KR101980816B1

KR101980816B1 - 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 치료 또는 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101980816B1
Application number: KR1020170151988A
Authority: KR
Inventors: 최기춘; 박형수; 김원호; 최기준
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2017-11-15
Publication date: 2019-05-22

Abstract

본 발명은 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산을 유효성분으로 함유하여 지방세포의 C/EBP-β, C/EBP-α, PPAR-γ, SREBP-1의 발현수준을 낮추고, p38MAPK 및 p44/42의 발현수준 및 AMPK-α의 인산화를 증가시켜 지방세포형성 및 세포의 지방축적을 억제함으로써 비만을 효과적으로 예방, 치료 또는 개선할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기와 같은 생리활성을 통해 소의 임신효율을 효과적으로 증강시킬 수 있다.

Description

이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 치료 또는 개선용 조성물{Composition for prevention, treatment or improvement of obesity comprising ferulic acid in italian ryegrass as an active ingredient}

본 발명은 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산을 유효성분으로 함유하여 지방세포의 C/EBP-β, C/EBP-α, PPAR-γ, SREBP-1의 발현수준을 낮추고, p38MAPK 및 p44/42의 발현수준 및 AMPK-α의 인산화를 증가시켜 지방세포형성 및 세포의 지방축적을 억제하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

비만은 그 자체로 또는 다른 질병과 관련하여 사람의 건강에 중요한 문제 중 하나이다. 비만은 2형 당뇨병, 심혈관 질환, 고혈압, 골관절염 등과 관련이 있고, 대사 자유화, 특히 포도당 섭취와 지방산 간지방증을 일으킬 수 있는 지방간으로 이어진다. 비만의 주요 원인은 에너지 섭취와 에너지 소비 사이의 불균형으로 궁극적으로 지방세포의 병리학적 성장을 유도한다. 지방세포는 지방조직의 가장 중요한 세포 구성 요소이다. 과량의 지방은 지방세포에 트리글리세라이드로 저장된다. 지방 수준이 한계를 초과하면 혈장 및 간이나 근육과 같은 다른 조직의 트리글리세리드 함량이 증가하여 생물학적 기능이 저하된다. 지방세포형성은 지방세포 발달과 관련된 전사 인자와 다른 조절 단백질의 캐스케이드를 포함하는 복잡한 과정이다. 최근에 지방세포 분화에 관련된 많은 긍정적이고 부정적인 요인들이 연구되어왔다. 이중 C/EBP-β(CCAAT/enhancer-binding protein-β)와 C/EBP-δ는 PPAR-γ 2(Peroxisome proliferator-activated receptor), C/EBP-α(CCAAT/enhancer-binding protein- α) 및 Krox와 같은 다른 몇몇 전사인자들의 발현을 유도할 수 있다. Krㆌppel과 같은 인자, sterol regulatory binding protein-1c 및 STAT5도 지방세포 분화에 중요한 역할을 한다. 이들 중 PPAR-γ는 세포질과 핵 모두에서 지방세포 분화에 중추적인 역할을 하는 1차 핵수용체 중 하나이다. PPAR-γ의 지방생성 및 전사 활성은 ERK에 의한 Ser84 인산화로 인한 미토겐 자극에 따라 조절될 수 있다. 미토겐 활성화에 따른 PPAR-γ와 핵 MEK 사이의 상호작용은 PPAR-γ의 전위를 유도할 수 있고, 이에 따라 PPAR-γ의 전사 활성이 감소한다.

이탈리안라이그라스(Italian ryegrass, Lolium multiflorum)는 그 영양성분으로 인해 우리나라에서 동물의 사료로 재배되는 일년생 또는 다년생 초본이다. 재배가 간단하고 우리나라에서 성장이 매우 빠르며 또한 대량 재배가 가능하기 때문에, 중요한 화합물의 분리를 위한 좋은 원료이다. 페룰산(ferulic acid, FA)은 아사페티다(asafetida, 자이언트 펜넬의 건조 유액)에서 발견된다. 페룰산은 항산화 및 간보호 활성을 포함한 다양한 생물학적 기능을 갖는다. 페룰산은 3T3-L1 지방세포에서 adiponectin 분비를 촉진할 수 있고, 항염증 활성, 항당뇨 활성, 항암 활성, 항노화 효과, 신경보호 기능, 폐보호 활성, 항혈전 활성, 항우울 효과 및 항죽종형성 활성을 갖는다. 또한, 페룰산은 심혈관계 질환을 예방하고 방사선을 조절할 수 있다. 비록 페룰산이 지방세포 분화 기능을 갖는 것으로 알려져 있지만, 이러한 기능에서 분자적 메커니즘은 명확하게 밝혀지지 않았다.

