CN105658659A - 蛋白酶抗性肽配体 - Google Patents

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本杰明·G·博鲍伊
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Abstract

本发明总体上涉及新型蛋白酶抗性肽配体的发现及其用途。具体来说，本发明提供一种具有三到二十个氨基酸的蛋白酶抗性肽配体，其能够结合生物制品并包含一个或多个碱性氨基酸和/或芳香族氨基酸，其中一个或多个所述氨基酸被非天然存在的氨基酸类似物替换。

Description

蛋白酶抗性肽配体
相关申请的交互引用
本申请要求2013年7月15日提交、Menegatti等、代理所案号NS13002USV的美国临时申请号61/846326“蛋白酶抗性肽配体(PROTEASE-RESISTANTPEPTIDELIGANDS)”的权益，该申请在此通过引用整体并入。
1.发明领域
本发明总体上涉及新型蛋白酶抗性肽配体的发现。
2.背景技术
1.介绍
从哺乳动物血清纯化免疫球蛋白用于治疗和研究应用是一件具有相当大的工业、医学和经济价值的事情。基于多克隆抗体的疗法表现出针对多个表位和靶点的多价交互作用，因此最适合用于预防或治疗某些疾病。血浆来源的多克隆静脉注射免疫球蛋白(IVIG)制剂已经成功地用于预防免疫缺陷患者中的感染性疾病并对自身免疫和炎性问题得到了越来越多的应用。至今，IVIG是全球血液产品市场上的主要血浆产品，每年的消耗量稳步增加。目前源自动物血浆的多克隆抗体也用于产生免疫测定法的研究并用于设计治疗和诊断工具。
目前对来自哺乳动物血清的多克隆抗体的亲和纯化主要基于使用蛋白配体，例如蛋白A和蛋白G。然而，这些蛋白配体面临几个缺点，例如1)成本高(每升吸附剂$15,000–20,000)，2)化学和生物化学稳定性低，3)免疫原性，伴随着与在产品主流中配体片段的浸出相关的风险，和4)由于高结合亲和性造成的苛刻的洗脱条件，其威胁洗脱蛋白的生物活性。此外，蛋白A并不结合人类IgG3和几种动物的免疫球蛋白。蛋白G尽管结合所有人类IgG亚类，但也显示出相当多地结合白蛋白，一种在人类和动物血浆及其级分中的主要蛋白。
为克服这些问题，已经提议用基于肽、氨基酸、三嗪支架和嗜硫化合物的合成配体用于纯化抗体。我们的研究小组已经鉴定出三种六肽配体，HWRGWV、HYFKFD和HFRRHL(SEQIDNO:1-3)，其通过Fc部分结合IgG，从而模拟蛋白A的结合机制。特别是，肽HWRGWV被进一步表征为具有从多种复杂来源分离IgG的能力，所述复杂来源包括细胞培养基、CHO细胞培养上清液、转基因奶和乳清、植物提取物、和人类血浆的Cohn级分II+III。从这些实验得到的产物收率和纯度总是与通过蛋白A介质获得的相当。
然而，当用于从人类血浆纯化多克隆抗体时蛋白配体和合成肽配体二者所面临的一个问题是在人类血浆中存在的蛋白水解酶、尤其是胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶的作用。胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，其在赖氨酸和精氨酸残基的羧基侧切开肽链。胰凝乳蛋白酶在疏水性残基例如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的羧基侧切开肽链。在长期暴露和/或反复接触哺乳动物血清后，蛋白或肽配体都会被这些内切蛋白酶所降解。为防止蛋白A被这些内切蛋白酶所降解以及由此引起的昂贵的亲和树脂寿命的减少，在注射前要向进料添加酶抑制剂。然而，这些抑制剂本身也是一笔相当大的额外成本。
3.发明内容
在具体的非限制性实施方式中，本发明提供了一种具有三到二十个氨基酸的蛋白酶抗性肽，其能够结合生物制品并包含一个或多个碱性氨基酸和/或芳香族氨基酸，其中一个或多个氨基酸被非天然存在的氨基酸类似物替换。所述非天然氨基酸类似物可以是表6中所列之一。
蛋白酶抗性肽可以是4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体、10聚体、11聚体、12聚体、13聚体、14聚体、15聚体、16聚体、17聚体、18聚体或19聚体。蛋白酶抗性肽是六肽，在被非天然存在的氨基酸替换前序列为HWRGWV、HYFKFD和HFRRHL(SEQIDNO:1-3)
蛋白酶抗性肽可以具有1个非天然存在的氨基酸。可选地，其可以具有2、3、4、或5个非天然存在的氨基酸。所述肽可以具有10分之1的被非天然存在的氨基酸替代的氨基酸(10％)。可选地，其可以具有19分之1的被替代的氨基酸(～5％)。其可具有10分之2的被替代的氨基酸(20％)或6分之2的被替代的氨基酸(33％)。其可以是50％的非天然存在的氨基酸，例如6分之3，或8分之4等。
如果天然存在的肽包含谷氨酰胺，则其可被N-γ-乙基-谷氨酰胺替代以形成蛋白酶抗性肽。如果天然对应物包含谷氨酸，则其可被羧基-谷氨酸替代。如果天然存在的肽包含脯氨酸，则蛋白酶抗性肽可以具有其中仲氢被苯甲基、OH或苯基替代的脯氨酸。如果天然存在的肽包含苯丙氨酸，则蛋白酶抗性肽在苯丙氨酸中可以有一个或多个芳香氢被氨基、乙氧基、乙基、甲氧基、甲基、OH或苯基替代。如果天然存在的肽包含酪氨酸，则蛋白酶抗性肽在酪氨酸中可以有一个或多个芳香氢被氨基、乙氧基、乙基、甲氧基、甲基、OH或苯基替代。如果天然存在的肽包含精氨酸，则其可被瓜氨酸替代或甲基化以形成蛋白酶抗性肽。类似地，天然存在的肽中的氨基可被甲基氨基或二甲基氨基替代，例如在赖氨酸中的氨基氢可被甲基化以形成蛋白酶抗性肽。
蛋白酶抗性肽可抵抗内肽酶或外肽酶的消化。在一个非限制性实施方式中，内肽酶可以是α-胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶。
本发明还包括与蛋白酶抗性肽偶联的固体载体。所述固体载体可以是作为树脂珠的树脂，例如Toyopearl。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种纯化生物制品的方法，其包括将具有蛋白酶抗性肽的固体载体与生物制品在合适条件下接触，使得所述生物制品结合至所述固体载体；洗涤所述固体载体和结合的生物制品；和从所述固体载体洗脱所述生物制品以纯化所述生物制品。生物制品可以是抗体。
本发明还提供了一种诊断试剂盒，其包含固体载体和蛋白酶抗性肽。
4.附图说明
图1.下列序列的1号簇：a)HWRGWV，b)HFRRHL，(SEQIDNO:1、3)，c)HWMetCitDWMetV，和d)HFMetCitCitHL(SEQIDNO:4-5)
图2.图(A)-(D)显示了天然肽结合剂和修饰的肽结合剂的蛋白水解消化产物。
图3.使用吸附剂从人类血浆的Cohn级分II+III色谱纯化IgG的SDS-PAGE(还原条件)。
图4.在结合缓冲液中的不同盐浓度下进行的从人类血浆的Cohn级分II+III色谱纯化IgG的SDS-PAGE(还原条件)。
5.具体实施方式
