KR20190103897A - 토목향 추출물의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물, 또는 이로부터 분리된 알란토락톤 또는 이소알란토락톤 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 분획물 또는 화합물은 멜라닌 합성을 억제하고, 본 발명의 화합물은 멜라닌 합성 촉진 인자인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor), 타이로시나제(tyrosinase), 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protein 1) 또는 타이로시나제 관련 단백질 2(tyrosinase related protein 2)의 mRNA 또는 단백질 발현을 억제하는 효과를 나타내므로, 피부 미백용 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

토목향 추출물의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물{Composition for whitening comprising fraction of Inula helenium as an active ingredient}
본 발명은 토목향 추출물의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.
사람의 피부색을 결정하는 멜라닌(melanin)은 멜라노사이트(melanocyte)라 불리는 세포에서 만들어져 케라티노사이트(keratinocyte)라는 세포로 이동한다. 여기서 멜라닌은 핵주변에 모자와 같은 구조를 형성하여 자외선으로부터 유전자를 보호하고 자유 라디칼(free radical)을 제거하여 세포 내 단백질을 보호하는 등 중요한 역할을 하게 된다. 생체 내에는 멜라닌을 분해하는 효소가 없고, 다만 케라티노사이트가 표피에서 떨어져 나갈 때 같이 피부에서 떨어져 나가는 것으로 제거된다.
멜라닌 합성 과정을 살펴보면, 멜라노사이트 내의 멜리노좀에서 먼저 티로신을 기질로 하여 티로시나아제라는 효소가 도파(DOPA)를 거쳐 도파퀴논 (DOPAquinone)을 생성시키고, 도파퀴논으로부터 자동 산화 반응과 효소 반응으로 도파크롬 (DOPAchrome)을 거쳐 공중합체인 멜라닌이 생성된다. 이렇게 생성된 멜라닌은 멜라노좀이라는 소포체를 통해 케라티노사이트로 옮겨지고 여기에서 약 28일간의 각화 과정을 거치면서 피부 표면으로 나와 각질과 함께 소실된다. 그러나, 이 과정에서 멜라닌 생성을 촉진하는 요인에 의해 멜라닌이 과다 생성되고 각화 작용이 원활히 이루어지지 않아 멜라닌이 완전히 없어지지 않으면 색소 침착 현상이 일어나게 된다. 따라서, 이러한 색소 침착 현상을 방지하기 위해서는 멜라닌 생성 과정의 일부분을 저해하여 멜라닌의 생성을 감소시켜야 한다.
현재 피부미용을 위한 미백제의 개발에 있어서, 생성된 멜라닌 색소를 환원시켜 탈색하는 방법과 멜라닌 색소를 형성하는 효소인 타이로시나제의 활성을 억제하는 방법이 알려져 있다. 그러나 멜라닌 색소를 환원시키기 위해 사용되는 토코페롤이나 비타민류 등을 사용한 미백제는 멜라닌 색소의 탈색효과가 미미한 것으로 알려져 있으므로 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 저해제에 관한 연구가 다수 진행되고 있다.
종래의 화장품 분야에서는 미백성분으로서, 예를 들면, 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 타이로시나제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(Hydroquinone), 비타민-C(L-Ascorbic acid) 및 이들의 유도체들이 사용되어 왔다. 그러나 상기 미백성분들은 처방계 중에서 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.
코지산은 타이로시나제의 활성부위에 존재하는 구리이온을 흡착시켜 효소활성을 저해하지만, 화장품에 배합 시 불안정성, 피부 부작용의 문제 및 최근 동물실험 결과 간암유발이 밝혀져 화장품 원료로 사용이 중지되었다. 비타민-C 및 그 유도체는 산화가 잘되는 불안정성 때문에 화장품 원료로서 사용이 어려우며, 하이드로퀴논은 피부에 대한 미백효과는 탁월하지만 알레르기를 유발하는 성질, 멜라닌 생성 세포에 대한 독성, 피부에의 영구 탈색화 등 피부에 대한 자극성이 높으며, 최근 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되어 각 나라별로 제한적인 농도만 허가하고 있다. 또한, 알부틴은 하이드로퀴논에 글루코피라노사이드(Glucopyranoside)가 결합된 유도체로 하이드로퀴논 사용 시 나타나는 부작용이 적으면서 인체에 대한 독성은 없이 멜라닌 색소의 합성을 억제하는 작용이 있어, 멜라닌 색소 침착이 증가되는 피부질환의 치료제로서 이용가능성이 제시되었으나, 피부효소에 의해 일부 분해되는 단점이 있다.
