JP3933535B2 - 細胞賦活剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤及び皮膚外用剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
加齢や紫外線等外来ストレスにより生じるシワ、シミの発生、皮膚弾性の低下といった皮膚の老化症状には、皮膚真皮の線維芽細胞の機能低下、細胞の酸化、紫外線によるメラニンの形成と沈着等が重要な要因となっている。しかし、従来の化粧品のように、ムコ多糖類やコラーゲンなどの生化学製品および合成高分子製品を配合して水分保持に努めるだけでは、皮膚の老化症状を十分に防止することができないことも明らかとなっている。そこで、皮膚の老化防止、改善作用を有する皮膚外用剤を得るため、細胞賦活作用、抗酸化作用及びメラニン産生抑制作用等のいずれかまたはこれらの作用のうち複数の作用を有する成分の検索と配合が試みられているが、安定性、副作用、効果などの点から未だ十分なものはない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来の問題点を解決し、天然由来で安全性が高く、細胞賦活作用、抗酸化作用、メラニン産生抑制作用等を有する成分を見いだし、老化防止に有用な皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく研究を重ねた結果、セリ科（Umbellif erae）のカワラボウフウ属（Peucedanum L.）に属する植物の抽出物が細胞賦活作用、抗酸化作用、メラニン産生抑制作用を有することを見いだし、さらに検討を加え遂に本発明を完成させた。すなわち、本発明は、セリ科（Umbelliferae）のカワラボウフウ属（Peucedanum L.）の植物の中から選ばれる１種または２種以上の植物の抽出物を含有する皮膚外用剤を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳述する。
【０００６】
本発明において用いられる原料の植物としては、セリ科（Umbelliferae）のカワラボウフウ属（Peucedanum L.）の植物であればよい。カワラボウフウ属の植物としては、ボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.）、ハクサンボウフウ（Pecedanum multivittatum Maxim.）、カワラボウフウ（Peucedanum terebinthaceum Fisch.）がある。
【０００７】
本発明はセリ科カワラボウフウ属の植物の中から選ばれる１種または２種以上の植物の抽出物を含有する細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤及び皮膚外用剤にかかるものである。本発明の細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤は皮膚外用剤、皮膚洗浄剤等に配合して用いることができ、これらに用いることによって、細胞の代謝を活性化し皮膚の老化を防止したり、あるいは肌質の改善や創傷治癒といった美容効果が期待できる。具体的には、ローション、乳液、クリーム、オイル、パックあるいは浴用剤などへの応用が挙げられる。また、上記以外にも、例えば栄養補強（栄養補助）などを目的とするような健康維持のための食品や飲料といったものにも配合して用いることもできる。
【０００８】
本発明に用いられるカワラボウフウ属の植物の抽出物は、常法により得ることができる。例えば、カワラボウフウ属の植物の全草あるいは各種部位（葉、花、根等）を生のままあるいは乾燥・粉砕後、溶媒で抽出することにより得ることができる。
【０００９】
抽出溶媒としては特に限定されず、水、アルコール類（エタノール、メタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ヘキサノール、メチルアミルアルコール、２−エチルブタノール、ｎ−オクチルアルコール等の１価のアルコール、グリセリン、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコール等の多価アルコールまたはその誘導体）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、メチル−ｎ−プロピルケトン等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸イソプロピル等）、エーテル類（エチルエーテル、イソプロピルエーテル、ｎ−ブチルエーテル等）、及びアセトニトリル等の極性溶媒、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサンなどの液状炭化水素、二酸化炭素の超臨界流体などの無（低）極性溶媒を単独あるいは２種以上の混液を任意に組み合わせて使用することができる。
【００１０】
これらの溶媒のうち、水、アルコール類（エタノール、メタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ヘキサノール、メチルアミルアルコール、２−エチルブタノール、ｎ−オクチルアルコール等の１価のアルコール、グリセリン、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコール等の多価アルコールまたはその誘導体）による抽出物に関しては溶媒を留去せずに使用しても良い。
【００１１】
また、リン酸緩衝生理食塩水等の無機塩類あるいは尿素などを添加した極性溶媒、界面活性剤を添加した溶媒を用いることもできる。
【００１２】
抽出方法は特に限定されず、室温で、又は冷却もしくは加熱した状態で含浸させて抽出する方法、水蒸気蒸留などの蒸留法を用いて抽出する方法、超臨界抽出装置を用いて抽出する方法、あるいはカワラボウフウ属植物体を圧搾して抽出物を得る方法などがある。これらの方法を単独で、又は２種以上を組み合わせて抽出を行う。抽出の際の植物体と溶媒との比率は特に限定されないが、カワラボウフウ属植物体１に対して溶媒0.1〜1000重量倍、特に抽出操作、効率の点で0.5〜100重量倍が好ましい。
【００１３】
カワラボウフウ属植物の抽出物は、抽出物をそのまま用いることもできるが、その効果を失わない範囲で、脱臭、脱色、濃縮などの精製操作を加えたり、さらにはカラムクロマトグラフィーなどを用いて分画物として用いてもよい。これらの抽出物や精製物、分画物は、これらから溶媒を除去することによって乾固物とすることもでき、さらに、アルコールなどの溶媒に可溶化した形態、あるいは乳剤の形態で用いることができる。本発明においては、カワラボウフウ属植物の中から選択される１種または２種以上の植物の抽出物を用いることができる。
【００１４】
これらの抽出物の皮膚外用剤への配合量は、その効果や添加した際の臭い、色調の点から考え、0.00001〜20重量％の濃度範囲とすることが好ましく、さらには0.0001〜10重量％とすることがより好ましい。
【００１５】
本発明の皮膚外用剤は、上記抽出物に加えて、必要に応じ、本発明の効果を損なわない範囲内で、化粧料、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤に一般的に用いられる成分、例えば水性成分、油性成分、粉末成分、保湿剤、増粘剤、紫外線吸収剤、防腐剤、酸化防止剤、香料、色剤、各種皮膚栄養剤等を配合することができる。
【００１６】
その他、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミン類（ビタミンC、ビタミンA、ビタミンE等）、アルブチン、コウジ酸、糖類（グルコース、フルクトース、トレハロース等）なども適宜配合することができる。
【００１７】
本発明の皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、化粧水等の可溶化系、乳液、クリーム等の乳化系、あるいは軟膏、粉末分散系、水−油二相系、水−油−粉末三相系、噴射剤と共に充填したエアゾール等どのような剤型でもかまわない。
【００１８】
【実施例】
以下に、カワラボウフウ属植物の抽出物の製造例、各作用を評価するための試験、皮膚外用剤としての処方例、使用試験を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものでないことはいうまでもない。