从哺乳动物血清纯化免疫球蛋白用于治疗和研究目的在生物技术和生物生产中是具有相当大关联性的事情[1,2]。血浆来源的多克隆静脉注射免疫球蛋白(IVIG)制剂已经成功用于预防免疫缺陷患者中的感染性疾病，并对自身免疫和炎性障碍得到了越来越多的使用[3,4]。至今，IVIG是全球血液产品市场上的主要血浆产品，每年的消耗量稳步增加[5]。此外，目前源自被免疫动物的血清的多克隆抗体也用于医学研究以开发免疫测定法、治疗性处理和新的药物递送策略[6-9]。血清也可以是单克隆抗体的来源，正如在杂交瘤技术的情况下，该技术尽管非常陈旧，但仍是开发单克隆抗体的一项强大的研究工具[10]。因为杂交瘤集落在主要具有高浓度的牛血清的培养基中生长，因此从这些流体纯化单克隆抗体实际上类似于从动物来源回收多克隆抗体[11]。抗体纯化最常用的亲和配体蛋白A和蛋白G不是很适合这种类型的抗体纯化[12,13]。除已知的成本高、化学稳定性低、免疫原性和由低解离常数(～10-8M)造成的苛刻的洗脱条件的问题外，还有一些其他的担心[14,15]。蛋白A并不结合人类IgG3亚类，显示出小鼠IgG1和牛IgG1的弱结合，并且不结合山羊和小鼠IgG，或鸡IgY亚类[16]。蛋白G尽管结合所有的人类IgG亚类和大多数动物抗体，但也捕获白蛋白(至今为止血浆和血清中的主要蛋白成分)，因此其不常用于从血浆纯化抗体[17]。已经开发出无白蛋白结合位点的工程化形式的蛋白G，但它们非常昂贵，并且稳定性和免疫原性的问题仍然是一个担心。为克服这些问题，已经开发了合成的配体用于抗体纯化，与蛋白配体相比，所述合成的配体更可承受的起且化学上稳固、毒性较少和免疫原性较低[19,20]。
我们的研究小组已经鉴定出三种肽配体，HWRGWV、HYFKFD和HFRRHL(SEQIDNO:1-3)，其通过Fc部分结合IgG，从而模拟蛋白A的结合机制[21-23]。这些序列结合所有的人类抗体亚类以及许多动物(牛、小鼠、兔、山羊、骆驼和禽)抗体，并且已经用于从多种来源(包括人类血浆的Cohn级分II+III)纯化单克隆和多克隆抗体[24-26]。在所有这些研究中，据发现，产物收率和纯度总是与由蛋白A所给出的相当。然而，由于它们更轻的结合强度(KD～10-5–10-6M)，它们允许在更温和的条件(pH4.0–5.0)下从亲和柱进行抗体洗脱，从而防止聚集和保持活性。还已经进行了大量工作以增加这些肽配体吸附剂的化学稳定性和动态结合能力(DBC)。作为这些优化研究的结果，HWRGWV-Toyopearl(SEQIDNO:6)吸附剂显示出在连续的使用循环期间对0.5MNaOH的高抗性和在50g/L范围中的DBC值[27,28]。这些配体因此使得能够开发来自血清和血浆的单克隆和多克隆抗体的工业规模的亲和纯化。
当用于从动物血浆纯化多克隆抗体时蛋白和合成肽配体两者面对的一个问题是存在蛋白水解酶，例如胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶[29,30]。这些蛋白酶分别在碱性(精氨酸和赖氨酸)和芳香族(色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸)氨基酸的羧基端切开肽链[31,32]。在将亲和吸附剂长期暴露于血清后，胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶引起蛋白或肽配体的显著降解，结果使结合能力受损。对于蛋白配体如蛋白A/G来说，该问题因产物主流中免疫原性片段的释放而加重。作为预防措施，通常在注射前向进料混合物添加蛋白酶抑制剂[33]。然而，这些抑制剂是昂贵的且需要从最终产物中除去。
对这些问题的彻底的解决方案是生产包含非天然氨基酸的肽配体的变体。这些变体预期组合了良好的靶亲和性和选择性以及对蛋白酶的高抗性。Verdoliva等已提议使用氨基酸的D-立体异构体合成肽配体，D-立体异构体不同于天然存在的L-型，不会被蛋白酶所识别和攻击[34,35]。然而，D-氨基酸非常昂贵且易于发生其他类型的化学性降解，例如由分别用于蛋白洗脱和树脂清洁的酸性和碱性溶液在氨基酸官能团上引起的那些降解[36-39]。为克服这些障碍，可使用化学修饰形式的L-氨基酸替代D-氨基酸以生产肽变体，所述变体尽管保留了原序列的靶亲和性和选择性，但也表现出高的酶抗性和化学稳定性。为此，本文中提出了一种设计和鉴定这些配体的方法，其包括三个步骤：1)使用非天然氨基酸设计已知肽配体的虚拟变体库，2)通过分子对接模拟而对靶生物分子在硅片中进行库筛选，3)在色谱树脂上合成所选择的变体并测试生成的吸附剂的靶结合和对蛋白酶的抗性。抗体结合肽HWRGWV、HYFKFD和HFRRHL(SEQIDNO:1-3)中的色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和赖氨酸被烷基化类似物替代，而用瓜氨酸替代精氨酸。
使用Nin-甲酰基-色氨酸和4-氨甲酰基-苯丙氨酸、以及通过用天冬氨酸替代HWRGWV中的甘氨酸而生成其他变体。然后使用对接软件HADDOCK(版本2.1)，针对IgG的pFc区域中已知的HWRGWV结合位点(Ser383–Asn389)，对库进行筛选[40,41]。该程序模拟蛋白-肽相互作用，并通过外部软件，基于对于如下的评价来估算结合自由能：范德华相互作用、氢键合、变形处罚、疏水效应、原子接触能、软化范德华相互作用、部分静电、结合自由能的其他估算、偶极-偶极相互作用和水的存在[40-45]。在基于聚甲基丙烯酸酯的色谱树脂ToyopearlAF-氨基-650M上直接合成所选序列，并测试IgG结合和对胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶的抗性。序列HWMetCitGWMetV、HFMetCitCitHL和HYMetFMetK(Met)2FMetD(SEQIDNO:4、5、7)被选择用于从人类血浆的Cohn级分II+III纯化多克隆抗体(IVIG)。
最后，进行结合缓冲液的导电性对IgG收率和纯度的影响的研究以比较亲本肽HWRGWV与其变体HWMetCitGWMetV和Ac-HWMetCitGWMetV(SEQIDNO:8-9)的结合机制。后者显示出在更低导电性的结合缓冲液下实现了比HWRGWV更高的IVIG收率和纯度，从而为大规模后续加工提供了显著的成本降低。
在一个非限制性实施方式中，所述方法可包括四个步骤：
1-使用非天然的修饰的氨基酸设计已知肽配体的变体库；
2-通过经由分子对接模拟来筛选针对靶生物分子的肽变体库而选择配体的子集；
3-通过常规的Fmoc/tBu偶联化学在色谱树脂上合成所选配体；
4-对亲和吸附剂进行色谱测试：a)对靶生物分子的结合和b)对色谱程序中使用的蛋白水解酶和化学试剂的抗性。
1-设计肽配体HWRGWV的变体
设计了肽变体的虚拟库(表1)。
表1.在分子建模研究中使用的肽
肽 SEQ ID NO:
HFRRHL 3
HFMetCitCitHL 5
HWCitGWV 10
HWRGWV 1
HWMetCitGWMetV 8
HWMetRGWMetV 11
HYFKFD 2
HWForCitGWForV 12
HYMetFMetKMetFMetD 13
HFCarbCitCitHL 14
HWMetCitDWMetV 4
HYMetFMetKMet2FMetD 7
2-分子建模
