JPH09249696A - ペプチド性サソリ毒素 - Google Patents
ペプチド性サソリ毒素Info
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- JPH09249696A JPH09249696A JP5729296A JP5729296A JPH09249696A JP H09249696 A JPH09249696 A JP H09249696A JP 5729296 A JP5729296 A JP 5729296A JP 5729296 A JP5729296 A JP 5729296A JP H09249696 A JPH09249696 A JP H09249696A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新たなサソリペプチド毒素を提供し、サソリ
毒素の医薬等に対する応用に寄与する。 【解決手段】 中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔ
ｅｎｓｉ）の毒腺からマウスに対する致死活性を指標に
単離された、次のアミノ酸配列式（１）または（２）： PyrGlu-Phe-Thr-Asp-Val-Lys-Cys-Thr-Gly-Ser-Lys-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys- Lys-Gln-Met-Phe-Gly-Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys- Tyr-Ser-OH （１） または PyrGlu-Phe-Thr-Asn-Val-Ser-Cys-Ser-Ala-Ser-Ser-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys- Lys-Lys-Leu-Phe-Gly-Thr-Tyr-Arg-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Ser-Lys-Cys-Arg-Cys- Tyr-Ser-OH （２） （式中、 PyrGlu-はピログルタミン酸残基を表す）で表
され、分子内に３箇所までのジスルフィド結合を有して
もよいペプチド。
毒素の医薬等に対する応用に寄与する。 【解決手段】 中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔ
ｅｎｓｉ）の毒腺からマウスに対する致死活性を指標に
単離された、次のアミノ酸配列式（１）または（２）： PyrGlu-Phe-Thr-Asp-Val-Lys-Cys-Thr-Gly-Ser-Lys-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys- Lys-Gln-Met-Phe-Gly-Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys- Tyr-Ser-OH （１） または PyrGlu-Phe-Thr-Asn-Val-Ser-Cys-Ser-Ala-Ser-Ser-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys- Lys-Lys-Leu-Phe-Gly-Thr-Tyr-Arg-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Ser-Lys-Cys-Arg-Cys- Tyr-Ser-OH （２） （式中、 PyrGlu-はピログルタミン酸残基を表す）で表
され、分子内に３箇所までのジスルフィド結合を有して
もよいペプチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なペプチド性毒
素に関し、さらに詳細には、中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕ
ｓ ｍａｒｔｅｎｓｉ）の毒腺から得られるペプチド性
毒素に関する。
素に関し、さらに詳細には、中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕ
ｓ ｍａｒｔｅｎｓｉ）の毒腺から得られるペプチド性
毒素に関する。
【０００２】
【従来の技術】サソリは蛛形綱サソリ目に属する節足動
物の総称であり、全世界に約６００種が生息する。サソ
リは一般に猛毒な生物であると考えられているが、実際
には致命的な毒素を持つサソリは種類が限られており、
例えば、アフリカの砂漠に生息するＢｕｔｈｕｓ ｕｓ
ｔｒａｌｉｓ，メキシコ産のＣｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ
ｅｘｉｌｉｃａｕｄａや，南ヨーロッパ産のＢ．ｏｃｃ
ｉｔａｕｄａ等、数種にすぎない。サソリの仲間のもつ
毒素は一般に神経毒であるが、なかにはそれほど強くな
い毒素も多く、それらの生理活性を医薬あるいは生化学
研究に利用するため、現在までに種々のサソリ毒素が単
離されている（Ｄｒｅｙｅｒ．Ｆ． Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１５
巻 ９４−１２８頁 １９９０年）。
物の総称であり、全世界に約６００種が生息する。サソ
リは一般に猛毒な生物であると考えられているが、実際
には致命的な毒素を持つサソリは種類が限られており、
例えば、アフリカの砂漠に生息するＢｕｔｈｕｓ ｕｓ
ｔｒａｌｉｓ，メキシコ産のＣｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ
ｅｘｉｌｉｃａｕｄａや，南ヨーロッパ産のＢ．ｏｃｃ
ｉｔａｕｄａ等、数種にすぎない。サソリの仲間のもつ
毒素は一般に神経毒であるが、なかにはそれほど強くな
い毒素も多く、それらの生理活性を医薬あるいは生化学
研究に利用するため、現在までに種々のサソリ毒素が単
離されている（Ｄｒｅｙｅｒ．Ｆ． Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１５
巻 ９４−１２８頁 １９９０年）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】現在までに単離され、
構造決定されたサソリ毒素の例としては、Ｃｈａｒｙｂ
ｄｏｔｏｘｉｎ１（ＣｈＴＸ，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．ら
Ｎａｔｕｒｅ，３１３巻３１６−３１８頁，１９８５
年），Ｉｂｅｒｉｏｔｏｘｉｎ（ＩｂＴＸ，Ｇａｌｖｅ
ｚ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５巻 １
９号 １１０８３−１１０９０頁， １９９０年），Ｋ
ａｌｉｏｔｏｘｉｎ（ＫＴＸ，Ｒｏｍｉ．Ｒ．ら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８巻 ３５号 ２６３０２
−２６３０９頁， １９９３年）およびＭａｒｇａｔｏ
ｘｉｎ（ＭｇＴＸ，Ｂｅｎｄｎａｒｒｅｋ．Ｍ．ら，Ｂ
ＢＲＣ，１９８巻 ６１９頁 １９９４年）等が知られ
ており、これらの毒素の生理作用として、特にＫ+ チャ
ンネルに対する作用が注目されている。
構造決定されたサソリ毒素の例としては、Ｃｈａｒｙｂ
ｄｏｔｏｘｉｎ１（ＣｈＴＸ，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．ら
Ｎａｔｕｒｅ，３１３巻３１６−３１８頁，１９８５
年），Ｉｂｅｒｉｏｔｏｘｉｎ（ＩｂＴＸ，Ｇａｌｖｅ
ｚ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５巻 １
９号 １１０８３−１１０９０頁， １９９０年），Ｋ
ａｌｉｏｔｏｘｉｎ（ＫＴＸ，Ｒｏｍｉ．Ｒ．ら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８巻 ３５号 ２６３０２
−２６３０９頁， １９９３年）およびＭａｒｇａｔｏ
ｘｉｎ（ＭｇＴＸ，Ｂｅｎｄｎａｒｒｅｋ．Ｍ．ら，Ｂ
ＢＲＣ，１９８巻 ６１９頁 １９９４年）等が知られ
ており、これらの毒素の生理作用として、特にＫ+ チャ
ンネルに対する作用が注目されている。
【０００４】これらのペプチド毒素は、構造に高い相同
性を示すものの、Ｋ+ チャンネルに対して全く正反対の
作用を示すものもあり、これらのペプチド毒素を医薬等
に応用するには、より多くのペプチド毒素を単離し、構
造活性相関を研究する必要がある。このような現状に鑑
み、本発明は、新たなサソリペプチド毒素を提供し、サ
ソリ毒素の医薬等に対する応用に寄与することを課題と
する。
性を示すものの、Ｋ+ チャンネルに対して全く正反対の
作用を示すものもあり、これらのペプチド毒素を医薬等
に応用するには、より多くのペプチド毒素を単離し、構
造活性相関を研究する必要がある。このような現状に鑑
み、本発明は、新たなサソリペプチド毒素を提供し、サ
ソリ毒素の医薬等に対する応用に寄与することを課題と
する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、中国産サ
ソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓｉ）の毒腺から、
マウスに対する致死活性を指標に、新たなサソリ毒素を
単離すべく鋭意研究を行い、配列番号１および配列番号
２で表されるペプチドを単離・精製し、その構造を推定
した。また、この配列番号１および配列番号２に従って
ペプチドを合成し、この構造を確認して本発明を完成し
た。すなわち、本発明によれば、配列番号１および配列
番号２で表されるペプチドをペプチド毒素として提供す
ることができる。以下、配列番号１で表されるペプチド
をＳＶ１と呼び、配列番号２で表されるペプチドをＳＶ
２と呼ぶ場合がある。
ソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓｉ）の毒腺から、
マウスに対する致死活性を指標に、新たなサソリ毒素を
単離すべく鋭意研究を行い、配列番号１および配列番号
２で表されるペプチドを単離・精製し、その構造を推定
した。また、この配列番号１および配列番号２に従って
ペプチドを合成し、この構造を確認して本発明を完成し
た。すなわち、本発明によれば、配列番号１および配列
番号２で表されるペプチドをペプチド毒素として提供す
ることができる。以下、配列番号１で表されるペプチド
をＳＶ１と呼び、配列番号２で表されるペプチドをＳＶ
２と呼ぶ場合がある。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のペプチドは、例えば、中
国産サソリ（Ｂ．ｍａｒｔｅｎｓｉ）から毒腺を摘出
し、これを例えば０．５Ｍ程度の酢酸でペプチドを抽出
して粗抽出物を得る。この粗抽出物から、通常、ペプチ
ド精製に用いられるイオン交換クロマトグラフィー、逆
相クロマトグラフィー等を用いて、マウスに対する致死
活性を指標に分離・精製することにより得ることができ
る。
国産サソリ（Ｂ．ｍａｒｔｅｎｓｉ）から毒腺を摘出
し、これを例えば０．５Ｍ程度の酢酸でペプチドを抽出
して粗抽出物を得る。この粗抽出物から、通常、ペプチ