【００１９】
＜製造例１＞
ボタンボウフウ、ハクサンボウフウ、カワラボウフウそれぞれについてその葉、花、根を乾燥させた後粉砕し、部位ごとに50重量％エタノール水溶液中で室温下、１週間抽出した後濾過し、濾液の溶媒を留去し、それぞれの植物について各部位の抽出物を得た。
【００２０】
＜製造例２＞
ボタンボウフウ、ハクサンボウフウ、カワラボウフウそれぞれについてその葉、花、根を乾燥させた後粉砕し、部位ごとに50重量％エタノール水溶液中で50℃に加温した条件の下、５時間抽出した後濾過し、濾液の溶媒を留去し、それぞれの植物について各部位の抽出物を得た。
【００２１】
＜製造例３＞
ボタンボウフウ、ハクサンボウフウ、カワラボウフウそれぞれについてその葉、花、根を乾燥させた後粉砕し、部位ごとにｎ−ヘキサン中で50℃に加温した条件の下、５時間抽出した後濾過し、濾液の溶媒を留去し、それぞれの植物について各部位の抽出物を得た。
【００２２】
＜製造例４＞
ボタンボウフウ、ハクサンボウフウ、カワラボウフウそれぞれについてその葉、花、根を乾燥させた後粉砕し、部位ごとに50重量％１，３−ブチレングリコール中で室温下、２週間抽出した後濾過し、それぞれの植物について各部位の抽出物を得た。
【００２３】
＜製造例５＞
ボタンボウフウ、ハクサンボウフウ、カワラボウフウそれぞれの乾燥させた葉について、二酸化炭素による超臨界抽出によって、それぞれの抽出物を得た。
【００２４】
＜試験１：真皮線維芽細胞を用いた細胞賦活作用の評価＞
試験１の評価は、以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当たり２．０×１０4個となるように９６穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１重量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、製造例１によるボタンボウフウの葉の抽出物を任意の濃度となるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に交換し、さらに４８時間培養した。次いで３−(４,５−ジメチル−２−チアゾリル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を４００μｇ／ｍＬ含有する培地に交換して２時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。
【００２５】
上記ボタンボウフウの葉の抽出物に代えて、製造例１によるボタンボウフウの根の抽出物を用いて、上記と同様の評価を行った。
【００２６】
さらに、ボタンボウフウ抽出物を添加した培地の代わりに、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１重量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いたものをコントロールとし、また測定法の妥当性を確認するために、ボタンボウフウ抽出物を添加した培地の代わりに、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５重量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いたものを陽性コントロールとしそれぞれについても測定を行った。表１に、コントロールにおける細胞賦活作用を１００とした相対値にて評価結果を示す。表１中、ｐは危険率を表す。以下の表においても、同様である。
【００２７】
【表１】
【００２８】
表１より、ボタンボウフウの葉の抽出物を０．５０〜１．００ｍｇ／ｍＬで添加した培地を用いた場合に、コントロールと比較して、危険率１％未満で有意な真皮線維芽細胞の賦活作用が認められた。また、表１より、ボタンボウフウの根の抽出物を０．０２〜１．００ｍｇ／ｍＬで添加した培地を用いた場合に、コントロールと比較して、危険率１％未満で有意な真皮線維芽細胞の賦活作用が認められた。このことから、ボタンボウフウの抽出物は、優れた真皮線維芽細胞の賦活作用を有することが明らかとなった。
【００２９】
＜試験２：表皮細胞を用いた細胞賦活作用の評価＞
試験２の評価は、以下の手順で行った。正常ヒト表皮細胞を１ウェル当たり２．０×１０4個となるように９６穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、市販のクラボウ社製Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２を用いた。２４時間培養後、製造例１によるボタンボウフウの葉の抽出物を任意の濃度となるように添加したＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、さらに２４時間培養した。次いで３−(４,５−ジメチル−２−チアゾリル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を１００μｇ／ｍｌ含有する培地に交換して２時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。
【００３０】
上記ボタンボウフウの葉の抽出物に代えて、製造例１によるボタンボウフウの根の抽出物、ボタンボウフウの花の抽出物を用いて、上記と同様の評価を行った。
【００３１】
さらに、ボタンボウフウ抽出物を添加した培地の代わりに、有効成分無添加のＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を用いたものをコントロールとし、測定を行った。表２に、コントロールにおける細胞賦活作用を１００とした相対値にて評価結果を示す。
【００３２】
【表２】
【００３３】
表２より、ボタンボウフウの葉、根、花の抽出物を０．０４〜１．００ｍｇ／ｍＬで添加した培地を用いた場合に、コントロールと比較して、有意な表皮細胞の賦活作用が認められた。特に、ボタンボウフウの根又は花の抽出物を０．０４〜１．００ｍｇ／ｍＬ添加した培地を用いた場合に、コントロールと比較して、危険率１％未満で有意な表皮細胞の賦活作用が認められた。このことから、ボタンボウフウの抽出物は、優れた表皮細胞の賦活作用を有することが明らかとなった。
【００３４】
＜試験３：抗酸化作用の評価＞
試験３は、以下の手順で行った。製造例１によるボタンボウフウの花の抽出物を５０重量％エタノール溶液に１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したものを試料として、９６穴マイクロプレートに１００μＬ添加した。次に０．２ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液を、９６穴マイクロプレートに１００μＬ添加した。室温，暗所にて２４時間放置後、ＤＰＰＨラジカルに由来する５１６ｎｍの波長の光の吸光度を測定した。上記試料に代えて、製造例１によるボタンボウフウの葉の抽出物、ボタンボウフウの根の抽出物を５０重量％エタノール溶液に１０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したものを試料として、上記と同様に５１６ｎｍの波長の光の吸光度を測定した。
【００３５】
試料を添加しなかった場合の吸光度を（Ａ）、試料を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、ラジカル消去率は次の式（１）で表すことができる。
【００３６】
ラジカル消去率＝［１−（Ｂ）／（Ａ）］×１００ ・・・・・ 式（１）
上記試験結果から算出されたラジカル消去率を表３に示す。
【００３７】
【表３】
【００３８】
表３より明らかなように、ボタンボウフウ抽出物は、優れた抗酸化作用を有することが明らかとなった。
【００３９】
＜試験４：Ｂ１６メラノーマ細胞を用いたメラニン産生抑制作用の評価＞
