TWI495465B

TWI495465B - A heparinase activity inhibitor and a wrinkle improving agent and a pharmaceutical composition containing the same

Info

Publication number: TWI495465B
Application number: TW099133112A
Authority: TW
Inventors: Shunsuke Iriyama; Hirotada Fukunishi; Masaru Suetsugu; Satoshi Amano
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2010-09-29
Publication date: 2015-08-11
Also published as: US9101564B2; EP2484349A4; EP2484349B1; JP5670340B2; KR20120093159A; TW201117805A; ES2457236T3; KR101736519B1; EP2484349A1; WO2011040495A1; US20120184782A1; JPWO2011040495A1; CN102573819A

Description

乙醯肝素酶活性抑制劑與含有其之皺紋改善劑及醫藥組合物

本發明係關於一種將4-烷基間苯二酚作為活性成分之乙醯肝素酶活性抑制劑、及使用該乙醯肝素酶活性抑制劑之皺紋改善劑及醫藥組合物。

乙醯肝素酶為特異性地分解各種硫酸乙醯肝素蛋白多糖之硫酸乙醯肝素鏈之酶，存在於血小板、白血球、內皮細胞、平滑肌細胞等各種細胞中。尤其是於皮膚中，該乙醯肝素酶於構成表皮之表皮角化細胞、或真皮之纖維母細胞及血管內皮細胞等中產生。又，已知於各種癌細胞中亦產量亦較高。

已知作為乙醯肝素酶之分解基質之硫酸乙醯肝素蛋白多糖(HSPG)係存在於各種動物組織之細胞表面或細胞外基質中之高分子，具有使硫酸乙醯肝素結合性生長因子(bFGF(鹼性纖維母細胞生長因子)、HGF(肝細胞生長因子)、VEGF(血管內皮生長因子)、HB-EGF(肝素結合性表皮生長因子樣生長因子)等)積存於細胞外等之功能。

於存在於表皮與真皮之交界部之表皮基底膜上，存在作為硫酸乙醯肝素蛋白多糖之1種之基底膜蛋白多糖，藉由使硫酸乙醯肝素結合性生長因子與表皮基底膜結合，而控制表皮與真皮之間的生長因子之移動。又，已知基底膜蛋白多糖亦控制生長因子對與基底膜結合之表皮基底細胞之作用，係表皮之良好之增殖、分化所必需者。因此，由乙醯肝素酶之活化或表現亢進引起之基底膜蛋白多糖之硫酸乙醯肝素鏈之分解會破壞積存之生長因子的釋放及表皮與真皮之間之生長因子的控制，產生表皮之分化、增殖控制之喪失及真皮之肥厚，促進皺紋之形成(參照PCT/JP2009/056717)。換言之，認為若抑制乙醯肝素酶活性，則會抑制硫酸乙醯肝素之分解所伴隨的生長因子之游離，因此可控制表皮與真皮之間的生長因子之移動，進而有助於皮膚之抗老化。

又，亦顯示出乙醯肝素酶與癌之惡性度之關聯。已知尤其是乙醯肝素酶之產生量較高之癌細胞，增殖性或轉移性較高，血管新生之誘導能力亦較高(非專利文獻1)。進而，已知乙醯肝素酶具有促進創傷癒合之作用(非專利文獻2)。因此，若可有效地抑制乙醯肝素酶活性，則對癌細胞之增殖或轉移之抑制、血管新生之抑制等用途亦有效。

[先前技術文獻] [非專利文獻]

[非專利文獻1]　Vlodavsky I.,等人Semin Cancer Biol.,2002;12(2):121-129

[非專利文獻2]　Zcharia E.,等人FASEB J. 2005 Feb;19(2):211-21

根據以上背景，業界需要一種可有效地抑制乙醯肝素酶活性之物質。

本發明係鑒於上述課題而實施者，其目的在於提供一種可有效地抑制乙醯肝素酶活性之乙醯肝素酶活性抑制劑與使用該乙醯肝素酶活性抑制劑之皺紋改善劑及醫藥組合物。

本發明者潛心研究，結果發現特定之4-烷基間苯二酚可有效地抑制乙醯肝素酶活性。

即，本發明之要旨如下所述。

(1)一種乙醯肝素酶活性抑制劑，其係包含下式(I)所示之4-烷基間苯二酚作為活性成分而成：

[化1]