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본 발명의 주된 목적은 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산의 지방세포에 대한 생리활성을 이용하여 비만의 예방, 치료 또는 개선에 효과적인 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산의 지방세포에 대한 생리활성을 이용하여 소의 임신효율 증강에 효과적인 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산을 유효성분으로 함유하여 지방세포의 C/EBP-β, C/EBP-α, PPAR-γ, SREBP-1의 발현수준을 낮추고, p38MAPK 및 p44/42의 발현수준 및 AMPK-α의 인산화를 증가시켜 지방세포형성 및 세포의 지방축적을 억제하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산을 유효성분으로 함유하여 지방세포의 C/EBP-β, C/EBP-α, PPAR-γ, SREBP-1의 발현수준을 낮추고, p38MAPK 및 p44/42의 발현수준 및 AMPK-α의 인산화를 증가시켜 지방세포형성 및 세포의 지방축적을 억제하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산을 유효성분으로 함유하여 지방세포의 C/EBP-β, C/EBP-α, PPAR-γ, SREBP-1의 발현수준을 낮추고, p38MAPK 및 p44/42의 발현수준 및 AMPK-α의 인산화를 증가시켜 지방세포형성 및 세포의 지방축적을 억제하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선용 기능성 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산을 유효성분으로 함유하여 지방세포의 C/EBP-β, C/EBP-α, PPAR-γ, SREBP-1의 발현수준을 낮추고, p38MAPK 및 p44/42의 발현수준 및 AMPK-α의 인산화를 증가시켜 지방세포형성 및 세포의 지방축적을 억제하는 것을 특징으로 하는 소의 임신효율 증강용 기능성 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산을 유효성분으로 함유하여 지방세포의 C/EBP-β, C/EBP-α, PPAR-γ, SREBP-1의 발현수준을 낮추고, p38MAPK 및 p44/42의 발현수준 및 AMPK-α의 인산화를 증가시켜 지방세포형성 및 세포의 지방축적을 억제함으로써 비만을 효과적으로 예방, 치료 또는 개선할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기와 같은 생리활성을 통해 소의 임신효율을 효과적으로 증강시킬 수 있다.