試験４は、以下の手順で行った。Ｂ１６マウスメラノーマＦ０ストレイン（Ｂ１６Ｆ０）細胞を３５ｍｍディッシュに１ディッシュあたり２０００個にて播種した。２４時間培養後、製造例１によるボタンボウフウの葉の抽出物を任意の濃度となるように添加した５重量％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に交換した。７日間培養後、０．２５％トリプシンにて細胞を収獲し、１．５ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。最後に沈殿物の色を表４に示す判定表を基に肉眼判定した。
【００４０】
上記ボタンボウフウの葉の抽出物に代えて、製造例１によるボタンボウフウの根の抽出物を用いて、上記と同様の評価を行った。
【００４１】
さらに、ボタンボウフウ抽出物を添加した培地の代わりに、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５重量％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したものを用いたものをコントロールとし、測定法の妥当性を確認するために、ボタンボウフウ抽出物を添加した培地の代わりに、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５０ｍＭの乳酸ナトリウムと５重量％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したものを用いたものを陽性コントロールとしそれぞれについても判定を行った。肉眼判定は表４に示す通り、５段階評価を実施した。表５に評価結果を示す。
【００４２】
【表４】
【００４３】
【表５】
【００４４】
表５より、ボタンボウフウの抽出物を０．１ｍｇ／ｍＬで添加した培地を用いた場合に、コントロールと比較して、有意なメラニン産生抑制作用が認められた。このことから、ボタンボウフウの抽出物は、優れたメラニン産生抑制作用を有することが明らかとなった。
【００４５】
以下、処方例を示すが、処方は各製品の製造における常法により製造したもので良く、各処方例におけるカワラボウフウ属植物抽出物とは、ボタンボウフウ、ハクサンボウフウ、カワラボウフウの葉、花、根のいずれかの部位の抽出物であり、各処方例において、これら異なる抽出物を用いた９種類の外用剤を処方した。配合量は全て重量％で示している。
【００４６】
＜処方例１：皮膚用ローション＞
（１）グリセリン10.0、（２）乳酸ナトリウム0.5、（３）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（60E.O.）0.2、（４）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.2、（５）精製水 100とする残余
（製法）（１）〜（４）の成分を混合し、均一化した後、（５）を加え均一に撹拌し、皮膚用ローションを得た。
【００４７】
＜処方例２：皮膚用ローション＞
（１）エタノール10.0、（２）1重量％ヒドロキシエチルセルロース水溶液20.0、（３）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.1、（４）グリセリン7.0、（５）グアイアズレンスルホン酸ナトリウム0.5、（６）精製水 100とする残余
（製法）（１）〜（６）を混合した後、均一とし皮膚用ローションを得た。
【００４８】
＜処方例３：美容液＞
（１）スクワラン5.0、（２）白色ワセリン2.0、（３）ミツロウ0.5、（４）ソルビタンセスキオレート0.8、（５）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（20E.O.）1.2、（６）プロピレングリコール5.0、（７）精製水 100とする残余、（８）1重量％カルボキシビニルポリマー水溶液20.0、（９）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例３による抽出物）0.5、（１０）10重量％水酸化カリウム水溶液1.0、（１１）エタノール5.0、（１２）香料0.2
（製法）（１）〜（５）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して溶解、均一化した。一方、（６）〜（８）の水相成分を混合、溶解して７５℃に加熱し、前記油相成分を添加して予備乳化し、（１０）を加えてｐＨを調整した後、ホモミキサーにて乳化した。冷却後４０℃にて（１１）、（９）及び（１２）を添加、混合して美容液を得た。
【００４９】
＜処方例４：皮膚用乳液＞
（１）スクワラン15.0、（２）セタノール1.2、（３）ワセリン3.0、（４）モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.）1.3、（５）モノステアリン酸ソルビタン1.0、（６）パラオキシ安息香酸メチル0.2、（７）１，３−ブチレングリコール10.0、（８）1重量％カルボキシビニルポリマー水溶液15.0、（９）精製水 100とする残余、（１０）10重量％Ｌ−アルギニン水溶液2.0、（１１）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）2.0
（製法）（１）〜（５）の油相成分を混合、７５℃に加熱して溶解、均一化した。一方、（６）〜（９）の水相成分を混合し、７５℃に加熱して溶解、均一化した後、前記油相成分を添加して予備乳化し、（１０）を加えてｐＨを調整後、ホモミキサーで乳化した。冷却後４０℃にて（１１）を添加し、混合して皮膚用乳液を得た。
【００５０】
＜処方例５：皮膚用ゲル剤＞
（１）1重量％カルボキシビニルポリマー水溶液50.0、（２）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（50E.O.）0.5、（３）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.5、（４）ジプロピレングリコール8.0、（５）10重量％水酸化カリウム水溶液1.0、（６）精製水 100とする残余
（製法）（１）に（２）〜（４）を均一に溶解したものを加え均一に撹拌した。これに（５）を（６）に溶解した水溶液を添加し、増粘させて皮膚用ゲル剤を得た。
【００５１】
＜処方例６：皮膚用クリーム＞
（１）ミツロウ6.0、（２）セタノール1.5、（３）還元ラノリン8.0、（４）スクワラン29.5、（５）親油型モノステアリン酸グリセリド4.0、（６）モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.）5.0、（７）プロピレングリコール5.0、（８）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.5、（９）精製水 100とする残余
（製法）（１）〜（６）の油相成分を混合、溶解して７５℃に加熱した。一方、（７）、（９）の水相成分を混合、溶解して７５℃に加熱した。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化した後、ホモミキサーにて均一に乳化し冷却後４５℃にして（８）を添加し、皮膚用クリームを得た。
【００５２】
＜処方例７：水中油型乳剤性軟膏＞
（１）白色ワセリン25.0、（２）ステアリルアルコール25.0、（３）グリセリン10.0、（４）ラウリル硫酸ナトリウム1.0、（５）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.5、（６）精製水 100とする残余
（製法）（１）〜（４）の油相成分を混合、溶解して均一とし、７５℃に加熱する。そして、７５℃に加熱した（６）に前記油相成分を添加して乳化し、冷却後４５℃にして（５）を添加して、水中油型乳剤性軟膏を得た。
【００５３】
＜処方例８：化粧水＞
（１）エタノール10.0、（２）１，３−ブチレングリコール5.0、（３）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例４による抽出物）10.0、（４）グリチルリチン酸ジカリウム0.5、（５）香料0.1、（６）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（60E.O.）0.2、（７）精製水 100とする残余
（製法）（１）、（２）、（６）、（５）を均一に溶解し、その後（４）を溶解した（７）を加え、（３）を添加して均一に混合、溶解し化粧水を得た。
