JP2017513833A

JP2017513833A - Ｖｉｉ型コラーゲンフィブロネクチンｉｉｉ型様リピートを有するポリペプチド組成物ならびに創傷の閉鎖および治癒のための治療方法

Info

Publication number: JP2017513833A
Application number: JP2016561745A
Authority: JP
Inventors: チェン、メイ; ウッドレイ、デイビッド・ティー．
Original assignee: ユニヴァーシティーオブサザンカリフォルニア
Priority date: 2014-04-08
Filing date: 2015-04-08
Publication date: 2017-06-01
Also published as: AU2015243535A1; WO2015157469A3; US20170015730A1; WO2015157469A9; US10227394B2; EP3129043A2; US20190256575A1; EP3129043A4; CA2945325A1; WO2015157469A2

Abstract

創傷閉鎖を速め、瘢痕化または線維症を予防、抑制、または軽減するための組成物および方法が開示される。本発明のこれらの方法は、コラーゲン７および／または１つ以上のその機能的断片もしくは変異体を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする人に投与することを含む。機能的断片は、コラーゲン７のＮＣ１領域の９個のフィブロネクチンＩＩＩ型様領域の内の少なくとも１つを通常含む。

Description

背景

連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金第ＲＯ１ＡＲ４７９８１号およびＡＲ３３６２５号のもとで、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

関連出願
本出願は、２０１４年５月６日に出願された米国仮出願第６１／９８９，３９９号、２０１４年４月１５日に出願された米国仮出願第６１／９７９，９１９号、および２０１４年４月８日に出願された米国仮出願第６１／９７７，０６５号の優先権を主張するものであり、これらの内容全体は参照によりここにそのまま組み込まれる。

技術的背景
ＶＩＩ型コラーゲン（コラーゲン７）は、係留線維、すなわち、ヒト皮膚の表皮と真皮の間の基底膜部（ＢＭＺ）内の接着構造物の主成分である。コラーゲン７遺伝子の遺伝的欠陥は、栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）、すなわち、全身の水疱形成および皮膚脆弱性の特徴を示す疾患を招く。

コラーゲン７は、３本の同一のα鎖から構成され、各α鎖は、１４５ｋＤａの中央のコラーゲン三重らせんセグメント（ＴＨ）、それに隣接するアミノ末端の１４５ｋＤａの大型球状非コラーゲンドメイン（ＮＣ１）、およびカルボキシル末端の３４ｋＤａの小型非コラーゲンドメイン（ＮＣ２）からなる。ＮＣ１の配列解析により、公知の接着性分子、たとえば、軟骨基質タンパク質（ＣＭＰ）、９個のフィブロネクチンＩＩＩ型様リピート（ＦＮＩＩＩ）、およびフォンビルブランド因子のＡドメイン（ＶＷＦ−Ａ）と相同性がある複数のサブモジュールが明らかになっている。非常に接着性が高いＮＣ１ドメインは、他のＢＭＺおよび細胞外基質成分（ＥＣＭ）へのコラーゲン７の結合を促進することができる。これらの結合は、コラーゲン７分子の集合体および真皮へのＢＭＺの接着を安定させ得る。したがって、コラーゲン７の構造変化は、ＥＣＭ成分との相互作用における機能の混乱、およびＤＥＢで認められるような表皮と真皮の接着障害（disadherance）をもたらす可能性が高い。

ＴＧＦ−βは、様々なＥＣＭタンパク質、たとえば、フィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、およびテネイシン、ならびにいくつかの小型の間質プロテオグリカン、たとえば、ビグリカン、デコリン、およびフィブロモジュリンに結合することが示されている。この基質結合は、ＴＧＦ−βを細胞外基質中に隔離し、その線維化特性を抑制することによって、ＴＧＦ−β活性を調節し得る。フィブロネクチンおよびテネイシン内部のフィブロネクチンＩＩＩ型様リピート（ＦＮＩＩ）は、ＴＧＦβへのそれらの結合を担っている。