(式中，R表示碳數1~6之直鏈或支鏈烷基)。

(2)如(1)之乙醯肝素酶活性抑制劑式，其中於(I)中，R為碳數2~4之直鏈或支鏈烷基。

(3)如(2)之乙醯肝素酶活性抑制劑，其中式(I)之4-烷基間苯二酚為4-異丁基間苯二酚。

(4)一種醫藥組合物，其係用以治療、改善或預防與乙醯肝素酶活性相關之狀態或症狀者，且係包含如(1)至(3)中任一項之乙醯肝素酶活性抑制劑作為有效成分而成。

(5)如(4)之醫藥組合物，其用於創傷癒合、癌細胞之增殖或轉移之抑制、或血管新生之抑制。

(6)一種皺紋改善劑，其係預防或抑制皺紋之形成者，且係包含如(1)至(3)中任一項之乙醯肝素酶活性抑制劑作為有效成分而成。

本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑可有效地抑制乙醯肝素酶活性，因此可作為例如皺紋改善劑之有效成分，較佳地用於預防或抑制皺紋(尤其是大皺紋)之形成等，或者可作為醫藥組合物之有效成分，較佳地用於治療、改善或預防與乙醯肝素酶活性相關之狀態或症狀等。

本發明者為了探索可有效地抑制乙醯肝素酶活性之物質，以乙醯肝素酶活性之抑制度為基準，對各種化合物進行篩選，結果發現顯著抑制乙醯肝素酶活性之特定之間苯二酚衍生物，從而完成本發明。

間苯二酚衍生物表現出對乙醯肝素酶活性之抑制作用先前完全不為人知。於日本專利特開平2-49715號公報及日本專利特開2006-124358號公報中，揭示有將特定之間苯二酚衍生物用於美白劑，於日本專利特開2007-254412號公報中，揭示有將特定之間苯二酚衍生物用於用以預防、改善皺紋之皮膚外用劑，但均未揭示乙醯肝素酶活性之抑制作用。

尤其是日本專利特開2007-254412號公報提示有，於細胞內之肝素(硫酸乙醯肝素之一種)之存在促進膠原蛋白纖維束結構之破壞、導致皺紋之形成之方面(參照[0006]等)，藉由間苯二酚衍生物可降低細胞內之肝素，防止該膠原蛋白纖維束結構之破壞，但其與本發明所揭示之間苯二酚衍生物對乙醯肝素酶活性之抑制作用完全不同。即，其原因在於：本發明中，藉由抑制乙醯肝素酶活性而抑制硫酸乙醯肝素蛋白多糖之硫酸乙醯肝素鏈之分解，因此細胞中之硫酸乙醯肝素(肝素等)之存在量反而維持於較高之值。

即，本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑係包含下式(I)所示之4-烷基間苯二酚作為活性成分而成：

[化2]

式中，R表示碳數1~6之直鏈或支鏈烷基。作為例子，可列舉甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、第二己基等。其中，較佳為碳數2~4之直鏈或支鏈烷基，例如乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基，特佳為異丁基。即，作為式(I)之4-烷基間苯二酚，最佳為4-異丁基間苯二酚。