도 1은 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산(FA)의 화학구조이다.
도 2는 3T3-L1 전지방 세포를 대상으로 한 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산(FA)의 세포독성 실험결과이다. A, 24시간 페룰산 처리; B, 48시간 페룰산 처리.
도 3은 3T3-L1 전지방 세포를 대상으로 한 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산(FA)의 지방세포 분화 및 지질축적에 대한 효과를 실험한 결과이다. A, 10일째의 실험 지방세포에서의 분화 부위; B, 실험 지방세포에서 지질의 Oil Red O 염색; 실험 세포에서의 지질 축적 비율.
도 4는 지방세포생성 및 지방생성 유전자의 mRNA 발현 수준에 대한 페룰산(FA)의 영향을 실험한 결과이다.
도 5는 분화 과정에서 지방세포생성 및 지방생성 단백질의 발현 수준에 대한 페룰산(FA)의 영향을 실험한 결과이다.
도 6은 PPAR-γ 및 지질축적에서 페룰산(FA)과 troglitazone(TRZ) 간의 경쟁을 실험한 결과이다. A, 10일째 DMI에서 분화된 3T3-L1 세포; B, troglitazone 및 페룰산과 함께 DMI에서 분화된 3T3-L1 세포; C, troglitazone과 함께 DMI에서 분화된 3T3-L1 세포; D, 페룰산과 함께 DMI에서 분화된 3T3-L1 세포.
도 7은 지질 및 지방분해경로에 대한 페룰산 또는 isoproterenol(ISO)의 영향을 실험한 결과이다. A, 웨스턴블롯 분석을 바탕으로 한 beta-adrenergic receptor(b-AR), AMP-activated protein kinase(AMPK-a), HSL 및 Fatty acid synthase(FAS)의 단백질 발현 수준, 모든 단백질 신호는 GAPDH로 정상화; B, 대조군과 실험 세포에서 방출된 글리세롤의 양.
도 8은 3T3-L1 세포 분화 동안 p38MAPK 및 p44/42(ERK1/2) 신호 경로에 대한 페룰산의 효과를 실험한 결과이다.
도 9는 비만 마우스를 유도하는 HFD에서 페룰산이 체중, 지방량, 혈청 콜레스테롤 및 중성지방 수치에 미치는 영향을 실험한 결과이다. 1, 체중(g); 2, BMI(kg/㎡); 3, 지방조직질량(%)(지방량의 %는 다음 계산에 의해 계산, 처리 지방 조직의 중량 / 대조군의 지방 조직 중량 × 100); 4, 혈청 총 콜레스테롤 및 중성 지방 수치.
도 10은 비만 마우스를 유도하는 HFD에서 페룰산이 주요 전사 인자 및 다른 단백질 발현에 미치는 영향을 실험한 결과이다. a, 정상식이 대조군 그룹; b, 고지방식이(45%) HFD 그룹; c, 체중 1kg 당 25mg의 페룰산 및 고지방식이 HFD-페룰산 그룹; d, 체중 1kg 당 50mg의 페룰산 및 고지방식이 HFD-페룰산 그룹.
도 11은 비만 마우스를 유도하는 HFD에서 페룰산이 p38MAPK, p44/42(ERK1/2) 및 AMPK-α 신호 경로에 미치는 영향을 실험한 결과이다. a, 정상식이 대조군 그룹; b, 고지방식이(45%) HFD 그룹; c, 체중 1kg 당 25mg의 페룰산 및 고지방식이 HFD-페룰산 그룹; d, 체중 1kg 당 50mg의 페룰산 및 고지방식이 HFD-페룰산 그룹.

본 발명은 이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산이 지방세포의 C/EBP-β, C/EBP-α, PPAR-γ, SREBP-1의 발현수준을 낮추고, p38MAPK 및 p44/42의 발현수준 및 AMPK-α의 인산화를 증가시켜 지방세포형성 및 세포의 지방축적을 억제한다는 새로운 발견을 통해 안출되었다.

본 발명의 조성물은 상기와 같은 생리활성으로 인해 비만을 효과적으로 예방, 치료 또는 개선할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기와 같은 생리활성으로 인해 소의 임신효율을 효과적으로 증강시킬 수 있다. 소의 임신과 체지방은 밀접한 관계가 있고, 과도한 체지방의 축적은 암소의 임신 실패로 이어질 수 있으며, 수소의 발정 감소로 이어질 수 있는데, 본 발명의 조성물은 지방세포형성 및 지방축적을 효과적으로 억제할 수 있으므로 소의 임신효율을 증강시키기 위한 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 전체 조성물의 중량을 기준으로 본 발명의 페룰산을 0.1 내지 90중량%로 함유할 수 있을 것으로 판단된다.

본 발명의 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있을 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

본 발명 약학적 조성물의 일일 투여량은 조성물에 함유된 본 발명의 페룰산을 기준으로 하루에 약 0.1 내지 200㎎/㎏, 바람직하게는 10 내지 100㎎/㎏일 수 있으며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 것이다.

실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있을 것이다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있을 것이다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있을 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 페룰산에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있을 것이다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 유효량을 기준으로 본 발명의 페룰산 및 식품학적으로 허용된 담체와 혼합한 조성물일 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 식육가공품, 어육제품, 두부, 묵, 죽, 라면이나 국수 등의 면류, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등의 조미식품, 소스, 과자, 발효유나 치즈 등의 유가공품, 김치나 장아찌 등의 절임식품, 과실, 채소, 두유, 발효음료 등의 음료수의 식품 형태가 가능할 것으로 판단된다. 또한 식품학적으로 허용된 담체는 상기 약학적으로 허용된 담체도 사용할 수 있을 것이다.

