then 1% periodic acid-3. After incubation for 1 hour in% acetic acid, the periodic acid solution was removed and incubated for 1 hour with the addition of Schiff reagent. The band of dyed glycoprotein was pink and the PAS stained gel was stored after soaking with 7.5% acetic acid.
  • gintonin For general amino acid analysis, 30 ⁇ g of gintonin was hydrolyzed at 110 ° C. for 24 hours with 6 N HCl in vacuo . In addition, for the analysis of cysteine, gintonin was hydrolyzed at 110 ° C. for 24 hours with 6 N HCl after peroxidation, treated with formic acid: hydrogen peroxide (10: 1) solution, and trypophan For analysis, the sample was hydrolyzed with 4 M methanesulfonic acid and 4 M KOH was added.
  • Phenylisothiocyanate (PITOC) derivatives were commissioned by the Korea Institute of Basic Science, Daejeon, Korea, and were equipped with a Waters Nova-Pak C18 column (3.9 ⁇ 300 mm). It was analyzed by HPLC (Hewlett Packard 1100 series).
  • Protein components were determined by Bradford method (Bradford, MM (1976). Anal. Biochem . 72 , 248-254) using bovine serum albumin (BSA) as a standard.
  • BSA bovine serum albumin
  • the N-terminal amino acid sequence of gintonin consists of an automated Edman degration on an Applied Biosystem model 477A gas-phase protein sequence and a MilliGen 6600 solid-phase sequence. Was performed).
  • SDS-PAGE was carried out using 100% of gintonin using a 12% separation gel, and protein bands were visualized by Coomassie Brilliant Blue R-250 staining. The bands were cut and digested in trypsin, and the digestion product was desalted and concentrated.
  • the MS / MS of all peptides thus derived was performed using a mass spectrometer (QTOF II, Micromass, UK) equipped with nano-ESI at the Korea Basic Science Research Institute.
  • the generated product ion is used as a reflector, a microchannel plate detector, and an orthogonal TOF analyzer having a fixed time-to-digital converter.
  • the data were processed using a PC running Mass Lynx software in a Windows NT environment, and sequence homologs were retrieved using BLAST (www.ncbi.nln.nih.gov/BLAST.cgi).
  • Table 1 shows the de novo amino acid sequence and composition of gintonin. Purely isolated gintonin was identified as consisting of the N-terminal amino acid sequence by automatic Edman degradation. However, since the N-terminus of gintonin was blocked and the entire sequence could not be obtained, 18 internal peptide sequences were estimated from gintonin treated with MALDI-TOF-MS / MS. Six individual gintonins generally contained several peptides and the amino acid sequence showed partial homology with human glucokinase and glucokinase isoform 2 (not shown).
  • the total protein content of gintonin by the Braford method was found to be 9.4, 24.1, 20.5, 35.8, 37.1 and 39.6% in gintonin E1, E2, E3, L1, L2, and L3, respectively.
  • the protein content of gintonin L1-L3 is about three times higher than that of gintonin E1.
  • hydrophobic amino acid in gintonin was higher than hydrophilic amino acid, but histidine (His), tyrosine (Tyr) and methionine (Met) were not detected. It is thought that methionine was not detected because the N-terminal of gintonin blocked.
  • phenylalanine is the highest in common in gintonin E1-E3 and L1-L3.
  • lysine (Lys) in gintonin L1 ⁇ L3 was higher than E1 ⁇ E3 (see Table 1).
  • the band of gintonin in SDS-PAGE was single but broad, and may contain carbohydrates because it was not strongly stained with Comassie Brilliant blue staining.
  • gintonin was hydrolyzed with 2M trifluoroacetic acid at 100 ° C. for 4 hours to obtain neutral sugar, and gintonin was also released.
  • the amino sugar and the acid sugar were obtained by hydrolysis in ampoules with 6 N HCl at 100 ° C. for 4 hours.
  • the carbohydrate composition of gintonin was commissioned by Sejong University's Carbohydrate Materials Research Institute in Seoul, and used HPAEC-PAD system equipped with CarboPac TM PA1 column after PAS staining (periodic acid-schiff based staining) technique. Analysis was performed using a chromatography-plus amphermetric dectection system (Dionex, California, USA). The molar weight of the monosaccharides was calculated from the peak area, and the carbohydrate content was calculated for the phenol-sulfonic acid method (Hounsell, EF, Davies, MJ, and Smith, KD (1997) Protein protocol for neutral sugars). handbood, Humanna press , Totawa, 803-804) and acid sugars were determined by the Anthrone method (Scott, TA, and Melvin, EH (1953) Anal. Biochem. 25 , 1656-1660).
  • gintonin is divided into five different types of neutral sugars and glucosamine, such as rhamnose, arabinose, glucose, mannose, and xylose. It was confirmed that it consists of one amino sugar (glucosamine), six gintonin was found to have almost similar carbohydrate composition (see Table 2 and Figure 7). However, mannose was not detected in gintonin E1-E3.
  • acidic sugars such as 1-N-acetyl-neuramic acid, 2-galactouronic acid, and 3-glucouronic acid Not detected (not shown).
  • the total carbohydrate content of gintonin was found to be about 34.3, 45.3, 38.1, 36.0, 29,8 and 45.2% in gintonin E1, E2, E3, L1, L2 and L3, respectively.
  • gintonin is a glycoprotein.
  • gintonin of the present invention was in the same fraction as ginsenosides by n-butanol extraction, it can be expected that gintonin will also contain a lipid moiety.
  • gintonin was hydrolyzed with 6 N HCl at 100 ° C. for 4 hours or digested with lipoprotein lipase to identify lipid and hydrophobic moieties.
  • CGFS hydrolyzed or digested crude total saponin fraction
  • the GC (6890N) was equipped with a flame ionization detector and a split injection system, and fixed a supelco SPB-1 capillary column (inner diameter: 15 m x 0.32 mm; thickness: 0.25 m) It was.
  • gintonin is ester form (free form) or free form (palmitic acid), stearic acid (stearic acid), oleic acid (oleic acid), It was found to contain linoleic acid and the like.
  • the ratio of linoleic acid which is polyunsaturated fatty acid in gintonin E1 or L1 was higher than saturated fatty acid palmitic acid and stearic acid or oleic acid, and palmitic acid was contained in gintonin E2, E3, L1, L2.
  • the total lipid content of gintonin measured by GC was about 34.3, 45.3, 38.1, 36.0, 29,8 and 45.2% of gintonin E1, E2, E3, L1, L2 and L3, respectively. Among them, the lipid content of gintonin E1 was the highest.
  • the gintonin of the present invention is a novel glycoliplipoprotein.
  • Measurement Example 1 Measurement of CaCC activity in Xenopus laevis oocytes
  • Xenopus laevis obtained from Xenopus I (Ann Arbor, MI, USA) is stored and treated according to the best standards, and frogs are used as 3-aminobenzoic acid ethyl esters to separate oocytes.
  • the patient was treated with collagenase and treated with 82.5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 5 mM HEPES, 2.5 mM sodium pyruvate, 100 It was isolated by stirring for 2 hours in Ca 2+ glass medium containing units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • Two-electrode voltage clamp recordings were obtained from individual eggs placed in a small plexiglass net chamber (0.5 ml), and electrophysiological experiments were performed with a microelectrode filled with 3 M KCl ( Resistance: 0.2-0.7 kV) and an Oocyte Clamp amplifier (OC-725C, Warner Instrument, CT, USA) were used at room temperature and CaCC was recorded at -80 kV holding potential.
  • 3 M KCl Resistance: 0.2-0.7 kV
  • Oocyte Clamp amplifier OC-725C, Warner Instrument, CT, USA
  • Gintonin was applied to eggs by bath perfusion (Lee, JH, Jeong, SM, Lee, BH, Noh, HS, Kim, BK, Kim, JI, Rhim, H., Kim, HC, Kim) , KM, and Nah, SY (2004) J Biol Chem 279 , 9912-9921).
  • EAT cells were collected weekly in intraperitoneal transplantation in ICR mice according to J ⁇ rgensen et al. (J ⁇ rgensen, NK, Pedersen, SF, Hoffmann, EK (1999) Am J Physiol 276. C26 ?? C37).
  • EAT cells were collected in 10 and 20% picol solutions ( Ficoll solution) was loaded into a centrifuge tube containing two layers and centrifuged at 1,800 rpm for 20 minutes to obtain only EAT cells. The cells were floated to the desired cell number and then incubated for about 30 minutes before starting the experiment.
  • gintonin or ginsenosides Ra, Rb1, Rb2, Rc, and Rg1 have an effect on the transient increase of [Ca 2+ ] i in Fura 2-loaded mouse EAT cells.
  • Mixed EAT cells (2 ⁇ 4 ⁇ 10 6 / mL) were incubated for 10 minutes in 1.5 mM Ca 2+ buffer or Ca 2+ free buffer, followed by the addition of gintonin and ginsenosides. The effect on the intracellular calcium concentration was confirmed in.
  • Ca 2+ buffer pH 7.2
  • NaCl 120 mM consisting of NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 1.5 mM, glucose 10 mM, and HEPES 25 mM, 2 ⁇ N with 30 min shaking in a 37 ° C. water bath using Ca 2+ glass buffer (pH 7.4) consisting of 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 0.2 mM EGTA, 10 mM glucose, and 25 mM HEPES.
  • EAT cells (2-4 ⁇ 10 6 / ml) were mixed with Fura 2-AM, and excess fura-2 was removed by washing the cells three times with Ca 2+ buffer or Ca 2+ glass buffer.