式(I)之4-烷基間苯二酚之製造方法並無限定，可列舉：使飽和羧酸或飽和羧酸鹵化物與間苯二酚於氯化鋅或氯化鋁等路易斯酸存在下進行夫裏得‧誇夫特反應，利用鋅汞齊/鹽酸使生成之4-醯基間苯二酚還原之方法(日本專利特公平6-51619號公報，美國專利第2093778號說明書)；以氧化鋁為催化劑，使間苯二酚與正己醇於液相中於200~400℃下發生反應，直接製造4-正己基間苯二酚之方法(英國專利第1581428號說明書)；使用選自特定金屬之氧化物及氫氧化物中之一種以上作為催化劑，使乙醇於超臨界狀態下與間苯二酚發生反應而製造4-烷基間苯二酚之方法(日本專利特開2002-167344號公報)等。

本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑可僅單獨包含1種式(I)之4-烷基間苯二酚，亦可以任意之組合及比率包含2種以上之式(I)之4-烷基間苯二酚。

本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑中之式(I)之4-烷基間苯二酚之含量只要為對於有效地發揮乙醯肝素酶活性之抑制作用充分之量便無特別限定，根據乙醯肝素酶活性抑制劑之用途適當選擇即可。但是，一般而言，式(I)之4-烷基間苯二酚相對於乙醯肝素酶活性抑制劑整體之比率通常設為0.0001質量%以上，其中較佳為設為0.0001質量%以上，又通常設為1質量%以下，其中較佳為設為0.2質量%以下。於使用2種以上之式(I)之4-烷基間苯二酚之情形時，該等之總量滿足上述範圍即可。

又，本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑只要不實質性地損害式(I)之4-烷基間苯二酚對乙醯肝素酶活性之抑制作用，則除式(I)之4-烷基間苯二酚以外，亦可含有其他任意成分。作為其他成分，可列舉：具有乙醯肝素酶活性之抑制作用之其他化合物(其他活性成分)、或醫藥上可容許之載體及/或補助劑。上述其他成分可單獨使用1種，亦可以任意之組合及比率使用2種以上。

本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑並無特別限定，可用作化妝料、准藥品、醫藥組合物等或用作該等之調配成分。

將本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑作為有效成分而調配之醫藥組合物(本發明之醫藥組合物)可用於與乙醯肝素酶活性相關之各種狀態或症狀之治療、改善或預防。此處作為「與乙醯肝素酶活性相關之狀態或症狀」，例如可列舉皮膚之老化、癌細胞之增殖或轉移、血管新生等。因此本發明之醫藥組合物適用於例如皮膚之老化之改善或預防(抗老化)、癌細胞之增殖或轉移之抑制、血管新生之抑制等。

關於皮膚老化，宏觀而言年齡增長為重要之原因，除此以外亦可列舉氧化、乾燥、太陽光(紫外線)等作為與皮膚老化相關之直接因素。作為皮膚老化之具體表現，已知以玻尿酸為代表之黏多糖類之減少、膠原蛋白之交聯反應、由紫外線所導致的細胞之損傷等。

為抑制、改善由皮膚損傷或由紫外線暴露導致之皮膚老化所引起的皮膚之皺紋、小皺紋、鬆弛等，業界正在進行各種研究。其結果表明，有效的是例如促進玻尿酸之產生(日本專利特開2001-163794號公報)；抑制基質金屬蛋白酶(MMP)之產生‧活性(日本專利特表2000-503660號公報)；促進膠原蛋白之產生促進、抑制酯酶之活性(日本專利特開平11-335235號公報)；抑制血管新生(WO 03/84302，日本專利申請案第2003-581562號公報)；抑制淋巴管擴張(參照K. Kajiya等人Am. J. Pathol.,2006,169(4): 1496-1503.)等。

該等研究大體分為著眼於表皮或表皮細胞而謀求抑制、改善小皺紋等之研究與著眼於抑制包含血管或淋巴管之真皮之變化而謀求抑制、改善大皺紋等之研究兩種。藉由表皮之變化傳遞至真皮而誘導包含血管或淋巴管之真皮之變化，乙醯肝素酶與該過程緊密相關。

