JPH09249696A - ペプチド性サソリ毒素 - Google Patents
ペプチド性サソリ毒素Info
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- JPH09249696A JPH09249696A JP5729296A JP5729296A JPH09249696A JP H09249696 A JPH09249696 A JP H09249696A JP 5729296 A JP5729296 A JP 5729296A JP 5729296 A JP5729296 A JP 5729296A JP H09249696 A JPH09249696 A JP H09249696A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新たなサソリペプチド毒素を提供し、サソリ
毒素の医薬等に対する応用に寄与する。 【解決手段】 中国産サソリ(Buthus mart
ensi)の毒腺からマウスに対する致死活性を指標に
単離された、次のアミノ酸配列式(1)または(2): PyrGlu-Phe-Thr-Asp-Val-Lys-Cys-Thr-Gly-Ser-Lys-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys- Lys-Gln-Met-Phe-Gly-Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys- Tyr-Ser-OH (1) または PyrGlu-Phe-Thr-Asn-Val-Ser-Cys-Ser-Ala-Ser-Ser-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys- Lys-Lys-Leu-Phe-Gly-Thr-Tyr-Arg-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Ser-Lys-Cys-Arg-Cys- Tyr-Ser-OH (2) (式中、 PyrGlu-はピログルタミン酸残基を表す)で表
され、分子内に3箇所までのジスルフィド結合を有して
もよいペプチド。
毒素の医薬等に対する応用に寄与する。 【解決手段】 中国産サソリ(Buthus mart
ensi)の毒腺からマウスに対する致死活性を指標に
単離された、次のアミノ酸配列式(1)または(2): PyrGlu-Phe-Thr-Asp-Val-Lys-Cys-Thr-Gly-Ser-Lys-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys- Lys-Gln-Met-Phe-Gly-Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys- Tyr-Ser-OH (1) または PyrGlu-Phe-Thr-Asn-Val-Ser-Cys-Ser-Ala-Ser-Ser-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys- Lys-Lys-Leu-Phe-Gly-Thr-Tyr-Arg-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Ser-Lys-Cys-Arg-Cys- Tyr-Ser-OH (2) (式中、 PyrGlu-はピログルタミン酸残基を表す)で表
され、分子内に3箇所までのジスルフィド結合を有して
もよいペプチド。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なペプチド性毒
素に関し、さらに詳細には、中国産サソリ(Buthu
s martensi)の毒腺から得られるペプチド性
毒素に関する。
素に関し、さらに詳細には、中国産サソリ(Buthu
s martensi)の毒腺から得られるペプチド性
毒素に関する。
【0002】
【従来の技術】サソリは蛛形綱サソリ目に属する節足動
物の総称であり、全世界に約600種が生息する。サソ
リは一般に猛毒な生物であると考えられているが、実際
には致命的な毒素を持つサソリは種類が限られており、
例えば、アフリカの砂漠に生息するButhus us
tralis,メキシコ産のCentruroides
exilicaudaや,南ヨーロッパ産のB.occ
itauda等、数種にすぎない。サソリの仲間のもつ
毒素は一般に神経毒であるが、なかにはそれほど強くな
い毒素も多く、それらの生理活性を医薬あるいは生化学
研究に利用するため、現在までに種々のサソリ毒素が単
離されている(Dreyer.F. Rev.Phys
iol.Biochem.Pharmacol.,15
巻 94−128頁 1990年)。
物の総称であり、全世界に約600種が生息する。サソ
リは一般に猛毒な生物であると考えられているが、実際
には致命的な毒素を持つサソリは種類が限られており、
例えば、アフリカの砂漠に生息するButhus us
tralis,メキシコ産のCentruroides
exilicaudaや,南ヨーロッパ産のB.occ
itauda等、数種にすぎない。サソリの仲間のもつ
毒素は一般に神経毒であるが、なかにはそれほど強くな
い毒素も多く、それらの生理活性を医薬あるいは生化学
研究に利用するため、現在までに種々のサソリ毒素が単
離されている(Dreyer.F. Rev.Phys
iol.Biochem.Pharmacol.,15
巻 94−128頁 1990年)。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】現在までに単離され、
構造決定されたサソリ毒素の例としては、Charyb
dotoxin1(ChTX,Miller,C.ら
Nature,313巻316−318頁,1985
年),Iberiotoxin(IbTX,Galve
z.A.ら,J.Biol.Chem.,265巻 1
9号 11083−11090頁, 1990年),K
aliotoxin(KTX,Romi.R.ら,J.