【００５４】
＜処方例９：メイクアップベースクリーム＞
（１）ステアリン酸1.2、（２）セタノール2.0、（３）トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリル2.5、（４）自己乳化型モノステアリン酸グリセリド2.0、（５）プロピレングリコール10.0、（６）10重量％水酸化カリウム水溶液1.5、（７）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.3、（８）精製水 100とする残余、（９）酸化チタン1.0、（１０）ベンガラ0.1、（１１）黄酸化鉄0.4、（１２）香料0.1
（製法）（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して均一とした。一方、（５）、（６）、（８）の成分を混合し、７５℃に加熱、溶解して均一とし、これに（９）〜（１１）の顔料を添加し、ホモミキサーにて均一に分散させて水相成分とした。この水相成分に前記油相成分を添加し、ホモミキサーにて乳化した後冷却し、４０℃にて（１２）、（７）の成分を添加、混合しメイクアップベースクリームを得た。
【００５５】
＜処方例１０：乳液状ファンデーション＞
（１）ステアリン酸2.0、（２）スクワラン5.0、（３）ミリスチン酸オクチルドデシル5.0、（４）セタノール1.0、（５）モノステアリン酸グリセリド1.0、（６）１，３−ブチレングリコール8.0、（７）10重量％水酸化カリウム水溶液1.0、（８）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.3、（９）精製水 100とする残余、（１０）酸化チタン9.0、（１１）タルク7.4、（１２）ベンガラ0.5、（１３）黄酸化鉄1.1、（１４）黒酸化鉄0.1、（１５）香料0.1
（製法）（１）〜（５）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して均一とした。一方、（６）、（７）、（９）の水相成分を混合し、７５℃に加熱、溶解して均一とし、これに（１０）〜（１４）の顔料を添加し、ホモミキサーにて均一に分散させた後冷却し、４０℃にて（１５）及び（８）を加え乳液状ファンデーションを得た。
【００５６】
＜処方例１１：ハンドクリーム＞
セタノール1.5、（２）ワセリン2.0、（３）流動パラフィン10.0、（４）モノステアリン酸グリセリド1.5、（５）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル（60E.O.）2.5、（６）酢酸トコフェロール0.5、（７）グリセリン20.0、（８）パラオキシ安息香酸メチル0.1、（９）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.5、（１０）精製水 100とする残余
（製法）（１）〜（６）の油相成分を混合、溶解して７５℃に加熱した。一方、（７）、（８）、（１０）の水相成分を混合、溶解して７５℃に加熱した。ついで、水相成分に油相成分を添加して予備乳化した後、ホモミキサーにて均一に乳化し、その後４０℃まで冷却し、（９）を加え、ハンドクリームを得た。
【００５７】
＜処方例１２：マッサージゲル＞
（１）ジプロピレングリコール7.0、（２）グリセリン8.0、（３）ポリオキシエチレン（15E.O.）オレイルエーテル0.5、（４）1重量％カルボキシビニルポリマー水溶液40.0、（５）1重量％メチルセルロース水溶液20.0、（６）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.3、（７）10重量％水酸化カリウム水溶液1.0、（８）精製水 100とする残余
（製法）（１）、（２）、（３）、（６）を均一に溶解後、（４）、（５）を加え均一にする。その後、（８）を加え均一化後、（７）を加えて増粘させてマッサージゲルを得た。
【００５８】
＜試験５：シワ、タルミ、ハリの改善作用の使用試験＞
試験５は、上記した本発明に係る皮膚外用剤についての処方例のうち、処方例４の乳液を実施例１〜６として、使用試験を行い、皮膚の老化症状の改善効果を評価した。ボタンボウフウの葉、花、根の抽出物を用いた乳液をそれぞれ実施例１、２、３、ハクサンボウフウの葉、花、根の抽出物を用いた乳液をそれぞれ実施例４、５、６とした。また、処方例４のカワラボウフウ属植物抽出物に代えて５０重量％エタノール水溶液を配合したものを比較例１とし同時に評価を行った。
【００５９】
皮膚の老化症状の改善効果は、シワ、タルミの形成、ハリの低下が顕著に認められる４０才代〜６０才代の女性パネラー２０名を１群とし、各群に実施例及び比較例のそれぞれをブラインドにて１日２回、２カ月間連続して使用させて評価した。シワの程度については肉眼観察及び写真撮影により評価し、タルミ及びハリについては肉眼観察により評価し、それぞれ使用試験開始前及び終了後の状態を比較し、「改善」，「やや改善」，「変化なし」の３段階で評価した。結果は、各評価を得たパネラー数にて表６に示した。
【００６０】
【表６】
【００６１】
表６より明らかなように、本発明の実施例使用群では、全群においてシワ、タルミ及びハリについてほとんどのパネラーに改善が認められた。シワについては７５％以上、タルミについては６５％以上、ハリについては７５％以上のパネラーにおいて明確な改善を認めていた。これに対し比較例使用群では、シワについては４５％、タルミについては２０％、ハリについては５０％のパネラーにおいて改善傾向が見られたに過ぎなかった。
【００６２】
なお、本発明に係る実施例１〜６については、２５℃で６カ月間保存した後にも皮膚の老化症状の改善効果の低下は認められず、急性毒性，亜急性毒性，慢性毒性及び催奇形性は認められなかった。また、２５℃で６カ月間保存した場合において状態の変化は全く認められず、男性パネラー３０名による４８時間の背部閉塞貼付試験においても、問題となる皮膚刺激性反応は認められなかった。
【００６３】
＜試験６：美白効果確認のための使用試験＞
試験６は、上記した本発明に係る皮膚外用剤についての処方例のうち、処方例３の美容液を実施例７〜９として、色素沈着症状の改善効果を評価した。ボタンボウフウの葉の抽出物を用いた美容液を実施例７、ハクサンボウフウの葉の抽出物を用いた美容液を実施例８、カワラボウフウの葉の抽出物を用いた美容液を実施例９とした。また、処方例３のカワラボウフウ属植物抽出物に代えて精製水を配合したものを比較例２とし同時に評価を行った。色素沈着症状の改善効果は、顕著なシミ，ソバカス等の色素沈着症状を有する女性パネラー２０名を一群とし、各群に実施例７、８、９及び比較例２をそれぞれブラインドにて１日２回ずつ１ヶ月間使用させ、１ヶ月後の皮膚の色素沈着の状態を観察して使用前と比較して評価した。色素沈着の状態は、表７に示す判定基準に従って評価し、２０名の平均値を算出して表８に示した
【００６４】
【表７】
【００６５】
【表８】
【００６６】
表８において明らかなように、各種カワラボウフウ属植物抽出物を配合した実施例７〜９使用群では、使用試験終了後の色素沈着症状は軽度と評価される程度にまで改善され、明確な色素沈着症状の改善が認められていた。これに対し、各種植物抽出物を精製水に代替した比較例２使用群では色素沈着症状の改善は認められなかった。
【００６７】
なお、上記の使用期間において、いずれの実施例を使用した群においても、痛み，痒み等の皮膚刺激感やアレルギー反応などの皮膚症状を訴えたパネラーはいなかった。また乳化状態の悪化や配合成分の沈降，変質なども認められなかった。
【００６８】
以上より、試験５、６において実施例で認められるシワ、タルミ、ハリの改善作用、色素沈着症状の改善作用は、カワラボウフウ属植物抽出物によるところが大きく、カワラボウフウ属植物抽出物は、細胞賦活作用、抗酸化作用、メラニン産生抑制作用を有するものであることが確認できた。
【００６９】
【発明の効果】
本発明によれば、天然由来で安全性が高い成分を有効成分とする細胞賦活剤、抗酸化剤及びメラニン産生抑制剤を提供することができる。また、これらを皮膚外用剤に適用することにより、老化防止に有用な皮膚外用剤を提供することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤及び皮膚外用剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