본 발명의 사료 조성물은 본 발명의 페룰산을 사료와 혼합하여 제조될 수 있다. 배합사료, 펠렛형태 및 사일레지 등의 형태가 가능할 것으로 판단된다. 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 상기 본 발명의 페룰산과 혼합하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 발효한 다음 상기 본 발명의 페룰산을 첨가하는 방법으로 제조될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[실시예]

1. 방법

1-1. 세포 배양 및 화합물

3T3-L1 세포주는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 입수하였다. Dulbecco modified Eagle 배지(DMEM)와 fetal bovine serum(FBS)을 Gibco-BRL(Gaithersburg, MD, USA)에서 조달했다. mRNA 추출 및 RT-PCR 키트는 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 페룰산, 오일 레드 O, dimethyl sulfoxide(DMSO), dexamethasone 및 3-isobutyl-1-methylxanthine은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 다른 모든 화학물질과 용제는 분석 등급을 사용하였다.

1-2. 이탈리안라이그라스에서 페룰산의 추출, 분리 및 동정

이탈리안라이그라스의 지상부위를 국립축산과학원(NIAS)(천안, 한국)의 초지 및 사료 연구센터에서 수집하였다. 샘플은 NIAS의 분류 학자에 의해 인증되었다. 재배 40일 후 개화시기에 수확하고, 60℃에서 3일 건조한 후 분쇄기로 분쇄하여 거친 분말을 얻었다. 메탄올을 사용하여 이탈리안라이그라스 분말 771g으로부터 조추출물을 얻고, 회전식 진공 증발기(Rotavapor R110, Bㆌchi, Switzerland)로 농축하고 동결 건조시켰다. 메탄올 추출물을 석유에테르, 클로로포름, n-부탄올 및 증류수와 같은 용매로 단계적으로 연속 추출하였다. 이들 추출물을 HPLC 분석에 사용하였다. 이들 중 클로로포름 추출물은 페룰산을 함유하는 것으로 나타났다. 세파덱스(Sephadex) LH-20 컬럼을 사용한 크로마토그래피를 통해 클로로포름 추출물로부터 총 16개의 하위 분획물(F1-F16)을 수득하였다. 100g의 Sephadex LH-20 수지(LH20100-100G)를 탈이온수에서 4℃로 밤새 수화시키고 유리컬럼(370±30mm)에 충진시켰다. 이탈리안라이그라스의 클로로포름 추출물(3.936g)을 LH-20 카트리지에 로딩하고 H₂O(베드 부피의 1/3)로 용출시켜 분획물 1(F1)을 얻었다. 이후 10%, 30%, 50%, 70% 및 100% 메탄올(베드 부피의 2배(v/v))로 순차적으로 분별하여 15개의 분획물(F2 ~ F16, 각 메탄올 구배에 대한 3개의 분획물)을 수득하였다. 분획 7 및 8은 9개의 페놀 화합물을 함유하는 것으로 나타났다. 이 화합물들은 표준 화합물을 사용하여 분리되고 확인되었다. 각 분획에서 유기용매를 증발시킨 후, 잔여 잔류물을 동결건조시켰다.

1-3. HPLC 조건

이탈리안라이그라스 분획의 성분은 역상 HPLC에 의해 동정되었다. 모든 샘플은 분석하기 전 0.45㎛ 필터로 여과하였다. S 2100 용매 전달 시스템(Sykam, Gewerbering, Germany) 및 S 7131 Reagent Organizer(Sykam)가 장착된 Sykam HPLC 시스템을 사용하여 각 시료 10㎕를 분리하였다. 이어서, 샘플을 18-ODS Hector C18-M51002546 컬럼(250 x 4.6㎜, 5㎛)(RStech Co., Ltd. Daejeon, Korea)을 통해 분리하였다. 이동상은 아세토니트릴(B) 및 0.1% 포름산을 함유하는 정제수를 이용하였다. 유속은 1.0㎖/min으로 설정하였다. 구배 용출은 다음과 같이 수행하였다: 0 ~ 1분, 10% 용매 B; 1 ~ 20분, 10 ~ 100% 용매 B의 선형 구배; 20 ~ 21분, 100% 용매 B; 21 ~ 26분, 선형 구배 100 ~ 10% 용매 B; 및 26 ~ 33분, 10% 용매 B. Reference 화합물 및 IRG 분획을 검출하고 파장 280nm에서 분획하였다. 페룰산을 개별적으로 추출하여 실험에 사용하였다. 또한, Sigma-Aldrich로부터 구입한 페룰산을 사용하였다. 페룰산의 구조는 도 1과 같다.