이들 미백 물질들 외에 천연물 특히 식물 중에서 미백 활성 성분을 찾기 위한 연구도 계속 이루어져왔고, 다수의 식물 추출물 및 생약재 추출물 등이 티로시나제에 작용하여 멜라닌 생성을 억제한다는 사실이 밝혀졌으나, 이들 역시 안전성, 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점을 갖고 있으며, 아직 뛰어난 효과를 나타내지도 못하고 있는 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1370113호
본 발명의 목적은 토목향 추출물의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
[화학식 2]
Figure pat00002
.
또한, 본 발명은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00003
[화학식 2]
Figure pat00004
.
또한, 본 발명은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00005
[화학식 2]
Figure pat00006
.
본 발명에 따른 토목향 추출물의 헥산 분획물 또는 이로부터 분리된 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물은 멜라닌 합성을 억제하고, 상기 화합물은 멜라닌 합성 촉진 인자인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor), 타이로시나제(tyrosinase), 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protein 1) 또는 타이로시나제 관련 단백질 2(tyrosinase related protein 2)의 mRNA 또는 단백질 발현을 억제하는 효과를 나타내므로, 피부 미백용 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 토목향 추출물의 메틸렌클로라이드 분획물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 토목향 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 토목향 추출물의 부탄올 분획물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 토목향 추출물의 헥산 분획물로부터 알란토락톤(alantolactone) 및 이소알란토락톤(isoalantolactone)을 분리한 결과를 나타낸 것이다.
도 6는 토목향 추출물의 헥산 분획물(IHHF)을 Melan-a 세포에 처리하였을 때의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 7은 토목향 유래 화합물인 알란토락톤(alantolactone, AL)을 Melan-a 세포에 처리하였을 때의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 8은 토목향 유래 화합물인 이소알란토락톤(isoalantolactone, IAL)을 Melan-a 세포에 처리하였을 때의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 9은 토목향 추출물의 헥산 분획물(IHHF)의 멜라닌 합성 억제 효과를 평가한 결과이다
((A): 멜라닌 양을 나타내는 발색 모습; (B): (A)의 결과를 정량화한 그래프; NT: 음성대조군(non-treatment); IHHF: 토목향 추출물의 헥산 분획물; arbutin: 양성대조군, 알부틴; 4-n-butylresorcinol: 양성대조군, 루시놀).
도 10는 토목향 유래 화합물인 알란토락톤(AL)의 멜라닌 합성 억제 효과를 평가한 결과이다
((A): 멜라닌 양을 나타내는 발색 모습; (B): (A)의 결과를 정량화한 그래프; NT: 음성대조군(non-treatment); AL: 토목향 유래 알란토락톤; arbutin: 양성대조군, 알부틴; 4-n-butylresorcinol: 양성대조군, 루시놀).
도 11은 토목향 유래 화합물인 이소알란토락톤(IAL)의 멜라닌 합성 억제 효과를 평가한 결과이다
((A): 멜라닌 양을 나타내는 발색 모습; (B): (A)의 결과를 정량화한 그래프; NT: 음성대조군(non-treatment); IAL: 토목향 유래 이소알란토락톤; AL: 토목향 유래 알란토락톤; arbutin: 양성대조군, 알부틴; 4-n-butylresorcinol: 양성대조군, 루시놀).
도 12은 토목향 유래 화합물인 알란토락톤(AL)의 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 13는 토목향 유래 화합물인 이소알란토락톤(IAL)의 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 14은 토목향 유래 화합물인 이소알란토락톤(IAL)의 타이로시나제(tyrosinase, TYR)의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 15는 토목향 유래 화합물인 이소알란토락톤(IAL)의 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protein 1, TRP-1)의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 16는 토목향 유래 화합물인 이소알란토락톤(IAL)의 타이로시나제 관련 단백질 2(tyrosinase related protein 2, TRP-2)의 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 17은 토목향 유래 화합물인 알란토락톤(AL)의 MITF, 타이로시나제(TYR), 타이로시나제 관련 단백질 1(TRP-1) 및 타이로시나제 관련 단백질 2(TRP-2)의 단백질 발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 토목향 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다:
1) 토목향에 추출 용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 토목향은 재배한 것 또는 시판된 것 등 제한없이 사용될 수 있다.
상기 제조방법에서, 토목향은 토목향의 잎, 줄기, 뿌리 등 모든 부위를 포함할 수 있고, 구체적으로 잎, 줄기 및 뿌리로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 토목향의 뿌리를 이용하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 단계 1)의 추출 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C2의 저급 알코올일 수 있고, 구체적으로 상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 메탄올로 추출하는 것이 가장 바람직하다.