使用PYMOL[PyMOL分子图形系统，版本1.2r3pre，LLC]生成了肽变体的坐标文件。通过观察最接近的匹配天然残基并复制用于设计非天然氨基酸进入的那些性质来确定关于修饰的参数和拓扑学文件。基于关于标准色氨酸残基的参数和拓扑学文件，设计了Nin-甲基化和甲酰化色氨酸。基于关于标准苯丙氨酸残基的参数和拓扑学文件，设计了4-甲基-、4-甲氧基-、和氨甲酰基-苯丙氨酸，尤其是从天冬酰胺获得氨甲酰基功能。基于精氨酸的碳δ和天冬酰胺对瓜氨酸进行建模。关于甲基化和二甲基化赖氨酸Lys(Me)和Lys(Me)2的文件已经被编码在HADDOCK中。指派了单个原子上的部分电荷以便维持官能团上的电中性，与HADDOCK中天然氨基酸的所有其它参数和拓扑学文件一致。对照提交到PRODRG服务器上的那些来核对参数和拓扑学文件修饰，以验证关于氨基酸修饰的拓扑学和参数文件。从RCSB蛋白质数据库(PDB，1FCC)得到hIgG的坐标文件[Structure.1995年3月15日；3(3):265-78.链球菌蛋白G的C2片段与人类IgG的Fc结构域的复合体的晶体结构(CrystalstructureoftheC2fragmentofstreptococcalproteinGincomplexwiththeFcdomainofhumanIgG).Sauer-ErikssonAE，KleywegtGJ,UhlénM,JonesTA.]。在hIgG上的残基Ser383-Asn389(SNGQPEN)(SEQIDNO:15)被定义为“有活性的”，并被用作配体对接的靶区域。将蛋白A包括在靶PDB文件中作为球状抑制物以防止肽配体与hIgG上的蛋白A结合位点(残基341-443)之间的相互作用。使用程序HADDOCK(版本2.1)进行分子建模[S.J.deVries,A.D.J.vanDjik,M.Krzeminski,M.vanDijk,A.Thureau,V.Hsu,T.Wassenaar,A.M.Bonvin,Proteins:Struc.Funct.&Bioinformatic69(2007)726.和C.Dominguez,R.Boelens,A.M.Bonvin,J.Am.Chem.Soc.125(2003)1731.]。对于每种肽变体，残基1-2被靶向于hIgG的残基389-387，残基3-4被靶向于hIgG386-383的残基，而残基5-6是非靶向的。在对接程序中使用默认的HADDOCK参数。通过使用程序ProFit(http://www.bioinf.org.uk/software/profit/)指派最小簇大小为4和RMSD(均方根距离)不大于将生成的对接结构按簇进行分组。按照被分组在三个家族dComplex、XScore(HPScore，HMScore，HSScore，-log(Kd)和ΔiG)和FireDock(球形，有吸引力的VdW，排斥的VdW，ACE和氢键)中的十二个评分函数，分析基于视觉检查最低能量对接溶液而为各序列所选择的所有簇[Wang,R.,Y.Lu,和S.Wang,比较评估分子对接的11个评分函数(Comparativeevaluationof11scoringfunctionsformoleculardocking).JMedChem,2003.46(12):p.2287-303和Andrusier,N.等,柔性蛋白-蛋白对接的原则(Principlesofflexibleprotein-proteindocking).Proteins,2008.73(2):p.271-89和Mashiach,E.等,FireDock：用于在分子对接中快速相互改善的网络服务器(FireDock:awebserverforfastinteractionrefinementinmoleculardocking).NucleicAcidsRes,2008.36(网络服务器发布):p.W229-32.和Liu,S.等,物理参考状态统一了用于蛋白折叠和结合的平均力的结构来源的潜力(Aphysicalreferencestateunifiesthestructure-derivedpotentialofmeanforceforproteinfoldingandbinding).Proteins,2004.56(1):p.93-101]。因此编写了序列排名，列出了按照根据各自函数所获得的得分值排序的序列。最后对这一排名进行了总计和平均，得到了最终序列列表，其中较低的得分指示较高的亲和性。
定义
术语“生物制品”包括生物药品或生物治疗药物，例如治疗蛋白。这些可以是具有酶和/或调节活性的蛋白治疗剂；或具有特殊结合活性的蛋白，例如单克隆抗体或Fc-融合蛋白；或蛋白疫苗；或诊断蛋白。生物制品可分离自活的生物体，例如血液因子，或通过重组技术生产。参见Strohl和Knight,CurrOpinBiotech，(2009)20:668-672，其内容由此通过引用整体并入。在本文中使用时，生物制品也包括病毒和微生物例如细菌、真菌、单细胞或多细胞生物体。在一些非限制性实施方式中，生物制品可以为致病性蛋白例如朊病毒，或病原微生物例如细菌等。
Nelson等和Nieri等最近回顾了在市场上或在临床开发中的治疗性抗体和用于它们的生产的当前技术。Nelson等，2010，NatRevDrugDisc，9,767-774；Nieri等，2009，CurrTopMedChem，16,753-779。
完全人类的抗体也可通过CHO细胞培养和通过转基因动植物进行生产。现在通过转基因动物(例如奶牛、山羊)的奶提取全尺寸人类单克隆抗体。Redwan，2009，JImmunoassImmunochem，30，262-290。同样，植物如烟草也用于生产抗体。烟草相对较容易地使用烟草病毒感染。Yusibov等，2011，HumVacc，7(3)313-321。
“生物聚合物”是一或多种类型的重复单元的聚合物。生物聚合物可以在天然生物系统中发现，尤其包括低聚糖和多糖，肽(该术语用于包括多肽和蛋白)，和多核苷酸(该术语用于包括DNA和RNA)；或可通过人工生物合成而生产，例如类肽和肽核酸(PNA)。在本文中使用时，术语“生物聚合物”包括具有生物活性的合成化合物，例如由以下组成或包含以下的天然存在的化合物的类似物：氨基酸或氨基酸类似物、糖或糖类似物或者核苷酸或非核苷酸类别。
在一些实施方式中，替换可以是保守的氨基酸替换。不太可能影响生物活性的保守的氨基酸替换的实例包括下列：丙氨酸替换丝氨酸、缬氨酸替换异亮氨酸、天冬氨酸替换谷氨酸、苏氨酸替换丝氨酸、丙氨酸替换甘氨酸、丙氨酸替换苏氨酸、丝氨酸替换天冬酰胺、丙氨酸替换缬氨酸、丝氨酸替换甘氨酸、酪氨酸替换苯丙氨酸、丙氨酸替换脯氨酸、赖氨酸替换精氨酸、天冬氨酸替换天冬酰胺、亮氨酸替换异亮氨酸、亮氨酸替换缬氨酸、丙氨酸替换谷氨酸、天冬氨酸替换甘氨酸、和相反的这些变化。参见例如Neurath等，TheProteins，AcademicPress，NewYork(1979)，其相关部分通过引用并入本文。此外，一组中的一种氨基酸与相同组中另一种氨基酸的互换是保守替换，其中所述组是如下：(1)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、和苯丙氨酸；(2)组氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、和天冬酰胺；(3)天冬氨酸和谷氨酸；(4)丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和半胱氨酸；和(5)甘氨酸、脯氨酸、和丙氨酸。