図１４Ａおよび１４Ｂに示すように、ＲＤＥＢ患者は、特徴的な重度の瘢痕および線維性のミトン奇形をしばしば患う。進行性で通常は致死的な皮膚癌が、瘢痕および慢性創傷の領域で発症し、患者の命を頻繁に奪った。これらの子供は、異常なＶＩＩ型コラーゲン、すなわち係留線維の主成分を生じさせる遺伝子欠陥をＣＯＬＡ１遺伝子中に有している。図１４Ｃの正常なヒト皮膚の電子顕微鏡写真のように、これらは、真皮と表皮の接合部に位置する大きな構造物であり、表皮と真皮を結合させる働きをする。図１４ＤのＲＤＥＢ皮膚の電子顕微鏡写真は、係留線維の不足および表皮と真皮の明らかな分離を示している。

概要

ＶＩＩ型コラーゲン（コラーゲン７）は、係留線維構造物を形成し、皮膚の表皮と真皮を互いに接着させる、皮膚中のコラーゲンであるとかつては考えられていた。本発明者らは、皮膚創傷の治癒にあたってのＶＩＩ型コラーゲンは、係留線維構造物に限定されず、むしろ、新生真皮中に散らばって分布し、そこで、創傷閉鎖を促進し、創傷の瘢痕化を抑制することを発見した。

本発明の１つの側面は、コラーゲン７が、ＴＧＦ−β１に結合し、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の線維形成促進活性を阻害することによって、皮膚瘢痕化を予防するという知見である。さらに、本発明者らのデータから、臨床瘢痕と相関するｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおけるコラーゲン格子の収縮を、コラーゲン７が抑制することが示される。これらの知見は、過大なＴＧＦ−β活性が、たとえば劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）および肥厚性熱傷瘢痕において瘢痕化および線維症を引き起こす場合に、コラーゲン７またはその機能的断片を治療的に使用するための分子的基盤を提供する。

コラーゲン７、ここで定義されるその機能的断片、および変異体の投与を含む本発明による治療方法は、（ｉ）創傷閉鎖を速めること、または（ｉｉ）瘢痕化もしくは線維症を予防、抑制、もしくは軽減することの何れかが臨床的に望ましい場合に、通常、使用されてもよい。理論に限定されるものではないが、これらの効果は、ＴＧＦ−βに結合しＴＧＦ−βの線維形成促進活性を低下させることが少なくとも一因となって、達成されると考えられている。

本発明の１つの態様は、瘢痕化もしくは線維症を発症するリスクを有する、創傷閉鎖を速める必要がある対象を治療する際に、または既存の瘢痕もしくは線維症の治療と一緒に、使用するための、コラーゲン７、またはここで定義されるその機能的断片もしくは変異体、および１種以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象とする。この態様による治療方法は、有効量のＣ７および／または１つ以上のその機能的断片もしくは変異体を、それを必要とする患者に投与することを含む。

１つの態様において、治療される対象は、栄養障害型表皮水疱症（ＥＢ）に罹患している人であり、この疾患は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子、すなわち、タンパク質コラーゲン７をコードする遺伝子の変異が原因で起こる。この態様において、それは、好ましくは、局所的に投与される。別の態様において、治療される対象は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子に変異がない対象、たとえばヒト、すなわち、ＥＢに罹患していない人である。皮膚のケロイドおよび肥厚性瘢痕、腱癒着、神経損傷後の伝達遮断、強皮症、クローン病、食道狭窄、尿道狭窄、人工乳房の周囲の被膜、肝硬変、アテローム性動脈硬化症、および骨での線維性偽関節を含めて、多数の臨床的適応症が、ＥＢに罹患していない人における瘢痕化および線維症に関連している。肥厚性瘢痕またはケロイドは、たとえば、熱傷、外科手術、およびざ瘡を含む外傷の結果として、形成される場合がある。ＥＢに罹患している人も、これらの同じ臨床的適応症に起因する線維症または瘢痕化のリスクを有する場合があり、コラーゲン７を用いる治療がＥＢに対する個別の治療として適応されない場合でさえ、本発明による治療の恩恵を同様に受ける可能性があることに、注目すべきである。

本発明の別の側面は、コラーゲン７の機能的断片およびその変異体、好ましくは、単離された機能的断片およびその変異体、ならびに医薬組成物、ならびにそれに基づく治療方法を対象とする。ここで使用される場合、コラーゲン７の機能的断片とは、ＴＧＦ−β１に結合し、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の線維形成促進活性を阻害する能力を維持しているが、コラーゲン７の２，９４４個のアミノ酸残基全体は含まない、コラーゲン７の一部分を意味する。任意に、機能的断片は、ヒト皮膚の表皮層と表皮層の間の係留線維を形成する能力は保持しないが、それでもなお、ＴＧＦ−β１に結合し、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の線維形成促進活性を阻害する能力を維持するように、大きさを調整され、構築されてもよい。