1-4. In-vitro 세포 분석

1-4-1. 세포독성 분석

수용성 tetrazolium[WST, 2[2-Methoxy-4-nitrophenyl]-3[4-Nitrophenyl]-5-[2,4-disulfophenyl]-2-H-tetrazolium monosodium salt]을 세포독성 분석에 사용하였다. 세포를 96-well plate에 1x10⁴ cells/well의 밀도로 접종하였다. 배양 24시간 후, 세포를 페룰산의 상이한 농도(0.2 ~ 2mM)에 노출시켰다. 5% CO₂로 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 세포를 WST로 처리하고 2시간 동안 배양하였다. 각 well의 흡광도는 Spectra count ELISA plate reader(Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA)를 사용하여 450nm의 파장에서 측정하였다.

1-4-2. 지방세포 분화

지방세포 분화 실험은 약간의 수정을 거친 공개된 방법(Choi et al., 2003)에 따라 수행되었다. 3T3-L1 전지방 세포를 6- 또는 12-well plate에 3x10⁴ 또는 1.5x10⁴ cells/well의 밀도로 각각 접종하였다. 그 다음 37℃에서 5% CO₂로 배양하였다. 배양배지는 매 48시간마다 교체하였다. 100% confluency에 도달한 후, 성장배지를 분화배지[10% FBS, 0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(DMI), 1μM dexamethasone 및 1.7㎕ 인슐린을 함유하는 DMEM]으로 대체하였다. 실험을 위해, 48시간 동안 상이한 농도의 페룰산 존재 하에서 DMI로 세포를 분화시켰다. 그 후, 세포를 분화배지 대신 페룰산이 함유된 분화배지(1.7㎕ 인슐린)로 48시간 배양하였다. 그 후, 세포 배양배지를 실험이 끝날 때까지 이틀마다 페룰산을 함유하는 성장배지로 대체하였다.

1-4-3. 지질 정량

3T3-L1 세포를 1시간 동안 포르말린(10%)에 고정시키고 40% isopropanol로 헹구었다. 헹구고 나서 oil red O 염색용액 3㎖를 각 well에 넣었다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 배양하고 증류수로 3회 세척하였다. 세포를 역상 현미경[CKX41, Olympus Corporation, Tokyo Japan]하에 촬영하였다. 또한, isopropanol(100%)을 사용하여 oil red O 염색을 용리하고 490nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다(Choi et al., 2003).

1-4-4. 지방분해활성

지방분해활성은 제조사의 프로토콜에 따라 지방세포 지방분해분석키트(Chemip International Inc., Temecula, CA, USA)를 사용하여 트리글리세리드 분해로부터 배지로 방출된 글리세롤 수준을 측정함으로써 평가하였다.

1-4-5. 정량적 RT-PCR을 이용한 지방세포생성 및 지방생성 유전자 발현 정량화

제조사의 지침에 따라 RNeasy lipid tissue mini kit[Qiagen, Valencia, CA, USA]를 사용하여 3T3-L1 지방세포에서 세포질 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 UVS-99 microvolume UV/Vis spectrometer-ACT gene으로 정량화하였다. 세포질 RNA 500ng을 RT-PCR용 Superscript III first-strand synthesis system(Invitrogen)에서 제공한 oligo[dT] 프라이머와 역전사효소를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. SYBR Greenbased real-time PCR은 ABI 7500 PCR 시스템[Applied Biosystems, Foster City, CA, USA]에서 수행하였다. 표적 유전자의 발현 수준은 하우스 키핑 유전자 β-actin의 발현 수준에 대해 정상화하였다(Choi et al., 2003).

1-5. In vivo 마우스 모델 연구

1-5-1. 마우스 및 식이

Feed Korea Lab(http://www.efeed.co.kr/hfd.html)에서 정상식이 및 고지방식이(HFD, 45%)을 구입하였다. Oriental Bio(Seonghwan, Korea)에서 체중이 30 ~ 32g인 5주된 Swiss albino 수컷 마우스를 얻었다. 모든 실험은 부산 대학교의 동물 치료 및 연구위원회(부산, 한국)의 승인을 받았다. 모든 마우스는 20±2℃의 냉난방 시설에 12시간의 빛과 12시간의 암흑 상태로 보관했다. 이 마우스들은 일주일 동안 실험 시설에 순응시켰고, 먹이와 물을 자유롭게 이용할 수 있게 하였다.