  • [Ca 2+ ] i was estimated in Fura 2-loaded cells using the RF-5300PC Intracellular Ion Measurement System (Shimadzu Corporation, Japan). Specifically, Fura 2-loaded cells were finally diluted to 2 ⁇ 4 ⁇ 10 6 / ml in the experimental medium, and transferred to polystyrene cuvette (Elkay Ultra-UV). Cells were agitated using Teflon coated magnets and the cuvette housing was adjusted to 37 ° C. Excitation wavelengths alternated between 340 and 380 nm under computer control, and emission was detected at 510 nm.
  • excitation and emission gap width was 5 to nm
  • background correction was carried according to the method such as J ⁇ rgensen, dijito Nin (digitonin) and EGTA is combined with fura-2 are completely dissociated from Ca 2+, and Ca 2+ It was used as a concentration adjustment reagent to make a state to be.
  • the measured ratio values of 340 nm to 380 nm were obtained using Hounsell et al. (Hounsell, EF, Davies, MJ, and Smith, KD (1997) Protein protocol handbood, Humanna press , Totawa, 803-804). To a value of [Ca 2+ ] i .
  • K d is the dissociation constant (224 nM)
  • R is the measured fluorescence ratio of 340 nm to 380 nm
  • R max and R min are the saturation concentrations of 50 ⁇ g / ml R value and R value in the glass medium to which 20 mM EGTA was added.
  • S f380 and S b380 are the fluorescene intensity at 380 nm with the addition of Digitonin and EGTA, and the ratios are the maximum and minimum when these values are displayed (Grynkiewicz, G., M. Poenie). , and RY Tsien. (1985) J Biol Chem 260 : 3440-3450).
  • y is the% activity at a given concentration of gintonin
  • y max is the maximum peak current
  • [EC 50 ] is the concentration of gintonin that can represent 50% of the maximum response
  • [ A] is the concentration of gintonin.
  • n is the interaction coefficient (interaction coefficient), all values are expressed as the mean ⁇ standard error, the average difference between the control group and the gintonin treatment data was analyzed using an unpaired Student's t-test. Statistical significance was tested at P ⁇ 0.05.
  • Gintonin E1 ⁇ E3 and L1 showed almost the same CaCC activity, but Gintonin L2 and L3 showed relatively weak CaCC activity.
  • ED 50 is 1.5 ⁇ 0.1, 2.3 ⁇ 0.1, 1.5 ⁇ 0.1 for gintonin E1-E3, 1.0 ⁇ 0.1, 3.2 ⁇ 0.2 and 4.3 ⁇ 0.2 ⁇ g /, respectively, for gintonin L1-L3. Ml.
  • the intracellular [Ca 2+ ] i was measured in the mouse EAT cells.
  • Ginsenosides also did not respond to EAT cells, whereas in contrast, the experimental group treated with 100 ng / ml of gintonin E2 was found to temporarily increase [Ca 2+ ] i (see A in FIG. 10). .
  • IP 3 receptor antagonists of non-dust IP 3 receptor antagonist
  • a membrane permeable 2-APB (2-aminoethoxydiphenyl borate ) - were tested for effects on the induction CaCC activity.
  • gintonin is the major active substance of the crude total saponin fraction (CGSF), which causes CaCC activity that occurs through the PLC-IP 3 -Ca 2+ pathway in frog eggs and mouse EAT cells.
  • the gintonin of the present invention exhibits its efficacy through a signal transduction pathway that increases intracellular calcium concentration as well as an effect of increasing intracellular calcium concentration and increases calcium influx from the outside.
  • the tablets were prepared by mixing the above components and tableting according to a conventional method for producing tablets.
  • the above ingredients are mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.
  • the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare capsules.
  • the amount of the above ingredient is prepared per ampoule (2 ml).
  • each component is added to the purified water to dissolve, the lemon flavor is appropriately added, the above components are mixed, purified water is added, the whole is purified to 100 ml, and then filled in a brown bottle.
  • the solution is prepared by sterilization.
  • Vitamin E 1.0mg
  • Vitamin B 1 0.13 mg
  • Vitamin B 6 0.5 mg
  • composition ratio of the vitamin and mineral mixture is a composition suitable for a relatively healthy food in a preferred embodiment
  • the compounding ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional health food manufacturing method.
  • the granules may be prepared and used for preparing a health food composition according to a conventional method.
  • the resulting solution is filtered and obtained in a sterilized 2 L container, sealed sterilization and refrigerated and stored in the present invention Used to prepare healthy beverage compositions.
  • composition ratio is mixed with a component suitable for a favorite beverage in a preferred embodiment, the composition ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, and usage.

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Abstract

본 발명은 인삼으로부터 분리 동정한 신규한 당지질단백질(glycolipoprotein)인 진토닌(gintonin)을 제조하는 방법과 상기 방법으로 인삼에서 분리 동정한 신규 당지질단백질 진토닌 및 상기 신규 당지질단백질 진토닌의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 신규 당지질 단백질 진토닌은 일시적으로 세포질내 유리 Ca2+(Free Ca2+)의 증가를 유발하고, 세포내 칼슘농도의 일시적인 증가로 인해 개구리알(Xenopus oocytes)에서 내인성으로 존재하는 칼슘 의존성 염소이온 채널(CaCC)을 활성화하여 세포내 칼슘 농도를 증가시키므로 칼슘 농도 저하로 기인되는 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 강장작용, 면역력 증가, 성기능 강화, 신경계 보호 및 활성, 혈관 신생, 항당뇨 작용과 같은 세포 내 칼슘의존성 여러 생리활성 등에서도 우수한 효과를 나타낸다.

Description

인삼으로부터 신규 당지질단백질 진토닌을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 신규 당지질단백질 진토닌
본 발명은 인삼에 존재하는 신규한 당지질단백질(glycolipoprotein)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인삼으로부터 분리 동정하여 신규한 당지질단백질을 제조하는 방법과 상기 방법으로 인삼에서 분리 동정한 신규 당지질단백질 및 상기 신규 당지질단백질의 용도에 관한 것이다.
인삼은 일반적으로 강장제(adaptogen) 또는 생명연장을 위한 강장제로서 이용되고 있으며, 스트레스, 피로, 질병, 암, 당뇨병에 대항하여 생체기능을 향상시킨다. 이러한 인삼은 한국뿐만 아니라 중국과 일본에서도 몇 백년 동안 인삼을 사용해 왔으며, 최근 인삼은 세계에서 소비되는 약초로 가장 유명한 것 중 하나이다(Tyler, J. Pharm. Technol. 11, 214-220, 1995).
진세노사이드(Ginsenoside)는 1960년대 초반에 분리되어 특성화되었기 때문에 생리학적, 약리학적 연구에서 대표적인 성분으로 많이 이용된다(Shibata, et al. Tetraheadron Letters 1962, 1239-1245, 1963; Wagner-Jauregg and Roth, Pharm Acta Helv 37, 352-357, 1962). 이외에도 최근 연구에서는 인삼에 다당류(polysaccharides), 폴리아세틸렌류(polyacetylenes), 단백질(proteins) 등 알려지지 않은 다른 성분들이 함유되어 있는 것이 밝혀졌다(Nah, Kor. J. Ginseng Sci. 21, 1-12, 1997).
인삼의 진세노사이드 성분은 양이 적고, 분리과정에 복잡하며, 순수한 진세노사이드의 경우에는 비싸기 때문에 인삼의 뿌리에서 부탄올 추출방법으로 얻어낸 조총사포닌 분획(crude ginseng total saponin fraction, CGSF)을 사용해 왔다(Kanzaki, et al . Br J Pharmacol. 125(2), 255-262, 1998; Choi, et al. Br J. Pharmacol. 132, 641-648, 2001; Choi, et al., J. Biol. Chem. 276, 48797-48802, 2001; Choi, et al. Eur J Pharmacol 468, 83-92, 2003; Lee, et al, J Biol Chem. 279, 9912-9921, 2004; Jeong, et al, Br J Pharmacol. 142, 585-593, 2004; Reay, et al, J Psychopharmacol. 19, 357-365, 2005; Lee, et al, Arch Pharm Res 28, 413-420, 2005; Wei, et al J Ethnopharmacol. 111, 613-618, 2007; Eriksson, et al J Ethnopharmacol. 119, 17-23, 2008).
조총사포닌 분획(CGSF)은 세포막 신호 경로(signal pathway)를 통해 그 활성이 나타나는 것으로 알려져 있는데, 예를 들면, 최 등은 개구리알(Xenopus oocytes)에 조총사포닌 분획을 처리했을 때 PLCβ-IP3에 연결되어 있는 PTX-insentive Gαq/11 단백질을 통해 칼슘 의존성 염소이온 채널(Ca2+ activated Chloride Channel, CaCC)이 활성화 되는 것을 밝혀냈다(Choi, et al., J. Biol. Chem. 276, 48797-48802, 2001). 또한, 이 등은 개구리알(Xenopus oocytes)에서 조총사포닌 분획을 지속적으로 처리했을 때 조총사포닌 분획에 의해 활성화된 칼슘 의존성 염소이온 채널 전류(CaCC currents)가 자발적으로 감소하는 것을 보고하였다(Lee, et al, J Biol Chem. 279, 9912-9921, 2004).
칼모둘린(Calmodulin)을 개구리알에 직접 주입을 하거나 세포 내 칼슘저장고를 고갈시켰을 때 조총사포닌 분획에 따른 칼슘 의존성 염소이온 채널의 활성이 사라진다(Lee, et al, Arch Pharm Res 28, 413-420, 2005). 게다가 개구리알에서 조총사포닌 처리시 SOCE(stored-operated Ca2+ entry)가 유발되며(Jeong, et al, Br J Pharmacol. 142, 585-593, 2004), 이에 따라 세포 밖에서부터 또는 세포 내 칼슘 저장고에서 칼슘의 농도 증가가 야기되어 개구리알 내 CaCC가 활성되는 것으로 알려져 있다(Dascal, CRC Crit Rev Biochem 22, 317-387, 1987).