加齢や紫外線等外来ストレスにより生じるシワ、シミの発生、皮膚弾性の低下といった皮膚の老化症状には、皮膚真皮の線維芽細胞の機能低下、細胞の酸化、紫外線によるメラニンの形成と沈着等が重要な要因となっている。しかし、従来の化粧品のように、ムコ多糖類やコラーゲンなどの生化学製品および合成高分子製品を配合して水分保持に努めるだけでは、皮膚の老化症状を十分に防止することができないことも明らかとなっている。そこで、皮膚の老化防止、改善作用を有する皮膚外用剤を得るため、細胞賦活作用、抗酸化作用及びメラニン産生抑制作用等のいずれかまたはこれらの作用のうち複数の作用を有する成分の検索と配合が試みられているが、安定性、副作用、効果などの点から未だ十分なものはない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来の問題点を解決し、天然由来で安全性が高く、細胞賦活作用、抗酸化作用、メラニン産生抑制作用等を有する成分を見いだし、老化防止に有用な皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく研究を重ねた結果、セリ科（Umbellif erae）のカワラボウフウ属（Peucedanum L.）に属する植物の抽出物が細胞賦活作用、抗酸化作用、メラニン産生抑制作用を有することを見いだし、さらに検討を加え遂に本発明を完成させた。すなわち、本発明は、セリ科（Umbelliferae）のカワラボウフウ属（Peucedanum L.）の植物の中から選ばれる１種または２種以上の植物の抽出物を含有する皮膚外用剤を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳述する。
【０００６】
本発明において用いられる原料の植物としては、セリ科（Umbelliferae）のカワラボウフウ属（Peucedanum L.）の植物であればよい。カワラボウフウ属の植物としては、ボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.）、ハクサンボウフウ（Pecedanum multivittatum Maxim.）、カワラボウフウ（Peucedanum terebinthaceum Fisch.）がある。
【０００７】
本発明はセリ科カワラボウフウ属の植物の中から選ばれる１種または２種以上の植物の抽出物を含有する細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤及び皮膚外用剤にかかるものである。本発明の細胞賦活剤、抗酸化剤、メラニン産生抑制剤は皮膚外用剤、皮膚洗浄剤等に配合して用いることができ、これらに用いることによって、細胞の代謝を活性化し皮膚の老化を防止したり、あるいは肌質の改善や創傷治癒といった美容効果が期待できる。具体的には、ローション、乳液、クリーム、オイル、パックあるいは浴用剤などへの応用が挙げられる。また、上記以外にも、例えば栄養補強（栄養補助）などを目的とするような健康維持のための食品や飲料といったものにも配合して用いることもできる。
【０００８】
本発明に用いられるカワラボウフウ属の植物の抽出物は、常法により得ることができる。例えば、カワラボウフウ属の植物の全草あるいは各種部位（葉、花、根等）を生のままあるいは乾燥・粉砕後、溶媒で抽出することにより得ることができる。
【０００９】
抽出溶媒としては特に限定されず、水、アルコール類（エタノール、メタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ヘキサノール、メチルアミルアルコール、２−エチルブタノール、ｎ−オクチルアルコール等の１価のアルコール、グリセリン、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコール等の多価アルコールまたはその誘導体）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、メチル−ｎ−プロピルケトン等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸イソプロピル等）、エーテル類（エチルエーテル、イソプロピルエーテル、ｎ−ブチルエーテル等）、及びアセトニトリル等の極性溶媒、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサンなどの液状炭化水素、二酸化炭素の超臨界流体などの無（低）極性溶媒を単独あるいは２種以上の混液を任意に組み合わせて使用することができる。
【００１０】
これらの溶媒のうち、水、アルコール類（エタノール、メタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ヘキサノール、メチルアミルアルコール、２−エチルブタノール、ｎ−オクチルアルコール等の１価のアルコール、グリセリン、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコール等の多価アルコールまたはその誘導体）による抽出物に関しては溶媒を留去せずに使用しても良い。
【００１１】
また、リン酸緩衝生理食塩水等の無機塩類あるいは尿素などを添加した極性溶媒、界面活性剤を添加した溶媒を用いることもできる。
【００１２】
抽出方法は特に限定されず、室温で、又は冷却もしくは加熱した状態で含浸させて抽出する方法、水蒸気蒸留などの蒸留法を用いて抽出する方法、超臨界抽出装置を用いて抽出する方法、あるいはカワラボウフウ属植物体を圧搾して抽出物を得る方法などがある。これらの方法を単独で、又は２種以上を組み合わせて抽出を行う。抽出の際の植物体と溶媒との比率は特に限定されないが、カワラボウフウ属植物体１に対して溶媒0.1〜1000重量倍、特に抽出操作、効率の点で0.5〜100重量倍が好ましい。
【００１３】
カワラボウフウ属植物の抽出物は、抽出物をそのまま用いることもできるが、その効果を失わない範囲で、脱臭、脱色、濃縮などの精製操作を加えたり、さらにはカラムクロマトグラフィーなどを用いて分画物として用いてもよい。これらの抽出物や精製物、分画物は、これらから溶媒を除去することによって乾固物とすることもでき、さらに、アルコールなどの溶媒に可溶化した形態、あるいは乳剤の形態で用いることができる。本発明においては、カワラボウフウ属植物の中から選択される１種または２種以上の植物の抽出物を用いることができる。
【００１４】
これらの抽出物の皮膚外用剤への配合量は、その効果や添加した際の臭い、色調の点から考え、0.00001〜20重量％の濃度範囲とすることが好ましく、さらには0.0001〜10重量％とすることがより好ましい。
【００１５】
本発明の皮膚外用剤は、上記抽出物に加えて、必要に応じ、本発明の効果を損なわない範囲内で、化粧料、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤に一般的に用いられる成分、例えば水性成分、油性成分、粉末成分、保湿剤、増粘剤、紫外線吸収剤、防腐剤、酸化防止剤、香料、色剤、各種皮膚栄養剤等を配合することができる。
【００１６】
その他、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミン類（ビタミンC、ビタミンA、ビタミンE等）、アルブチン、コウジ酸、糖類（グルコース、フルクトース、トレハロース等）なども適宜配合することができる。
【００１７】
本発明の皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、化粧水等の可溶化系、乳液、クリーム等の乳化系、あるいは軟膏、粉末分散系、水−油二相系、水−油−粉末三相系、噴射剤と共に充填したエアゾール等どのような剤型でもかまわない。
【００１８】
【実施例】
以下に、カワラボウフウ属植物の抽出物の製造例、各作用を評価するための試験、皮膚外用剤としての処方例、使用試験を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものでないことはいうまでもない。
【００１９】
＜製造例１＞