상기 단계 1)의 추출 방법은 진탕추출, Soxhlet 추출, 환류추출 또는 초음파추출일 수 있다. 이때, 추출 온도는 10 내지 60℃인 것이 바람직하며, 15 내지 35℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 추출 용매는 추출에 사용되는 토목향의 중량 1 g당 1 내지 50 mL으로 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 1 내지 20 mL으로 첨가하여 추출하는 것이 더 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 추출 시간은 10분 내지 10시간인 것이 바람직하며, 10분 내지 5시간이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 횟수는 1 내지 10회인 것이 바람직하며, 1 내지 3회인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 온도, 추출 시간 또는 추출 횟수의 조건을 벗어난 범위에서는 추출이 충분히 이루어지지 않아 토목향 추출물 내에 유효성분의 함량이 미미할 수 있다. 또는 더 이상 추출 수율이 증가하지 않아 추출 작업의 효율이 떨어질 수 있다.
상기 단계 3)의 감압 농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 또한, 상기 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있다.
상기 토목향 추출물의 분획물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다:
1) 토목향에 추출 용매를 가하여 토목향 추출물을 수득하는 단계; 및
2) 단계 1)의 추출물을 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 분획물을 얻는 단계.
상기 단계 1)의 토목향 추출물은 상술한 방법을 수행하여 얻을 수 있다.
구체적으로, 상기 분획물은 상기 단계 1)에서 얻은 토목향 추출물을 용매에 현탁시킨 후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 첨가하여 각각의 층을 분리한 다음, 각 층을 감압 농축 및 건조시켜 각 분획물을 수득하는 것이 바람직하다.
상기 토목향 추출물의 헥산 분획물은 멜라닌 합성을 억제할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 토목향 추출물을 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 분획물을 얻은 후, 각 분획물을 멜라닌 생성 세포인 Melan-a에 처리하여 세포 독성을 나타내지 않는 각 분획물의 농도를 확인하였다 (도 6 참조).
또한, 본 발명자들은 토목향 추출물의 분획물 중, 헥산 분획물이 Melan-a 세포의 멜라닌 합성을 억제함을 확인하였다 (도 9 참조).
따라서, 본 발명에 따른 토목향 추출물의 헥산 분획물은 멜라닌 합성을 억제하므로, 피부 미백용 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00007
[화학식 2]
Figure pat00008
.
상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물은 본 발명에 따른 토목향 추출물의 추출 단계 및 분획 단계를 수행하여 얻어진 토목향 추출물의 헥산 분획물을 크로마토그래피를 수행하고 정제하는 단계를 추가로 진행하여 얻을 수 있다.
상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물은 멜라닌 합성을 억제할 수 있다.
상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물은 MITF(microphthalmia-associated transcription factor), 타이로시나제(tyrosinase), 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protein 1) 및 타이로시나제 관련 단백질 2(tyrosinase related protein 2)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 토목향 추출물의 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물을 각각 HPLC로 분석한 결과, 헥산 분획물에서 미백에 효과적인 알란토락톤(alantolactone, 화학식 1) 및 이소알란토락톤(isoalantolactone, 화학식 2) 화합물을 검출하였다 (도 2 내지 도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 토목향 추출물의 헥산 분획물로부터 알란토락톤 및 이소알란토락톤 화합물을 분리한 후, 각 화합물을 멜라닌 생성 세포인 Melan-a에 처리하여 세포 독성을 나타내지 않는 각 분획물의 농도를 확인하였다 (도 7 및 도 8 참조).
또한, 본 발명자들은 토목향 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤 및 이소알란토락톤 화합물은 Melan-a 세포의 멜라닌 합성을 억제함을 확인하였다 (도 10 및 도 11 참조).
또한, 본 발명자들은 토목향 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤 화합물은 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 mRNA 발현을 억제하며, 토목향 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 이소알란토락톤 화합물은 MITF(microphthalmia-associated transcription factor), 타이로시나제(tyrosinase), 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protein 1) 및 타이로시나제 관련 단백질 2(tyrosinase related protein 2)의 mRNA 발현을 억제함을 확인하였다 (도 12 내지 도 16 참조).
또한, 본 발명자들은 토목향 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤 화합물은 MITF(microphthalmia-associated transcription factor), 타이로시나제(tyrosinase), 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protein 1) 및 타이로시나제 관련 단백질 2(tyrosinase related protein 2)의 단백질 발현을 억제함을 확인하였다 (도 17 참조).