术语“固体载体”是指聚合物或无机性质的具有亲水性大孔材料的材料可用在本发明中。固体载体包括无机材料、有机材料和其组合。其可以是羟基化固体载体或羟基化复合固体载体。固体载体可以是丙烯酰胺衍生物、琼脂糖、纤维素、几丁质、几丁聚糖、葡聚糖、玻璃、磁石、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇、二氧化硅、硅、氧化锆和其组合。固体载体材料可以呈多孔珠形式，其可以是球形的。可选地，载体可以是颗粒状的或具有其他规则或不规则形状的分开形式。合适的固体载体材料的其他实例包括膜、半透膜、毛细管、微阵列、monolites、由氧化铝构成的多孔板、氧化铝负载的聚合物、或多糖。本发明的固体载体可以是刚性或非刚性的柔性材料，例如可以是纺织或无纺的织物。合适的非刚性柔性材料可能为膜(用本领域中已知的不同技术生产的浇铸(cast)、无纺、或者微或纳米纤维)。
优选的固体载体材料是具有最小的非特异性蛋白结合且对用于有机合成及本发明中使用的纯化过程的条件例如pH和离子强度的变化有物理和化学抗性的那些材料。在本发明中使用的固体载体可以是丙烯酸酯的聚合物。丙烯酸酯聚合物的实例包括但不限于聚甲基丙烯酸酯、聚羟甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈和其他丙烯酸酯衍生物。在优选的非限制性实施方式中，固体载体是甲基丙烯酸酯聚合物。
组合物和试剂盒
本发明提供了组合物和试剂盒，用于在可以是诊断测定法的测定法中使用本文中描述的蛋白酶抗性结合肽检测和/或测量特定的目标靶的类型和水平。用于执行本发明的测定法的试剂盒通常包括合适的容器机构，(i)包含本发明的蛋白酶抗性结合肽的探针；(ii)用于检测探针的存在的标记物；以及(iii)如何测量目标靶的说明书。试剂盒可以包括一种或多种蛋白酶抗性结合肽，例如特异性结合至目标靶并识别目标靶的第一蛋白酶抗性肽和/或第二和/或第三和/或附加的蛋白酶抗性肽。试剂盒的容器机构通常包括可以将本发明的第一蛋白酶抗性肽放置在其中和/或合适地分装在其中的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其他容器。如果提供了第二和/或第三和/或附加的组分，试剂盒通常也包括可以将该该组分放置在其中的第二、第三和/或其他附加的容器。可选地，容器可以包含多于一种的本发明的蛋白酶抗性肽的混合物，每种试剂结合不同的标志物。本发明的试剂盒通常也包括用于密闭容纳蛋白酶抗性肽探针用于商业销售的机构。这样的容器可包括在其中保留有所需小瓶的注塑和/或吹塑的塑料容器。
试剂盒还可包括阳性和阴性对照，以及根据本发明的方法使用其中包含的试剂盒组分的说明书。
除非另行规定，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。本文中不带具体数量的指称指的是一个或多于一个(即，指的是至少一个)所指对象。举例来说，“要素”指的是一种或多种要素。
在本说明书中，词语“包含”或变体例如“包括”将被理解为暗示纳入了指定的要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组，但并没有排除任何其它要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组。本发明可以合适地“包括”权利要求书中描述的步骤、要素、和/或试剂，“由所述步骤、要素、和/或试剂组成”或“基本上由所述步骤、要素、和/或试剂组成”。
还需指出的是，权利要求书可被起草为排除任何任选的要素。因此，本声明用于作为与权利要求要素的引用相关的如“唯一地”、“仅仅”等这样的排除性术语的使用或“负性”限制的使用的在先基础。
如果提供值的范围，除非文中清楚地另行指定，否则应该理解为也具体公开了在该范围的上限和下限之间的每个中间值至下限单位的十分之一。在指定范围中的任何指定值或中间值与在该指定范围中的任何其它指定值或中间值之间的各个更小范围均被包括在本发明内。这些更小范围的上限和下限可独立地被包括在该范围中或从该范围中排除，并且其中任一个极限或两个极限被包括在较小范围中或两个极限均不被包括在较小范围中的各范围也被包括在本发明内，服从在指定范围中任何具体排除的极限。如果指定范围包括一个或两个极限，则排除了那些包括的极限中的一个或两个的范围也被包括在本发明中。
下列实施例进一步说明了本发明，但不意欲限制本发明的范围。尤其是，应该理解，本发明不限于所描述的具体实施方式，因此其当然可以有所变化。还应该理解，本文中使用的术语仅用于描述具体的实施方式的目的，并不意欲限制，因为本发明的范围仅受权利要求的限制。
6.实施例
选择的肽变体的合成
材料
从ChemImpexInc.(WoodDale，IL，USA)购买用于肽合成的被保护的氨基酸和偶联剂。胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、二异丙基乙胺(DIPEA)、哌啶、三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(triisopropylsylane)(TIPS)、乙二硫醇(EDT)、苯硅烷、苯甲硫醚、二乙基二硫代氨基甲酸钠、吲哚、磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.4、和Kaiser测试试剂盒购自SigmaAldrich(SaintLouis，MO，USA)。N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、HPLC级乙腈和水、醋酸钠、氯化钠、冰醋酸购自FisherScientific(Pittsburgh，PA，USA)。ToyopearlAF-氨基-650M树脂购自TosohBioscience(KingofPrussia，PA，USA)。
方法
在200mg的ToyopearlAF-氨基-650M树脂(d＝75-150微米，氨基密度＝0.4mmol/g)上合成各个所选序列。在配有特氟龙(Teflon)釉料的聚丙烯管中、在连续的氮流和35℃的温度下进行各个氨基酸偶联步骤25分钟。在DMF中冲洗树脂10分钟后，用在3mL无水DMF中的Fmoc-Ala-OH(与基础树脂官能团密度相比过量3摩尔当量)、HCTU(3当量)和DIPEA(6当量)进行一次偶联。在室温下使用在4mLDMF中的乙酸酐和DIPEA(50当量)进行乙酰化步骤30分钟。然后通过与5mL在DMF中的20％哌啶温育20分钟而除去Fmoc保护。
通过常规Fmoc/tBu策略合成肽序列。对于每个氨基酸来说，向树脂加入Fmoc-氨基酸(2当量)、HCTU(2当量)和DIPEA(4当量)的无水DMF溶液(2.5mL)。对每个氨基酸进行两次偶联以饱和所有可用氨基，通过Kaiser测试进行监测。用5mL在DMF中的20％哌啶处理20分钟来除去最后一个氨基酸上的Fmoc保护，每批树脂分成两等份，其中一份按照如上所示进行乙酰化。在用DMF和DCM冲洗树脂后，使用含TFA/DCM/吲哚(70/28/2)的切割混合物进行肽脱保护1.5小时。然后用DCM和DMF大量冲洗树脂，最后在真空下干燥。
亲和吸附剂的色谱测试
材料
冻干形式的人类多克隆免疫球蛋白G(IgG)购自Equitech-Bio,Inc.(Kernville，TX，USA)。在室温下进行所有研究。对于所有色谱操作均使用整合有2487UV检测器的Waters626LC系统(Waters，MA，USA)。微内径不锈钢柱30mm长x2.1mm内径来自Altech-AppliedScience(Somerset，PA，USA)。所有实验在室温下进行。