Biol.Chem.,268巻 35号 26302
−26309頁, 1993年)およびMargato
xin(MgTX,Bendnarrek.M.ら,B
BRC,198巻 619頁 1994年)等が知られ
ており、これらの毒素の生理作用として、特にK+ チャ
ンネルに対する作用が注目されている。
構造決定されたサソリ毒素の例としては、Charyb
dotoxin1(ChTX,Miller,C.ら
Nature,313巻316−318頁,1985
年),Iberiotoxin(IbTX,Galve
z.A.ら,J.Biol.Chem.,265巻 1
9号 11083−11090頁, 1990年),K
aliotoxin(KTX,Romi.R.ら,J.
Biol.Chem.,268巻 35号 26302
−26309頁, 1993年)およびMargato
xin(MgTX,Bendnarrek.M.ら,B
BRC,198巻 619頁 1994年)等が知られ
ており、これらの毒素の生理作用として、特にK+ チャ
ンネルに対する作用が注目されている。
【0004】これらのペプチド毒素は、構造に高い相同
性を示すものの、K+ チャンネルに対して全く正反対の
作用を示すものもあり、これらのペプチド毒素を医薬等
に応用するには、より多くのペプチド毒素を単離し、構
造活性相関を研究する必要がある。このような現状に鑑
み、本発明は、新たなサソリペプチド毒素を提供し、サ
ソリ毒素の医薬等に対する応用に寄与することを課題と
する。
性を示すものの、K+ チャンネルに対して全く正反対の
作用を示すものもあり、これらのペプチド毒素を医薬等
に応用するには、より多くのペプチド毒素を単離し、構
造活性相関を研究する必要がある。このような現状に鑑
み、本発明は、新たなサソリペプチド毒素を提供し、サ
ソリ毒素の医薬等に対する応用に寄与することを課題と
する。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、中国産サ
ソリ(Buthus martensi)の毒腺から、
マウスに対する致死活性を指標に、新たなサソリ毒素を
単離すべく鋭意研究を行い、配列番号1および配列番号
2で表されるペプチドを単離・精製し、その構造を推定
した。また、この配列番号1および配列番号2に従って
ペプチドを合成し、この構造を確認して本発明を完成し
た。すなわち、本発明によれば、配列番号1および配列
番号2で表されるペプチドをペプチド毒素として提供す
ることができる。以下、配列番号1で表されるペプチド
をSV1と呼び、配列番号2で表されるペプチドをSV
2と呼ぶ場合がある。
ソリ(Buthus martensi)の毒腺から、
マウスに対する致死活性を指標に、新たなサソリ毒素を
単離すべく鋭意研究を行い、配列番号1および配列番号
2で表されるペプチドを単離・精製し、その構造を推定
した。また、この配列番号1および配列番号2に従って
ペプチドを合成し、この構造を確認して本発明を完成し
た。すなわち、本発明によれば、配列番号1および配列
番号2で表されるペプチドをペプチド毒素として提供す
ることができる。以下、配列番号1で表されるペプチド
をSV1と呼び、配列番号2で表されるペプチドをSV
2と呼ぶ場合がある。
【0006】
【発明の実施の形態】本発明のペプチドは、例えば、中
国産サソリ(B.martensi)から毒腺を摘出
し、これを例えば0.5M程度の酢酸でペプチドを抽出
して粗抽出物を得る。この粗抽出物から、通常、ペプチ
ド精製に用いられるイオン交換クロマトグラフィー、逆
相クロマトグラフィー等を用いて、マウスに対する致死
活性を指標に分離・精製することにより得ることができ
る。
国産サソリ(B.martensi)から毒腺を摘出
し、これを例えば0.5M程度の酢酸でペプチドを抽出
して粗抽出物を得る。この粗抽出物から、通常、ペプチ
ド精製に用いられるイオン交換クロマトグラフィー、逆
相クロマトグラフィー等を用いて、マウスに対する致死
活性を指標に分離・精製することにより得ることができ
る。
【0007】また本発明のペプチドは、分子内に3箇所