따라서, 토목향 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤(상기 화학식 1) 또는 이소알락토락톤(상기 화학식 2) 화합물은 멜라닌 합성을 억제하고, 멜라닌 합성 촉진 인자인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor), 타이로시나제(tyrosinase), 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protein 1) 또는 타이로시나제 관련 단백질 2(tyrosinase related protein 2)의 mRNA 또는 단백질 발현을 억제하는 효과를 나타내므로, 피부 미백용 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 화합물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부 미백 활성 성분을 1종 이상 포함할 수 있다. 피부 미백 활성 성분으로는 코지산 및 이의 유도체, 알부틴, 아스코르브산 및 이의 유도체, 하이드로퀴논 및 이의 유도체, 루시놀, 사이클로알카논, 메틸렌디옥시페닐 알칸올, 2,7-디니트로인다졸, 덩굴귤 추출물, 쌀 추출물, 감초 추출물과 같은 식물 추출물 등이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 본 발명의 화합물을 상기 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 90 중량부의 양으로 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 본 발명의 화합물에 추가적으로 피부학적으로 허용된 담체를 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 피부학적으로 허용된 담체는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제(thickening agent), 항산화제, 점도 안정화제(viscosity stabilizer), 킬레이팅제, 완충제, 방부제, 저급 알코올 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 그 종류와 농도는 다양하고, 당업자가 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 수정 및 변경할 수 있는 부분을 포함한다. 필요에 따라 미백제, 보습제, 항염증제, 항박테리아제, 항진균제, 비타민, 자외선 차단제, 항생제, 여드름 방지제, 향수, 염료가 포함될 수도 있으며, 이들은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 양으로 본 발명에 따른 주름 예방 또는 개선용 또는 미백용 화장용 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물로부터 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 상기 화장품은 본 발명의 펩토이드 화합물 이외에도 피부학적으로 허용된 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수도 있다.
적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트 또는 미용액 등이 있다. 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
또한, 본 발명은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00009
[화학식 2]
Figure pat00010
.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 토목향 추출물을 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 분획물을 얻은 후, 분획물 중 헥산 분획물이 Melan-a 세포의 멜라닌 합성을 억제함을 확인하였으므로 (도 9 참조), 본 발명에 따른 토목향 추출물의 헥산 분획물은 피부 미백용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명자들은 토목향 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤 및 이소알란토락톤 화합물이 Melan-a 세포의 멜라닌 합성을 억제하고 (도 10 및 도 11 참조), 멜라닌 합성 촉진 인자인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor), 타이로시나제(tyrosinase), 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protein 1) 또는 타이로시나제 관련 단백질 2(tyrosinase related protein 2)의 mRNA 또는 단백질 발현을 억제함 (도 12 내지 도 17 참조)을 확인하였으므로, 본 발명에 따른 토목향 추출물의 헥산 분획물은 피부 미백용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 토목향 추출물의 헥산 분획물 또는 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
또한, 본 발명은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00011
[화학식 2]
Figure pat00012
.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 토목향 추출물을 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 분획물을 얻은 후, 분획물 중 헥산 분획물이 Melan-a 세포의 멜라닌 합성을 억제함을 확인하였으므로 (도 9 참조), 본 발명에 따른 토목향 추출물의 헥산 분획물은 피부 미백용 건강기능식품에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명자들은 토목향 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤 및 이소알란토락톤 화합물이 Melan-a 세포의 멜라닌 합성을 억제하고 (도 10 및 도 11 참조), 멜라닌 합성 촉진 인자인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor), 타이로시나제(tyrosinase), 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protein 1) 또는 타이로시나제 관련 단백질 2(tyrosinase related protein 2)의 mRNA 또는 단백질 발현을 억제함 (도 12 내지 도 17 참조)을 확인하였으므로, 본 발명에 따른 토목향 추출물의 헥산 분획물은 피부 미백용 건강기능식품에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 토목향 추출물의 헥산 분획물 또는 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물은 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 토목향 추출물의 제조
토목향(Inula helenium) 뿌리의 건조분말 (1 g)을 메탄올 10 mL에 첨가하여 초음파추출법으로 25℃ 온도에서 1시간 동안 추출하였고 이를 3회 반복하여, 토목향의 메탄올 추출물을 얻었다.
< 실시예 2> 토목향 추출물의 분획물 제조
상기 실시예 1에서 얻어진 토목향 메탄올 추출물을 여과하고 감압농축기로 감압농축하여 용매를 제거하였다. 건조 추출물을 25 mL의 물에 현탁시킨 후에 헥산 25 mL씩으로 3회 추출, 이어서 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올을 순으로 25 mL씩 3회 추출하여, 토목향 추출물의 분획물(헥산 분획물, 메틸렌클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물)을 얻었다.
< 실험예 1> 토목향 추출물의 분획물의 미백 유효성분 분석
미백의 주요 미백의 주요 유효성분인 알란토락톤(alantolactone) 및 이소알란토락톤(isoalantolactone)의 함유량을 측정하고자, 실시예 2에서 얻은 토목향 추출물의 분획물 각각을 감압농축하고 이를 1000 μg/mL 이 되도록 메탄올에 재용해시켜 HPLC 분석을 수행하였다.