肽配体的IgG结合与对蛋白水解酶的抗性的色谱评价
将所有树脂(每个35mg)装填在30mmx2.1mm内径的微内径柱(0.1mL)(Alltech-AppliedScience，Somerset，PA，USA)中，并用20％v/v甲醇溶胀。在用PBS,pH7.4平衡后使用PBS中的10mg/mLhIgG溶液进行三次IgG结合测试。在每次结合测试之间，使树脂与在TrisHCl缓冲液，pH8.5中的胰蛋白酶或α-胰凝乳蛋白酶的0.15mg/mL溶液接触。所有五次注射所使用的色谱方案如下。将100微升的进料样品以0.05mL/min(87cm/h)的流速荷载到柱上。在用2mL平衡缓冲液以0.2mL/min(348cm/h)流速进行洗涤步骤后，用4mL的0.2M醋酸盐缓冲液pH4.0以0.4mL/min(696cm/h)流速进行洗脱。最后，将吸附剂用4mL的0.85％磷酸再生。将吸附剂HWRGWV-Toyopearl、HYFKFD-Toyopearl、和HFRRHL-Toyopearl(SEQIDNO:6、16、17)树脂用作对照。通过280nm下的吸光度监测流出物。
使用吸附剂HWMetCitGWMetV–Toyopearl、HYMetFMetK(Met)2FMetD–Toyopearl和HFMetCitCitHL–Toyopearl(SEQIDNO:18-20)树脂从人类血浆的Cohn级分II+III纯化IVIG
将Cohn级分II+III溶于PBS,pH7.4中，以获得约5mg/mL的IgG浓度，并使用PallCorporation(PortWashington，NY，USA)的0.44μm和0.22μm过滤器顺序过滤。按照如上所述装填和溶胀每个肽树脂。在用含0.25MNaCl的PBS缓冲液平衡后，将100μL进料样品以0.05mL/min(87cm/h)的流速荷载到柱上。在用2mL的平衡缓冲液以0.2mL/min(348cm/h)的流速洗涤柱后，用4mL的0.2M醋酸盐缓冲液pH5.0以0.4mL/min(696cm/h)的流速进行洗脱。使用4mL的0.85％磷酸进行清洗和再生，接着用4mL的在醋酸盐缓冲液(pH4.0)中的2M尿素洗涤。将ToyopearlAF-rProteinA-650F树脂用作阳性对照。按照制造商的说明书，色谱方案包括用PBS,pH7.4(以0.05mL/min的流速)结合和用0.1M甘氨酸缓冲液pH2.5(以0.4mL/min的流速)洗脱。通过280nm下的吸光度监测流出物。按照如下所述，收集各级分并用于分析IgG纯度和收率。
导电性对使用吸附剂Ac-HWRGWV–Toyopearl和Ac-HWMetCitGWMetV–Toyopearl(SEQIDNO:21-22)树脂从人类血浆的Cohn级分II+III纯化IgG的影响
将树脂按照如上所述进行装填和溶胀，而用于注射的Cohn级分II+III按照如上所述制备。在被添加到PBS中的0M、0.135M和0.25MNaCl下研究结合缓冲液的导电性的影响。在用结合缓冲液平衡后，以0.05mL/min(87cm/h)的流速将100μL的进料荷载到柱上。按照如上所述进行色谱方案和级分收集。
样品分析以获得收率和纯度
通过HPLC，使用1mLHiTrap蛋白G柱对收集的级分中的IgG的量进行定量。IgG的收率被计算为洗脱的IgG与总荷载的IgG的比。使用在XcellSuperLockTMMini-Cell系统(LifeSciences，Carlsbad，CA，USA)中的Novex4–12％双Tris凝胶，通过在还原条件下的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定洗脱级分中IgG的纯度。通过向13μL样品中加入5μLLDS缓冲液和2μL还原剂并将生成的混合物煮沸10分钟而进行样品制备。通过使用SimpleBlueTMSafeStain对凝胶进行考马斯染色。通过考马斯染色的凝胶的密度计分析，借助ImageJ1.32j软件(NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD，USA)测定IgG纯度。
产物纯度被计算为等同于在25和50KDa下的IgG条带的总面积的分数。
结果和讨论
选择了七种非天然氨基酸用于该研究，即Nin-甲基-色氨酸、Nin-甲酰基-色氨酸、4-甲基-苯丙氨酸、4-氨甲酰基-苯丙氨酸、O-甲基-酪氨酸、e,e-二甲基-赖氨酸，和瓜氨酸。使用关于作为基础结构的各对应的标准氨基酸的可用文件生成了这些残基的参数和拓扑学文件。通过复制标准残基上最接近的匹配部分并调节电荷分布以保证电中性，引入了在侧链官能团上的修饰。对照提交到PRODRG服务器上的那些来核对生成的参数和拓扑学文件修饰，这是氨基酸修饰的参数化的一种标准验证方法。因此，生成了肽序列的虚拟库并针对hIgG使用HADDOCK2.1进行筛选[S.J.deVries,A.D.J.vanDjik,M.Krzeminski,M.vanDijk,A.Thureau,V.Hsu,T.Wassenaar,A.M.Bonvin,Proteins:Struc.Funct.&Bioinformatic69(2007)726.和C.Dominguez,R.Boelens,A.M.Bonvin,J.Am.Chem.Soc.125(2003)1731.]。
为进行物理学上有意义的对接，在模拟中引入了基于Yang等人的以前的研究结果的一些限制。首先，hIgG的Fc片段的蛋白酶消化产物的MS分析显示了在pFc片段上对于HWRGWV的推定的结合序列，包括环Ser383-Asn389(SNGQPEN)，发现其不同于蛋白A结合位点(hIgG上的残基341-443)[23]。该结果与肽HWRGWV不与蛋白A竞争hIgG结合的观察结果一致。其次，包含肽序列的前三个氨基酸(即，组氨酸，随后为芳香族残基和碱性残基)的基础基序对IgG的结合是关键性的。这已经被由六肽的固相库的筛选而鉴定到的序列HWRGWV、HYFKFD和HFRRHL(SEQIDNO:1-3)中发现的一致性所证实[21]。基于该同源性，可以合理地推定两种序列HYFKFD和HFRRHL与和HWRGWV相同的hIgG结合位点相互作用。
最后，由于肽的C-端被色谱树脂的表面束缚，相当有可能的是，六肽配体的残基5和6在靶向IgG中仅起到有限的作用。基于该信息，hIgG上的残基Ser383-Asn389被定义为“有活性的”，并被用作用于配体对接的靶点。所有有活性的残基表现出高于40％的相对溶剂可接触性，正如程序NACCESS[Campbell&Thornton(1991)J.Mol.Biol.220,507-530]所限定的。
此外，在每个肽变体上，残基1-2被靶向于hIgG的残基389-387，残基3-4被靶向于残基386-383，而残基5和6被留下未有指派并允许与IgG上所希望的任何残基相互作用。为了使验证中的偏倚最小化，设计了下面一套总体标准用于选择从对接模拟中得到的复合物：1)对于在分子对接最后阶段中的各序列所测定的所有结构均基于严格的的RMSD(均方根距离)截止值进行成簇，而默认的成簇的RMSD截止值通常设定在以及4个结构的最小的簇大小。2.)用于分析的结构是每个簇在能量上最有利的对接结构。3)使用评分方法dComplex、XScore和FireDock、估算已知三维结构的给定蛋白-配体复合物的结合亲和性的经验评分函数对每个簇进行分析。