實際上，本發明者以前即明確，藉由將乙醯肝素酶抑制劑塗佈於小皺紋模型上，而具有顯著之抗皺紋效果(PCT/JP2009/056717)。

如實施例之欄之詳細敍述，本發明者此次明確：若對培養之正常角化細胞照射紫外線，則正常角化細胞之乙醯肝素酶會活化(參照圖1)。又明確：藉由對人類皮膚照射紫外線，而使表皮中乙醯肝素酶之量增加，基底膜之硫酸乙醯肝素降低(參照圖2)。由此明確不僅小皺紋模型會引起乙醯肝素酶活化，而且紫外線亦會引起乙醯肝素酶活化。

進而，若乙醯肝素酶活化，則會分解基底膜硫酸乙醯肝素，因此本發明者等人製作基底膜中含有硫酸乙醯肝素之正常模型、與基底膜中不含硫酸乙醯肝素之硫酸乙醯肝素分解模型作為虛擬皮膚模型，進行VEGF之透過性及血管新生之評價。其結果，與正常模型比較，硫酸乙醯肝素分解模型中VEGF之透過性增大，誘導血管新生(參照圖3~6)。

先前，矢野等人發現：由於顯示出藉由紫外線誘導真皮中之血管新生、引起真皮之變化，對大皺紋形成較為重要(日本專利申請案第2002-580892號)，因此乙醯肝素酶係不僅與小皺紋形成緊密相關而且與大皺紋形成亦緊密相關之酶。即，抑制乙醯肝素酶活性不僅對於由乾燥所導致的小皺紋之預防有效，而且對於由長期日光暴露等所導致的大皺紋之預防亦有效。

再者，本說明書中，所謂「抗老化」，係指藉由抑制由年齡增長或光老化所導致之基底膜蛋白多糖之硫酸乙醯肝素的分解所引起之伴隨於硫酸乙醯肝素結合性生長因子之游離的皮膚變化，具體而言，藉由抑制表皮分化異常、真皮血管新生、淋巴管擴張、彈力蛋白分解而防止、改善皮膚之皺紋、鬆弛、硬化等，從而維持彈力存在或健康之皮膚狀態。

本發明之醫藥組合物之投予路徑及劑型均無限定，根據其用途適當選擇即可。作為投予路徑之例，可列舉經口投予、非經口投予(靜脈投予、腹腔內投予等)、局部投予(皮膚外用等)等。作為劑型，於經口投予之情形時，可列舉錠劑、塗層錠、糖衣錠、顆粒劑、散劑、膠囊劑(例如硬或軟膠囊)等固體製劑，內服液劑、糖漿劑等液體製劑(溶液、懸濁液)等形態。於非經口投予之情形時，可列舉注射液等形態。於局部投予(皮膚外用材)之情形時，可列舉如下形態：將溶液系、溶解系、乳化系、粉末分散系、水-油二層系、水-油-粉末三層系等製成貼劑、軟膏、乳霜、乳液、化妝水、凝膠、氣溶膠等之形態。

本發明之醫藥組合物中之本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑之調配量亦無限定，根據醫藥組合物之用途、劑型、投予形態等適當選擇即可。例如，於本發明之醫藥組合物為皮膚外用劑之情形時，本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑之調配量於皮膚外用劑總量中，以乾燥質量(固形物成分質量)計，通常為0.0001質量%以上之範圍，其中較佳為0.0001質量%以上之範圍，又通常為1質量%以下之範圍，其中較佳為0.2質量%以下之範圍。若調配量少於上述範圍，則有無法充分地發揮本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑之效果之傾向，另一方面，即便超過上述範圍進行調配，亦有無法獲得與調配量對應之效果之提昇之傾向，又有製劑化變得困難之傾向。

又，於本發明之醫藥組合物中，只要不實質性地損害本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑對乙醯肝素酶活性之抑制作用，則除本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑以外，亦可調配其他1種或2種以上之任意成分。其他成分無特別限定，根據醫藥組合物之用途、劑型、投予形態等適當選擇即可，作為例子，可列舉醫藥上可容許之載體及/或補助劑。作為補助劑，例如可列舉：稀釋劑、結合劑、崩解劑、增稠劑、分散劑、再吸收促進劑、調味劑、緩衝劑、界面活性劑、溶解助劑、防腐劑、乳化劑、等張劑、穩定劑、pH調整劑等。