までのジスルフィド結合を有しうるオリゴペプチドであ
るため、通常のペプチド合成機(例えばパーキン・エル
マー社製ペプチド合成機431A型)を用いた固相法に
より、ジスルフィド結合を含まないペプチドを合成し、
所望により、これを酸化反応に付して、分子内にジスル
フィド結合を導入した後、C−18逆相高速液体クロマ
トグラフィー等に付して精製することにより、製造する
こともできる。
までのジスルフィド結合を有しうるオリゴペプチドであ
るため、通常のペプチド合成機(例えばパーキン・エル
マー社製ペプチド合成機431A型)を用いた固相法に
より、ジスルフィド結合を含まないペプチドを合成し、
所望により、これを酸化反応に付して、分子内にジスル
フィド結合を導入した後、C−18逆相高速液体クロマ
トグラフィー等に付して精製することにより、製造する
こともできる。
【0008】本発明のペプチドにおいて、分子内に3箇
所のジスルフィド結合が存在しうることは、(1)一次
構造に6個のCys残基が存在すること、および(2)
サソリ(B.martensi)から抽出したペプチド
の質量分析のデータによれば、ペプチドは単量体で存在
し、分子内に3箇所のジスルフィド結合が存在すること
を示している、という二つの事実から明らかである。
所のジスルフィド結合が存在しうることは、(1)一次
構造に6個のCys残基が存在すること、および(2)
サソリ(B.martensi)から抽出したペプチド
の質量分析のデータによれば、ペプチドは単量体で存在
し、分子内に3箇所のジスルフィド結合が存在すること
を示している、という二つの事実から明らかである。
【0009】サソリ(B.martensi)から抽出
した天然型の本発明のペプチドにおける3箇所のジスル
フィド結合については、前記の既に知られているサソリ
毒素であるChTXおよびIbTXにおける、3箇所の
ジスルフィド結合の位置から類推して、7−28番目,
13−33番目および17−35番目のCys残基間に
存在すると推定されるが、その存在箇所は未だ同定され
ていない。しかし、天然型のペプチドを合成法で得るに
は、例えば、固相法でジスルフィド結合を含まないペプ
チドを合成した後、酸化反応により、無作為に3箇所の
ジスルフィド結合を導入して、例えばC−18HPLC
で天然品と同じ保持時間を有する画分を単離して生理活
性を測定すれば得ることができる。
した天然型の本発明のペプチドにおける3箇所のジスル
フィド結合については、前記の既に知られているサソリ
毒素であるChTXおよびIbTXにおける、3箇所の
ジスルフィド結合の位置から類推して、7−28番目,
13−33番目および17−35番目のCys残基間に
存在すると推定されるが、その存在箇所は未だ同定され
ていない。しかし、天然型のペプチドを合成法で得るに
は、例えば、固相法でジスルフィド結合を含まないペプ
チドを合成した後、酸化反応により、無作為に3箇所の
ジスルフィド結合を導入して、例えばC−18HPLC
で天然品と同じ保持時間を有する画分を単離して生理活
性を測定すれば得ることができる。
【0010】さらに、天然型以外の様式のジスルフィド
結合を有するペプチドであっても、本発明のペプチドと
同様の生理活性を有する限りにおいて、本発明に使用す
ることができる。
結合を有するペプチドであっても、本発明のペプチドと
同様の生理活性を有する限りにおいて、本発明に使用す
ることができる。
【0011】
【作用】本発明のペプチドは、後記評価例に示すよう
に、C57/B16雄性マウスに対して、すでに報告さ
れている毒素と同程度の神経毒活性を示した。このこと
は、本発明のペプチドが新たな一次構造を有するサソリ
毒素ペプチドであることを示すものである。サソリ毒素
ペプチドの神経毒活性は、K+ チャンネルの開口、遮断
に関与するためと考えられている。そのため、本発明の
ペプチドは、神経生理学における生化学試薬として有用
であるばかりか、医薬、動物薬への応用も考えられる。
例えば、脳血管平滑筋のK+ チャンネルとクモ膜下出血
後の脳血管の攣縮に関する研究から、K+ チャンネルオ
ープナーは有望な治療薬であると考えられている(H.