这些函数解释了范德华相互作用、氢键合、变形处罚、疏水效应、原子接触能、软化范德华相互作用、部分静电、结合自由能的其他估算以及偶极-偶极相互作用[Wang,R.,Y.Lu,和S.Wang,比较评估分子对接的11个评分函数(Comparativeevaluationof11scoringfunctionsformoleculardocking).JMedChem,2003.46(12):p.2287-303和Andrusier,N.等,柔性蛋白-蛋白对接的原则(Principlesofflexibleprotein-proteindocking.Proteins),2008.73(2):p.271-89和Mashiach,E.等，FireDock：用于在分子对接中快速相互改善的网络服务器(FireDock:awebserverforfastinteractionrefinementinmoleculardocking).NucleicAcidsRes,2008.36(网络服务器发布):p.W229-32.和Liu,S.等,物理参考状态统一了用于蛋白折叠和结合的平均力的结构来源的潜力(Aphysicalreferencestateunifiesthestructure-derivedpotentialofmeanforceforproteinfoldingandbinding).Proteins,2004.56(1):p.93-101]。采用了利用多种评分方法的混合方法以使得结果不会向某一具体方法偏倚。按照每个簇在各评分方法中的单个得分对其进行排名，对由此生成的单个排名进行总计和平均。在表2中报道了原始序列和几个所选变体的最终排名。图1示出了下列序列的1号簇：a)HWRGWV，b)HFRRHL，c)HWMetCitDWMetV，和d)HFMetCitCitHL(SEQIDNO:1、3、4、5)
尽管对接模拟生成了每个序列的多个簇，在许多情况下1号簇显示了最高数量的结构，以及来自如上所述的混合评分方法的最低平均值。这种再现性指示了良好完成的对接模拟并允许排除与主簇相比以显著更低的能量出现的异常值。通过将HWRGWV和HFRRHL与它们的变体HWCitGWV和HFCitCitHL(SEQIDNO:1,3,10,23)相比较，注意到前者具有与靶抗体最大的接触，而后者具有最多的氢键。这指示了与含有精氨酸的原始序列相比变体的稍微不同的结合机制，尤其是在静电分量方面。实际上，通过用电中性的瓜氨酸替代带正电荷(在pH7.4下)的精氨酸，结合的静电分量显著降低。一方面，与原始序列相比，这引起了肽变体与靶抗体的预测的结合自由能降低，这进而提示后者可能比前者具有较低的结合能力。另一方面，这使得变体可能较不易于非特异性静电结合于带负电荷的蛋白、尤其是白蛋白，这降低了产物纯度。这些区别对于色谱方案、尤其是对于结合缓冲液的导电性对IgG收率和纯度的作用有直接影响，并且在本文中做了讨论。
使用甲酰基-色氨酸和氨甲酰基-苯丙氨酸设计了HWRGWV和HFRRHL的其他变体，然而，这两者均未获得良好的得分。出于通过在天冬氨酸和IgG上的残基383-386(SNGQ)(SEQIDNO:24)之间形成可能的氢键来增加亲和性的目的，通过用天冬氨酸替代甘氨酸而生成了另一种变体HWMetCitDWMetV(SEQIDNO:4)。然而与期望相反，这一序列获得了较低的得分。还运行了HYFKFD及其两种变体HYMetFMetKMetFMetD和HYMetFMetK(Met)2FMetD(SEQIDNO:2、13、7)，但获得了平均更差的得分，指示与HWRGWV、HFRRHL及它们的变体相比较低的亲和性。
在Toyopearl树脂上合成了表2中列出的序列，全部在0.12meq/g的近似密度下。将由此获得的每种吸附剂装填到色谱柱(0.1mL)中并测试IgG结合。收集流经级分和洗脱级分并通过蛋白G色谱法进行分析，以确定IgG收率(表2)。各序列在平均排名和收率之间的比较指示了在对接模拟和抗体结合的实验结果之间良好的一致性。这证实了虚拟库的设计、对接限制的指定以及模拟结果的分析均得以很好地执行，并形成了用于选择肽变体的有效策略。
表2.原始肽序列及它们的变体获得的预测的结合自由能、对接排名、和IgG收率。(SEQIDNOS:***)
序列 DiG(kcal/mol) 平均排名 IgG收率
HFRRHL -6.96 2.00 93％
HFMetCitCitHL -6.57 2.00 90％
HWCitGWV -6.64 4.00 91％
HWRGWV -6.37 5.00 95％
HWMetCitGWMetV -6.71 9.00 90％
HWMetRGWMetV -6.38 10.00 91％
HYFKFD -5.66 14.00 78％
HWForCitGWForV -5.41 16.17 75％
HYMetFMetKMetFMetD -5.17 18.67 49％
HFcarbCitCitHL -5.03 21.50 53％
HWMetCitDWMetV -5.50 26.50 47％
HYMetFMetKMet2FMetD -4.69 26.67 42％
色谱评价肽配体被IgG的结合和对蛋白水解酶的抗性
基于在表2中报道的结果，测试了原始序列HWRGWV、HFRRHL、和HYFKFD(SEQIDNO:1-3)以及它们的变体HWMetCitGWMetV、HFMetCitCitHL、和HYMetFMetK(Met)2FMetD(SEQIDNO:4、5、7)对酶消化的抗性。序列HWMetCitGWMetV、HFMetCitCitHL被选择为它们各自原始肽的最好变体，而HYMetFMetKMet2FMetD被用作阴性对照。最后，选择了另外两种序列HWCitGWV和HWMetRGWMetV作为中间变体，因此预期仅显示对一种酶的抗性。对每种吸附剂进行五次连续的色谱操作。首先，注射在PBS中的10mg/mL的纯的人类多克隆IgG的溶液以确定在与任何酶接触前每种吸附剂的IgG收率。在这次最初的操作中，所有四种肽变体均给出高于91％的收率。然后将树脂与α-胰凝乳蛋白酶在Tris缓冲液pH8.5中的溶液接触10分钟。被荷载到柱上的酶的量为1:100肽∶酶的质量比，正如Verdoliva等所做的[35]。在冲洗树脂后，然后进行IgG的第二次注射，以估算由于α-胰凝乳蛋白酶对肽配体的消化引起的结合能力的损失。然后以相同的肽：酶比，将树脂与第二酶溶液、即Tris缓冲液pH8.5中的胰蛋白酶进行接触。最后执行第三次IgG注射，以估算在第二次酶处理后每种树脂的剩余结合能力。图4示出了吸附剂HWMetCitGWMetV-Toyopearl、HWMetRGWMetV-Toyopearl、HWCitGWV-Toyopearl、和HWRGWV-Toyopearl(SEQIDNO:18,25,26,6)树脂的三次IgG注射的色谱图。
尽管HWRGWV显然被胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶两者所降解，正如在两次酶处理后结合能力的损失所指示的(图2，a)，其变体HWMetCitGWMetV完全不受任何一者的影响(图2，d)。正如所预期的，中间变体HWMetRGWMetV和HWCitGWV显示出仅对一种酶、分别为α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的抗性(图2，b和c)。其他吸附剂得到的结果总结在表3中，其报道了在用α-胰凝乳蛋白酶(第二次IgG注射)和胰蛋白酶(第三次IgG注射)处理前(第一次操作)和后的IgG收率的值。