1-5-2. 실험 디자인

Swiss albino 마우스를 4그룹으로 나누어 그룹 당 10마리의 마우스 그룹을 만들었다. 그룹 A, 정상식이(ND)(AIN-93G, 한국 사료 실험실, 한국); 그룹 B, 고지방식이(HFD)(고지방 45칼로리 식단); 그룹 C, 1일 체중 1㎏ 당 25㎎의 페룰산이 함유된 HFD; 및 그룹 D, HFD는 1일 체중 1㎏ 당 50㎎의 페룰산이 함유된 HFD. 90일 동안 각 식이를 급여하였다. 실험의 종료 시 실험용 마우스를 마취 하에 희생시켰다. 피하 및 부고환 패드를 채취하여 추후 연구를 위해 액체질소에서 동결시켰다. 매일 음식 섭취량을 측정하고, 체중은 매주 측정하였다. 체질량 지수(BMI)는 킬로그램 체중을 제곱미터로 나누어 계산하였다(kg/㎡). 마우스의 혈청 총 콜레스테롤과 트리글리세리드 수치는 Total Cholesterol Assay kit와 Serum Triglyceride Quantification Kit(Cell Biolabs, San Diego, CA, USA)를 사용하여 각각 정량화하였다.

1-6. 단백질 추출 및 면역블롯

단백질은 1X protease inhibitor cocktail(Roche, Basel, Switzerland)과 함께 제공된 RIPA lysis buffer를 사용하여 3T3-L1 지방세포로부터 추출하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 500㎕의 RIPA lysis buffer를 첨가한 후 4℃에서 5분간 배양하였다. 다음 세포 스크래퍼로 긁어 모든 세포를 수집하였다. 세포 용해물을 microfuge tube(2ml)에 옮기고 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 조직 단백질 추출을 위해 조직을 RIPA 완충액 중에서 차가운 상태에서 균질화시키고 19,000g에서 4분 동안 10분간 원심분리하였다. 단백질 정량은 Bio-Rad Protein Assay Kit(Hercules, CA, USA)를 사용하였다. 동일한 양의 단백질 샘플을 SDS-PAGE(10%)로 분리하고, Trans-blot Turbo transfer system(Bio-Rad)을 사용하여 PVDF 멤브레인에 블롯시켰다. 모든 면역블롯분석은 Benchpro 4100 card processing station을 사용하여 4℃에서 수행하였다. 토끼 단클론 항체(Cell Signaling technology, Danvers, MA, USA)를 실험 샘플에서 단백질 발현을 검출하는데 사용하였다. 밴드 신호는 Enhanced Chemiluminescence Kit(Bio-Rad, USA)를 사용하여 전개하고 Chemiluminescence Imaging system(Davinch Chemiluminescence, South Korea)으로 캡처하였다. 밴드의 강도는 ImageJ software (1.49 version, 32 bit, Wayne Rasband, National Institute of Health, USA)로 정량화하였다.

1-7. 통계분석

일원 분산 분석 (ANOVA)과 다변량 비교와 같은 모든 통계 분석은 social science의 statistical package[SPSS-Version 16.0, SPSS, Inc., Chicago, IL, USA]를 사용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 p값이 0.05 미만일 때 고려되었다.

2. 결과

2-1. 이탈리안라이그라스로부터 페룰산의 분리 및 추출

이탈리안라이그라스의 지상부를 HPLC 방법으로 페룰산을 분리하는데 사용하였다. 상응하는 대조 화합물을 사용하여 HPLC에 의해 활성 분획 7 및 8로부터 총 9 가지 화합물을 수득하였다(Choi et al., 2017).

2-2. In vitro 실험

2-2-1. 페룰산의 in vitro 세포독성

EZcytox kit(Daeil Biotech Company, Suwon, Korea)를 사용하여 24시간 또는 48시간 동안 다양한 농도(<0.6 mM)로 페룰산을 처리하여 세포독성 효과를 확인한 결과, 3T3-L1 전지방 세포에 세포독성이 없는 것으로 나타났다(도 2). 그러나 0.6mM 내지 2mM의 페룰산 농도는 3T3-L1 전지방 세포의 세포생존을 약간 감소시켰다. 이러한 결과에 기초하여, 0.6mM 미만의 페룰산 농도를 추후 실험에 사용하였다.