ド精製に用いられるイオン交換クロマトグラフィー、逆
相クロマトグラフィー等を用いて、マウスに対する致死
活性を指標に分離・精製することにより得ることができ
る。
【０００７】また本発明のペプチドは、分子内に３箇所
までのジスルフィド結合を有しうるオリゴペプチドであ
るため、通常のペプチド合成機（例えばパーキン・エル
マー社製ペプチド合成機４３１Ａ型）を用いた固相法に
より、ジスルフィド結合を含まないペプチドを合成し、
所望により、これを酸化反応に付して、分子内にジスル
フィド結合を導入した後、Ｃ−１８逆相高速液体クロマ
トグラフィー等に付して精製することにより、製造する
こともできる。
までのジスルフィド結合を有しうるオリゴペプチドであ
るため、通常のペプチド合成機（例えばパーキン・エル
マー社製ペプチド合成機４３１Ａ型）を用いた固相法に
より、ジスルフィド結合を含まないペプチドを合成し、
所望により、これを酸化反応に付して、分子内にジスル
フィド結合を導入した後、Ｃ−１８逆相高速液体クロマ
トグラフィー等に付して精製することにより、製造する
こともできる。
【０００８】本発明のペプチドにおいて、分子内に３箇
所のジスルフィド結合が存在しうることは、（１）一次
構造に６個のＣｙｓ残基が存在すること、および（２）
サソリ（Ｂ．ｍａｒｔｅｎｓｉ）から抽出したペプチド
の質量分析のデータによれば、ペプチドは単量体で存在
し、分子内に３箇所のジスルフィド結合が存在すること
を示している、という二つの事実から明らかである。
所のジスルフィド結合が存在しうることは、（１）一次
構造に６個のＣｙｓ残基が存在すること、および（２）
サソリ（Ｂ．ｍａｒｔｅｎｓｉ）から抽出したペプチド
の質量分析のデータによれば、ペプチドは単量体で存在
し、分子内に３箇所のジスルフィド結合が存在すること
を示している、という二つの事実から明らかである。
【０００９】サソリ（Ｂ．ｍａｒｔｅｎｓｉ）から抽出
した天然型の本発明のペプチドにおける３箇所のジスル
フィド結合については、前記の既に知られているサソリ
毒素であるＣｈＴＸおよびＩｂＴＸにおける、３箇所の
ジスルフィド結合の位置から類推して、７−２８番目，
１３−３３番目および１７−３５番目のＣｙｓ残基間に
存在すると推定されるが、その存在箇所は未だ同定され
ていない。しかし、天然型のペプチドを合成法で得るに
は、例えば、固相法でジスルフィド結合を含まないペプ
チドを合成した後、酸化反応により、無作為に３箇所の
ジスルフィド結合を導入して、例えばＣ−１８ＨＰＬＣ
で天然品と同じ保持時間を有する画分を単離して生理活
性を測定すれば得ることができる。
した天然型の本発明のペプチドにおける３箇所のジスル
フィド結合については、前記の既に知られているサソリ
毒素であるＣｈＴＸおよびＩｂＴＸにおける、３箇所の
ジスルフィド結合の位置から類推して、７−２８番目，
１３−３３番目および１７−３５番目のＣｙｓ残基間に
存在すると推定されるが、その存在箇所は未だ同定され
ていない。しかし、天然型のペプチドを合成法で得るに
は、例えば、固相法でジスルフィド結合を含まないペプ
チドを合成した後、酸化反応により、無作為に３箇所の
ジスルフィド結合を導入して、例えばＣ−１８ＨＰＬＣ
で天然品と同じ保持時間を有する画分を単離して生理活
性を測定すれば得ることができる。
【００１０】さらに、天然型以外の様式のジスルフィド
結合を有するペプチドであっても、本発明のペプチドと
同様の生理活性を有する限りにおいて、本発明に使用す
ることができる。
結合を有するペプチドであっても、本発明のペプチドと
同様の生理活性を有する限りにおいて、本発明に使用す
ることができる。
【００１１】
【作用】本発明のペプチドは、後記評価例に示すよう
に、Ｃ５７／Ｂ１６雄性マウスに対して、すでに報告さ
れている毒素と同程度の神経毒活性を示した。このこと
は、本発明のペプチドが新たな一次構造を有するサソリ
毒素ペプチドであることを示すものである。サソリ毒素
ペプチドの神経毒活性は、Ｋ+ チャンネルの開口、遮断
に関与するためと考えられている。そのため、本発明の
ペプチドは、神経生理学における生化学試薬として有用
であるばかりか、医薬、動物薬への応用も考えられる。
例えば、脳血管平滑筋のＫ+ チャンネルとクモ膜下出血
後の脳血管の攣縮に関する研究から、Ｋ+ チャンネルオ
ープナーは有望な治療薬であると考えられている（Ｈ．
Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｃｏｏｋ，Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，７５巻
３２７−３３６頁 １９９４年）。
に、Ｃ５７／Ｂ１６雄性マウスに対して、すでに報告さ
れている毒素と同程度の神経毒活性を示した。このこと
は、本発明のペプチドが新たな一次構造を有するサソリ
毒素ペプチドであることを示すものである。サソリ毒素
ペプチドの神経毒活性は、Ｋ+ チャンネルの開口、遮断
に関与するためと考えられている。そのため、本発明の
ペプチドは、神経生理学における生化学試薬として有用
であるばかりか、医薬、動物薬への応用も考えられる。
例えば、脳血管平滑筋のＫ+ チャンネルとクモ膜下出血
後の脳血管の攣縮に関する研究から、Ｋ+ チャンネルオ
ープナーは有望な治療薬であると考えられている（Ｈ．
Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｃｏｏｋ，Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，７５巻
３２７−３３６頁 １９９４年）。
【００１２】次に実施例によって本発明をさらに説明す