HPLC는 HITACHI L-6200 펌프와 Shimadzu SIL-9A autoinjector, Hitachi UV 검출기 L-7400을 사용하였다. 용매 A로 물, 용매 B로 아세토니트릴을 사용하였으며, 구배 방식으로 0분에서 30분까지 20-60% 용매 B, 30분에서 35분까지 60-100% 용매 B, 마지막 5분은 20% 용매 B로 1 mL/분으로 흘려주었다. 역상 INNO C18 칼럼 (150 mm x 4.6 mm, 5 μm 입자크기, Youngjin biochrom, Seongnam, Korea)을 이용하여 개별 분획물을 분리하였으며 UV 검출기의 흡수파장은 220 nm로 설정하였다.
토목향 추출물의 분획물들로부터 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 HPLC-UV를 이용하여 확인한 결과, 토목향 추출물의 헥산 분획물에서만 알란토락톤(하기 화학식 1) 및 이소알란토락톤(하기 화학식 2)이 검출되었으며 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물에서는 검출되지 않았다(도 1 내지 4 참조).
[화학식 1]
Figure pat00013
[화학식 2]
Figure pat00014
.
< 실시예 3> 토목향 분획물로부터 알란토락톤 및 이소알란토락톤의 분리
실험예 1에서 확인한 결과를 바탕으로, 토목향 추출물의 헥산 분획물로부터 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 분리하고자 하였다.
내경이 1.8 mm이고, 전체 용량이 260 mL인 폴리테트라플루오로에틸렌 (polytetrafluoroethylene, PTFE) 튜브 컬럼을 구비한 HSCCC TBA-300A (Tauto Biotech, 상하이, 중국) 크로마토그래피를 이용하였다. 헥산:아세토나이트릴:메탄올:물 (5:3:1:2 비율)의 혼합 용매는 그 전날 미리 만들어 상층을 고정상으로, 하층을 이동상으로 나누고, 사용 전에 녹아 있는 가스를 제거하였다. 우선 코일형태로 감아져 있는 컬럼에 고정상으로 사용할 용매를 채운 후 850 rpm (TBE-300A)원심의 속도로 컬럼을 회전키고, 컬럼의 회전이 안정화되면 1.0 mL/min의 유속으로 이동상으로 사용할 용매를 흘려주었다. 컬럼내에서 고정상과 이동상간의 평형화가 이루어지면 실시예 2에서 얻은 토목향 추출물의 헥산 분획물 200 mg을 1:1 부피비율로 혼합된 2상계(고정상 및 이동상)의 용매 20 mL에 녹인 후 컬럼에 주입하였다. 하층 이동상을 1.0 mL/min의 유속으로 500분간 흘려주고, HSCCC의 용리액을 UV 검출기 (220 nm)를 이용하여 검출함과 동시에 분획수집기를 사용하여 분획하였다.
그 결과, 이소알란토락톤 및 알란토락톤을 각각 280-310 min과 330-380 min에서 획득하였다 (도 5).
< 실험예 2> 토목향 추출물의 분획물 및 토목향 유래 화합물 처리에 따른 Melan-a 세포주의 세포 생존율 확인
실시예 2에서 얻은 토목향 분획물과 실시예 3에서 얻은 토목향 유래 화합물인 알란토락톤 및 이소알란토락톤의 멜라닌 생성 세포인 Melan-a 세포주(pigmented melanocytes)에 대한 세포 생존율을 확인하고자 하였다.
Melan-a 세포주는 처음 Dr. Bennett 팀 (Cancer Research Center, London, England)에 의해 C57BL/6 마우스로부터 분리되었으며, 본 발명자들은 이를 분양받아 사용하였다 (Bennett et al., 1987, Int. J. Cancer).
Melan-a 세포주를 6-웰 배양용기에 7×105 세포수씩 접종하고, 37℃ 및 10% CO2 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 배지로 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) (Gibco, Australiaorigin), 1% 항생제 (antibiotic-antimyocotics, A/A) (Gibco, USA) 및 200 nM의 TPA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) (Cayman, USA)가 첨가된 RPMI 1640 배지 (GE Healthcare Life Sciences, USA)를 사용하였다. 그 다음, 실시예 2에서 얻은 각 토목향 분획물을 감압 농축하고 DMSO에 용해시키고, 실시예 3에서 얻은 토목향 유래 화합물인 알란토락톤과 이소알란토락톤도 각각 DMSO에 용해시킨 후, Melan-a 세포주에 처리하였다.