본 발명자들은 진세노사이드가 CaCC를 활성화시키는 것을 확인하기 위하여 조총사포닌 분획물(CGSF)로부터 순수한 진세노사이드를 분리하는 과정 중 CGSF 보다 진세노사이드가 풍부한 분획물의 경우 CaCC 활성에 대한 그 효과가 급격하게 사라지거나 없어지는 것을 발견하였다. 즉, CGSF로부터 순수하게 분리된 진세노사이드의 경우 개구리알 내에서 CaCC 활성 효과가 없는 것을 확인하고, 이는 진세노사이드 뿐만 아니라 알 수 없는 어떤 물질들이 CGSF에 존재하며, 이 물질에 의해 개구리알 내에 존재하는 CaCC의 활성에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
이에 CGSF 내에 내인성 CaCC의 활성을 일으키는 어떤 성분의 분리를 위해 예의 노력한 결과, 새로운 생리활성 성분을 분리 동정하고 본 발명을 완성하였다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 인삼에서 강장 활성 역할을 하는 새로운 생리활성 물질을 분리 동정하는 방법과 상기 방법으로 분리 동정된 생리활성 물질 및 상기 생리활성 물질의 용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼에 존재하는 신규한 당지질단백질(glycolipoprotein)을 인삼으로부터 분리 동정하여 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 인삼으로부터 신규 당지질단백질인 진토닌(이하, '진토닌(gintonin)'이라 함)의 제조방법은, (1) 인삼으로부터 메탄올 추출물을 제조하는 단계; (2) 상기 메탄올 추출물을 물과 n-부탄올의 혼합용매로 분획하는 단계; (3) 상기 물 분획물과 n-부탄올 분획물 중 n-부탄올 분획물을 용출용매로서 클로로메탄:메탄올:물의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 8개의 분획으로 분리하는 단계; (4) 상기 8개의 분획물 중 CaCC(Ca2+-activated Chloride Channel)에 대한 활성이 가장 활성이 높은 7번째 분획물을 용출용매로서 에탄올:에틸아세테이트:물의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 2개의 분획으로 분리하는 단계; 및 (5) 상기 2개의 분획물 중 CaCC 활성이 높은 분획물 Ⅱ를 투석하여 최종 생성물을 얻는 단계;를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기에 더하여,
(6) 최종 분획물을 NaCl이 함유된 pH 7.2의인산염 완충 식염수(phosphate buffer saline; PBS) 용액에 용해하여 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 2개의 분획으로 분리하는 단계; 및 (7) 상기 2개의 분획물을 각각 NaCl이 함유된 pH 8.2의 Tris-HCl와 NaCl이 함유된 pH 7.2의 인산염 완충 식염수(PBS)로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 개별 진토닌을 분리하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기와 같은 방법으로 인삼에서 분리 동정한 신규 당지질단백질(진토닌)을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 당지질단백질(진토닌)의 분자량은 약 67 kDa이고, 겉보기 분자량은 약 13 kDa인 오량체(pentarmer)인 것을 특징으로 하며, 아미노산조성 성분으로 시스테인과 시스틴(cysteine and cystine), 아스파라긴과 아스파르트산(asparagine and aspartic acid), 글루타민과 글루탐산(glutamine and glutamic acid), 세린(serine), 글리신(glycine), 아르기닌(arginine), 트레오닌(threonine), 알라닌(alanine), 프롤린(proline), 발린(valine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan) 및 리신(lysine)과; 탄수화물 조성 성분으로서 람노스(rhamnose), 아라비노오스(arabinose), 글루코오스(glucose), 만노오스(mannose), 크실로오스(xylose) 및 글루코사민(glucosamine); 및 지질 조성 성분으로 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 올레산(oleic acid), 및 스테아르산(stearic acid) 등을 포함한다.
인삼은 두릅나무과 약용식물로서, 가공 방법에 따라 가공하지 아니한 수삼, 수삼을 건조시킨 백삼, 수삼을 쪄서 건조시킨 홍삼 등이 있으며, 재배 방법에 따라서는 인삼밭에서 인위적으로 재배한 재배삼, 인삼씨를 산중에 뿌려서 자연 상태에서 재배한 장뇌삼, 자연 상태로 자생한 산삼 등이 있으며, 본 발명에서의 인삼은 상기 모든 인삼 종류를 포함하는 의미로 사용된다. 또한, 본 발명에서 인삼은 고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 서양삼 및 중국인삼 등을 포함한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 인삼에 존재하는 신규한 당지질단백질인 진토닌은 하기와 같이 수득될 수 있다.
먼저, 건조된 인삼 분말을 시료 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 1 내지 10배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C1 내지 C4의 저급 알코올의 극성 용매 또는 이들의 약 1 : 0.1 내지 1 : 10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 1 : 0.2 내지 1 : 5의 혼합비(v/v)를 갖는 물과 메탄올의 혼합용매로, 70 내지 120℃에서 약 0.1 내지 48시간, 바람직하게는 5 내지 12시간 동안 교반추출, 열수추출, 냉침추출, 가온추출, 환류냉각추출 또는 초음파추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각추출한 후 여과하여 상층액을 회수하고, 상기의 과정을 수회, 바람직하게는 2 내지 5회 반복 수행한 다음 상층액을 모아 감압농축한 것을 물과 n-부탄올이 동량으로 혼합된 혼합용매로 용매분획 하여 물과 n-부탄올의 분획물을 수득한다.
상기 분획물 중 조총사포닌 분획(CGSF)에 해당하는 n-부탄올 분획물을 용출용매로 클로로메탄:메탄올: 물(CHCl3:MeOH:H2O)의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 8개의 분획으로 분리한 후, 분리된 분획물들에 대하여 개구리알(Xenopus oocytes)에서의 칼슘 의존성 염소이온 채널(CaCC) 활성 확인 실험 실시하여 분획물의 활성을 검색한 다음, 가장 활성이 높은 분획에 대하여 다시 에탄올:에틸아세테이트:물(EtOH:EtOAc:H2O)의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 2개의 분획으로 분획하고, 이중 활성이 높은 분획을 과량의 증류수와 투석막(dialysis membrane)을 이용해 투석하여 본 발명의 조 진토닌을 수득할 수 있다.
이렇게 얻어진 조 진토닌은 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량 분석, 단백질 및 아미노산 조성 분석, 탄수화물 조성 분석, GC-MS에 의한 지질 조성 분석 등을 통해 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 개별 진토닌들은 상기와 같은 공정으로 수득된 조 진토닌을 NaCl이 함유된 인산염 완충 식염수(phosphate buffer saline; PBS)에 용해하여 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 2개의 진토닌 분획물을 수득하고, 각각의 진토닌 분획물은 NaCl이 함유된 Tris-HCl(pH 8.2)와 NaCl이 함유된 PBS(pH 7.2)를 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 수득할 수 있다.
본 발명에서 진토닌의 제조를 위해 산삼, 장뇌삼, 재배삼, 서양삼 및 중국인삼 등의 인삼을 사용할 수 있고, 상기 인삼은 수삼, 백삼, 홍삼 등의 형태로 이용될 수 있으며, 바람직하게는 4 내지 6년근 고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)으로 제조한 홍삼을 사용하는 것이 좋으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또한 당지질단백질(진토닌)을 칼슘 농도 저하로 기인되는 질환의 예방 및 치료제로서의 용도를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 당지질단백질인 진토닌을 유효성분으로 포함하는 칼슘 농도 저하로 기인되는 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 진토닌은 일시적으로 세포질내 유리 Ca2+(Free Ca2+)의 증가를 유발하고, 세포내 칼슘농도의 일시적인 증가로 인해 개구리알(Xenopus oocytes)에서 내인성으로 존재하는 칼슘 의존성 염소이온 채널(CaCC)을 활성화하여 세포내 칼슘 농도를 증가시키며, 그 결과 칼슘 농도 저하로 기인되는 질환의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타내며, 특히 칼슘 농도 저하로 야기되는 신경계 질환의 이상을 개선함으로써 치료 및 예방이 가능하다.
칼슘 농도 저하로 인한 신경계 질환에는 정신분열(Schizophrenia), 알츠하이머병(Alzheimer's Disease), 헌팅톤병(Hungtington's Disease), 유전적 편마비편두통(Familial hemiplegic migraine), 간질(Eilepsy), 발작적 운동실조증(episodic ataxia), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxias) 등을 포함하나 이들 질환으로 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 칼슘 부족으로 인한 성장저해 등에도 효과가 있으며, 세포 내 칼슘의존성 여러 생리활성, 예를 들면, 강장작용, 면역력 증가, 성기능 강화, 신경계 보호 및 활성, 혈관 신생, 항당뇨 작용 등에서도 효과를 나타낸다.
또한, 인삼은 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 것으로 인삼에서 분리해 낸 본 발명의 진토닌 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 전혀 없다.
본 발명의 칼슘 농도 저하로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 진토닌은 0.0001 내지 10중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1중량%로 포함한다.
또한, 본 발명의 진토닌을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있고, 본 발명의 진토닌의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약리적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 진토닌을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알제네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피릴리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트,탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습유제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 진토닌 또는 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있고, 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 진토닌을 포함하는 조성물은 상기와 같은 제형으로 칼슘 농도 저하로 기인하는 질환의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있고, 상기 진토닌은 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.