るが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものでは
ない。
るが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものでは
ない。
【００１３】実施例１．中国産サソリからＳＶ１の精製 ａ．粗抽出 中国産サソリの毒腺の凍結乾燥物３００ｍｇを約１５ｍ
ｌの０．５Ｍ酢酸でホモジナイズし、３，０００×ｇで
２０分間遠心分離した。沈殿は同様にホモジナイズ後遠
心分離する操作を３回繰り返し、得られた上清を孔径
０．４５μｍのフィルターで濾過して、粗抽出液を得
た。
ｌの０．５Ｍ酢酸でホモジナイズし、３，０００×ｇで
２０分間遠心分離した。沈殿は同様にホモジナイズ後遠
心分離する操作を３回繰り返し、得られた上清を孔径
０．４５μｍのフィルターで濾過して、粗抽出液を得
た。
【００１４】ｂ．逆相カラムクロマトグラフィー（１） ａ．で得られた粗抽出液の原料換算６０ｍｇ分を１バッ
チとして、Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ ＳＧ−１
２０（資生堂，φ１０×２５０ｍｍ）を用いたＣ−１８
逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速３
ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、１
０２分間で０％から４５％のアセトニトリルの直線濃度
勾配で溶出した。２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしな
がら、ピークを示す画分を３６フラクションを分画し、
Ｃ５７／Ｂｌ６雄性マウスを用いる生物検定により、保
持時間４７分および５０分に溶出される２個の活性画分
を得た。
チとして、Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ ＳＧ−１
２０（資生堂，φ１０×２５０ｍｍ）を用いたＣ−１８
逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速３
ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、１
０２分間で０％から４５％のアセトニトリルの直線濃度
勾配で溶出した。２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしな
がら、ピークを示す画分を３６フラクションを分画し、
Ｃ５７／Ｂｌ６雄性マウスを用いる生物検定により、保
持時間４７分および５０分に溶出される２個の活性画分
を得た。
【００１５】ｃ．陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー ｂ．で得られた保持時間４７分の画分を、をＴＳＫ−ｇ
ｅｌ ＳＰ−５ＰＷ（東ソー，φ７．５×７５ｍｍ）を
用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、
流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間で０Ｍから０．８Ｍ
のＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。２３０ｎｍのＵ
Ｖ吸収でモニターしながら分画し、生物検定により、Ｎ
ａＣｌ濃度５８０ｍＭで溶出される活性画分を得た。
ー ｂ．で得られた保持時間４７分の画分を、をＴＳＫ−ｇ
ｅｌ ＳＰ−５ＰＷ（東ソー，φ７．５×７５ｍｍ）を
用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、
流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．８）中、８０分間で０Ｍから０．８Ｍ
のＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。２３０ｎｍのＵ
Ｖ吸収でモニターしながら分画し、生物検定により、Ｎ
ａＣｌ濃度５８０ｍＭで溶出される活性画分を得た。
【００１６】ｄ．逆相カラムクロマトグラフィー（２） ｃ．で得られた活性画分を、１００Ａ Ｃ１８逆相ＨＰ
ＬＣカラム（メルク，φ４×１２５ｍｍ）を用いるＣ−
１８逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流
速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．
２）中、４０分間で０％から４０％のアセトニトリルの
直線濃度勾配で、２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしな
がら溶出した。ＳＶ１は保持時間２７．３分の箇所にシ
ングルピークとして溶出された。この分画を集めて凍結
乾燥し、１ｍｇのＳＶ１を得た。
ＬＣカラム（メルク，φ４×１２５ｍｍ）を用いるＣ−
１８逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流
速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．
２）中、４０分間で０％から４０％のアセトニトリルの
直線濃度勾配で、２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしな
がら溶出した。ＳＶ１は保持時間２７．３分の箇所にシ
ングルピークとして溶出された。この分画を集めて凍結
乾燥し、１ｍｇのＳＶ１を得た。
【００１７】実施例２．中国産サソリからＳＶ２の精製 実施例１のステップｂ．で得られた保持時間５０分の画