图2.图(A)-(D)显示了天然肽结合剂和修饰的肽结合剂的蛋白水解消化产物。
在(A)中的色谱图显示了两种蛋白水解酶消化了原始肽配体。首先，胰蛋白酶攻击R。然后α-胰凝乳蛋白酶在W处切开。
在(B)中的色谱图显示了由于修饰的WM，α-胰凝乳蛋白酶不切开肽，而胰蛋白酶在R上切开肽。
在(C)中的色谱图显示了相似的行为，而胰蛋白酶由于瓜氨酸替代了R而无效。
在(D)中的色谱图由于用WM替代W和用瓜氨酸替代R而没有示出被任何酶降解的迹象。
已经鉴定到几种其它的肽序列用于从复杂的介质中亲和纯化抗体。从合成的四肽库选择了序列APAR(SEQIDNO:27)用于从小鼠腹水中捕获抗-粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)单克隆抗体。通过用针对癌相关MUC1粘蛋白的抗体进行表位作图而鉴定到了肽配体PDTRPAP(SEQIDNO:28)。Ehrlich和同事通过对人源化抗-TacIgG1抗体(HAT)的pFc片段进行生物淘选，从噬菌体展示文库分离出了肽序列EPIHRSTLTALL(SEQIDNO:29)。Fassina和同事鉴定到了结合IgG的Fc部分的三肽四聚体(Arg-Thr-Tyr)4-Lys2-Lys-Gly(SEQIDNO:30)，也称为TG19318或PAM(蛋白A模拟物)。最近，Lund等提出了用于IgG纯化的肽配体，称为D2AAG(SEQIDNO:31)，其包含精氨酸(A)和甘氨酸(G)以及合成的芳酸2,6-二-叔丁基-4-羟基苯甲基丙烯酸酯(D)。已知用于纯化抗体的所有这些肽配体含有芳香族氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)或碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)，这使得它们易于被胰蛋白酶和/或α-胰凝乳蛋白酶所蛋白水解降解。因此所提出的方法对设计蛋白酶抗性肽变体来说具有非常宽的有效性。因此有可能构造对酶切割有抗性的肽配体变体。这些配体可用于纯化来自动物血浆的IgG和任何其它目标蛋白。
作为一个附加说明，应该指出，本文中报道的用于生产生化上稳定的肽配体的方法通常对将要从可能含蛋白水解酶的任何所需体液纯化出的所有种类的靶生物分子有效，有可能将设计配体变体的过程和它们对目标生物分子的筛选进行自动化。对于包含天然氨基酸的给定肽配体来说，软件将生成使用修饰氨基酸的肽变体的库。这种设计单元也将与后续的对接模块连接，所述对接模块将设计的序列与靶分子、或更理想地靶分子上已知的结合区域进行对接。该软件包对于不具有使用专业对接程序的能力的用户具有很大价值。
表3-在将树脂与酶溶液接触前后IgG收率的值
由配体HFRRHL及其衍生物HFMetCitCitHL得到的结果非常类似于HWRGWV和HWMetCitGWMetV的结果。序列HWRGWV是胰蛋白酶的一种理想底物，最有可能是因为C-位置中的甘氨酸相对于精氨酸在空间上更有利于酶对肽的攻击。肽HFRRHL也是胰蛋白酶的一种良好底物，尽管精氨酸在序列上的毗连性稍微降低了酶攻击。相反，HYFKFD几乎不受胰蛋白酶的攻击，可能是因为赖氨酸两侧残基的空间位阻可能妨碍了酶活性位点在肽上的有效锚定。其变体HYMetFMetK(Met)2FMetD显示出对蛋白水解的高抗性，尽管较低的收率值指示了序列不适合于蛋白回收。
尽管是序列依赖的，但这些结果清楚地显示了天然氨基酸被类似的合成残基所替代，同时保持相似的抗体结合特性。
如对接模拟所预测的作为原始序列的结合特性赋予了对酶消化的高抗性。芳香族氨基酸的甲基化显著降低了被α-胰凝乳蛋白酶的蛋白水解攻击，而瓜氨酸和甲基化赖氨酸的使用似乎完全防止了胰蛋白酶的作用。尽管似乎是所提出的替换中最重要的，由于其降低了结合的静电分量，瓜氨酸被证明在靶结合与生化抗性两方面都是出色的替代。
使用吸附剂HWMetCitGWMetV–Toyopearl树脂、HFMetCitCitHL–Toyopearl树脂、和HYMetFMetK(Met)2FMetD–Toyopearl树脂从人类血浆的Cohn级分II+III纯化IVIG
为确定所提出的配体变体对于IVIG纯化的适用性，使用序列HWMetCitGWMetV、HFMetCitCitHL、和HYMetFMetK(Met)2FMetD从人类血浆的Cohn级分II+III纯化多克隆抗体。将原始肽配体用作阳性对照。将CohnII+III糊的粗储备在PBS中稀释以制备进料样品，并且在注射到柱中之前通过过滤除去固体粒子。在本次工作中采用的色谱方案源自以前的优化，并包括使用作为结合缓冲液的在PBS中的0.25MNaCl和用于洗脱的0.2M醋酸盐缓冲液pH5.0[24]。收集级分并通过蛋白G色谱法和SDS-PAGE进行分析(图3)以分别确定IgG收率和纯度。表4中给出了结果的总结。
表4.从人类血浆的Cohn级分II+III纯化的IgG的收率和纯度。通过在图3中报道的考马斯染色SDS-PAGE的密度计分析来确定IgG纯度。
由变体HWMetCitGWMetV和HFMetCitCitHL得到的产物收率和纯度与原始序列和蛋白A给出的结果十分相似。尽管可以在洗脱的级分中检测到少量白蛋白(图3)，但两种配体均提供非常高的产物收率和纯度。大多数可观察到的污染物简单地流经柱子，并且尽管可能发生一些其他免疫球蛋白、即IgA和IgM的结合，但对洗脱条件(pH5.0)进行了选择以将它们在洗脱级分中的存在最小化[49]。变体HYMetFMetK(Met)2FMetD给出了高的产物纯度，但在收率方面表现较差。尽管后者是基于上述结果预测的，但不预期在洗脱的级分中有高的IgG纯度。令人惊奇的是，尽管由于使用了烷基化氨基酸而存在较高的序列疏水性，但几乎没有由于疏水性相互作用引起的对杂质的非特异性结合。
还感兴趣地注意到，肽变体所结合的白蛋白和其他杂质的量始终低于原始序列所观察到的量。这可以根据以前的研究结果和由对接模拟提供的信息进行解释。例如原始序列HWRGWV在pH7.4下带有两个正电荷，一个在精氨酸上，另一个在肽的N-端，其被发现通过静电相互作用捕获白蛋白(pI＝4.7)这种在血浆中存在的最丰富的带负电荷的蛋白。为避免白蛋白和相似蛋白杂质的这种非特异性结合，通过添加氯化钠来增加结合缓冲液的导电性直至给出产物收率和纯度方面的最佳折中的最佳水平[25]。然而，盐的使用导致了纯化过程的额外成本。用电中性氨基酸如瓜氨酸和二甲基化赖氨酸替代带正电荷的残基，允许固有地降低静电结合的程度，而不论结合缓冲液中存在的盐的量的多少。这些研究结果虽然解释了由配体变体给出的较高纯度(表3)，但要求对于盐对收率和纯度的影响进行更深入的研究，并且这在下面的部分中给出。
导电性对使用吸附剂HWRGWV-Toyopearl、Ac-HWRGWV-Toyopearl、HWMetCitGWMetV-Toyopearl、和Ac-HWMetCitGWMetV-Toyopearl(SEQIDNO:6、32、18、22)树脂从人类血浆的Cohn级分II+III纯化IgG的影响
为确定结合的静电分量的程度，使用具有不同电荷值和分布的如下四种肽配体研究了结合缓冲液的导电性对产物收率和纯度的影响：a)原始HWRGWV，b)其乙酰化版本Ac-HWRGWV，c)变体HWMetCitGWMetV，和d)其乙酰化版本Ac-HWMetCitGWMetV。