ボタンボウフウ、ハクサンボウフウ、カワラボウフウそれぞれについてその葉、花、根を乾燥させた後粉砕し、部位ごとに50重量％エタノール水溶液中で室温下、１週間抽出した後濾過し、濾液の溶媒を留去し、それぞれの植物について各部位の抽出物を得た。
【００２０】
＜製造例２＞
ボタンボウフウ、ハクサンボウフウ、カワラボウフウそれぞれについてその葉、花、根を乾燥させた後粉砕し、部位ごとに50重量％エタノール水溶液中で50℃に加温した条件の下、５時間抽出した後濾過し、濾液の溶媒を留去し、それぞれの植物について各部位の抽出物を得た。
【００２１】
＜製造例３＞
ボタンボウフウ、ハクサンボウフウ、カワラボウフウそれぞれについてその葉、花、根を乾燥させた後粉砕し、部位ごとにｎ−ヘキサン中で50℃に加温した条件の下、５時間抽出した後濾過し、濾液の溶媒を留去し、それぞれの植物について各部位の抽出物を得た。
【００２２】
＜製造例４＞
ボタンボウフウ、ハクサンボウフウ、カワラボウフウそれぞれについてその葉、花、根を乾燥させた後粉砕し、部位ごとに50重量％１，３−ブチレングリコール中で室温下、２週間抽出した後濾過し、それぞれの植物について各部位の抽出物を得た。
【００２３】
＜製造例５＞
ボタンボウフウ、ハクサンボウフウ、カワラボウフウそれぞれの乾燥させた葉について、二酸化炭素による超臨界抽出によって、それぞれの抽出物を得た。
【００２４】
＜試験１：真皮線維芽細胞を用いた細胞賦活作用の評価＞
試験１の評価は、以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当たり２．０×１０4個となるように９６穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１重量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、製造例１によるボタンボウフウの葉の抽出物を任意の濃度となるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に交換し、さらに４８時間培養した。次いで３−(４,５−ジメチル−２−チアゾリル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を４００μｇ／ｍＬ含有する培地に交換して２時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。
【００２５】
上記ボタンボウフウの葉の抽出物に代えて、製造例１によるボタンボウフウの根の抽出物を用いて、上記と同様の評価を行った。
【００２６】
さらに、ボタンボウフウ抽出物を添加した培地の代わりに、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１重量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いたものをコントロールとし、また測定法の妥当性を確認するために、ボタンボウフウ抽出物を添加した培地の代わりに、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５重量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いたものを陽性コントロールとしそれぞれについても測定を行った。表１に、コントロールにおける細胞賦活作用を１００とした相対値にて評価結果を示す。表１中、ｐは危険率を表す。以下の表においても、同様である。
【００２７】
【表１】
表１より、ボタンボウフウの葉の抽出物を０．５０〜１．００ｍｇ／ｍＬで添加した培地を用いた場合に、コントロールと比較して、危険率１％未満で有意な真皮線維芽細胞の賦活作用が認められた。また、表１より、ボタンボウフウの根の抽出物を０．０２〜１．００ｍｇ／ｍＬで添加した培地を用いた場合に、コントロールと比較して、危険率１％未満で有意な真皮線維芽細胞の賦活作用が認められた。このことから、ボタンボウフウの抽出物は、優れた真皮線維芽細胞の賦活作用を有することが明らかとなった。
【００２９】
＜試験２：表皮細胞を用いた細胞賦活作用の評価＞
試験２の評価は、以下の手順で行った。正常ヒト表皮細胞を１ウェル当たり２．０×１０4個となるように９６穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、市販のクラボウ社製Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２を用いた。２４時間培養後、製造例１によるボタンボウフウの葉の抽出物を任意の濃度となるように添加したＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、さらに２４時間培養した。次いで３−(４,５−ジメチル−２−チアゾリル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を１００μｇ／ｍｌ含有する培地に交換して２時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。
【００３０】
上記ボタンボウフウの葉の抽出物に代えて、製造例１によるボタンボウフウの根の抽出物、ボタンボウフウの花の抽出物を用いて、上記と同様の評価を行った。
【００３１】
さらに、ボタンボウフウ抽出物を添加した培地の代わりに、有効成分無添加のＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地を用いたものをコントロールとし、測定を行った。表２に、コントロールにおける細胞賦活作用を１００とした相対値にて評価結果を示す。
【００３２】
【表２】
表２より、ボタンボウフウの葉、根、花の抽出物を０．０４〜１．００ｍｇ／ｍＬで添加した培地を用いた場合に、コントロールと比較して、有意な表皮細胞の賦活作用が認められた。特に、ボタンボウフウの根又は花の抽出物を０．０４〜１．００ｍｇ／ｍＬ添加した培地を用いた場合に、コントロールと比較して、危険率１％未満で有意な表皮細胞の賦活作用が認められた。このことから、ボタンボウフウの抽出物は、優れた表皮細胞の賦活作用を有することが明らかとなった。
【００３４】
＜試験３：抗酸化作用の評価＞
試験３は、以下の手順で行った。製造例１によるボタンボウフウの花の抽出物を５０重量％エタノール溶液に１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したものを試料として、９６穴マイクロプレートに１００μＬ添加した。次に０．２ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液を、９６穴マイクロプレートに１００μＬ添加した。室温，暗所にて２４時間放置後、ＤＰＰＨラジカルに由来する５１６ｎｍの波長の光の吸光度を測定した。上記試料に代えて、製造例１によるボタンボウフウの葉の抽出物、ボタンボウフウの根の抽出物を５０重量％エタノール溶液に１０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したものを試料として、上記と同様に５１６ｎｍの波長の光の吸光度を測定した。
【００３５】
試料を添加しなかった場合の吸光度を（Ａ）、試料を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、ラジカル消去率は次の式（１）で表すことができる。
【００３６】
ラジカル消去率＝［１−（Ｂ）／（Ａ）］×１００ ・・・・・ 式（１）
上記試験結果から算出されたラジカル消去率を表３に示す。
【００３７】
【表３】
表３より明らかなように、ボタンボウフウ抽出物は、優れた抗酸化作用を有することが明らかとなった。
【００３９】
＜試験４：Ｂ１６メラノーマ細胞を用いたメラニン産生抑制作用の評価＞
試験４は、以下の手順で行った。Ｂ１６マウスメラノーマＦ０ストレイン（Ｂ１６Ｆ０）細胞を３５ｍｍディッシュに１ディッシュあたり２０００個にて播種した。２４時間培養後、製造例１によるボタンボウフウの葉の抽出物を任意の濃度となるように添加した５重量％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に交換した。７日間培養後、０．２５％トリプシンにて細胞を収獲し、１．５ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。最後に沈殿物の色を表４に示す判定表を基に肉眼判定した。