分を、実施例１のステップｃ．と同様にＴＳＫ−ｇｅｌ
ＳＰ−５ＰＷ（東ソー，φ７．５×７５ｍｍ）を用い
る陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製し、Ｎ
ａＣｌ濃度６００ｍＭで溶出される活性画分を得た。こ
の画分を、実施例１のステップｄ．と同様に１００Ａ
Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（メルク，φ４×１２５ｍ
ｍ）を用いるＣ−１８逆相高速液体カラムクロマトグラ
フィーで精製し、保持時間２９．２分の箇所にシングル
ピークとして溶出された分画を集めて凍結乾燥して、
０．８ｍｇのＳＶ２を得た。
分を、実施例１のステップｃ．と同様にＴＳＫ−ｇｅｌ
ＳＰ−５ＰＷ（東ソー，φ７．５×７５ｍｍ）を用い
る陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製し、Ｎ
ａＣｌ濃度６００ｍＭで溶出される活性画分を得た。こ
の画分を、実施例１のステップｄ．と同様に１００Ａ
Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（メルク，φ４×１２５ｍ
ｍ）を用いるＣ−１８逆相高速液体カラムクロマトグラ
フィーで精製し、保持時間２９．２分の箇所にシングル
ピークとして溶出された分画を集めて凍結乾燥して、
０．８ｍｇのＳＶ２を得た。
【００１８】実施例３．１次構造の同定 ａ．アミノ酸組成の測定 ＳＶ１およびＳＶ２をそれぞれ、減圧下封管中に定沸点
６Ｎ−ＨＣｌを用いて１１０℃，２０時間処理して加水
分解し、アミノ酸分析器によりアミノ酸組成を求めた。
結果を〔表１〕に示す。
６Ｎ−ＨＣｌを用いて１１０℃，２０時間処理して加水
分解し、アミノ酸分析器によりアミノ酸組成を求めた。
結果を〔表１〕に示す。
【００１９】
【表１】 表１ ＳＶ１およびＳＶ２のアミノ酸組成 ---------------------------------------- アミノ酸残基 ＳＶ１ ＳＶ２ ---------------------------------------- Asx 2.7 (3) 1.9 (2) Glx 2.9 (3) 2.1 (2) Ser 2.0 (2) 5.6 (6) Gly 4.2 (4) 2.2 (2) Thr 2.0 (2) 2.0 (2) Ala − 1.1 (1) Pro 2.2 (2) 1.0 (1) Arg 1.1 (1) 2.0 (2) Tyr 0.9 (1) 1.8 (2) Val 2.0 (2) 2.0 (2) Met 2.0 (2) 1.0 (1) Leu − 1.2 (1) Phe 1.9 (2) 1.9 (2) Lys 5.6 (6) 3.7 (4) ---------------------------------------- 単位はｐｍｏｌで示し、 （ ）の数字は計算された残基数を示す。
【００２０】ｂ．アミノ酸組成の測定 常法に従って還元およびＳ−カルボキシメチル化したＳ
Ｖ１およびＳＶ２は、通常のエドマン分解に抵抗性であ
ったので、ギムネ・ガレゴら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５巻 ３３２９−３３３３
頁，１９８８年）の方法で、ピログルタミン酸アミノペ
プチダーゼ処理を行った。得られたペプチドをアミノ酸
シーケンサーにより分析し、ＳＶ−１からは、
Ｖ１およびＳＶ２は、通常のエドマン分解に抵抗性であ
ったので、ギムネ・ガレゴら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５巻 ３３２９−３３３３
頁，１９８８年）の方法で、ピログルタミン酸アミノペ
プチダーゼ処理を行った。得られたペプチドをアミノ酸
シーケンサーにより分析し、ＳＶ−１からは、
【００２１】Glu-Phe-Thr-Asp-Val-Lys-Cys-Thr-Gly-Se
r-Lys-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys-Lys-Gln-Met-Phe-Gly-
Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met
r-Lys-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys-Lys-Gln-Met-Phe-Gly-
Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met
【００２２】のＮ末端側の配列が同定された（但し、配
列中Ｃｙｓは、Ｓ−カルボキシメチル化Ｃｙｓとして同
定した）。さらに、ＳＶ１からは、ロミらの方法（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．，Ｃｈｅｍ．，２６８巻 ３５号 ２６３０
２−２６３０９頁，１９９３年）によりＣＮＢｒ分解す
ることにより、
列中Ｃｙｓは、Ｓ−カルボキシメチル化Ｃｙｓとして同
定した）。さらに、ＳＶ１からは、ロミらの方法（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．，Ｃｈｅｍ．，２６８巻 ３５号 ２６３０
２−２６３０９頁，１９９３年）によりＣＮＢｒ分解す
ることにより、
【００２３】Phe-Gly-Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met-As
n-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser および