토목향 추출물의 분획물은 0 내지 50 ㎍/mL로, 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 0 내지 20 μM 농도로 Melan-a 세포에 처리하고 72시간 동안 배양한 후, 0.5 mg/mL의 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 첨가하여 3시간 동안 더 배양하였다. 상층액을 제거하고, 형성된 포르마잔(formazan)을 녹이기 위해 DMSO 2 mL을 처리하고 1시간 동안 쉐이커 위에서 흔들어 준 후, ELISA 리더를 이용하여 흡광도(540 nm)를 측정하였다. 세포 생존율이 80%가 되는 농도인 CV80 (concentrations that reduce cell viability by 20%)을 계산하였다 (표 1).
CV80
(분획물1은 μg/mL, 화합물2은 μM 단위)
헥산 분획물1 7.93 ± 0.01 5 μg/mL에서 CV 91%
메틸렌클로라이드 분획물1 25.26 ± 0.30 25 μg/mL에서 CV 84%
에틸아세테이트 분획물1 > 50 50 μg/mL에서 CV 96%
부탄올 분획물1 > 50 50 μg/mL에서 CV 98%
알란토락톤2 > 15 15 μM에서 CV 87%
이소알란토락톤2 > 20 20 μM에서 CV 93%
표 1에 나타난 바와 같이, 토목향 추출물의 헥산 분획물의 CV80은 7.93 ± 0.01 μg/mL (도 6 참조), 메틸렌클로라이드 분획물은 25.26 ± 0.30 μg/mL, 에틸아세테이트와 부탄올 분획물은 50 μg/mL 이상이었다. 토목향 유래 알란토락톤의 CV80은 15.52 ± 0.06 μM (도 7) 이었고, 이소알란토락톤은 0 내지 20 μM 농도 범위에서 독성을 나타내지 않았다 (표 1 참조).
후속 실험에서는 토목향 추출물의 분획물, 알락토락톤 및 이소알락토락톤을 Melan-a 세포주에 유의미한 독성을 나타나지 않는 최대 농도(CV80) 이내로 수행하였다.
< 실험예 3> 토목향 추출물의 분획물 및 토목향 유래 화합물 처리에 따른 Melan-a 세포주의 멜라닌 합성 억제 효과 확인
실시예 2에서 얻은 토목향 추출물의 분획물과 토목향 유래 화합물인 알란토락톤 및 이소알란토락톤의 멜라닌 생성 세포인 Melan-a 세포주(pigmented melanocytes)에 대한 멜라닌 합성 억제 효과를 확인하고자 하였다.
구체적으로, Melan-a 세포주를 6-웰 배양용기에 7 X 105 세포수씩 분주하고 37℃ 및 10% CO2 조건에서 24시간 동안 배양했다. 그 다음 실시예 2에서 얻은 토목향 추출물의 분획물과 실시예 3에서 얻은 토목향 유래 화합물인 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 DMSO에 용해시켜 유의미한 독성이 나타나지 않는 최대 농도 (CV80) 이내로 처리하고 72시간 동안 배양하였다.
배양 후, 배지를 제거하고 DPBS (Dulbecco's Phosphate BufferedSaline, DPBS) (Sigma-Aldrich, USA) 1 mL로 세척한 뒤, 800 μL의 트립신-EDTA (Gibco, USA)로 37℃에서 2분간 처리하였다. 분리된 세포들을 모아 4℃에서 5,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 펠렛을 DPBS로 세척하고 1N NaOH (10% DMSO 포함) 100 μL를 첨가한 후, 멜라닌이 추출되도록 60℃에서 15-30분 동안 방치하였다. 추출된 멜라닌을 용해한 후 ELISA 리더를 이용하여 490 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포 내 멜라닌 합성 정도를 확인하였다. 음성 대조군 (non-treatment, NT) 대비 멜라닌 합성이 50%로 억제되는 농도인 IC50 (The half maximal inhibitory concentration)를 구하였다 (표 2).
동일한 실험을 3회 실시하여 각 분석 결과의 표준편차를 계산하였다. 실험결과는 student's t-test를 이용하여 p-value를 구하였으며 p<0.05인 경우 *로 표기하였고, p<0.01인 경우 **, p<0.001인 경우 ***로 표기하여 유의성을 나타내었다.
양성 대조군으로, 미백 효능 평가 시 사용하는 루시놀(4-n-butylresorcinol) (Sigma-Aldrich, USA)과 알부틴(arbutin) (Sigma-Aldrich, USA)을 이용하였다. 루시놀(4-n-butylresorcinol)은 100 μM, 알부틴(arbutin)은 1 mM 농도로 처리하였다.