Zhang and David Cook,Phar
macology & Toxicology,75巻
327−336頁 1994年)。
に、C57/B16雄性マウスに対して、すでに報告さ
れている毒素と同程度の神経毒活性を示した。このこと
は、本発明のペプチドが新たな一次構造を有するサソリ
毒素ペプチドであることを示すものである。サソリ毒素
ペプチドの神経毒活性は、K+ チャンネルの開口、遮断
に関与するためと考えられている。そのため、本発明の
ペプチドは、神経生理学における生化学試薬として有用
であるばかりか、医薬、動物薬への応用も考えられる。
例えば、脳血管平滑筋のK+ チャンネルとクモ膜下出血
後の脳血管の攣縮に関する研究から、K+ チャンネルオ
ープナーは有望な治療薬であると考えられている(H.
Zhang and David Cook,Phar
macology & Toxicology,75巻
327−336頁 1994年)。
【0012】次に実施例によって本発明をさらに説明す
るが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものでは
ない。
るが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものでは
ない。
【0013】実施例1.中国産サソリからSV1の精製 a.粗抽出 中国産サソリの毒腺の凍結乾燥物300mgを約15m
lの0.5M酢酸でホモジナイズし、3,000×gで
20分間遠心分離した。沈殿は同様にホモジナイズ後遠
心分離する操作を3回繰り返し、得られた上清を孔径
0.45μmのフィルターで濾過して、粗抽出液を得
た。
lの0.5M酢酸でホモジナイズし、3,000×gで
20分間遠心分離した。沈殿は同様にホモジナイズ後遠
心分離する操作を3回繰り返し、得られた上清を孔径
0.45μmのフィルターで濾過して、粗抽出液を得
た。
【0014】b.逆相カラムクロマトグラフィー(1) a.で得られた粗抽出液の原料換算60mg分を1バッ
チとして、Capcell pak C18 SG−1
20(資生堂,φ10×250mm)を用いたC−18
逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速3
ml/minで、0.1%TFA(pH2.2)中、1
02分間で0%から45%のアセトニトリルの直線濃度
勾配で溶出した。230nmのUV吸収でモニターしな
がら、ピークを示す画分を36フラクションを分画し、
C57/Bl6雄性マウスを用いる生物検定により、保
持時間47分および50分に溶出される2個の活性画分
を得た。
チとして、Capcell pak C18 SG−1
20(資生堂,φ10×250mm)を用いたC−18
逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速3
ml/minで、0.1%TFA(pH2.2)中、1
02分間で0%から45%のアセトニトリルの直線濃度
勾配で溶出した。230nmのUV吸収でモニターしな
がら、ピークを示す画分を36フラクションを分画し、
C57/Bl6雄性マウスを用いる生物検定により、保
持時間47分および50分に溶出される2個の活性画分
を得た。
【0015】c.陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー b.で得られた保持時間47分の画分を、をTSK−g
el SP−5PW(東ソー,φ7.5×75mm)を
用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、
流速0.5ml/minで、10mMリン酸ナトリウム
緩衝液(pH6.8)中、80分間で0Mから0.8M
のNaClの直線濃度勾配で溶出した。230nmのU
V吸収でモニターしながら分画し、生物検定により、N
aCl濃度580mMで溶出される活性画分を得た。
ー b.で得られた保持時間47分の画分を、をTSK−g
el SP−5PW(東ソー,φ7.5×75mm)を
用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、
流速0.5ml/minで、10mMリン酸ナトリウム
緩衝液(pH6.8)中、80分間で0Mから0.8M
のNaClの直線濃度勾配で溶出した。230nmのU
V吸収でモニターしながら分画し、生物検定により、N
aCl濃度580mMで溶出される活性画分を得た。
【0016】d.逆相カラムクロマトグラフィー(2) c.で得られた活性画分を、100A C18逆相HP
LCカラム(メルク,φ4×125mm)を用いるC−
18逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流
速1.0ml/minで、0.1%TFA(pH2.
2)中、40分間で0%から40%のアセトニトリルの
直線濃度勾配で、230nmのUV吸収でモニターしな
がら溶出した。SV1は保持時間27.3分の箇所にシ
ングルピークとして溶出された。この分画を集めて凍結
乾燥し、1mgのSV1を得た。
LCカラム(メルク,φ4×125mm)を用いるC−
18逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流
速1.0ml/minで、0.1%TFA(pH2.