n-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser および
【００２４】Asn-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser
【００２５】のＣ末端部分の構造を確認した。また、Ｓ
Ｖ１は、ＭＳ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる質量値、４１
６９．１Ｄａを示した。このことは、分子内に３箇所の
ジスルフィド結合を有するとして、アミノ酸配列から計
算した質量値である４１８５．９Ｄａより１６Ｄａ少な
く、ＳＶ１は配列番号１で示されるペプチドであること
が判明した。また、同様にＳＶ２からは、同様の処理に
より、
Ｖ１は、ＭＳ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる質量値、４１
６９．１Ｄａを示した。このことは、分子内に３箇所の
ジスルフィド結合を有するとして、アミノ酸配列から計
算した質量値である４１８５．９Ｄａより１６Ｄａ少な
く、ＳＶ１は配列番号１で示されるペプチドであること
が判明した。また、同様にＳＶ２からは、同様の処理に
より、
【００２６】Phe-Thr-Asn-Val-Ser-Cys-Ser-Ala-Ser-Se
r-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys-Lys-Lys-Leu-Phe-Gly-Thr
r-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys-Lys-Lys-Leu-Phe-Gly-Thr
【００２７】のＮ末端側配列が同定された（但し、配列
中Ｃｙｓは、Ｓ−カルボキシメチル化Ｃｙｓとして同定
した）。さらに、ＳＶ２のＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ（Ac
hromobactor 由来）による分解では、
中Ｃｙｓは、Ｓ−カルボキシメチル化Ｃｙｓとして同定
した）。さらに、ＳＶ２のＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ（Ac
hromobactor 由来）による分解では、
【００２８】Leu-Phe-Gly-Thr-Tyr-Arg-Gly-Lys の部
分構造、
分構造、
【００２９】Cys-Met-Asn-Ser-Lys の部分構造およ
び、
び、
【００３０】Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser
【００３１】のＣ末端部分の構造を確認した。また、未
処理のＳＶ２は、ＭＳ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる質量
値、４１７７．２Ｄａを示した。このことは、分子内に
３箇所のジスルフィド結合を有するとして、アミノ酸配
列から計算した質量値である４１９３．７Ｄａより１６
Ｄａ少なく、ＳＶ２は配列番号２で示されるペプチドで
あることが判明した。
処理のＳＶ２は、ＭＳ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる質量
値、４１７７．２Ｄａを示した。このことは、分子内に
３箇所のジスルフィド結合を有するとして、アミノ酸配
列から計算した質量値である４１９３．７Ｄａより１６
Ｄａ少なく、ＳＶ２は配列番号２で示されるペプチドで
あることが判明した。
【００３２】実施例４．固相法によるペプチドの合成 ペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）樹脂
（パーキン・エルマー社製）を担体とし、パーキン・エ
ルマー・ジャパン社の全自動ペプチド合成機４３３Ａ型
を用いて、ＦａｓｔＭｏｃTM（パーキン・エルマー・ジ
ャパン社）の固相法により合成した。（但し、ｔＢｕ＝
ｔ−Ｂｕｔｙｌを示す。）
（パーキン・エルマー社製）を担体とし、パーキン・エ
ルマー・ジャパン社の全自動ペプチド合成機４３３Ａ型
を用いて、ＦａｓｔＭｏｃTM（パーキン・エルマー・ジ
ャパン社）の固相法により合成した。（但し、ｔＢｕ＝
ｔ−Ｂｕｔｙｌを示す。）
【００３３】ペプチド樹脂からのペプチドの切り放しと
粗ペプチドの脱保護は、ＴＦＡ／チオアニソール／１，
２−エタンジオール（９０／５／５，ｖ／ｖ）混合液
を、ペプチド樹脂１ｍｇ当たり１０ｍｌ加えた後、室温
で２．５時間処理することにより行った。反応液を濾過
し、濾液にエーテルを加えてペプチドを沈澱させた後、
沈澱をエーテルで３回洗浄した。次いで得られた沈殿を
ＴＦＡに再溶解し、再びエーテルで沈澱させて粗ペプチ
ドを得た。
粗ペプチドの脱保護は、ＴＦＡ／チオアニソール／１，
２−エタンジオール（９０／５／５，ｖ／ｖ）混合液
を、ペプチド樹脂１ｍｇ当たり１０ｍｌ加えた後、室温
で２．５時間処理することにより行った。反応液を濾過
し、濾液にエーテルを加えてペプチドを沈澱させた後、
沈澱をエーテルで３回洗浄した。次いで得られた沈殿を
ＴＦＡに再溶解し、再びエーテルで沈澱させて粗ペプチ
ドを得た。
【００３４】得られた粗ペプチドは、蒸留水に１．７ｍ
Ｍの濃度に溶解し、室温で４８時間空気酸化して、分子
内にジスルフィド結合を導入した後、ＳＶ１については
実施例１のステップｄ．，ＳＶ２については実施例２の
最終ステップのＣ−１８ＨＰＬＣと同様の方法で精製
し、合成ペプチドを得た。
Ｍの濃度に溶解し、室温で４８時間空気酸化して、分子
内にジスルフィド結合を導入した後、ＳＶ１については