2-2-2. 지방세포 분화 및 지방축적에서 페룰산의 효과

서로 다른 농도에서 페룰산(50, 75, 100, 125, 250, 500μM)이 지방세포 분화와 지질축적에 대한 조절 효과를 나타낼 수 있는지를 oil red O 염색법으로 조사하였다. 지방세포의 분화는 지질의 축적으로 인한 oil red O 염색 세포의 증가와 관련이 있다. 지방세포의 현미경적 관찰은 페룰산의 농도가 증가할 때 지방액적의 수가 점차적으로 감소함을 보여주었다(도 3의 A, B). 실험 세포에서 추출한 oil red O 염색의 흡광도 값은 페룰산 처리가 대조구에 비해 지질축적을 유의하게(p<0.05) 감소 시켰다는 것을 보여주었다(도 3의 C). 이러한 결과는 페룰산이 3T3-L1 세포에서 지방세포분화를 억제한다는 것을 나타낸다. 그러나 페룰산에 의한 지방세포분화의 효과적인 억제는 0.25mM 및 0.5mM의 농도에서만 나타났다. 따라서 이 농도를 추가 분석에 적용하였다.

2-2-3. 지방세포형성 및 지방생성 유전자 발현에서 페룰산의 저해 효과

qPCR 결과에 따르면 C/EBP-β, C/EBP-α, PPAR-γ2 및 SREBP-1c와 같은 전사인자의 발현 수준은 대조군 세포와 비교하여 페룰산으로 처리된 세포에서 감소하였고, 지방세포 결합 단백질(aP2), acetyl CoA carboxylase(ACC), fatty acid synthase(FAS) 및 lipoprotein lipase(LPL)의 mRNA 발현 수준은 분화 5일째 및 10일째에 대조군에 비교하여 페룰산 처리된 세포에서 감소하였다(도 4). 웨스턴블롯 결과 또한 페룰산 처리로 PPAR-γ, C/EBP-α, SREBP-1, FAS 및 aP2의 단백질 수준을 하향 조절함으로써 세포의 분화 및 지질축적을 억제한다는 것으로 나타났다. 이러한 효과는 페룰산 처리 후 10일째에 크게 감소하였다(도 5).

2-2-4. 페룰산은 troglitazone(TRZ)-유도 PPARγ 단백질 발현과 경쟁한다.

PPARγ는 지방세포분화 및 지방세포의 지질축적을 조절하는 주요 전사 인자이다. TRZ는 지질축적을 자극하는 PPARγ의 아고니스트(agonist)이다. 페룰산이 3T3-L1 세포에서 TRZ-유도 지방세포분화와 경쟁할 수 있는지를 결정하기 위해, PPAR-γ 및 지질축적에 대한 페룰산과 TRZ 사이의 경쟁 실험을 수행하였다. 이의 결과, 분화 동안 PPARγ 발현이 대조군 세포보다 높은 것으로 나타났다. 그러나 TRZ를 페룰산과 함께 처리하였을 때 TRZ 단독 처리에 비해 지질축적과 PPARγ 발현이 감소하였다(도 6).

2-2-5. 지방생성 및 지방분해 메커니즘에서 페룰산 또는 isoproterenol(ISO)의 효과

페룰산이 hormonal sensitive lipase(HSL)의 활성화 및 FAS 단백질의 억제를 통해 분화된 세포에서 지방분해를 활성화시킬 수 있음을 발견했다. 따라서 페룰산이 세포 내에서 지방분해를 어떻게 활성화 하는지를 조사하였다. ISO는 beta-adrenergic receptor-매개 AMPK-α 경로를 활성화시켜 지방분해를 촉진하는 아고니스트이다. ISO로 처리한 세포는 ISO 처리를 하지 않은 대조 세포에 비해 beta-adrenergic receptor(BR), HSL 및 pAMPK-α의 단백질 발현 수준이 더 높았다. 또한, ISO 처리는 FAS 단백질 발현 수준을 감소시켰다. 마찬가지로, 페룰산은 pAMPK-α 활성화에 의한 BR-매개 HSL 활성화를 통해 지방분해를 자극했다. 페룰산 처리는 또한 ISO 처리와 유사하게 분화된 지방세포로부터 글리세롤 방출을 증가시켰다(도 7). 페룰산 처리에 의한 글리세롤 방출 촉진은 ISO 처리에 의한 것과 거의 유사하였다.