본 발명의 진토닌은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 진토닌은 칼슘 농도 저하로 기인하는 질환의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있는데, 이때 식품 또는 음료 중의 상기 진토닌의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 진토닌을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 천연 탄수화물은 예를 들어, 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올 등이 있다. 또한, 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율을 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있으며, 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100중량부당 0 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 인삼에 존재하는 신규한 당지질단백질인 진토닌을 분리 동정하여 제조하는 방법과 상기 방법으로 제조된 신규 당지질단백질 진토닌 및 상기 신규 당지질 단백질 진토닌의 칼슘 농도 저하로 기인되는 질환의 예방 및 치료제로서의 용도를 을 제공하는 효과가 있다.
본 발명의 진토닌은 일시적으로 세포질내 유리 Ca2+(Free Ca2+)의 증가를 유발하고, 세포내 칼슘농도의 일시적인 증가로 인해 개구리알(Xenopus oocytes)에서 내인성으로 존재하는 칼슘 의존성 염소이온 채널(CaCC)을 활성화하여 세포내 칼슘 농도를 증가시키므로 칼슘 농도 저하로 기인되는 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 진토닌은 강장작용, 면역력 증가, 성기능 강화, 신경계 보호 및 활성, 혈관 신생, 항당뇨 작용과 같은 세포 내 칼슘의존성 여러 생리활성 등에서도 우수한 효과를 나타낸다.
도 1의 A는 인삼에서 신규한 당지질단백질인 진토닌을 분리 동정하는 방법을 도식화 한 그림이며, 도 1의 B는 진토닌 분획물의 개구리알에서의 CaCC 활성을 확인한 크로마토그램이고, 도 1의 C는 조 진토닌의 SDS-PAGE 결과이다.
도 2는 조 진토닌으로부터 개별 진토닌을 분리 동정하는 방법을 도식화 한 그림이다.
도 3은 개별 진토닌의 음이온 교환 및 겔 크로마토그램으로, A는 조 진토닌에서 분리한 진토닌 E와 진토닌 L 분획의 음이온 교환 크로마토그램이고, B는 상기 (A)에서 얻은 진토닌 L 분획의 겔 여과 크로마토그램이며, C는 진토닌 E 분획의 음이온 교환 크로마토그램이고, D는 진토닌 L 분획의 음이온 교환 크로마토그램이다.
도 4는 겔 또는 연속 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 개별 진토닌의 용출 패턴을 나타낸 것으로, A와 C는 정제된 진토닌 E1~E3 및 진토닌 L1~L3의 겔 여과 크로마토그램이고, B와 D는 정제된 진토닌 E1~E3 및 진토닌 L1~L3의 음이온 교환 크로마토그램이다.
도 5는 겔 여과 크로마토그래피를 통한 진토닌의 분자량 결정 교정곡선으로, 각 점은 사용된 표준 단백질이며(IgG: 160 kDa; BSA: 67 kDa; β-lactoglobulin: 35 kDa; cytochrome C: 12 kDa; aprotinin: 6.5 kDa), 화살표는 진토닌이다.
도 6의 A는 개별 진토닌의 SDS-PAGE이고, B는 상기 개별 진토닌의 탄수화물 성분의 겔 염색 SDS-PAGE 결과이다.
도 7은 HPAED-PAD 크로마토그램에 의한 개별 진토닌의 탄수화물 성분 분석 결과로, A는 중성당(Neutral sugar)의 성분 분석이고(표준물질: 1. L-과당; 2. L-람노스; 3. D-아라비노오스; 4. D-갈락토오스; 5. D-글루코오스; 6. D-만노오스; 7. D-크실로오스), B는 아미노당(Amino sugar)의 성분 분석이다(표준물질: 1. D-갈락토사민; 2. D-글루코사민).
도 8은 개별 진토닌 E1~E3 및 L1~L3의 지질 성분을 GC-MS 스펙트럼 분석 결과이다.
도 9는 진토닌 처리 시 마우스 EAT 세포에서 내인성 내향성 CaCC 전류흐름을 나타낸 것으로, A는 -80 ㎷ 지지전위에서의 진토닌과 진세노사이드의 전류흐름을 나타낸 것이고, B와 C는 각각 조 진토닌과 개별 진토닌의 농도별 전류흐름을 나타낸 그래프이다.
도 10은 진토닌 처리 시 마우스 EAT 세포에서 세포내 칼슘의 증가를 확인한 그래프로, A는 Ca2+ 완충액에 배양한 Fura-2에 섞은 EAT 세포에서의 시간에 따른 세포내 칼슘 증가를 확인한 것이고, B는 Ca2+ 완충액 또는 Ca2+ 유리 완충액에 배양한 Fura-2에 섞은 EAT 세포에서의 진토닌 농도에 따른 세포내 칼슘 증가를 확인한 것이다.
도 11은 진토닌에 의한 CaCC 활성 및 마우스 EAT 세포에서 세포내 칼슘의 증가에 대한 PLC 억제제, IP3 수용체 길항제 및 Ca2+ 킬레이트제 효과를 나타낸 것으로, A는 PLC 억제제(U-73343/U-73122)에 의해, B와 C는 각각 IP3 수용체 길항제(2-APB) 및 Ca2+ 킬레이트제(BAPTA-AM)에 의해 CaCC 활성화가 감소되는 것을 확인한 전류 흐름 막대그래프이다.
도 12는 마우스 EAT 세포에서 진토닌에 의해 증가되는 세포내 칼슘 농도에 대한 활성형 또는 비활성형 PLC 억제제의 효과를 나타낸 것으로, A는 Ca2+ 완충액에 배양한 Fura-2에 섞은 EAT 세포에서의 세포내 칼슘 증가 억제를 확인한 것이며, B는 Ca2+ 유리 완충액에 배양한 Fura-2에 섞은 EAT 세포에서의 진토닌 농도에 따른 세포내 칼슘 증가 억제를 확인한 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 인삼에서 조 진토닌(crude gintonin) 분리
한국인삼공사(대전, 한국)에서 구입한 6년근 홍삼(Panax ginseng C. A. Meyer) 20 ㎏을 잘게 분쇄(>3 ㎜)하고, 80% 메탄올 30 ℓ를 가하여 80℃에서 8시간 환류냉각추출 한 다음, 진공 여과하여 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3회 반복하여 상층액을 모은 후 감압농축하고(메탄올 추출물 총 6.2 ㎏ 수득), 물과 n-부탄올의 혼합용매(1:1)로 용매 분획하여 물과 n-부탄올의 분획물을 수득하였다.(n-부탄올 분획물 총 908 g 수득).
상기 n-부탄올 분획물(조총사포닌 분획, CGSF)은 농축하여, 클로로포름:메탄올: 물(CHCl3:MeOH:H2O=13:7:2) 혼합용매로 용리하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 8개의 분획으로 분리한 후, 각각의 분획물에 대해 Xenopus oocytes(개구리알)에서 내인성으로 존재하는 칼슘 의존성 염소이온 채널(Ca2+-activated Chloride Channel; CaCC)에 대한 활성을 실험하여 CaCC 활성이 가장 높게 나타난 7분획(도 1의 B 참조)에 대해 다시 에틸아세테트:에탄올:물(EtOAc:EtOH:H2O=1:3:0.5) 혼합용매로 용리하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하고 2개의 분획을 수득하였다.
상기 2개의 분획물 중 EAT(Ehrlich Ascites Tumor) 세포에서의 세포내 칼슘방출실험 평가와 개구리알에서 강한 CaCC 활성을 보인 분획물 Ⅱ를 4℃에서 8시간 동안 과량의 증류수(distilled water, DW)와 Spectra/Por 투석막(molecular weight cut off 6,000~8,000)(Spectrum Laboratories, Inc., Califoinia, USA)을 이용하여 투석하고 진세노사이드 및 다른 저분자 물질을 제거한 후 최종적으로 분획물을 수득하였다.
상기 수득한 분획물에 대해 전기영동(SDS-PAGE)을 수행한 결과, Comassie Brilliant Blue에 염색되며, 겉보기(apparent) 분자량이 약 13 kDa임을 확인하였다. 이는 EAT 세포에서의 세포내 칼슘방출실험 평가와 개구리 알에서의 CaCC 활성을 일으키는 신규 물질이 진세노사이드가 아닌 단백질의 한 종류라는 것을 시사하는 것으로, 상기 단백질을 진토닌(gintonins)라고 명명하였으며, 이로부터 얻은 최종 분획물은 조 진토닌(crude gintonin)이라 명명하였다.
그러나, 인삼의 단백질이나 다당류를 포함하고 있는 물 분획물과 지질(lipid) 성분을 함유하는 있는 석유 에테르 분획물은 EAT 세포에서의 세포 내 칼슘방출실험과 개구리 알에서의 CaCC 활성효과가 전혀 없었다(도식하지 아니함).
실시예 2. 개별 진토닌(gintonin) 분리
조 진토닌(crude gintonin)에서 개별 진토닌들(gintonins)을 분리하기 위하여, 상기 실시예 1에서 얻은 조 진토닌을 인산염 완충 식염수(phosphate buffer saline, PBS)(pH 7.2)에 용해하여 DEAE 세파로스 CL-6B 컬럼이 장착된 음이온 교환수지 크로마토그래피(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 수행하고 2개의 주된 첨두(major peak)를 얻었다. 이때, 용매는 0 내지 2 M NaCl이 PBS에 녹아있는 것을 사용하였으며, 1 ㎖/분의 유속으로 280 ㎚에서 모니터링 하면서 선형 기울기(linear gradient) 방식으로 분리하여 얻은 2개의 주된 첨두는 각각 진토닌 E(early eluted gintonin)과 진토닌 L(late eluted gintonin)로 명명하였다.