作為具體例，於將本發明之醫藥組合物作為皮膚外用劑之情形時，可視需要適當調配通常用於外用劑之成分，例如：美白劑、保濕劑、抗氧化劑、油性成分、紫外線吸收劑、界面活性劑、增稠劑、醇類、粉末成分、著色劑、水性成分、水、各種皮膚營養劑等。進而，亦可適當調配：乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸三鈉、檸檬酸鈉、聚磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡萄糖酸等金屬離子封阻劑，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丁酯等防腐劑，咖啡因、單寧、維拉帕米、傳明酸及其衍生物、甘草萃取物、光甘草啶、木瓜果實之熱水萃取物、各種天然藥、生育醇乙酸酯、甘草酸及其衍生物或其鹽等藥劑，維生素C、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸葡糖苷、葡糖苷、曲酸等美白劑，葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖類，視黃酸、視黃醇、視黃醇乙酸酯、視黃醇棕櫚酸酯等維生素A衍生物類等。

另一方面，於將本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑用於化妝料或准藥品之情形時，較佳為用作皺紋改善劑之有效成分。將本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑作為有效成分調配而成之皺紋改善劑(本發明之皺紋改善劑)可用於預防或抑制皺紋之形成等。再者，如上所述，皺紋分為因乾燥等而形成於表皮上之小皺紋、與因紫外線等而形成於真皮上之大皺紋，本發明之皺紋改善劑可適用於上述任一者，尤其對由紫外線等所導致的大皺紋之改善有效。

本發明之皺紋改善劑之投予路徑及劑型均無限定，根據其用途適當選擇即可。作為投予路徑之例，可列舉經口投予、局部投予等。作為劑型之例，關於醫藥組合物，可列舉上述各種劑型，此外關於經口投予，亦可列舉添加於各種食品或飲料品中等。

本發明之皺紋改善劑中之本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑之調配量亦無限定，根據皺紋改善劑之用途、劑型、投予形態等適當選擇即可。

又，於本發明之皺紋改善劑中，只要不實質性地損害本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑對乙醯肝素酶活性之抑制作用，則除本發明之乙醯肝素酶活性抑制劑以外，亦可調配其他1種或2種以上之任意成分。其他成分無特別限定，根據皺紋改善劑之用途、劑型、投予形態等適當選擇即可。

以上，列舉具體例對本發明進行說明，但以上之具體例僅為例示，本發明可於未脫離專利申請範圍之範圍內加以任意變更而實施。

以下，列舉實施例更具體地說明本發明，但本發明並非限定於下述實施例。

[實施例1]以乙醯肝素酶活性之抑制率為基準之評價

利用添加有10%之血清之DMEM(達爾伯克改良伊格爾培養基)對A431細胞(浸潤性人類上皮癌細胞)進行培養。使用溶解緩衝液(Lysis Buffer)(50 mM之tris-HCL(三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽)，0.5%之TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，0.15 M之氯化鈉，pH為4.5)溶解培養細胞並利用刮刀回收之後，進行吸打(Pipeting)並於冰上靜置30分鐘。其後，以10,000 rpm離心10分鐘，去除不溶物，將上清液作為細胞萃取液加以回收。利用BCA蛋白質定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit，PIERCE，CA46141)測定該細胞萃取液中之蛋白質之量。