機能的断片は、医薬組成物として調製され、選択された機能的断片および／またはその変異体の投与に基づく治療方法と一緒に使用されてもよい。ここで説明するように、これらの方法には、選択された機能的断片および／またはその変異体を含む有効量の医薬組成物を投与することによって、創傷閉鎖を速めるか、または線維症および／もしくは瘢痕化を抑制もしくは軽減するための方法が含まれる。

本発明の機能的断片は、コラーゲン７のＮＣ１領域の９個のフィブロネクチンＩＩＩ型様リピート（「ＦＮＩＩＩ」）の内の少なくとも１つを通常含む。１つの態様において、機能的断片は、コラーゲン７のＮＣ１ドメインのすべてを含む。すなわち、それは、非コラーゲンＮＣ１ドメイン全体（すなわち、成熟ペプチドの残基１７〜１２５３）を含む。したがって、本発明の１つの態様は、ＮＣ１領域全体またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。

別の態様において、機能的断片は、ＦＮＩＩＩ領域１、ＦＮＩＩＩ領域５、およびＦＮＩＩＩ領域６の内の少なくとも１つを含むポリペプチドである。したがって、本発明の１つの態様は、ＦＮＩＩＩ領域１またはその変異体に対応するアミノ酸配列、ならびに任意に、ＦＮＩＩＩ領域５および／もしくはＦＮＩＩＩ領域６またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。

本発明の別の態様は、ＦＮＩＩＩ領域５またはその変異体に対応するアミノ酸配列、および任意に、ＦＮＩＩＩ領域６またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。本発明の別の態様は、ＦＮＩＩＩ領域６またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。