2)中、40分間で0%から40%のアセトニトリルの
直線濃度勾配で、230nmのUV吸収でモニターしな
がら溶出した。SV1は保持時間27.3分の箇所にシ
ングルピークとして溶出された。この分画を集めて凍結
乾燥し、1mgのSV1を得た。
【0017】実施例2.中国産サソリからSV2の精製 実施例1のステップb.で得られた保持時間50分の画
分を、実施例1のステップc.と同様にTSK−gel
SP−5PW(東ソー,φ7.5×75mm)を用い
る陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製し、N
aCl濃度600mMで溶出される活性画分を得た。こ
の画分を、実施例1のステップd.と同様に100A
C18逆相HPLCカラム(メルク,φ4×125m
m)を用いるC−18逆相高速液体カラムクロマトグラ
フィーで精製し、保持時間29.2分の箇所にシングル
ピークとして溶出された分画を集めて凍結乾燥して、
0.8mgのSV2を得た。
分を、実施例1のステップc.と同様にTSK−gel
SP−5PW(東ソー,φ7.5×75mm)を用い
る陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製し、N
aCl濃度600mMで溶出される活性画分を得た。こ
の画分を、実施例1のステップd.と同様に100A
C18逆相HPLCカラム(メルク,φ4×125m
m)を用いるC−18逆相高速液体カラムクロマトグラ
フィーで精製し、保持時間29.2分の箇所にシングル
ピークとして溶出された分画を集めて凍結乾燥して、
0.8mgのSV2を得た。
【0018】実施例3.1次構造の同定 a.アミノ酸組成の測定 SV1およびSV2をそれぞれ、減圧下封管中に定沸点
6N−HClを用いて110℃,20時間処理して加水
分解し、アミノ酸分析器によりアミノ酸組成を求めた。
結果を〔表1〕に示す。
6N−HClを用いて110℃,20時間処理して加水
分解し、アミノ酸分析器によりアミノ酸組成を求めた。
結果を〔表1〕に示す。
【0019】
【表1】 表1 SV1およびSV2のアミノ酸組成 ---------------------------------------- アミノ酸残基 SV1 SV2 ---------------------------------------- Asx 2.7 (3) 1.9 (2) Glx 2.9 (3) 2.1 (2) Ser 2.0 (2) 5.6 (6) Gly 4.2 (4) 2.2 (2) Thr 2.0 (2) 2.0 (2) Ala − 1.1 (1) Pro 2.2 (2) 1.0 (1) Arg 1.1 (1) 2.0 (2) Tyr 0.9 (1) 1.8 (2) Val 2.0 (2) 2.0 (2) Met 2.0 (2) 1.0 (1) Leu − 1.2 (1) Phe 1.9 (2) 1.9 (2) Lys 5.6 (6) 3.7 (4) ---------------------------------------- 単位はpmolで示し、 ( )の数字は計算された残基数を示す。
【0020】b.アミノ酸組成の測定 常法に従って還元およびS−カルボキシメチル化したS
V1およびSV2は、通常のエドマン分解に抵抗性であ
ったので、ギムネ・ガレゴら(Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 85巻 3329−3333
頁,1988年)の方法で、ピログルタミン酸アミノペ
プチダーゼ処理を行った。得られたペプチドをアミノ酸
シーケンサーにより分析し、SV−1からは、
V1およびSV2は、通常のエドマン分解に抵抗性であ
ったので、ギムネ・ガレゴら(Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 85巻 3329−3333
頁,1988年)の方法で、ピログルタミン酸アミノペ
プチダーゼ処理を行った。得られたペプチドをアミノ酸
シーケンサーにより分析し、SV−1からは、
【0021】Glu-Phe-Thr-Asp-Val-Lys-Cys-Thr-Gly-Se
r-Lys-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys-Lys-Gln-Met-Phe-Gly-
Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met
r-Lys-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys-Lys-Gln-Met-Phe-Gly-
Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met
【0022】のN末端側の配列が同定された(但し、配
列中Cysは、S−カルボキシメチル化Cysとして同
定した)。さらに、SV1からは、ロミらの方法(J.