상기 진토닌 E와 진토닌 L 분획물은 CentriVap DNA 진공 농축기(Labconco, Missouri, USA)로 농축한 후 PBS(pH 7.2)를 용리액으로 하고, 수퍼덱스(Superdex) 75 겔 여과 컬럼을 이용해 0.5 ㎖/분의 유속으로 280 ㎚에서 모니터링 하면서 크로마토그래피를 수행하여 분자량이 큰 주첨두(major peak)와 부첨두(minor peak)를 얻었다(도 3의 B 참조).
이렇게 얻어진 진토닌 E와 L은 개구리알에서 CaCC 활성을 나타내는 것을 확인한 후, 진토닌 E 분획물은 다시 100, 150, 200, 250 mM NaCl이 함유된 20 mM Tris-HCl(pH 8.2)을 사용하여 단계 기울기(step gradient) DEAE 음이온 교환 컬럼(anion exchange columm; HiTrapTM DEAE FF, 1㎖)에 1 ㎖/분의 유속으로 로딩하여 4개의 첨두를 얻었다(도 3의 C 참조). 이 중 100, 150, 및 200 mM NaCl 용리액의 분획물을 대량 투석(extensive dialysis)과 농축한 후 다시 0 내지 1 M NaCl이 함유된 20 mM Tris-HCl(pH 8.2)을 사용하여 단계 기울기 DEAE 음이온 교환 컬럼을 수행한 다음 최종적으로 수퍼덱스 75 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 최종 분획물을 각각 3.7, 26.7 및 13.5 ㎎씩 얻었으며, 이들은 각각 진토닌 E1, E2 및 E3으로 명명하였다.
한편, 진토닌 L 분획물은 150, 200, 250, 300, 400 mM NaCl이 함유된 PBS(pH 7.2)를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 얻은 5개의 첨두(도 3의 D 참조) 중에서 150, 200, 및 250 mM NaCl 용리액의 분획물에 대해 최종 분획물을 7.4, 17,6 및 6.6 ㎎씩 얻었으며, 이들은 각각 진토닌 L1, L2 및 L3으로 명명하였다.
또한, 이들의 수율은 조총사포닌 분획(CGSF) 908 g으로부터 각각 진토닌 E1이 0.0004%(3.7 ㎎), 진토닌 E2가 0.0029%(26.7 ㎎), 진토닌 E3가 0.0015%(13.5 ㎎), 진토닌 L1이 0.0008%(7.4 ㎎), 진토닌 L2가 0.0019%(17.6 ㎎), 및 진토닌 L3가 0.007%(6.6 ㎎)인 것으로 나타났다.
실시예 3. 진토닌의 분자량 결정
상기와 같이 수득된 6개의 각각 다른 진토닌은 야마모토 등의 방법(Yamamoto, Y., Nunome, T., Yamauchi, R., Kato, K., and Sone, Y. (1995) Carbohydr Res. 275, 319-332)에 준하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 분자량을 결정하되, PBS(pH 7.2)로 평형을 유지한 수퍼덱스 75 컬럼(10×300 ㎜)이 장착된 바이오로직 듀오플로우 크로마토그래피 시스템(BioLogic DuoFlowTM Chromatograpgy; BIO-RAD, California, USA)을 사용하여 280 ㎚에서 모니터링 하면서 유속 0.5 ㎖/분으로 분획물을 모은 후, 면역글로불린 G(IgG; 160,000 Da), 소혈청알부민(BSA; 67,000 Da), β-락토글로불린(β-lactoglobulin; 35,000 Da), 사이토크롬 C(cytochrome C; 12,327 Da), 및 아프로티닌(aprotinin; 6,512 Da)과 같은 표준단백질로 이루어진 교정곡선(calibration curve)을 이용하여 분자량을 결정하였다.
그 결과, 진토닌이 띠는 전하가 달라 NaCl 기울기 용출에 따라 용출(elution) 패턴이 다르게 보였으나, 겔 여과 크로마토그래피에서는 거의 동시에 용출되어 분자량은 거의 같았다(도 4의 B 및 D 참조).
또한, 표준단백질을 이용하여 결정한 진토닌 L2의 native 분자량 역시 약 67 kDa이었으며(도 5 참조), 다른 진토닌들의 분자량 역시 약 67 kDa인 것으로 확인되었다(도식하지 아니함).
또한, SDS-PAGE의 결과, 6개의 진토닌이 broad 하지만 단일한 주 밴드(single major band)를 나타내었으며, 이의 겉보기 분자량(apparent molecular weight)은 약 13 kDa로 확인되었다.
상기와 같은 결과는 본 발명의 진토닌이 오량체(pentamer)인 것을 시사한다(도 6의 A 참조).
실시예 4. 진토닌의 순도결정
또한, 상기의 조 진토닌 및 개별 진토닌의 순도를 결정하기 위하여 12.0% 분리겔(separating gel)을 사용하여 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하였다(Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685).
구체적으로, 조 진토닌과 개별 진토닌 E1~E3, L1~L3을 100 ㎍씩 취하여 각 레인(lane)에 로딩하여 전기영동 후, 진토닌 밴드를 Coomassie Brilliant Blue R-250 염색으로 시각화 하였다. 또한, 당단백질(glycoprotein) 검출을 위해서 겔은 PAS 염색(periodic acid-schiff based staining) 기법을 사용하여 염색하고, 40% 에탄올-7% 아세트산수용액에서 30분간 배양한 다음 1% 과요오드산-3% 아세트산에서 1시간 배양한 후, 과요오드산 용액을 제거하고 Schiff 시약을 첨가하여 1시간 동안 배양하였다. 염색된 당단백질의 밴드는 분홍색을 띠며, PAS 염색된 겔은 7.5% 아세트산으로 적심(soaking) 후 보관하였다.
실시예 5. 진토닌의 아미노산 조성 분석
일반 아미노산(general amino acid) 분석을 위해, 진토닌 30 ㎍을 진공 하(in vacuo)에서 6 N HCl으로 110℃에서 24시간 동안 가수분해 하였다. 또한, 시스테인(cysteine)의 분석을 위해서는, 진토닌을 과산화(peroxidation) 후 6 N HCl으로 110℃에서 24시간 동안 가수분해 하고, 포름산:과산화수소(10:1) 용액으로 처리하였으며, 트립토판(trypophan)의 분석을 위해서는, 시료를 4 M 메탄설폰산(methanesulfonic acid)으로 가수분해하고, 4 M KOH를 가했다.
또한, 페닐이소티오시아네이트(Phenylisothiocyanate, PITOC) 유도체에 숨겨진 아미노산은 대전에 소재한 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 워터스 노바-팩 C18 컬럼(Waters Nova-Pak C18 column; 3.9×300 ㎜)이 장착된 HPLC(Hewlett Packard 1100 series)로 분석하였다.
단백질 성분은 표준으로 소 혈청 알부민(BSA)을 사용한 Bradford법(Bradford, M. M. (1976). Anal. Biochem. 72, 248-254)으로 결정하였다.
실시예 6. 진토닌의 부분 아미노산 서열
진토닌의 N-말단 아미노산 서열은 자동 에드만 분해 어플라이드 바이오시스템 모델 477A 가스상 단백질 서열(automated Edman degration on an Applied Biosystem model 477A gas-phase protein sequence) 및 밀리겐 6600 고체상 서열(MilliGen 6600 solid-phase sequence)에 의해 수행되었다.
진토닌 100 ㎍을 12% 분리겔을 사용하여 SDS-PAGE를 실시하고, 단백질 밴드는 Coomassie Brilliant Blue R-250 염색으로 시각화 하였다. 상기 밴드를 절단하여 트립신(trypsin)에서 digesting 하고, 상기 digestion product는 탈염(desalt) 및 농축하였다.
이렇게 유도된 모든 펩타이드들의 MS/MS는 한국기초과학지원연구소에서 나노-ESI가 장착된 질량 분석계(Mass spectrometer; QTOF Ⅱ, Micromass, UK)를 사용하여 수행하였다. 이때, 생성된 이온(product ion)은 반사체(reflector), 마이크로채널 검출기(microchannel plate detector), 및 시간 대 디지털 변환기(time-to-digital converter)가 고정된 직각 TOF 분석기(orthogonal TOF analyzer)를 이용하여 분석하였으며, 데이터는 윈도우 NT 환경에서 Mass Lynx software가 구동되는 PC를 사용하여 처리하였고, 서열 동족체는 BLAST(www.ncbi.nln.nih.gov/BLAST.cgi)를 사용하여 검색하였다.
표 1은 진토닌의 de novo 아미노산 서열과 조성을 나타낸 것으로, 순수분리된 진토닌은 자동 에드만 분해에 의한 N-말단 아미노산 서열로 이루어진 것으로 확인되었다. 그러나, 진토닌의 N-말단이 블로킹(blocking)되어 전체 서열을 얻을 수 없었기 때문에 MALDI-TOF-MS/MS 이용하여 트립신 처리한 진토닌으로부터 18개의 내부 펩타이드 서열(internal peptide sequence)을 추정한 결과, 6개의 개별 진토닌은 일반적으로 몇 개의 펩타이드를 함유하였고, 아미노산 서열은 인간 글루코키나제(human glucokinase) 및 글루코키나제 아이소형 2(glucokinase isoform 2)와 부분적 상동성을 나타내었다(도식하지 아니함).