本発明の別の態様は、ＰＣＲ１またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。

本発明の別の態様は、ＰＣＲ２またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。

本発明の別の態様は、ＰＣＲ３またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。

本発明の別の態様は、ＰｐｕＭＩまたはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。

本発明の別の態様は、ＦＰ１５またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。

本発明の別の態様は、ＦＰ１６またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。

図１は、プロα１（ＶＩＩ）鎖のドメイン構成およびコラーゲン７分子の係留線維へのアセンブリーの概略図を示す。ＶＩＩ型コラーゲンは、３本の同一のα鎖からなり、それらがホモ三量体を形成する。２つのＣ７分子が、カルボキシ末端同士の位置が合うように並んで逆平行二量体を形成し、次いで、横方向に集合して係留線維を形成する。図２は、コラーゲン７およびＮＣ１中の増殖因子結合部位の同定を示す。図３は、３種のＴＧＦ−βアイソフォームすべてに対するコラーゲン７およびＮＣ１の用量依存的結合を示す。図４は、ＮＣ１のサブドメインを含む細菌融合タンパク質の概略図を示す。図５は、ＦＮＩＩＩのサブドメインがＴＧＦ−βへのＮＣ１の結合を媒介することを示す。固相リガンド結合アッセイを用いて、ＴＧＦ−βの３種のアイソフォームすべてに対する組換え融合タンパク質の結合を測定した。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３、またはＢＳＡをＥＬＩＳＡプレートに加え、図に示した融合タンパク質と共に室温で２時間インキュベートした。アフィニティー精製したポリクローナル抗ＧＳＴ抗体（１：２０００）、続いて、アルカリホスファート（alkaline phosphate）を結合させた二次抗体（１：３００）を用いて、結合を検出した。ＰＣＲ３およびＰＣＲ２は３種のＴＧＦ−βアイソフォームすべてに対して顕著な親和性を有していたのに対して、他の断片はどれも、ほとんど結合活性を示さなかったことに注目されたい。図６は、３種のＴＧＦ−βアイソフォームすべてに対するＮＣ１サブドメインの用量依存的結合を示す。図７は、ＰＣＲ３およびＰＣＲ２の内部の細菌融合タンパク質の概略図である。図８は、ＦＮＩＩＩのサブドメインがＴＧＦ−βへのＮＣ１の結合を媒介することを示す。図９は、３種のＴＧＦ−βすべてに対するＰＣＲ３およびＰＣＲ２サブドメインの用量依存的結合を示す。図１０は、コラーゲン７およびサブドメインへのＴＧＦ−β１結合が温度感受性であることを示す。図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｃ７の方がフィブロネクチンよりも強くＴＧＦ−βに結合することを示す。フィブロネクチンも、ＴＧＦβアイソフォームに結合することが公知である。図１１に示すように、本発明者らは、ＴＧＦβアイソフォームおよび増殖因子ＰＤＦＧ−ＢＢへのフィブロネクチンおよびｒＣ７の結合を比較した。Ｃ７およびＮＣ１の方がフィブロネクチンよりも有意に強く、ＴＧＦβ１および２に結合することに注目して頂きたい。ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合については、Ｃ７とフィブロネクチンとの間に有意な差異はない。図１１Ｂは、本実験で使用された精製組換えＮＣ１、フィブロネクチン、およびＣ７のクーマシーブルー染色した６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥスラブゲルを示す。同上図１２Ａおよび１２Ｂは、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２へのＣ７およびＮＣ１の結合能力が、温度を上げても保持されることを示す。タンパク質とタンパク質の結合相互作用の強さの１つの指標は、高温でのそれらの親和性の持続である。本実験において、Ｃ７またはＮＣ１を、２０、４５、６５、および１００で５分間プレインキュベートし、次いで、それらを結合アッセイに加えた。図１２Ａおよび１２Ｂに示すように、ｒＣ７およびＮＣ１は、６５度ほどの高さの温度ではＴＧＦ−β１および２に結合する能力を保持しているが、１００度に加熱すると活性を失う。同上図１３Ａおよび１３Ｂは、ＴＧＦ−βアイソフォームがＮＣ１への結合を得るために競合することを示す。図１３Ａに示すように、本発明者らは、組換えＮＣ１を各ＴＧＦβアイソフォームと混合し、次いで、抗ＮＣ１抗体を用いる免疫沈降を実施した。次に、本発明者らは、その沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流し、各ＴＧＦβアイソフォームに対する抗体を用いる免疫ブロットを実施した。抗原対抗原ＥＬＩＳＡのデータと一致して、免疫沈降により、ＮＣ１は３種のＴＧＦ−βアイソフォームすべてに結合することに注目して頂きたい。下側のパネルの実験において、本発明者らは、抗原対抗原ＥＬＩＳＡ競合アッセイによって、ＮＣ１が３種のＴＧＦ−βアイソフォームすべてに対して同じ結合部位を利用するかを検査した。ＴＧＦβ１へのＮＣ１の結合が、１０倍過剰量のＴＧＦ−β２およびβ３が存在することによって、それぞれ５０％および９０％阻害されたことに注目して頂きたい。これらのデータから、３種のＴＧＦ−βアイソフォームがＮＣ１の同じ部位に結合することが示される。同上図１４Ａおよび１４Ｂは、ＲＤＥＢ患者が重度の瘢痕、拘縮、およびミトン奇形を患うことを示す。図１４Ａおよび１４Ｂは、ＲＤＥＢ患者の特徴である重度の瘢痕および線維性のミトン奇形である。進行性で通常は致死的な皮膚癌が、瘢痕および慢性創傷の領域で発症し、患者の命を頻繁に奪った。これらの子供は、異常なＶＩＩ型コラーゲン、すなわち係留線維の主成分を生じさせる遺伝子欠陥をＣＯＬＡ１遺伝子中に有している。図１４Ｃは、正常なヒト皮膚の電子顕微鏡写真であり、これらは、真皮と表皮の接合部に位置する大きな構造物であり、表皮と真皮を結合させる働きをすることを示している。図１４Ｄの電子顕微鏡写真は、ＲＤＥＢ皮膚であり、係留線維の不足および表皮と真皮の明らかな分離を示している。同上同上同上図１５は、線維形成促進性アイソフォームであるＴＧＦ−β１および２に対する抗体ならびに皮膚瘢痕化の公知のマーカーに対する抗体を用いた、ＲＤＥＢ患者２名に由来する皮膚生検材料のＩＦ染色を示す。正常な皮膚と比べて、ＲＤＥＢ患者の皮膚の方が、何れも線維症および瘢痕化のマーカーである、ＴＧＦβ１、β２、ｐ−Ｓｍａｄ２／３（ＴＧＦβシグナル伝達の下流要素）、Ｉ型コラーゲン、テネイシン、フィブロネクチン、およびＣＴＧＦの強い発現を示していることに注目されたい。図１６Ａおよび１６Ｂは、増殖因子（ＧＦ）の存在下および非存在下で、ＲＤＥＢ患者６名（ＰＴ１〜ＰＴ）に由来する線維芽細胞の収縮活性を正常ヒト対象由来の線維芽細胞と比較するための、ｉｎｖｉｔｒｏコラーゲン格子収縮アッセイを示す。ＲＤＥＢ線維芽細胞の方が、正常線維芽細胞と比べて、強い収縮活性を示したことに注目されたい。ＲＤＥＢ線維芽細胞は、増殖因子の非存在下でさえ、過剰収縮活性を示した。これらのデータから、単離されたＲＤＥＢ線維芽細胞が、正常線維芽細胞より大きなコラーゲン格子収縮能力を培養状態で保持していることが実証される。同上図１７Ａおよび１７Ｂは、組換えＶＩＩ型コラーゲンの存在により、ＲＤＥＢ線維芽細胞がコラーゲン格子を過剰収縮させる能力をＲＤＥＢ患者において抑制できたことを示す。図１７Ｂに示すように、コラーゲン格子収縮アッセイに組換えＣ７を加えると、ＲＤＥＢ線維芽細胞の増殖因子誘発性収縮だけでなく、基礎収縮も抑制された。同上