【００４０】
上記ボタンボウフウの葉の抽出物に代えて、製造例１によるボタンボウフウの根の抽出物を用いて、上記と同様の評価を行った。
【００４１】
さらに、ボタンボウフウ抽出物を添加した培地の代わりに、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５重量％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したものを用いたものをコントロールとし、測定法の妥当性を確認するために、ボタンボウフウ抽出物を添加した培地の代わりに、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５０ｍＭの乳酸ナトリウムと５重量％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したものを用いたものを陽性コントロールとしそれぞれについても判定を行った。肉眼判定は表４に示す通り、５段階評価を実施した。表５に評価結果を示す。
【００４２】
【表４】
【表５】
表５より、ボタンボウフウの抽出物を０．１ｍｇ／ｍＬで添加した培地を用いた場合に、コントロールと比較して、有意なメラニン産生抑制作用が認められた。このことから、ボタンボウフウの抽出物は、優れたメラニン産生抑制作用を有することが明らかとなった。
【００４５】
以下、処方例を示すが、処方は各製品の製造における常法により製造したもので良く、各処方例におけるカワラボウフウ属植物抽出物とは、ボタンボウフウ、ハクサンボウフウ、カワラボウフウの葉、花、根のいずれかの部位の抽出物であり、各処方例において、これら異なる抽出物を用いた９種類の外用剤を処方した。配合量は全て重量％で示している。
【００４６】
＜処方例１：皮膚用ローション＞
（１）グリセリン10.0、（２）乳酸ナトリウム0.5、（３）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（60E.O.）0.2、（４）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.2、（５）精製水 100とする残余
（製法）（１）〜（４）の成分を混合し、均一化した後、（５）を加え均一に撹拌し、皮膚用ローションを得た。
【００４７】
＜処方例２：皮膚用ローション＞
（１）エタノール10.0、（２）1重量％ヒドロキシエチルセルロース水溶液20.0、（３）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.1、（４）グリセリン7.0、（５）グアイアズレンスルホン酸ナトリウム0.5、（６）精製水 100とする残余
（製法）（１）〜（６）を混合した後、均一とし皮膚用ローションを得た。
【００４８】
＜処方例３：美容液＞
（１）スクワラン5.0、（２）白色ワセリン2.0、（３）ミツロウ0.5、（４）ソルビタンセスキオレート0.8、（５）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（20E.O.）1.2、（６）プロピレングリコール5.0、（７）精製水 100とする残余、（８）1重量％カルボキシビニルポリマー水溶液20.0、（９）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例３による抽出物）0.5、（１０）10重量％水酸化カリウム水溶液1.0、（１１）エタノール5.0、（１２）香料0.2
（製法）（１）〜（５）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して溶解、均一化した。一方、（６）〜（８）の水相成分を混合、溶解して７５℃に加熱し、前記油相成分を添加して予備乳化し、（１０）を加えてｐＨを調整した後、ホモミキサーにて乳化した。冷却後４０℃にて（１１）、（９）及び（１２）を添加、混合して美容液を得た。
【００４９】
＜処方例４：皮膚用乳液＞
（１）スクワラン15.0、（２）セタノール1.2、（３）ワセリン3.0、（４）モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.）1.3、（５）モノステアリン酸ソルビタン1.0、（６）パラオキシ安息香酸メチル0.2、（７）１，３−ブチレングリコール10.0、（８）1重量％カルボキシビニルポリマー水溶液15.0、（９）精製水 100とする残余、（１０）10重量％Ｌ−アルギニン水溶液2.0、（１１）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）2.0
（製法）（１）〜（５）の油相成分を混合、７５℃に加熱して溶解、均一化した。一方、（６）〜（９）の水相成分を混合し、７５℃に加熱して溶解、均一化した後、前記油相成分を添加して予備乳化し、（１０）を加えてｐＨを調整後、ホモミキサーで乳化した。冷却後４０℃にて（１１）を添加し、混合して皮膚用乳液を得た。
【００５０】
＜処方例５：皮膚用ゲル剤＞
（１）1重量％カルボキシビニルポリマー水溶液50.0、（２）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（50E.O.）0.5、（３）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.5、（４）ジプロピレングリコール8.0、（５）10重量％水酸化カリウム水溶液1.0、（６）精製水 100とする残余
（製法）（１）に（２）〜（４）を均一に溶解したものを加え均一に撹拌した。これに（５）を（６）に溶解した水溶液を添加し、増粘させて皮膚用ゲル剤を得た。
【００５１】
＜処方例６：皮膚用クリーム＞
（１）ミツロウ6.0、（２）セタノール1.5、（３）還元ラノリン8.0、（４）スクワラン29.5、（５）親油型モノステアリン酸グリセリド4.0、（６）モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.）5.0、（７）プロピレングリコール5.0、（８）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.5、（９）精製水 100とする残余
（製法）（１）〜（６）の油相成分を混合、溶解して７５℃に加熱した。一方、（７）、（９）の水相成分を混合、溶解して７５℃に加熱した。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化した後、ホモミキサーにて均一に乳化し冷却後４５℃にして（８）を添加し、皮膚用クリームを得た。
【００５２】
＜処方例７：水中油型乳剤性軟膏＞
（１）白色ワセリン25.0、（２）ステアリルアルコール25.0、（３）グリセリン10.0、（４）ラウリル硫酸ナトリウム1.0、（５）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.5、（６）精製水 100とする残余
（製法）（１）〜（４）の油相成分を混合、溶解して均一とし、７５℃に加熱する。そして、７５℃に加熱した（６）に前記油相成分を添加して乳化し、冷却後４５℃にして（５）を添加して、水中油型乳剤性軟膏を得た。
【００５３】
＜処方例８：化粧水＞
（１）エタノール10.0、（２）１，３−ブチレングリコール5.0、（３）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例４による抽出物）10.0、（４）グリチルリチン酸ジカリウム0.5、（５）香料0.1、（６）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（60E.O.）0.2、（７）精製水 100とする残余
（製法）（１）、（２）、（６）、（５）を均一に溶解し、その後（４）を溶解した（７）を加え、（３）を添加して均一に混合、溶解し化粧水を得た。
【００５４】
＜処方例９：メイクアップベースクリーム＞