Biol.,Chem.,268巻 35号 2630
2−26309頁,1993年)によりCNBr分解す
ることにより、
列中Cysは、S−カルボキシメチル化Cysとして同
定した)。さらに、SV1からは、ロミらの方法(J.
Biol.,Chem.,268巻 35号 2630
2−26309頁,1993年)によりCNBr分解す
ることにより、
【0023】Phe-Gly-Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met-As
n-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser および
n-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser および
【0024】Asn-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser
【0025】のC末端部分の構造を確認した。また、S
V1は、MS−MALDI−TOFによる質量値、41
69.1Daを示した。このことは、分子内に3箇所の
ジスルフィド結合を有するとして、アミノ酸配列から計
算した質量値である4185.9Daより16Da少な
く、SV1は配列番号1で示されるペプチドであること
が判明した。また、同様にSV2からは、同様の処理に
より、
V1は、MS−MALDI−TOFによる質量値、41
69.1Daを示した。このことは、分子内に3箇所の
ジスルフィド結合を有するとして、アミノ酸配列から計
算した質量値である4185.9Daより16Da少な
く、SV1は配列番号1で示されるペプチドであること
が判明した。また、同様にSV2からは、同様の処理に
より、
【0026】Phe-Thr-Asn-Val-Ser-Cys-Ser-Ala-Ser-Se
r-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys-Lys-Lys-Leu-Phe-Gly-Thr
r-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys-Lys-Lys-Leu-Phe-Gly-Thr
【0027】のN末端側配列が同定された(但し、配列
中Cysは、S−カルボキシメチル化Cysとして同定
した)。さらに、SV2のLys−Cプロテアーゼ(Ac
hromobactor 由来)による分解では、
中Cysは、S−カルボキシメチル化Cysとして同定
した)。さらに、SV2のLys−Cプロテアーゼ(Ac
hromobactor 由来)による分解では、
【0028】Leu-Phe-Gly-Thr-Tyr-Arg-Gly-Lys の部
分構造、
分構造、
【0029】Cys-Met-Asn-Ser-Lys の部分構造およ
び、
び、
【0030】Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser
【0031】のC末端部分の構造を確認した。また、未
処理のSV2は、MS−MALDI−TOFによる質量
値、4177.2Daを示した。このことは、分子内に
3箇所のジスルフィド結合を有するとして、アミノ酸配
列から計算した質量値である4193.7Daより16
Da少なく、SV2は配列番号2で示されるペプチドで
あることが判明した。
処理のSV2は、MS−MALDI−TOFによる質量
値、4177.2Daを示した。このことは、分子内に
3箇所のジスルフィド結合を有するとして、アミノ酸配
列から計算した質量値である4193.7Daより16
Da少なく、SV2は配列番号2で示されるペプチドで
あることが判明した。
【0032】実施例4.固相法によるペプチドの合成 ペプチドの合成は、Fmoc−Ser(tBu)樹脂
(パーキン・エルマー社製)を担体とし、パーキン・エ
ルマー・ジャパン社の全自動ペプチド合成機433A型
を用いて、FastMocTM(パーキン・エルマー・ジ
ャパン社)の固相法により合成した。(但し、tBu=
t−Butylを示す。)
(パーキン・エルマー社製)を担体とし、パーキン・エ
ルマー・ジャパン社の全自動ペプチド合成機433A型
を用いて、FastMocTM(パーキン・エルマー・ジ
ャパン社)の固相法により合成した。(但し、tBu=
t−Butylを示す。)
【0033】ペプチド樹脂からのペプチドの切り放しと
粗ペプチドの脱保護は、TFA/チオアニソール/1,
2−エタンジオール(90/5/5,v/v)混合液
を、ペプチド樹脂1mg当たり10ml加えた後、室温
で2.5時間処理することにより行った。反応液を濾過
し、濾液にエーテルを加えてペプチドを沈澱させた後、
沈澱をエーテルで3回洗浄した。次いで得られた沈殿を
TFAに再溶解し、再びエーテルで沈澱させて粗ペプチ
ドを得た。
粗ペプチドの脱保護は、TFA/チオアニソール/1,
2−エタンジオール(90/5/5,v/v)混合液
を、ペプチド樹脂1mg当たり10ml加えた後、室温
で2.5時間処理することにより行った。反応液を濾過
し、濾液にエーテルを加えてペプチドを沈澱させた後、
沈澱をエーテルで3回洗浄した。次いで得られた沈殿を
TFAに再溶解し、再びエーテルで沈澱させて粗ペプチ
ドを得た。