発明の詳細な説明

いくつかの用語を最初に定義する。追加の用語は、本明細書の全体にわたって定義する。

ここで使用される場合、「長期投与」とは、一定期間にわたる、複数用量の作用物質の投与を意味する。長期投与は、長期間にわたる規則的な投与を含んでもよい。また、長期投与は、治療用作用物質の濃度が、治療期間の間ずっと、治療的または予防的に有効なレベルで維持されるように、長期間にわたる（場合によっては、対象の寿命が尽きるまでの）治療物質（therapy）の投与を含んでもよい。

コラーゲン７またはその機能的断片もしくは変異体の「有効量」とは、複数用量を長期にわたり徐々に与える様式で、または他の任意のタイプの所定の治療計画の一環として、投与された場合に、問題（complication）に関連付けられている少なくとも１つの臨床的パラメーターに基づいて証明されるような転帰の測定可能な統計学的改善をもたらす、コラーゲン７またはその機能的断片もしくは変異体の量を意味する。

「組換え」とは、タンパク質またはポリペプチド分子に関してここで使用される場合、単離核酸分子または組換え核酸分子を利用して発現させられるタンパク質またはポリペプチド分子に関連する。

「単離」タンパク質とは、単離タンパク質を得ることができる天然試料の少なくとも１種の成分の少なくとも９０％から分離されたタンパク質を意味する。タンパク質は、関心対象の化学種または化学種の集団が、重量基準で少なくとも５、１０、２５、５０、７５、８０、９０、９２、９５、９８、または９９％純粋である場合、「少なくとも」ある程度純粋であり得る。

ここで同義的に使用される用語「タンパク質」および「ポリペプチド」。

対象の疾患を「予防すること」という用語は、疾患の少なくとも１つの症状が予防されるように、その対象を薬学的処置、たとえば薬物の投与に供すること、すなわち、望まれない状態（たとえば、宿主動物の疾患または他の望まれない状態）の臨床症状発現より前に投与され、その結果、それが、望まれない状態にならないように宿主を保護することを意味する。疾患を「予防すること」は、「予防」または「予防処置」と呼ばれてもよい。本開示において、瘢痕化の１種以上の症状が予防され得る。たとえば、ＥＢ（たとえば、ＤＥＢ、たとえば、ＲＤＥＢまたはＤＤＥＢ）の対象における瘢痕化は、次の症状の内の１種以上をもたらす場合がある：拘縮、たとえば（たとえば、四肢の）屈曲拘縮；偽合指症、たとえば、手の偽合指症および足の偽合指症；癌腫（たとえば、扁平上皮癌）；直腸病変；粘膜病変；水疱形成；手の外傷後の水疱形成；爪の変形；歯の変形；食道の狭窄；眼障害、貧血、栄養失調；二次的な皮膚感染症；敗血症；嗄声；尿道狭窄；包茎；角膜瘢痕化；吸収不良；ならびに成長障害。