또한, Braford 방법에 의한 진토닌의 총단백질의 함량은 진토닌 E1, E2, E3, L1, L2, 및 L3에서 각각 9.4, 24.1, 20.5, 35.8, 37.1 및 39.6%인 것으로 나타났다. 진토닌 L1~L3의 단백질 함량은 진토닌 E1의 그것보다 약 3배 높은 함량이다.
또한, 진토닌에서 소수성 아미노산(hydrophobic amino acid)은 친수성 아미노산(hydrophilic amino acid) 보다 더 많았으나, 히스티딘(His)과 티로신(Tyr) 및 메티오닌(Met)은 검출되지 아니하였다. 이 중에서 메티오닌은 진토닌의 N-말단이 블로킹 되어 검출되지 않은 것으로 생각된다.
한편, 진토닌 E1~E3 및 L1~L3에서 공통적으로 페닐알라닌(Phe)이 제일 높게 함유하는 것으로 나왔다. 또한, 진토닌 L1~L3에서의 리신(Lys)은 E1~E3 보다 높게 나타났다(표 1 참조).
표 1 본 발명에 따른 진토닌의 아미노산 조성(%)
아미노산 E1 E2 E3 L1 L2 L3
CYA 2.90 3.87 1.29 0.97 1.14 0.94
ASX 8.27 8.60 6.11 1.89 3.71 3.98
GLX 6.67 7.22 4.57 2.43 4.89 4.25
Ser 4.57 4.29 3.29 2.29 5.00 3.59
Gly 12.40 13.67 11.55 12.88 11.57 10.56
His 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Arg 1.68 1.85 1.19 0.63 1.69 1.10
Thr 3.11 3.29 2.20 1.37 1.46 1.79
Ala 5.62 6.98 3.59 4.52 4.07 4.67
Pro 4.52 4.90 3.30 3.18 3.09 4.86
Tyr 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Val 3.13 3.89 3.74 3.99 4.68 6.00
Met 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Ile 6.03 5.16 7.54 10.36 8.83 7.76
Lue 3.96 5.09 3.43 4.26 6.83 10.09
Phe 26.40 18.66 35.10 28.89 21.37 22.47
Trp 3.59 7.10 3.62 4.88 8.13 6.10
Lys 7.14 5.42 9.78 17.48 13.56 11.85
단, 상기에서 CYA는 시스테인과 시스틴의 합계이며, ASX는 아스파라긴과 아스파르트산의 합계이고, GLX는 글루타민과 글루탐산의 합계이다.
실시예 7. 진토닌의 탄수화물 조성 분석
도 6의 A에서 나타난 바와 같이, SDS-PAGE에서 진토닌의 밴드는 단일(single)하지만 broad하였고, Comassie Brilliant blue staining으로 강하게 염색되지 않았기 때문에 탄수화물을 포함하고 있을 가능성이 있다.
따라서, 진토닌의 탄수화물 조성을 확인하기 위하여, 진토닌을 2 M 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)으로 100℃에서 4시간 동안 가수분해한 후 중성당(neutral sugar)을 얻었으며, 또한 진토닌을 유리 앰플(ampule)에서 6 N HCl로 100℃에서 4시간 동안 가수분해를 통해 아미노당(amino sugar)과 산성당(acid sugar)을 얻었다.
진토닌의 탄수화물 조성은 서울 소재의 세종대학교 탄수화물 소재 연구소에 의뢰, PAS 염색(periodic acid-schiff based staining) 기법을 사용하고 염색한 후 CarboPacTM PA1 컬럼이 장착된 HPAEC-PAD 시스템(high performance anion exchange chromatography-plused amphermetric dectection system; Dionex, California, USA)을 사용하여 분석하였다. 단당류의 몰중량(molar weight)은 첨두의 면적(peak area)으로부터 계산하였으며, 탄수화물 함량은 중성당의 경우, 페놀-설폰산 방법(Hounsell, E.F., Davies, M.J., and Smith, K.D. (1997) Protein protocol handbood, Humanna press, Totawa, 803-804)으로 결정하고, 산성당은 Anthrone 방법으로 결정하였다(Scott, T.A., and Melvin, E.H. (1953) Anal. Biochem. 25, 1656-1660).
그 결과, 진토닌은 람노스(rhamnose), 아라비노오스(arabinose), 글루코오스(glucose), 만노오스(mannose), 크실로오스(xylose)와 같은 5개의 다른 종류의 중성당(neutral sugar)과 글루코사민(glucosamine)과 같은 1개의 아미노당(amino sugar)으로 구성된 것으로 확인되었으며, 6개의 진토닌은 서로 거의 유사한 탄수화물 구성을 갖는 것을 알 수 있었다(표 2 및 도 7 참조). 그러나, 진토닌 E1~E3에서 만노스는 검출되지 않았다.
한편, 1-N-아세틸-뉴라민산(1-N-acetyl-neuramic acid), 2-갈락투론산(2-galactouronic acid), 3-글루쿠론산(3-glucouronic acid)과 같은 산성당은 검출되지 않았다(도식되지 아니함).
마지막으로, 진토닌의 총 탄수화물 함량은 진토닌 E1, E2, E3, L1, L2 및 L3에서 각각 약 34.3, 45.3, 38.1, 36.0, 29,8 및 45.2%로 나타났으며, 상기 결과로부터 본 발명의 진토닌은 당단백질이라는 것을 재확인할 수 있었다.
표 2 본 발명에 따른 진토닌의 탄수화물 조성(%)
탄수화물 E1 E2 E3 L1 L2 L3
Rhamnose 0.86 1.02 0.91 1.11 0.93 1.09
Arabinose 5.66 5.10 5.66 9.11 8.32 7.36
Glucose 84.84 84.41 83.97 77.16 74.64 71.59
Manose - - - 1.76 2.30 3.37
Xylose 1.12 0.94 0.95 2.73 2.55 2.50
Glucosamine 7.52 8.53 8.51 8.13 11.26 14.09
실시예 8. 진토닌의 지질 성분 분석
본 발명의 진토닌은 n-부탄올 추출에 의해 진세노사이드와 같은 분획에 있었기 때문에 진토닌 역시 지질 모이어티(lipid moiety)를 함유할 것으로 예상할 수 있다.
이를 확인하기 위하여, 진토닌을 6 N HCl로 4시간 동안 100℃에서 가수분해 하거나 또는 지질단백질 리파아제(lipoprotein lipase)에 소화시켜 지질(lipid) 및 소수성 모이어티(hydrophobic moiety)를 확인하였다.
구체적으로, 조총사포닌 분획(CGFS)을 산 가수분해 또는 소화시킨 것을 농축하여 다시 물과 n-헥산으로 더 분획한 후, n-헥산 분획물을 DB5-MS 모세관 컬럼(capillary column; 30 ㎝×250 ㎛×0.25 ㎛)이 장착된 Agilent 6890N GC-MS 시스템(California, USA)을 이용하여 한국기초과학지원연구소에서 지질(lipid) 및 소수성 모이어티(hydrophobic moiety)를 분석하였다. 이때, GC(6890N)는 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector)와 분리 주입 시스템(split injection system)이 장착되었으며, supelco SPB-1 모세관 컬럼(내경: 15 m×0.32 ㎜; 두께: 0.25 m)을 고정하였다.
그 결과, 표 3과 도 8에 나타난 바와 같이, 진토닌은 에스테르형(ester form) 또는 자유형(free form)의 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid) 등을 함유하는 것으로 확인되었다.
또한, 진토닌 E1이나 L1에서 다가 불포화지방산인 리놀레산의 비율은 포화 지방산인 팔미트산과 스테아르산 또는 올레산보다 높았으며, 팔미트산은 진토닌 E2, E3, L1, L2에서 다량 함유되어 있었다.
또한, GC에 의해 측정한 진토닌에 함유된 총 지질 함량은 진토닌 E1, E2, E3, L1, L2 및 L3가 각각 약 34.3, 45.3, 38.1, 36.0, 29,8 및 45.2%로 나타났으며, 이 중 진토닌 E1의 지질함량이 가장 높았다.
상기와 같은 결과는 본 발명의 진토닌이 신규한 당지질단백질(glycolipoprotein)이라는 것을 시사한다.
표 3 본 발명에 따른 진토닌의 지질 조성(%)
지질 E1 E2 E3 L1 L2 L3
Palmitic acid(16:0), ester form 29.82 57.39 56.59 36.48 41.78 39.5
Stearic acid(18:0), ester form 4.22 8.73 8.20 4.74 5.49 5.44
Oleic acid(18:1) or Oleic acid ester form 7.08 26.06 27.52 14.32 30.04 26.64
Linoleic acid(18:2) or Linoleic acid ester form 58.88 7.82 7.69 44.46 22.69 28.42
측정예 1. Xenopus laevis oocytes에서 CaCC 활성 측정
1-(1). Oocyte 준비
Xenopus Ⅰ(Ann Arbor, MI, USA)로부터 얻은 Xenopus laevis는 최상의 규격지침에 따라 보관 및 처리하고, oocytes(난자)를 분리하기 위해 개구리를 3-아미노벤조산에틸에스테르(3-amino benzoic acid ethyl ester)의 통기용액(aerated solution)으로 마취시켜 수술한 후 콜라게나제(collagenase)로 처리한 다음 82.5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 2.5 mM 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 100 units/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 Ca2+ 유리 배지에서 2시간 동안 교반하여 분리하였다.
Ⅴ-Ⅵ 단계의 난자를 수집하여 젠타마이신(gentamicin) 50 ㎍/㎖를 추가한 ND96(96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 및 5 mM HEPES; pH 7.4)에서 보관하였으며, 상기 난자를 포함하는 용액은 연속적으로 가볍게 진탕하면서 18℃로 유지하고, 매일 교환하였다.