【0034】得られた粗ペプチドは、蒸留水に1.7m
Mの濃度に溶解し、室温で48時間空気酸化して、分子
内にジスルフィド結合を導入した後、SV1については
実施例1のステップd.,SV2については実施例2の
最終ステップのC−18HPLCと同様の方法で精製
し、合成ペプチドを得た。
Mの濃度に溶解し、室温で48時間空気酸化して、分子
内にジスルフィド結合を導入した後、SV1については
実施例1のステップd.,SV2については実施例2の
最終ステップのC−18HPLCと同様の方法で精製
し、合成ペプチドを得た。
【0035】合成ペプチドは、上記C−18HPLC
で、天然品と同一の保持時間を示し、天然品と同一のア
ミノ酸組成および分子量を示した。また、合成ペプチド
と天然品との混合物は、上記C−18HPLCで、天然
品と同一の保持時間の箇所にシングルピークを与えた。
さらに、合成ペプチドは、天然品と同一の生理活性を示
した。これらのことから、SV1およびSV2はそれぞ
れ配列表1および2に示すアミノ酸配列を有するペプチ
ドであることが明らかである。
で、天然品と同一の保持時間を示し、天然品と同一のア
ミノ酸組成および分子量を示した。また、合成ペプチド
と天然品との混合物は、上記C−18HPLCで、天然
品と同一の保持時間の箇所にシングルピークを与えた。
さらに、合成ペプチドは、天然品と同一の生理活性を示
した。これらのことから、SV1およびSV2はそれぞ
れ配列表1および2に示すアミノ酸配列を有するペプチ
ドであることが明らかである。
【0036】評価例1.ネズミに対する毒性試験 本発明のペプチドのネズミに対する毒性試験は、Mar
tinら(J.Biol.Chem.262巻 445
2−4459頁 1987年)の方法に準じて実施し
た。すなわち、体重20±3gのC57/B16雄性マ
ウスを用い、0.1%のウシ血清アルブミン(BSA)
を含む、種々の濃度の試料溶液を5μl/マウスを大脳
脳室内に投与し、神経興奮により惹起される神経毒の症
状を観察した。マウスの致死率から計算したSV1およ
びSV2のLD50は、20〜50ng/マウスであり、
この値は、モロッコ産サソリから単離されたKTX
(R.Romiら,J.Biol.Chem.文献前
出)の値とほぼ同様であった。このKTXについては、
本発明者らによって、K+ チャンネル ブロッカー活性
を有することが確認されており(文献前出)、本発明の
ペプチドであるSV1およびSV2も、投与時の神経毒
の症状およびLD50値から、K+ チャンネルに対して、
何らかの作用を有すると考えられる。
tinら(J.Biol.Chem.262巻 445
2−4459頁 1987年)の方法に準じて実施し
た。すなわち、体重20±3gのC57/B16雄性マ
ウスを用い、0.1%のウシ血清アルブミン(BSA)
を含む、種々の濃度の試料溶液を5μl/マウスを大脳
脳室内に投与し、神経興奮により惹起される神経毒の症
状を観察した。マウスの致死率から計算したSV1およ
びSV2のLD50は、20〜50ng/マウスであり、
この値は、モロッコ産サソリから単離されたKTX
(R.Romiら,J.Biol.Chem.文献前
出)の値とほぼ同様であった。このKTXについては、
本発明者らによって、K+ チャンネル ブロッカー活性
を有することが確認されており(文献前出)、本発明の
ペプチドであるSV1およびSV2も、投与時の神経毒
の症状およびLD50値から、K+ チャンネルに対して、
何らかの作用を有すると考えられる。
【0037】
【発明の効果】本発明によれば、配列番号1および配列
番号2で示されるペプチドを、サソリ毒素ペプチドとし
て提供することができる。これらのペプチドは、評価例
に示すように、C57/B16雄性マウスに対して、す
でに報告されている毒素と同程度の活性を示し、新たな
一次構造を有するサソリ毒素ペプチドである。従って、
本発明のペプチドは、神経生理学における生化学試薬と
して有用であるばかりか、サソリ毒素ペプチドの医薬、
動物薬としての応用に繋がるものである。
番号2で示されるペプチドを、サソリ毒素ペプチドとし
て提供することができる。これらのペプチドは、評価例
に示すように、C57/B16雄性マウスに対して、す
でに報告されている毒素と同程度の活性を示し、新たな
一次構造を有するサソリ毒素ペプチドである。従って、
本発明のペプチドは、神経生理学における生化学試薬と
して有用であるばかりか、サソリ毒素ペプチドの医薬、
動物薬としての応用に繋がるものである。
【0038】
【0039】配列番号:1 配列の長さ:37 配列の型:アミノ酸 配列の種類:ペプチド 起源: 生物名:中国産サソリ(Buthus martens
i) 配列の特徴: E−disulfide−bonds 3箇所 E−N末端ピログルタミル化 配列: Glu Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 37
i) 配列の特徴: E−disulfide−bonds 3箇所 E−N末端ピログルタミル化 配列: Glu Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 37
【0040】配列番号:2 配列の長さ:37 配列の型:アミノ酸 配列の種類:ペプチド 起源: 生物名:中国産サソリ(Buthus martens