IC50
(분획물1은 ㎍/mL, 화합물2은 μM 단위)
헥산 분획물1 5.16 ± 0.02 -
메틸렌클로라이드 분획물1 > 25 -
에틸아세테이트 분획물1 > 50 50 ㎍/mL에서 8% 억제
부탄올 분획물1 > 50 50 ㎍/mL에서 8% 억제
알란토락톤2 11.77 ± 0.29 -
이소알란토락톤2 17.77 ± 0.38 -
표 2에 나타난 바와 같이, 토목향 추출물의 헥산 분획물, 토목향 유래 화합물인 알란토락톤 및 이소알란토락톤은 멜라닌 합성을 억제 시켰다(도 9 내지 10 참조). 특히 토목향 추출물의 헥산 분획물은 IC50가 5.16 ㎍/mL로 저농도에서 우수한 미백 효과를 나타냈다. 또한 알란토락톤 및 이소알란토락톤의 경우, IC50가 각 11.77 μM, 17.88 μM로 양성 대조군인 루시놀(4-n-butylresorcinol) 100 μM 및 알부틴(arbutin) 1 mM 보다 멜라닌 합성을 우수하게 억제하였다.
한편 토목향 추출물의 헥산 분획물을 제외한 메틸렌클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물에서는 최대 처리 농도(메틸렌클로라이드 분획물은 25 μg/mL, 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물은 50 μg/mL)에서 유의미한 멜라닌 합성 억제 효과를 보이지 않았다(표 2 참조).
< 실험예 4> 토목향 유래 화합물인 알란토락톤 및 이소알란토락톤 처리에 따른 Melan -a 세포주의 멜라닌 합성 촉진 인자의 mRNA 발현량 억제 효과 확인
실시예 3에서 얻은 토목향 유래 화합물인 알란토락톤 및 이소알란토락톤의 멜라닌 합성 촉진 인자인 MITF (Microphthalmia-associated transcription factor), 타이로시나제 (Tyrosinase), 타이로시나제 관련 단백질 1 (Tyrosinase related protein 1, TRP-1) 및 타이로시나제 관련 단백질 2 (Tyrosinase related protein 2, TRP-2)의 mRNA 발현량 억제 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, Melan-a 세포주를 6-웰 배양용기에 7 X 105 세포수씩 분주하고 37℃ 및 10% CO2 조건에서 24시간 동안 배양했다. 그 다음 실시예 3에서 얻은 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 DMSO에 용해시켜 0, 5, 10, 15 및 20 μM 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수득한 후, TRIzol (Invitrogen, USA) 시약을 이용, 제조사의 프로토콜에 따라 total RNA를 추출하였다. 분리된 RNA는 정량한 뒤 amfiRivert cDNA master mix (GenDEPOT, USA)를 이용, 제조사의 프로토콜에 따라 25℃ 5분, 42℃ 60분, 70℃ 15분 처리하여 cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA는 프라이머 세트(Bioneer, Korea) 및 SYBR green working solution (iTaqTM Universal SYBR Green Supermix,BIO-RAD, USA)과 함께 40 cycle 수준으로 Applied Biosystems Prism 7300 Real-Time PCR (Applied Biosystems, USA)을 수행하였다. 초기의 변성은 95℃에서 30초, 그 후부터는 95℃에서 15초 (denaturation), 60℃에서 6초씩 40 사이클 (annealing, extension and plate read)을 수행하였다. 얻어진 Ct값은 β-액틴에 대한 상대적인 값으로 표준화하여, mRNA 유전자 발현 수준을 분석하였다. Real-Time PCR을 위해 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같다.
서열번호 유전자 서열
1 MITF 정방향 프라이머 5’-CTAAGTGGTCTGCGGTGTCTC-3’
2 역방향 프라이머 5’-GGTTTTCCAGGTGGGTCTG-3’
3 타이로시나제(Tyrosinase) 정방향 프라이머 5’-CACCCTGAAAATCCTAACTTACTCA-3’
4 역방향 프라이머 5’-CTCTTCTGATCTGCTACAAATGATCT-3’
5 TRP-1 정방향 프라이머 5’-TGGGAACACTTTGTAACAGCA-3’
6 역방향 프라이머 5’-ACTGCTGGTCTCCCTACATTTC-3’
7 TRP-2 정방향 프라이머 5’-GGCTACAATTACGCCGTTG-3’
8 역방향 프라이머 5’-CACTGAGAGAGTTGTGGACCAA-3’
9 β-actin 정방향 프라이머 5′-CCCACTCCTAAGAGGAGGATG-3’
10 역방향 프라이머 5′-AGGGAGACCAAAGCCTTCAT-3’
그 결과, 토목향 유래 화합물인 알란토락톤은 멜라닌 합성 촉진 인자인 MITF의 mRNA 발현량을 억제하는 것으로 나타났으며 (도 12), 이소알란토락톤은 멜라닌 합성 촉진 인자인 MITF, 타이로시나제 (Tyrosinase), TRP-1 및 TRP-2의 mRNA 발현량을 억제하는 것으로 나타났다 (도 13 내지 15).