使用这四种序列从Cohn级分II+III纯化IVIG。如上所述，在使用HWRGWV进行IVIG纯化的之前的研究中，选择了PBS+0.25MNaCl作为最佳的结合缓冲液。在之前的部分中获得的结果得出了一个假设，即用中性残基替代带正电荷的氨基酸会减少配体的静电行为，并由此增加产物纯度。为验证这一假设，使用上面列出的序列和在PBS中包含0M、0.13M、和0.25MNaCl的三种结合缓冲液重复结合研究。图4示出了在不同导电性下用四种吸附剂中的每一种获得的SDS-PAGE结果，而表9报道了产生的产物收率和纯度的值。图3.使用下列吸附剂从人类血浆的Cohn级分II+III色谱纯化IgG的SDS-PAGE(还原条件)：a)HWRGWV-Toyopearl树脂和HWMetCitGWMetV-Toyopearl树脂；b)HFRRHL-Toyopearl树脂和HFMetCitCitHL-Toyopearl树脂；以及c)HYFKFD-Toyopearl树脂和HYMetFMetK(Met)2FMetD-Toyopearl树脂。标记：FT-流经级分；EL-洗脱级分。
图4.在下述结合缓冲液中在不同盐浓度下进行的从人类血浆的Cohn级分II+III色谱纯化IgG的SDS-PAGE(还原条件)：a)HWRGWV和Ac-HWRGWV，b)HWMetCitGWMetV和Ac-HWMetCitGWMetV。标记：FT-流经级分；EL-洗脱级分。
表5.使用不同盐浓度下的结合缓冲液从人类血浆的Cohn级分II+III纯化的IgG的收率和纯度。通过在图4中报道的考马斯染色SDS-PAGE的密度计分析来确定IgG纯度。
如表5所示，降低肽上正电荷的数量导致了更高的IgG纯度。正如所预期的，结合缓冲液的导电性对产物纯度的影响对于HWRGWV来说非常明显，HWRGWV带有两个正电荷，因此对静电力的屏蔽最为敏感，而导电性的影响对于Ac-HWMetCitGWMetV来说几乎微不足道。后者与HWMetCitGWMetV之间以及原始序列与其乙酰化形式之间的比较显示，与用瓜氨酸替代精氨酸相比，肽N-端的乙酰化对于产物收率和纯度的影响较小。使用低导电性结合缓冲液由Ac-HWMetCitGWMetV获得的IgG纯度(93％)高于使用HWRGWV获得的任何值(81％-83％)。值得注意地，高纯度并不通过牺牲收率而获得，收率被稳定地保持在高于90％，尽管基于对接计算的结果预期到收率有一定减少，所述对接计算预测到变体的结合ΔiG稍微低于原始序列的结合ΔiG。对于基于小肽配体亲和色谱法的抗体纯化的可承受和稳固的方法来说，序列Ac-HWMetCitGWMetV具有多种所需的特征。
结论
该研究提供了用于设计包含非天然氨基酸且具有出色的靶亲和性和选择性的性质以及生化稳定性的小肽配体的策略。基于已知肽序列可用的信息、尤其是在靶生物分子上的结合位点，以及使用当前技术状态的建模工具，该方法指导用非天然变体替代关键氨基酸残基以方便地修饰结合机制或赋予对于化学和生物试剂例如强酸和强碱及蛋白水解酶的稳定性。使用了三种抗体结合肽HWRGWV、HYFKFD和HFRRHL作为模型以开发显示出较高蛋白水解抗性并维持较高靶亲和性和特异性的配体变体。由于从基于血浆的流体如Cohn级分和杂交瘤细胞培养物回收抗体具有较高价值，本工作目标在于为肽赋予针对主要的血浆蛋白酶——胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶的生化稳定性。为此，通过用甲基化变体和瓜氨酸替代芳香族和碱性氨基酸而设计了变体的虚拟库，然后使用分子对接软件HADDOCK针对IgG上的肽结合位点(Ser383–Asn389)在硅片中进行筛选。
在色谱树脂上合成基于对接计算的结果所选的肽变体，并测试了对蛋白水解的抗性和来自人类血浆的Cohn级分II+III的IVIG的纯化。这些变体具有与它们的亲本序列可比的靶亲和性以及高得多的生化抗性。此外，对于HWRGWV相关变体的IgG结合机制的静电分量的深入研究导致鉴定到了序列Ac-HWMetCitGWMetV，该序列表现出比原始HWRGWV更高的选择性。吸附剂Ac-HWMetCitGWMetV-Toyopearl树脂固有地显示出对白蛋白和其他杂质的结合较低，这意味着在结合缓冲液中需要较低量的盐来达到较高的IgG纯度及由此较低的纯化成本。
对于靶向生物分子的任何小的合成或天然肽配体来说，此处使用的方法通常是有效的。一旦已知结合位点非常近似，则有可能使用可靠的分子对接程序迅速且廉价地设计和筛选大量的库。这些工具除了提供对于结合强度的较好的估算外，还提供了关于配体-靶相互作用的了解。氨基酸替换的明智选择使得可以精细地调整肽配体的生化性质。特别是，通过修饰电荷分布以及疏水和亲水基团，有可能提高亲和性和选择性以及生化稳定性。使用合成的变体替换易于被化学降解的氨基酸，例如在碱性条件下经历脱酰胺化的天冬酰胺和谷氨酰胺，特别适合于设计用于亲和色谱法的肽配体，在亲和色谱法中苛刻的化学试剂被用于蛋白洗脱和柱清洗及清洁。降低化学降解的程度意味着更长的吸附剂寿命。
本文中给出的方法也适合于对蛋白活性机制中隐伏的非共价相互作用进行基础研究。通过使用合适的氨基酸来沉默或激活结合的特定组分，有可能研究生物识别现象和设计控制靶与配体之间的特异性相互作用的小生物分子。通过给出在结合靶抗体中的在多个方面优于蛋白A的小肽变体，本工作提供了在这一方向上的实例。这些研究结果代表了朝着对于生物分离和更普遍地在生物技术中的多种应用具有巨大潜力的最佳合成蛋白模拟物又迈进了一步。
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应该理解，尽管本发明结合其具体实施方式进行了描述，但前述描述用于说明目的，并不限制本发明的范围。本发明的其他方面、优点和修改均在权利要求书的范围中。在本说明书中引用的所有公开文本、专利、和专利申请均通过引用并入本文，就像每个单个公开文本或专利申请被明确和单独地指示通过引用并入一样。
表6-非天然氨基酸的实例

Claims (12)

1.一种包含三到二十个氨基酸的蛋白酶抗性肽，其能够结合生物制品并包含一个或多个碱性氨基酸或芳香族氨基酸，其中一个或多个所述氨基酸被非天然存在的氨基酸类似物替换。
2.权利要求1的蛋白酶抗性肽，其中非天然的氨基酸类似物在表6中列出。
3.权利要求1的蛋白酶抗性肽，其中所述肽是六肽。
4.权利要求1的蛋白酶抗性肽，其中所述蛋白酶抗性肽是六肽，并且在被非天然存在的氨基酸类似物替换前的序列为HWRGWV、HYFKFD和HFRRHL(SEQIDNO:1-3)。
5.权利要求1的蛋白酶抗性肽，其中所述肽对内肽酶的消化有抗性。
6.权利要求1的蛋白酶抗性肽，其中所述肽对外肽酶的消化有抗性。
7.权利要求1的蛋白酶抗性肽，其中所述内肽酶是α-胰凝乳蛋白酶。
8.权利要求1的蛋白酶抗性肽，其中所述内肽酶是胰蛋白酶。
9.一种固体载体，其与权利要求1的蛋白酶抗性肽偶联。
10.一种纯化生物制品的方法，其包括将权利要求9的固体载体与所述生物制品在合适条件下接触，使得所述生物制品结合至所述固体载体；洗涤所述固体载体和结合的生物制品；以及将所述生物制品从所述固体载体洗脱以纯化所述生物制品。
11.权利要求10的方法，其中所述生物制品是抗体。
12.一种诊断试剂盒，其包含权利要求9的固体载体。
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