i) 配列の特徴: E−disulfide−bonds 3箇所 E−N末端ピログルタミル化 配列: Glu Phe Thr Asn Val Ser Cys Ser Ala Ser Ser Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Lys Leu Phe Gly Thr Tyr Arg Gly Lys Cys Met Asn Ser Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 37
i) 配列の特徴: E−disulfide−bonds 3箇所 E−N末端ピログルタミル化 配列: Glu Phe Thr Asn Val Ser Cys Ser Ala Ser Ser Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Lys Leu Phe Gly Thr Tyr Arg Gly Lys Cys Met Asn Ser Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 37
フロントページの続き (72)発明者 中嶋 暉躬 大阪府三島郡島本町若山台1丁目1番1号 財団法人サントリー生物有機科学研究所 内
Claims (2)
- 【請求項1】次のアミノ酸配列式(1): PyrGlu-Phe-Thr-Asp-Val-Lys-Cys-Thr-Gly-Ser-Lys-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys- Lys-Gln-Met-Phe-Gly-Lys-Pro-Asn-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Gly-Lys-Cys-Arg-Cys- Tyr-Ser-OH (1) (式中、 PyrGlu-はピログルタミン酸残基を表す)で表
され、分子内に3箇所までのジスルフィド結合を有して
もよいペプチド。 - 【請求項2】次のアミノ酸配列式(2): PyrGlu-Phe-Thr-Asn-Val-Ser-Cys-Ser-Ala-Ser-Ser-Gln-Cys-Trp-Pro-Val-Cys- Lys-Lys-Leu-Phe-Gly-Thr-Tyr-Arg-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Ser-Lys-Cys-Arg-Cys- Tyr-Ser-OH (2) (式中、 PyrGlu-はピログルタミン酸残基を表す)で表
され、分子内に3箇所までのジスルフィド結合を有して
もよいペプチド。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP05729296A JP3776968B2 (ja) | 1996-03-14 | 1996-03-14 | ペプチド性サソリ毒素 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP05729296A JP3776968B2 (ja) | 1996-03-14 | 1996-03-14 | ペプチド性サソリ毒素 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09249696A true JPH09249696A (ja) | 1997-09-22 |
JP3776968B2 JP3776968B2 (ja) | 2006-05-24 |
Family
ID=13051487
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP05729296A Expired - Fee Related JP3776968B2 (ja) | 1996-03-14 | 1996-03-14 | ペプチド性サソリ毒素 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3776968B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100377741C (zh) * | 2004-02-23 | 2008-04-02 | 江卫世 | 注射用复方骨肽及其制备工艺 |
CN107501403A (zh) * | 2017-10-09 | 2017-12-22 | 南京图艾生物医药科技有限公司 | 一种蝎毒素的提取和纯化工艺 |
-
1996
- 1996-03-14 JP JP05729296A patent/JP3776968B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN107501403A (zh) * | 2017-10-09 | 2017-12-22 | 南京图艾生物医药科技有限公司 | 一种蝎毒素的提取和纯化工艺 |
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---|---|
JP3776968B2 (ja) | 2006-05-24 |
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