対象を「治療すること」とは、疾患の少なくとも１つの症状が治癒するか、緩和されるか、または軽減されるように、その対象を薬学的処置、たとえば薬物の投与に供することを意味する。

「治療的有効量」とは、必要とされる投薬量および期間にて、所望の治療結果を達成するのに有効な量を意味する。組成物の治療的有効量は、因子、たとえば、個体の疾患の状態、年齢、性別、および体重、ならびにタンパク質が個体において所望の応答を誘発する能力に応じて変動してもよい。また、治療的有効量は、組成物の任意の毒性作用または有害作用を治療的に有益な作用が上回っている量でもある。

本発明の方法によって治療される「患者」、「対象」、または「宿主」（これらの用語は同義的に使用される）とは、ヒトまたは非ヒト動物の何れかを意味してもよい。

ここで説明される治療の何れも、別の作用物質または治療物質と組み合わせて投与すことができる。「組合せ」という用語は、同じ患者を治療するための２種以上の作用物質または治療物質の使用を意味し、その際、それらの作用物質または治療物質の使用または作用は時間的に重なっている。これらの作用物質または治療物質は、同時に（たとえば、患者に投与される単一の製剤として、もしくは同時に投与される２つの個別の製剤として）、または任意の順序で逐次的に、投与することができる。いくつかの態様において、１つの作用物質または治療物質の送達は、２番目の送達の開始時に引き続き起こっており、その結果、投与の観点からいえば重複がある。これは、「同時に起こる」または「同時送達」とここで呼ばれることがある。他の態様において、１つの作用物質または治療物質の送達は、他の物質の送達が始まる前に終わる。何れかの場合のいくつかの態様において、併用投与のおかげで、治療の有効性は高まる。たとえば、第２の治療薬は、第１の治療薬の非存在下で第２の治療薬が投与された場合に認められたであろうよりも有効性が高い、たとえば、より少量の第２の治療薬で同等の効果が認められるか、もしくは第２の治療薬が、より大幅に症状を軽減する、または類似した状況が第１の治療薬で認められる。いくつかの態様において、送達は、症状の軽減、または障害に関連する他のパラメーターが、一方の治療薬が他方の非存在下で送達される場合に観察されるであろうよりも、程度が大きくなるようなものである。２種の治療薬の作用は、ある程度相加的な場合も、完全に相加的な場合も、または相加されるより大きい場合もある。送達は、送達される第１の治療薬の作用が、第２の治療薬の送達時に引き続き検出可能であるようなものであってよい。

コラーゲン７およびその変異体
本発明の１つの側面は、コラーゲン７および／またはその変異体を含む医薬組成物ならびに７型コラーゲンおよび／またはその変異体の投与に基づく治療方法を対象とする。ここで説明するように、これらの方法には、コラーゲン７および／またはその変異体を含む有効量の医薬組成物を投与することによって、創傷閉鎖を速めるか、または線維症もしくは瘢痕化を抑制もしくは軽減するための方法が含まれる。

ここで使用される場合、「コラーゲン７」とは、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子にコードされる７型コラーゲンを意味する。コラーゲン７は、２，９４４個のアミノ酸からなる。これは、非コラーゲンＮＣ１ドメイン（成熟ペプチドの残基１７〜１２５３を含む）、中央のコラーゲンらせんドメイン（残基１２５４〜２７８３）、およびカルボキシル末端のＮＣ２ドメイン（残基２７８４〜２９４４）を含む。

コラーゲン７の変異体には、ヒト皮膚の表皮層と真皮層の間の係留線維を形成する能力を維持しているコラーゲン７の機能的断片との実質的な同一性を有するポリペプチドが含まれる。コラーゲン７変異体には、コラーゲン７と比べて化学的に改変されているか、かつ／またはコラーゲン７と比べて１つ以上のアミノ酸配列変化を含むかの何れかのコラーゲン７ポリペプチドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。