（１）ステアリン酸1.2、（２）セタノール2.0、（３）トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリル2.5、（４）自己乳化型モノステアリン酸グリセリド2.0、（５）プロピレングリコール10.0、（６）10重量％水酸化カリウム水溶液1.5、（７）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.3、（８）精製水 100とする残余、（９）酸化チタン1.0、（１０）ベンガラ0.1、（１１）黄酸化鉄0.4、（１２）香料0.1
（製法）（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して均一とした。一方、（５）、（６）、（８）の成分を混合し、７５℃に加熱、溶解して均一とし、これに（９）〜（１１）の顔料を添加し、ホモミキサーにて均一に分散させて水相成分とした。この水相成分に前記油相成分を添加し、ホモミキサーにて乳化した後冷却し、４０℃にて（１２）、（７）の成分を添加、混合しメイクアップベースクリームを得た。
【００５５】
＜処方例１０：乳液状ファンデーション＞
（１）ステアリン酸2.0、（２）スクワラン5.0、（３）ミリスチン酸オクチルドデシル5.0、（４）セタノール1.0、（５）モノステアリン酸グリセリド1.0、（６）１，３−ブチレングリコール8.0、（７）10重量％水酸化カリウム水溶液1.0、（８）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.3、（９）精製水 100とする残余、（１０）酸化チタン9.0、（１１）タルク7.4、（１２）ベンガラ0.5、（１３）黄酸化鉄1.1、（１４）黒酸化鉄0.1、（１５）香料0.1
（製法）（１）〜（５）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して均一とした。一方、（６）、（７）、（９）の水相成分を混合し、７５℃に加熱、溶解して均一とし、これに（１０）〜（１４）の顔料を添加し、ホモミキサーにて均一に分散させた後冷却し、４０℃にて（１５）及び（８）を加え乳液状ファンデーションを得た。
【００５６】
＜処方例１１：ハンドクリーム＞
セタノール1.5、（２）ワセリン2.0、（３）流動パラフィン10.0、（４）モノステアリン酸グリセリド1.5、（５）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル（60E.O.）2.5、（６）酢酸トコフェロール0.5、（７）グリセリン20.0、（８）パラオキシ安息香酸メチル0.1、（９）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.5、（１０）精製水 100とする残余
（製法）（１）〜（６）の油相成分を混合、溶解して７５℃に加熱した。一方、（７）、（８）、（１０）の水相成分を混合、溶解して７５℃に加熱した。ついで、水相成分に油相成分を添加して予備乳化した後、ホモミキサーにて均一に乳化し、その後４０℃まで冷却し、（９）を加え、ハンドクリームを得た。
【００５７】
＜処方例１２：マッサージゲル＞
（１）ジプロピレングリコール7.0、（２）グリセリン8.0、（３）ポリオキシエチレン（15E.O.）オレイルエーテル0.5、（４）1重量％カルボキシビニルポリマー水溶液40.0、（５）1重量％メチルセルロース水溶液20.0、（６）カワラボウフウ属植物抽出物（製造例１による抽出物）0.3、（７）10重量％水酸化カリウム水溶液1.0、（８）精製水 100とする残余
（製法）（１）、（２）、（３）、（６）を均一に溶解後、（４）、（５）を加え均一にする。その後、（８）を加え均一化後、（７）を加えて増粘させてマッサージゲルを得た。
【００５８】
＜試験５：シワ、タルミ、ハリの改善作用の使用試験＞
試験５は、上記した本発明に係る皮膚外用剤についての処方例のうち、処方例４の乳液を実施例１〜６として、使用試験を行い、皮膚の老化症状の改善効果を評価した。ボタンボウフウの葉、花、根の抽出物を用いた乳液をそれぞれ実施例１、２、３、ハクサンボウフウの葉、花、根の抽出物を用いた乳液をそれぞれ実施例４、５、６とした。また、処方例４のカワラボウフウ属植物抽出物に代えて５０重量％エタノール水溶液を配合したものを比較例１とし同時に評価を行った。
【００５９】
皮膚の老化症状の改善効果は、シワ、タルミの形成、ハリの低下が顕著に認められる４０才代〜６０才代の女性パネラー２０名を１群とし、各群に実施例及び比較例のそれぞれをブラインドにて１日２回、２カ月間連続して使用させて評価した。シワの程度については肉眼観察及び写真撮影により評価し、タルミ及びハリについては肉眼観察により評価し、それぞれ使用試験開始前及び終了後の状態を比較し、「改善」，「やや改善」，「変化なし」の３段階で評価した。結果は、各評価を得たパネラー数にて表６に示した。
【００６０】
【表６】
表６より明らかなように、本発明の実施例使用群では、全群においてシワ、タルミ及びハリについてほとんどのパネラーに改善が認められた。シワについては７５％以上、タルミについては６５％以上、ハリについては７５％以上のパネラーにおいて明確な改善を認めていた。これに対し比較例使用群では、シワについては４５％、タルミについては２０％、ハリについては５０％のパネラーにおいて改善傾向が見られたに過ぎなかった。
【００６２】
なお、本発明に係る実施例１〜６については、２５℃で６カ月間保存した後にも皮膚の老化症状の改善効果の低下は認められず、急性毒性，亜急性毒性，慢性毒性及び催奇形性は認められなかった。また、２５℃で６カ月間保存した場合において状態の変化は全く認められず、男性パネラー３０名による４８時間の背部閉塞貼付試験においても、問題となる皮膚刺激性反応は認められなかった。
【００６３】
＜試験６：美白効果確認のための使用試験＞
試験６は、上記した本発明に係る皮膚外用剤についての処方例のうち、処方例３の美容液を実施例７〜９として、色素沈着症状の改善効果を評価した。ボタンボウフウの葉の抽出物を用いた美容液を実施例７、ハクサンボウフウの葉の抽出物を用いた美容液を実施例８、カワラボウフウの葉の抽出物を用いた美容液を実施例９とした。また、処方例３のカワラボウフウ属植物抽出物に代えて精製水を配合したものを比較例２とし同時に評価を行った。色素沈着症状の改善効果は、顕著なシミ，ソバカス等の色素沈着症状を有する女性パネラー２０名を一群とし、各群に実施例７、８、９及び比較例２をそれぞれブラインドにて１日２回ずつ１ヶ月間使用させ、１ヶ月後の皮膚の色素沈着の状態を観察して使用前と比較して評価した。色素沈着の状態は、表７に示す判定基準に従って評価し、２０名の平均値を算出して表８に示した
【００６４】
【表７】
【表８】
表８において明らかなように、各種カワラボウフウ属植物抽出物を配合した実施例７〜９使用群では、使用試験終了後の色素沈着症状は軽度と評価される程度にまで改善され、明確な色素沈着症状の改善が認められていた。これに対し、各種植物抽出物を精製水に代替した比較例２使用群では色素沈着症状の改善は認められなかった。
【００６７】
なお、上記の使用期間において、いずれの実施例を使用した群においても、痛み，痒み等の皮膚刺激感やアレルギー反応などの皮膚症状を訴えたパネラーはいなかった。また乳化状態の悪化や配合成分の沈降，変質なども認められなかった。
【００６８】
以上より、試験５、６において実施例で認められるシワ、タルミ、ハリの改善作用、色素沈着症状の改善作用は、カワラボウフウ属植物抽出物によるところが大きく、カワラボウフウ属植物抽出物は、細胞賦活作用、抗酸化作用、メラニン産生抑制作用を有するものであることが確認できた。
【００６９】
【発明の効果】
本発明によれば、天然由来で安全性が高い成分を有効成分とする細胞賦活剤、抗酸化剤及びメラニン産生抑制剤を提供することができる。また、これらを皮膚外用剤に適用することにより、老化防止に有用な皮膚外用剤を提供することができる。
Claims (2)
- セリ科（Umbelliferae）のカワラボウフウ属（Peucedanum L.）の植物の中から選ばれる１種または２種以上の植物の抽出物を含有することを特徴とする細胞賦活剤。
- セリ科（Umbelliferae）のカワラボウフウ属（Peucedanum L.）の植物がボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.）であることを特徴とする請求項１に記載の細胞賦活剤。
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