1-(2). CaCC의 측정
2-전극 전압고정(two-electrode voltage clamp) 기록은 소형 플랙시글라스(plexiglass) 네트 챔버(0.5㎖)에 놓인 개별적인 난자로부터 얻었으며, 전기생리학 실험(electrophysiological experiments)은 3 M KCl로 채운 마이크로전극(저항: 0.2~0.7㏁)과 난자 고정 증폭기(Oocyte Clamp amplifier; OC-725C, Warner Instrument, CT, USA)를 사용하여 실온에서 진행한 후 CaCC를 -80 ㎷ 지지전위(holding potential)에서 기록하였다.
진토닌은 증탕 관류(bath perfusion)에 의해 난자에 적용하였다(Lee, J. H., Jeong, S. M., Lee, B. H., Noh, H. S., Kim, B. K., Kim, J. I., Rhim, H., Kim, H. C., Kim, K. M., and Nah, S. Y. (2004) J Biol Chem 279, 9912-9921).
측정예 2. 마우스 EAT 세포에서 세포 내 유리 칼슘([Ca 2+ ] i ) 측정
2-(1). EAT(Ehrlich Ascites Tumor) 세포의 준비
EAT 세포는 Jørgensen 등의 방법(Jørgensen, N. K., Pedersen, S. F., Hoffmann, E. K. (1999) Am J Physiol 276. C26??C37)에 따라 ICR 생쥐에서 복강내 이식(interaperitoneal transplantation)에서 매주 수집하였다.
구체적으로, 복수(ascites fluid)는 마우스 복막강(peritoneal cavity)으로부터 2.5U/㎖ 헤파린이 포함된 Hank's 용액에 수집하였으며, RBC로부터 EAT 세포를 분리하기 위해서는, EAT 세포를 10 및 20% 피콜 용액(Ficoll solution)의 두 층을 포함하는 원심분리관에 로딩하여 1,800 rpm으로 20분 동안 원심분리 하고, EAT 세포만을 얻었다. 상기 세포는 원하는 세포수가 되도록 부유시킨 후 실험을 시작하기 전에 약 30분간 배양하였다.
2-(2). Fura 2와 EAT 세포의 혼합
Fura 2-loaded mouse EAT 세포에서 G-단백질 결합 수용체 작용제(G-protein coupled receptor agonist) 처리는 세포 내 유리 칼슘([Ca2+]i)의 일시적인 증가를 유도하는 것이 밝혀졌다(Scott and Melvin. Anal. Biochem., 25, 1656-1660, 1953).
본 발명에서는 진토닌 또는 진세노사이드 Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rg1이 Fura 2-loaded mouse EAT 세포에서의 [Ca2+]i의 일시적 증가에 효과를 나타내는지를 확인하기 위하여, Fura-2에 섞은 EAT 세포(2~4×106/㎖)는 1.5 mM Ca2+ 완충액(buffer) 또는 Ca2+ 유리 완충액(free buffer)에서 10분간 배양한 후 진토닌과 진세노사이드를 첨가하고 EAT 세포에서 세포 내 칼슘 농도에 미치는 효과를 확인하였다. 단, 이용할 수 있는 순수 분리된 개별 진토닌 양의 한계 때문에, 대표적인 진토닌으로서 진토닌 E2를 사용하여 마우스 EAT 세포(Riken BRC Cell Bank, Tsukuba, Japan)에서의 [Ca2+]i 증가에 대해 실험하였다.
구체적으로, Jørgensen 등의 방법에 따라 NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1.5 mM, 글루코오스 10 mM, 및 HEPES 25 mM로 구성된 Ca2+ 완충액(pH 7.2)과 NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, EGTA 0.2 mM, 글루코오스 10 mM, 및 HEPES 25 mM로 구성된 Ca2+ 유리 완충액(pH 7.4)을 사용하여 37℃ 수욕조(water bath)에서 30분간 진탕하면서 2 μN Fura 2-AM에 EAT 세포(2~4×106/㎖)를 혼합하고, 과량의 fura-2는 세포를 Ca2+ 완충액 또는 Ca2+ 유리 완충액으로 3번 씻어서 제거하였다.
2-(3). 세포 부유물 내 [Ca 2+ ] i 의 형광 측정
[Ca2+]i는 RF-5300PC 세포내 이온 측정 시스템(Intracellular Ion Measurement System; Shimadzu Corporation, Japan)을 사용하여 Fura 2-loaded cell에서 추정하였다. 구체적으로, Fura 2-loaded cell은 최종적으로 2~4×106/㎖까지 실험 배지에서 희석한 후, 폴리스틸렌 큐벳(Elkay Ultra-UV)으로 옮겼다. 세포는 테플론 코팅된 자석을 사용하여 교반하였으며, 큐벳 하우징은 37℃로 조절하였다. 여기 파장들(excitation wavelengths)들은 컴퓨터 제어 하에서 340 및 380 ㎚ 사이를 교대하였고, 방출(emission)은 510 ㎚에서 검출하였다. 이때, 여기 및 방출 틈새 너비는 5 ㎚로 하였으며, 배경 보정은 Jørgensen 등의 방법에 준하여 실시하되, 디지토닌(digitonin) 및 EGTA는 fura-2가 완전하게 Ca2+와 화합하고 Ca2+로부터 해리되는 상태를 만들기 위한 농축 반응 시약(concentration adjustment reagent)으로 사용하였다.
2-(4). Fura 2 측정값으로부터 [Ca 2+ ] i 의 추정
측정된 340 ㎚ 대 380 ㎚의 비율값(ratio value)은 Hounsell 등의 식(Hounsell, E.F., Davies, M.J., and Smith, K.D. (1997) Protein protocol handbood, Humanna press, Totawa, 803-804)을 사용하여 [Ca2+]i의 값으로 변환하였다.
[Ca2+] = Kd [(R - Rmin)/(Rmax - R)](Sf380/Sb380)
단, K d는 해리 상수(224 nM)이며, R은 측정된 340 ㎚ 대 380 ㎚의 형광비(fluorescence ratio)이고, Rmax 및 Rmin는 50 ㎍/㎖ 디지토닌을 첨가한 포화 농도에서의 R값 및 20 mM EGTA를 첨가한 유리 배지에서의 R값이다. 또한, Sf380와 Sb380는 디지토닌과 EGTA를 첨가했을 때 380 ㎚에서의 형광 세기(fluorescene intensity)이고, 비율은 이들 값이 표시될 때의 최대 및 최소값이다(Grynkiewicz, G., M. Poenie, and R. Y. Tsien. (1985) J Biol Chem 260: 3440-3450).
2-(5). 데이터 분석
InsP6를 포함하는 농도 반응 곡선을 얻기 위해, 관찰된 첨두(peak)의 진폭을 표준화 및 도표화 한 후 Origin software(Northampton, MA)를 사용하여 하기의 Hill 식에 대응시켰다.
y/ymax = [A]n/([A]n + [EC50]n)
단, 상기에서 y는 진토닌의 주어진 농도에서의 % 활성이며, ymax는 최대 첨두 전류(maximum peak current)이고, [EC50]은 최대 반응의 50%를 나타낼 수 있는 진토닌의 농도, [A]는 진토닌의 농도이다. 또한, n은 상호 계수(interaction coefficient)이고, 모든 값은 평균±표준오차로 나타내었으며, 대조군과 진토닌 처리군 데이터 사이의 평균차는 unpaired Student's t-test를 사용하여 분석하였다. 통계학적 유의성은 P<0.05에서 검정하였다.
실험예 1. Xenopus laevis oocytes에 내인성으로 존재하는 CaCC 활성에 대한 조 진토닌 및 개별 진토닌의 효과 확인
개구리알(Xenopus laevis oocytes)에 내인성으로 존재하는 CaCC 활성에 대한 조 진토닌 및 개별 진토닌의 효과를 확인하기 위하여, 상기 참조예 1의 각각의 방법을 사용하여 CaCC의 활성 증가로 기록되는 지지전위를 측정하였다.
그 결과, 조 진토닌을 처리한 군에서는 - 80 ㎷ 지지전위(holding potential)에서 내향성(inward) Cl- 전류를 유도하였으나, 진세노사이들은 유도 효과가 전혀 확인되지 않았으며, ED50은 4.4±0.5 ㎍/㎖인 것으로 나타났다(도 9의 A 및 B 참조).
또한, 개별 진토닌에 대해서도 개구리 알에서의 CaCC 활성 효과를 실험한 결과, 진토닌 E1~E3 및 L1은 거의 동일한 정도의 CaCC 활성을 나타내었으나 진토닌 L2와 L3은 상대적으로 약한 CaCC 활성을 나타내었으며(도 9의 C 참조), 이때 ED50은 각각 진토닌 E1~E3가 1.5±0.1, 2.3±0.1, 1.5±0.1, 진토닌 L1~L3가 1.0±0.1, 3.2±0.2 및 4.3±0.2 ㎍/㎖이었다.
실험예 2. 마우스 EAT 세포에서 세포 내 유리 칼슘([Ca 2+ ] i )에 대한 효과 확인
상기 측정예 2의 각각의 방법에 따라, 마우스 EAT 세포에서 세포 내 [Ca2+]i를 측정한 결과, 부유시킨 EAT 세포에 진세노사이드를 단독으로 각각 100 μM씩 처리했을 때, 실험한 어떤 진세노사이드도 EAT 세포에 반응을 일으키지 못한 반면, 이와 대조적으로 100 ng/㎖의 진토닌 E2로 처리한 실험군에서는 [Ca2+]i를 일시적으로 증가시키는 것이 확인되었다(도 10의 A 참조).