コラーゲン７の変異体には、ヒトコラーゲン７のアミノ酸配列（下記参照）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドが含まれる。２つの配列間の「同一性」または「配列相同性」（これらの用語は、ここで同義的に使用される）の計算は、以下のように実施する。最適に比較することを目的としてこれらの配列を整列させる（たとえば、最適なアライメントのために第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、かつ比較のために、非相同配列を無視することができる）。最適なアライメントは、ギャップペナルティを１２、ギャップ伸長ペナルティを４、およびフレームシフトギャップペナルティを５としてＢｌｏｓｓｕｍ６２スコア行列を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用することにより、最良のスコアとして決定する。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、これらの分子はその位置で同一である（ここで使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」に等しい）。２つの配列間の同一性パーセントは、これらの配列に共通である同一位置の数の関数である。

また、コラーゲン７の変異体には、コラーゲン７のアミノ酸配列（下記参照）からのアミノ酸改変（たとえば、欠失、付加、または置換、たとえば保存的置換）を有するポリペプチドも含まれる。たとえば、コラーゲン７の変異体は、コラーゲン７（下記参照）と少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、ただし５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１５個以下、または１０個以下のアミノ酸が異なってもよい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえられているものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（たとえば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。

ポリペプチド：コラーゲン７の機能的断片およびその変異体
本発明の１つの側面は、コラーゲン７の機能的断片およびその変異体、好ましくは、単離された機能的断片およびその変異体、ならびに医薬組成物、ならびにそれに基づく治療を対象とする。ここで使用される場合、コラーゲン７の機能的断片とは、ＴＧＦ−β１に結合し、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の線維形成促進活性を阻害する能力を維持しているが、コラーゲン７の２，９４４個のアミノ酸残基全体は含まない、コラーゲン７の一部分を意味する。任意に、機能的断片は、ヒト皮膚の表皮層と表皮層の間の係留線維を形成する能力は維持しないが、それでもなお、ＴＧＦ−β１に結合し、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の線維形成促進活性を阻害する能力を維持するように、大きさを調整され、構築されてもよい。

本発明の機能的断片は、医薬組成物として調製され、選択された機能的断片および／またはその変異体の投与に基づく治療方法と一緒に使用されてもよい。ここで説明するように、これらの方法には、選択された機能的断片および／またはその変異体を含む有効量の医薬組成物を投与することによって、創傷閉鎖を速めるか、または線維症および／もしくは瘢痕化を抑制もしくは軽減するための方法が含まれる。

本発明の機能的断片は、コラーゲン７のＮＣ１領域の９個のフィブロネクチンＩＩＩ型様リピート（「ＦＮＩＩＩ」）の内の少なくとも１つを通常含み、それらは、
フィブロネクチンＩＩＩ型領域１（残基２３３〜３２５）（「ＦＮＩＩＩ領域１」）
フィブロネクチンＩＩＩ型領域２（残基３３３〜４１３）（「ＦＮＩＩＩ領域２」）
フィブロネクチンＩＩＩ型領域３（残基４１９〜４９２）（「ＦＮＩＩＩ領域３」）
フィブロネクチンＩＩＩ型領域４（残基５０９〜５８７）（「ＦＮＩＩＩ領域４」）
フィブロネクチンＩＩＩ型領域５（残基５９８〜６８０）（「ＦＮＩＩＩ領域５」）
フィブロネクチンＩＩＩ型領域６（残基６８７〜７７１）（「ＦＮＩＩＩ領域６」）
フィブロネクチンＩＩＩ型領域７（残基７７７〜８６２）（「ＦＮＩＩＩ領域７」）
フィブロネクチンＩＩＩ型領域８（残基８６７〜９５２）（「ＦＮＩＩＩ領域８」）、および
フィブロネクチンＩＩＩ型領域９（残基９５５〜１０４４）（「ＦＮＩＩＩ領域９」）
である。

１つの態様において、機能的断片は、コラーゲン７のＮＣ１ドメインのすべてを含む。すなわち、それは、非コラーゲンＮＣ１ドメイン全体（すなわち、成熟ペプチドの残基１７〜１２５３）を含む。１つの態様において、この機能的断片は、中央のコラーゲンらせんドメイン、たとえば、コラーゲン７の中央のコラーゲンらせんドメインのアミノ酸残基１９２０〜２６０３、および／またはカルボキシル末端のＮＣ２ドメイン（残基２７８４〜２９４４）を含まない。あるいは、機能的断片は、中央のコラーゲンらせんドメインの１００個未満、５０個未満、４０個未満、２０個未満、もしくは１０個未満のアミノ酸残基および／またはカルボキシ末端のＮＣ２ドメインの４０個未満、２０個未満、もしくは１０個未満のアミノ酸残基の断片を含んでいてもよい。