< 실험예 5> 토목향 유래 화합물인 알란토락톤 처리에 따른 Melan -a 세포주의 멜라닌 합성 촉진 인자의 단백질 발현량 억제 효과 확인
실시예 3에서 얻은 토목향 유래 화합물인 알란토락톤의 멜라닌 합성 촉진 인자인 MITF (Microphthalmia-associated transcription factor), 타이로시나제 (Tyrosinase), 타이로시나제 관련 단백질 1 (Tyrosinase related protein 1, TRP-1) 및 타이로시나제 관련 단백질 2 (Tyrosinase related protein 2, TRP-2)의 단백질 발현량 억제 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, Melan-a 세포주를 6-웰 배양용기에 7 X 105 세포수씩 분주하고 37℃ 및 10% CO2 조건에서 24시간 동안 배양했다. 그 다음 실시예 3에서 얻은 알란토락톤을 DMSO에 용해시켜 0, 5, 10, 및 15 μM 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 DPBS (Dulbecco's Phosphate BufferedSaline, DPBS) (Sigma-Aldrich, USA) 1 mL로 세척한 뒤 세포를 긁어 회수하고, 용해 버퍼 (20 mM HEPES [pH 7.6], 350 mM NaCl, 20% 글리세롤, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1% NP-40, 50 mM NaF, 0.1 mM DTT, 0.1 mM PMSF) 80 ㎕을 첨가한 후, 얼음에서 보관하였다. 진탕 믹서를 이용하여 10분에 한 번씩, 총 3번 세포를 진탕한 후, 15,000 rpm 회전속도로 10분간 4℃에서 원심분리하여 세포 용해물을 수득하였다.
20 μg의 단백질을 8% SDS-PAGE 겔에서 100 V로 2시간 동안 전기영동하고, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시켰다. 멤브레인을 5% 탈지유로 실온에서 1시간 동안 블로킹한 후, MITF에 대한 1차 항체 (Santacruz, USA, Cat No. sc-52938), Tyrosinase (Santacruz, USA, Cat No. sc-20035), TRP-1에 대한 1차 항체 (Santacruz, USA, Cat No. sc-166857) 및 TRP-2에 대한 1차 항체 (Santacruz, USA, Cat No. sc-74439)를 각각 1:3000으로 희석하여 멤브레인과 4℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 멤브레인을 TBST 버퍼로 10분간 3회씩 세척한 후, 2차 항체로서 HRP-결합 항-mouse (Santacruz, USA, Cat No. sc-2005)를 1:3000의 비율로 희석하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 TBST 버퍼로 10분간 3회씩 세척하였다. 화학발광기질 시약 (ECL western solution, DoGen, Korea)을 처리하고, LAS-1000 (Fujifilm, Japan)을 이용하여 생성된 발광을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로 β-액틴 단백질의 발현 정도를 측정하였으며 구체적으로 항-β-액틴 항체를 1차 항체로 하여 1:5000의 비율로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
토목향 유래 화합물인 알란토락톤은 멜라닌 합성 촉진 인자인 MITF, 타이로시나제 (Tyrosinase), TRP-1 및 TRP-2의 단백질 발현량을 억제하는 것으로 나타났으며 (도 17), 특히 멜라닌 합성 과정의 중요한 전사 조절 인자인 MITF의 단백질 발현은 알란토락톤 10 μM 처리 시에도 완전히 억제되었다.
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Claims (12)

  1. 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 토목향 추출물은 토목향을 물, C1 내지 C2의 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 추출된 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 토목향 추출물은 토목향의 뿌리로부터 얻은 추출물인, 피부 미백용 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 헥산 분획물은 토목향 추출물을 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻은 분획물 중 헥산 분획물인 것을 특징으로 하는, 피부 미백용 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 헥산 분획물은 멜라닌 합성을 억제하는 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
  6. 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00015

    [화학식 2]
    .
  7. 제6항에 있어서, 상기 화합물은 멜라닌 합성을 억제하는 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 화합물은 MITF(microphthalmia-associated transcription factor), 타이로시나제(tyrosinase), 타이로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protein 1) 및 타이로시나제 관련 단백질 2(tyrosinase related protein 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 억제하는 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
  9. 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 약학적 조성물.
  10. 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품.
  11. 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00017

    [화학식 2]
    Figure pat00018
    .
  12. 토목향(Inula helenium) 추출물의 헥산 분획물로부터 분리된 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품:
    [화학식 1]
    Figure pat00019

    [화학식 2]
    Figure pat00020
    .
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