도 10의 B는 진토닌 E2에 의해 유도된 [Ca2+]i의 증가가 처리 농도 의존적이라는 것을 보여준다. 흥미롭게도, 진토닌 E2에 의해 유도된 [Ca2+]i의 일시적인 증가는 외부의 Ca2+(0.2 mM EGTA를 포함하는 Ca2+ 유리 완충액)를 제거함으로써 크게 감소하였다(P<0.001, 세포 외 Ca2+ 존재 대비). 이는 세포 외 Ca2+ 역시 진토닌 처리시 세포 내로 들어간다는 것을 의미한다. 그러나, 진토닌 E2의 처리는 여전히 농도 의존적으로 [Ca2+]i를 증가시켰으며, 이로부터 진토닌 E2에 의해 유도된 [Ca2+]i의 증가는 세포 내 저장 Ca2+의 방출과 세포 바깥쪽에서의 Ca2+의 유입에 의한 것임을 알 수 있었다.
이때, EC50값은 세포 외 Ca2+ 존재와 부재에 따라 각각 33.6±8.2 ng/㎖와 43.6±14.2 ng/㎖(평균±표준오차, n=5~6) 이었으며, 상기와 같은 결과는 포유동물 세포에서 [Ca2+]i의 증가를 일으키는 것은 진세노사이드가 아닌 진토닌이라는 것을 보여준다.
실험예 3. 조 진토닌에 의한 CaCC 활성과 EAT 세포에서 [Ca 2+ ] i 상승효과에 대한 PLC 억제제, IP 3 수용체 길항제 또는 Ca 2+ 킬레이트제 효과 확인
세포질의 [Ca2+]i와 CaCC 활성화를 증가시키는 진토닌-유도 신호 전달 경로에서의 인지질분해효소 C(phospholipase C, PLC)의 가능한 역할을 설명하기 위해, 먼저 활성 PLC 억제제인 U-73122와 비활성 유사체인 U-73343의 효과를 개구리알(Xenopus oocytes)과 마우스 EAT 세포를 이용하여 확인하였다.
개구리알에서 조 진토닌-유도 CaCC 전류는 U-73122에서 대조군(control)의 3.9±0.3%였으나, U-73343에서는 대조군의 97.2±0.2% 이었다(도 11의 A 참조). 이러한 결과는 진토닌에 의해 유도된 [Ca2+]i의 상승과 진토닌에 의해 매개된 CaCC 활성화가 PLC 활성화를 통해 매개된다는 것을 의미한다.
다음 단계로, IP3 수용체(receptor)를 통한 세포 내 Ca2+ 방출이 진토닌-유도 CaCC 활성화를 일으키는지 여부를 검사하였다(Grynkiewicz, et al., J. Biol. Chem. 260: 3440-3450, 1985; Parekh, A.B. Pflugers Arch.-Eur. J. Physiol., 430, 954-963, 1995; Broad, et al., J. Biol. Chem. 276, 15945-15952, 2001).
이를 위해, IP3 수용체 길항제(IP3 receptor antagonist)인 막 투과성 2-APB(2-aminoethoxydiphenyl borate)의 진토닌-유도 CaCC 활성에 대한 효과를 검사하였다.
도 11의 B에서 나타난 바와 같이, 2-APB의 첨가는 진토닌에 의해 유도된 내향성 Cl- 전류(1.3±0.2 내지 0.03±0.01 ㎂의 대조 전류, P<0.01)를 거의 완전히 소멸시켰으며, 또한 막 투과성 BAPTA(1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid)-AM(10 μM 최종) 처리로 세포 내 유리 Ca2+를 제거하는 것 역시 진토닌-매개 CaCC 활성화를 거의 소멸시켰다(도 11의 C 참조).
마우스 EAT 세포의 경우에서도 U-73122의 처리는 세포 외 Ca2+의 존재 유무와 관계없이 진토닌의 작용을 거의 소멸시키는 것으로 나타났으나, U-73343은 그렇지 않았다(도 12 참조).
이러한 결과들은 개구리알과 마우스 EAT 세포에서 PLC-IP3-Ca2+ 경로를 통해 일어나는 CaCC 활성을 일으키는 조총사포닌 분획(CGSF)의 주요 활성 물질이 진토닌이라는 것을 재차 확인해 주고 있다.
결론적으로, 본 발명의 진토닌은 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 작용은 물론 세포외로부터 칼슘의 유입 증가를 유발하여 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 신호 전달 경로를 통해 그 효능을 나타냄을 알 수 있었다.
본 발명의 진토닌을 포함하는 약학조성물의 제제예를 하기와 같이 예시하나, 본 발명은 이를 한정하고자 하는 것이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 정제의 제조
진토닌 100㎎
유당 100㎎
전분 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예 2. 산제의 제조
진토닌 100㎎
유당 100㎎
탈크 10㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 3. 캡슐제의 제조
진토닌 100㎎
결정성 셀룰로오스 3㎎
락토오스 14.8㎎
스테아린산 마그네슘 0.2㎎
통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
진토닌 20㎎
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
진토닌 1000㎎
이성화당 10g
만니톨 5g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강식품의 제조
진토닌 100㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70㎕
비타민 E 1.0㎎
비타민 B1 0.13㎎
비타민 B2 0.15㎎
비타민 B6 0.5㎎
비타민 B12 0.2㎍
비타민 C 10㎎
비오틴 10㎍
니코틴산아미드 1.7㎎
엽산 50㎍
판토텐산 칼슘 0.5㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75㎎
산화아연 0.82㎎
탄산마그네슘 25.3㎎
제1인산칼륨 15㎎
제2인산칼슘 55㎎
구연산칼륨 90㎎
탄산칼슘 100㎎
염화마그네슘 24.8㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강음료의 제조
진토닌 100g
비타민 C 15g
비타민 E(분말) 100g
젖산철 19.75g
산화아연 3.5g
니코틴산아미드 3.5g
비타민 A 1.0g
비타민 B1 0.13g
비타민 B2 0.15g
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 다음의 단계를 포함하는 신규 당지질단백질(glycolipoprotein) 진토닌(gintonins)의 제조방법:
    (1) 인삼으로부터 메탄올 추출물을 제조하는 단계;
    (2) 상기 메탄올 추출물을 물과 n-부탄올의 혼합용매로 분획하는 단계;
    (3) 상기 물 분획물과 n-부탄올 분획물 중 n-부탄올 분획물을 용출용매로서 클로로메탄:메탄올:물의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 8개의 분획으로 분리하는 단계;
    (4) 상기 8개의 분획물 중 CaCC(Ca2+-activated Chloride Channel)에 대한 활성이 가장 높은 7번째 분획물을 용출용매로서 에탄올:에틸아세테이트:물의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 2개의 분획으로 분리하는 단계; 및
    (5) 상기 2개의 분획물 중 CaCC 활성이 높은 분획물 Ⅱ를 투석하여 최종 생성물을 얻는 단계.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (5) 단계 이후, 하기 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 개별 진토닌(gintonin) E1, E2, E3, L1, L2 및 L3의 제조방법:
    (6) 최종 분획물을 NaCl이 함유된 pH 7.2의 인산염 완충 식염수(phosphate buffer saline; PBS) 용액에 용해하여 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 2개의 분획으로 분리하는 단계; 및
    (7) 상기 2개의 분획물을 각각 NaCl이 함유된 pH 8.2의 Tris-HCl와 NaCl이 함유된 pH 7.2의 인산염 완충 식염수(PBS) 용액으로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 개별 당지질 단백질을 분리하는 단계.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 인삼은 홍삼, 수삼, 백삼, 재배삼, 장뇌삼 및 산삼으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 신규 당지질단백질(glycolipoprotein) 진토닌(gintonins)의 제조방법.
  4. 제 2항의 방법으로 제조되고, 분자량이 67 kDa이며, 겉보기 분자량은 13 kDa인 오량체(pentamer)인 것을 특징으로 하는 인삼에서 분리 동정한 신규 당지질 단백질 진토닌 E1, E2, E3, L1, L2 및 L3.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 당지질단백질은 아미노산조성 성분으로 시스테인과 시스틴(cysteine and cystine), 아스파라긴과 아스파르트산(asparagine and aspartic acid), 글루타민과 글루탐산(glutamine and glutamic acid), 세린(serine), 글리신(glycine), 아르기닌(arginine), 트레오닌(threonine), 알라닌(alanine), 프롤린(proline), 발린(valine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan) 및 리신(lysine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼에서 분리 동정한 신규 당지질 단백질 진토닌.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 당지질단백질은 탄수화물 조성 성분으로서 람노스(rhamnose), 아라비노오스(arabinose), 글루코오스(glucose), 만노오스(mannose), 크실로오스(xylose) 및 글루코사민(glucosamine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼에서 분리 동정한 신규 당지질 단백질 진토닌.
  7. 제 4항에 있어서,
    상기 당지질단백질은 지질 조성 성분으로서 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palmitic acid), 올레산(oleic acid), 및 스테아르산(stearic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼에서 분리 동정한 신규 당지질 단백질 진토닌.
  8. 제 4항의 당지질단백질을 유효성분으로 포함하는 정신분열(Schizophrenia), 알츠하이머병(Alzheimer's Disease), 헌팅톤병(Hungtington's Disease), 유전적 편마비편두통(Familial hemiplegic migraine), 간질(Eilepsy), 발작적 운동실조증(episodic ataxia), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxias) 및 칼슘부족으로 인한 성장저해 중에서 선택되는 칼슘 농도 저하로 기인되는 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
  9. 제 4항의 당지질단백질 및 식품할적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품.
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