其次，利用分析緩衝液(50 mM之HEPES(4-羥乙基哌乙磺酸)，50 mM之乙酸納，150 mM之氯化鈉，9 mM之氯化鈣，0.1% BSA(牛血清白蛋白))將上述A431細胞萃取液稀釋成500 μg/mL。繼而，將作為試驗對象之化合物溶解於DMSO(二甲基亞碸)中，並以化合物成為0.0005質量%、0.005質量%及0.05質量%之比率之方式添加至上述稀釋細胞萃取液中，混合而製作試樣溶液(DMSO之最終濃度為5%)。對照溶液係將DMSO以最終濃度成為5%之方式與稀釋細胞萃取液混合，將該等試樣溶液及對照溶液以100 μL/孔之比例播種於生物素化硫酸乙醯肝素固定板上。使其於37℃下使其反應2小時，利用PBS-T清洗3次後，以100 μL/孔之比例添加稀釋10,000倍之HRP-抗生素蛋白(Vector，A-2004)/PBS-T，並於37℃下使其反應1小時。再次利用PBS-T清洗3次，以100 μL/孔之比例添加TMB(四甲基聯苯胺)試劑(BIO-RAD，172-1066)並使其反應，利用1 N之硫酸使反應停止後，測定475 nm下之吸光度(OD475)。

又，於利用上述A431細胞萃取液之分析緩衝液所獲得之階段稀釋液(細胞萃取液濃度為500 μg/mL、50 μg/mL、5 μg/mL、0.5 μg/mL)中，不添加作為試驗對象之化合物，以最終濃度成為5%之方式添加DMSO並混合(校準曲線用溶液)。對該校準曲線用溶液，以與上述相同之工序進行向生物素化硫酸乙醯肝素固定板之播種以後之處理，測定OD475。

其次，基於校準曲線用溶液之OD475之值描繪蛋白質濃度之校準曲線，利用該校準曲線，並根據以各添加濃度添加試驗對象化合物而成之試樣溶液之OD475之值，算出各試樣溶液之蛋白質濃度。進而，對於對照用溶液，亦同樣地算出蛋白質濃度。根據各試樣溶液之蛋白質濃度與對照用溶液之蛋白質濃度之比率(%)求出各試樣溶液之乙醯肝素酶活性之抑制率。

再者，關於以上之工序，請參照日本專利特表2003-502054號公報。

藉由以上之工序，測定4-異丁基間苯二酚之乙醯肝素酶活性抑制作用。將結果示於表1。根據表1可明確：4-異丁基間苯二酚即便於添加濃度為0.0005%時亦顯示出37.64%之抑制率，於添加濃度為0.05%時顯示出94.74%之抑制率，有效地抑制乙醯肝素酶活性。

[表1]

[實施例2]利用紫外線評價乙醯肝素酶之活性變化

利用正常角化細胞用培養基EpiLife對正常人類角化細胞進行培養。使用如下所得之溶液作為紫外線照射群之試樣溶液：以PBS(磷酸鹽緩衝液)暫時代替培養基後照射50 mJ之UVB(中波紫外線)，培養1小時、2小時、4小時後使用溶解緩衝液(Lysis Buffer)溶解細胞而成者。又，使用以PBS暫時代替培養基、未照射紫外線者作為對照用溶液。使用該等試樣溶液及對照用溶液，與實施例1同樣地進行處理，測定OD475。基於所得之OD475之值，與實施例1同樣地評價乙醯肝素酶活性。將其結果示於圖1。可明確：與未照射紫外線之對照組比較，紫外線照射群中乙醯肝素酶顯著地活化。

紫外線照射人類皮膚中之乙醯肝素酶及硫酸乙醯肝素之免疫染色

對二十幾歲之人類之臀部照射2MED之紫外線，兩天後利用生檢(biopsy)採集照射部位與附近之未照射紫外線之臀部皮膚，利用AMeX法製作石蠟塊。製作3 μm之組織切片，實施乙醯肝素酶及硫酸乙醯肝素之免疫染色。將所得之免疫染色圖像示於圖2。可明確：與未照射部位比較，紫外線照射部位乙醯肝素酶之量增加，又硫酸乙醯肝素之量降低。