実施例１のステップｄ．，ＳＶ２については実施例２の
最終ステップのＣ−１８ＨＰＬＣと同様の方法で精製
し、合成ペプチドを得た。
【００３５】合成ペプチドは、上記Ｃ−１８ＨＰＬＣ
で、天然品と同一の保持時間を示し、天然品と同一のア
ミノ酸組成および分子量を示した。また、合成ペプチド
と天然品との混合物は、上記Ｃ−１８ＨＰＬＣで、天然
品と同一の保持時間の箇所にシングルピークを与えた。
さらに、合成ペプチドは、天然品と同一の生理活性を示
した。これらのことから、ＳＶ１およびＳＶ２はそれぞ
れ配列表１および２に示すアミノ酸配列を有するペプチ
ドであることが明らかである。
で、天然品と同一の保持時間を示し、天然品と同一のア
ミノ酸組成および分子量を示した。また、合成ペプチド
と天然品との混合物は、上記Ｃ−１８ＨＰＬＣで、天然
品と同一の保持時間の箇所にシングルピークを与えた。
さらに、合成ペプチドは、天然品と同一の生理活性を示
した。これらのことから、ＳＶ１およびＳＶ２はそれぞ
れ配列表１および２に示すアミノ酸配列を有するペプチ
ドであることが明らかである。
【００３６】評価例１．ネズミに対する毒性試験 本発明のペプチドのネズミに対する毒性試験は、Ｍａｒ
ｔｉｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻 ４４５
２−４４５９頁 １９８７年）の方法に準じて実施し
た。すなわち、体重２０±３ｇのＣ５７／Ｂ１６雄性マ
ウスを用い、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を含む、種々の濃度の試料溶液を５μｌ／マウスを大脳
脳室内に投与し、神経興奮により惹起される神経毒の症
状を観察した。マウスの致死率から計算したＳＶ１およ
びＳＶ２のＬＤ50は、２０〜５０ｎｇ／マウスであり、
この値は、モロッコ産サソリから単離されたＫＴＸ
（Ｒ．Ｒｏｍｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．文献前
出）の値とほぼ同様であった。このＫＴＸについては、
本発明者らによって、Ｋ+ チャンネル ブロッカー活性
を有することが確認されており（文献前出）、本発明の
ペプチドであるＳＶ１およびＳＶ２も、投与時の神経毒
の症状およびＬＤ50値から、Ｋ+ チャンネルに対して、
何らかの作用を有すると考えられる。
ｔｉｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻 ４４５
２−４４５９頁 １９８７年）の方法に準じて実施し
た。すなわち、体重２０±３ｇのＣ５７／Ｂ１６雄性マ
ウスを用い、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を含む、種々の濃度の試料溶液を５μｌ／マウスを大脳
脳室内に投与し、神経興奮により惹起される神経毒の症
状を観察した。マウスの致死率から計算したＳＶ１およ
びＳＶ２のＬＤ50は、２０〜５０ｎｇ／マウスであり、
この値は、モロッコ産サソリから単離されたＫＴＸ
（Ｒ．Ｒｏｍｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．文献前
出）の値とほぼ同様であった。このＫＴＸについては、
本発明者らによって、Ｋ+ チャンネル ブロッカー活性
を有することが確認されており（文献前出）、本発明の
ペプチドであるＳＶ１およびＳＶ２も、投与時の神経毒
の症状およびＬＤ50値から、Ｋ+ チャンネルに対して、
何らかの作用を有すると考えられる。
【００３７】
【発明の効果】本発明によれば、配列番号１および配列
番号２で示されるペプチドを、サソリ毒素ペプチドとし
て提供することができる。これらのペプチドは、評価例
に示すように、Ｃ５７／Ｂ１６雄性マウスに対して、す
でに報告されている毒素と同程度の活性を示し、新たな
一次構造を有するサソリ毒素ペプチドである。従って、
本発明のペプチドは、神経生理学における生化学試薬と
して有用であるばかりか、サソリ毒素ペプチドの医薬、
動物薬としての応用に繋がるものである。
番号２で示されるペプチドを、サソリ毒素ペプチドとし
て提供することができる。これらのペプチドは、評価例
に示すように、Ｃ５７／Ｂ１６雄性マウスに対して、す
でに報告されている毒素と同程度の活性を示し、新たな
一次構造を有するサソリ毒素ペプチドである。従って、
本発明のペプチドは、神経生理学における生化学試薬と
して有用であるばかりか、サソリ毒素ペプチドの医薬、
動物薬としての応用に繋がるものである。
【００３８】
【００３９】配列番号：１ 配列の長さ：３７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓ
ｉ） 配列の特徴： Ｅ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｓ ３箇所 Ｅ−Ｎ末端ピログルタミル化 配列： Glu Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 37
ｉ） 配列の特徴： Ｅ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｓ ３箇所 Ｅ−Ｎ末端ピログルタミル化 配列： Glu Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 37
【００４０】配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：中国産サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓ
ｉ） 配列の特徴： Ｅ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｓ ３箇所 Ｅ−Ｎ末端ピログルタミル化 配列： Glu Phe Thr Asn Val Ser Cys Ser Ala Ser Ser Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Lys Leu Phe Gly Thr Tyr Arg Gly Lys Cys Met Asn Ser Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 37
ｉ） 配列の特徴： Ｅ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｓ ３箇所 Ｅ−Ｎ末端ピログルタミル化 配列： Glu Phe Thr Asn Val Ser Cys Ser Ala Ser Ser Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Lys Leu Phe Gly Thr Tyr Arg Gly Lys Cys Met Asn Ser Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 37
フロントページの続き (72)発明者 中嶋 暉躬 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 財団法人サントリー生物有機科学研究所 内
Claims (2)
- 【請求項１】次のアミノ酸配列式（１）： PyrGlu-Phe-Thr-Asp-Val-Lys-Cys-Thr-Gly-Ser-Lys-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys- Lys-Gln-Met-Phe-Gly-Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys- Tyr-Ser-OH （１） （式中、 PyrGlu-はピログルタミン酸残基を表す）で表
され、分子内に３箇所までのジスルフィド結合を有して
もよいペプチド。 - 【請求項２】次のアミノ酸配列式（２）： PyrGlu-Phe-Thr-Asn-Val-Ser-Cys-Ser-Ala-Ser-Ser-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys- Lys-Lys-Leu-Phe-Gly-Thr-Tyr-Arg-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Ser-Lys-Cys-Arg-Cys- Tyr-Ser-OH （２） （式中、 PyrGlu-はピログルタミン酸残基を表す）で表
され、分子内に３箇所までのジスルフィド結合を有して
もよいペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05729296A JP3776968B2 (ja) | 1996-03-14 | 1996-03-14 | ペプチド性サソリ毒素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05729296A JP3776968B2 (ja) | 1996-03-14 | 1996-03-14 | ペプチド性サソリ毒素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09249696A true JPH09249696A (ja) | 1997-09-22 |
| JP3776968B2 JP3776968B2 (ja) | 2006-05-24 |
Family
ID=13051487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05729296A Expired - Fee Related JP3776968B2 (ja) | 1996-03-14 | 1996-03-14 | ペプチド性サソリ毒素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3776968B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100377741C (zh) * | 2004-02-23 | 2008-04-02 | 江卫世 | 注射用复方骨肽及其制备工艺 |
| CN107501403A (zh) * | 2017-10-09 | 2017-12-22 | 南京图艾生物医药科技有限公司 | 一种蝎毒素的提取和纯化工艺 |
-
1996
- 1996-03-14 JP JP05729296A patent/JP3776968B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100377741C (zh) * | 2004-02-23 | 2008-04-02 | 江卫世 | 注射用复方骨肽及其制备工艺 |
| CN107501403A (zh) * | 2017-10-09 | 2017-12-22 | 南京图艾生物医药科技有限公司 | 一种蝎毒素的提取和纯化工艺 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3776968B2 (ja) | 2006-05-24 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
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