2-2-6. p38MAPK 및 P44/42(ERK1/2) 단백질 발현에서 페룰산의 효과

페룰산 처리된 세포에서 지방세포분화 및 지방축적의 하향 조절에 연관된 신호 경로를 조사하였다. 페룰산 처리는 대조군 처리와 비교하여 3T3-L1 세포에서 인산화된 p38MAPK 및 p44/42(ERK1/2) 단백질 발현을 상향 조절하였다(도 8). 이는 페룰산이 p38MAPK 및 p44/42(ERK1/2)를 상향 조절함으로써 주요 지방생성 전사 인자 및 그 하류 표적을 하향 조절함으로써 지방세포분화를 억제할 수 있음을 나타낸다.

2-3. 체중, 지방조직량 및 혈청지질에 대한 페룰산의 효과를 확인하기 위한 in vivo 실험

페룰산은 3T3-L1 세포의 분화 및 지질축적을 효과적으로 억제하여 항비만 활성을 가질 수 있는 것으로 나타났다. 따라서 페룰산이 고지방식이(HFD)로 유발된 비만을 감소시킬 수 있는지 여부를 Swiss albino 마우스를 사용하여 조사하였다. 마우스에 HFD-페룰산 식이를 하루 25 또는 50mg/kg의 농도로 90일 동안 급여하였다. 실험 기간 동안 정상식이 또는 HFD-페룰산 식이 마우스에서 비정상적인 활동은 관찰되지 않았다. 실험 기간 후, HFD만 급여한 마우스는 정상식이를 섭취한 대조 마우스와 비교하여 체중, 지방조직질량(피하 및 부고환 조직) 및 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수치가 높았으나 페룰산 처리에 의해 감소되었다(도 9). 실험 기간 동안 집단 간의 식이섭취량에는 유의한 차이가 없었다. 전체적으로, 페룰산은 HFD에 의해 유도된 마우스의 체중 증가, 지질 수준 및 지방 조직 질량을 효과적으로 감소시켰다.

2-3-1. 피하 및 부고환 조직의 지방세포형성 및 지방생성 단백질 발현에서 페룰산의 효과

웨스턴블롯으로 피하 및 부고환 조직의 단백질 발현을 분석하였다. 전체 단백질 농도는 HFD와 HFD-페룰산 급여 마우스 간에 약간 차이가 있었다. 그러나 각각의 그룹으로부터 총 20㎕의 총 단백질을 웨스턴블롯 분석을 위해 SDS-PAGE로 분석한 결과, HFD-페룰산 급여 마우스는 HFD 유도 비만 마우스에 비해 PPAR-γ 및 C/EBP-α SREBP-1 및 그 하류 단백질인 FAS, aP2 및 ACC와 같은 주요 지방세포 전사 인자의 발현 수준이 낮았다. 또한, 페룰산은 hormonal sensitive lipase(HSL) 단백질 발현을 상향 조절함으로써 지방분해를 활성화시켰다(도 10).

2-3-2. 페룰산에 의한 주요 지방세포생성 및 지방생성 인자 하향조절에 관련된 분자 메커니즘

마우스에서 페룰산이 항비만 효과를 일으키는 분자 메커니즘을 조사하였다. HFD-페룰산을 투여한 마우스는 HFD를 투여한 마우스와 비교하여 PPAR-γ 및 C/EBPs 발현의 하향 조절 및 지방분해인자 HSL의 활성화를 유도하는 p38MAPK, p44/42(ERK1/2) 및 AMPK-α의 인산화가 상향 조절되었다(도 11).

Claims

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이탈리안라이그라스로부터 추출된 페룰산을 유효성분으로 함유하여 지방세포의 C/EBP-β, C/EBP-α, PPAR-γ, SREBP-1의 발현수준을 낮추고, p38MAPK 및 p44/42의 발현수준 및 AMPK-α의 인산화를 증가시켜 지방세포형성 및 세포의 지방축적을 억제하는 것을 특징으로 하는 소의 임신효율 증강용 기능성 사료 조성물.