根據硫酸乙醯肝素之有無評價VEGF之透過性及血管新生將2 mg之硫酸乙醯肝素及10 mg之瓊脂糖於1 ml之PBS(1%瓊脂糖溶液)中加熱溶解後，塗佈於小室(Corning公司製造之24孔用Transwell)上，藉此形成包含硫酸乙醯肝素之片材。又，作為對照，藉由除不使用硫酸乙醯肝素而僅使用瓊脂糖以外其他相同之程序，形成不含硫酸乙醯肝素之片材。如此，製作將小室內看作表皮側、片材看作基底膜、孔看作真皮側之虛擬皮膚模型(圖3a、b)。

如此所得之虛擬皮膚模型可作為根據看作基底膜之片材(以下稱為「基底膜片材」)上有無硫酸乙醯肝素而評價VEGF之透過性及血管新生之評價系統而使用。再者，於以下之記載中，將基底膜片材中包含硫酸乙醯肝素之虛擬皮膚模型設為「正常模型」，將基底膜片材中不含硫酸乙醯肝素之虛擬皮膚模型設為「硫酸乙醯肝素分解模型」。

首先，為評價VEGF之透過性，而向各模型之表皮側(小室內)添加10 μg/mL之VEGF水溶液，於室溫下靜置3小時，利用VEGF ELISA試劑盒(R&D systems)測出真皮側之孔內之VEGF濃度。將其結果示於圖4。與硫酸乙醯肝素分解模型比較，正常模型中VEGF之透過量顯著減少。

其次，為評價血管新生，而向各模型之表皮側(小室內)添加100 μg/mL之VEGF水溶液，置於血管新生試劑盒(Kurabo公司)中培養11天後，拍攝培養物之光學顯微鏡照片。將所得之圖像示於圖5。於硫酸乙醯肝素分解模型中，隨著濃度增大而發現顯著之血管新生，但正常模型中未發現血管新生。

進而，使用血管新生試劑盒用解析軟件(Kurabo公司)解析圖5之圖像之血管面積。將其結果示於圖6。可明確：與正常模型比較，硫酸乙醯肝素分解模型中發現顯著之血管面積增加，血管新生顯著地產生。

[產業上之可利用性]

本發明適用於如下之醫藥組合物等領域，該醫藥組合物之目的在於與乙醯肝素酶活性相關之狀態或症狀之治療、改善或預防，具體而言在於皮膚老化之改善或預防(抗老化)、創傷癒合、癌細胞增殖或轉移之抑制、血管新生之抑制等。

圖1係表示正常人類角化細胞之紫外線照射及未照射條件下之乙醯肝素酶活性之差異的圖表；

圖2係表示正常人類臀部組織之紫外線照射部位及未照射部位之乙醯肝素酶及硫酸乙醯肝素的免疫染色圖像；

圖3(a)、(b)均係表示虛擬皮膚模型之示意圖。圖3(a)表示基底膜片材中不含硫酸乙醯肝素之「硫酸乙醯肝素分解模型」(硫酸乙醯肝素(-))，圖3(b)表示基底膜片材中不含硫酸乙醯肝素之「正常模型」(硫酸乙醯肝素(+))；

圖4係表示使用圖3(a)、(b)之虛擬皮膚模型的VEGF之透過性之評價結果的圖表；

圖5係表示使用圖3(a)、(b)之虛擬皮膚模型的血管新生之評價結果的照片；及

圖6係表示圖5之照片中之血管面積之解析結果的圖表。

(無元件符號說明)

Claims

一種4-異丁基間苯二酚用於製造乙醯肝素酶活性抑制劑之用途。
如請求項1之用途，其中上述乙醯肝素酶活性抑制劑係用以治療、改善或預防與乙醯肝素酶活性相關聯之狀態或症狀者。
如請求項2之用途，其中上述乙醯肝素酶活性抑制劑係用於創傷癒合、癌細胞之增殖或轉移之抑制、或血管新生之抑制。
如請求項1之用途，其中上述乙醯肝素酶活性抑制劑係用於預防或抑制皺紋之形成者。