したがって、本発明の１つの態様は、ＮＣ１領域全体またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドである。

好ましい態様において、機能的断片は、ＦＮＩＩＩ領域１、ＦＮＩＩＩ領域５、およびＦＮＩＩＩ領域６の内の少なくとも１つを含むポリペプチドである。

したがって、本発明の１つの態様は、ＦＮＩＩＩ領域１またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。１つの態様において、単離されたポリペプチドは、ＦＮＩＩＩ領域５および／もしくはＦＮＩＩＩ領域６またはその変異体に対応するアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。別の態様において、このポリペプチドは、ポリペプチド配列に具体的に含まれていない他の任意のＦＮＩＩＩ領域、他の任意のＮＣ１領域、もしくはコラーゲン７のコラーゲンドメインもしくはＮＣ２ドメイン、またはこれらの任意の組合せに対応するアミノ酸配列を含まない。

本発明の別の態様は、ＦＮＩＩＩ領域５またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。１つの態様において、単離されたポリペプチドは、ＦＮＩＩＩ領域１および／もしくはＦＮＩＩＩ領域６またはその変異体に対応するアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。別の態様において、このポリペプチドは、ポリペプチド配列に具体的に含まれていない他の任意のＦＮＩＩＩ領域、もしくは他の任意のＮＣ１領域、もしくはコラーゲン７のコラーゲンドメインもしくはＮＣ２ドメイン、またはこれらの組合せの何れかに対応するアミノ酸配列を含まない。

本発明の別の態様は、ＦＮＩＩＩ領域６またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。別の態様において、このポリペプチドは、ポリペプチド配列に具体的に含まれていない他の任意のＦＮＩＩＩ領域、他の任意のＮＣ１領域、もしくはコラーゲン７のコラーゲンドメインもしくはＮＣ２ドメイン、またはこれらの任意の組合せに対応するアミノ酸配列を含まない。

コラーゲン７の機能的断片の変異体とは、コラーゲン７の機能的断片との実質的な同一性を有し、かつＴＧＦ−β１に結合し、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の線維形成促進活性を阻害する機能的断片の能力を維持しているポリペプチドを意味する。機能的断片の変異体には、機能的断片と比べて化学的に改変されているか、かつ／またはコラーゲン７と比べて１つ以上のアミノ酸配列変化を含むかの何れかのポリペプチドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。

コラーゲン７の機能的断片の変異体には、機能的断片のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドが含まれる。２つの配列間の「同一性」または「配列相同性」（これらの用語は、ここで同義的に使用される）の計算は、以下のように実施する。最適に比較することを目的としてこれらの配列を整列させる（たとえば、最適なアライメントのために第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、かつ比較のために、非相同配列を無視することができる）。最適なアライメントは、ギャップペナルティを１２、ギャップ伸長ペナルティを４、およびフレームシフトギャップペナルティを５としてＢｌｏｓｓｕｍ６２スコア行列を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用することにより、最良のスコアとして決定する。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、これらの分子はその位置で同一である（ここで使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」に等しい）。２つの配列間の同一性パーセントは、これらの配列に共通である同一位置の数の関数である。

コラーゲン７の機能的断片の変異体には、コラーゲン７のアミノ酸配列（下記参照）からのアミノ酸改変（たとえば、欠失、付加、または置換、たとえば保存的置換）を有するポリペプチドも含まれる。たとえば、機能的断片の変異体は、コラーゲン７（下記参照）と少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、ただし１０個以下のアミノ酸が異なってもよい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえられているものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（たとえば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。

適応症および治療方法
本発明によるコラーゲン７、機能的断片、および変異体の投与を含む治療方法は、（ｉ）創傷閉鎖を速めること、または（ｉｉ）瘢痕化もしくは線維症を予防、抑制、もしくは軽減することの何れかが臨床的に望ましい場合に、通常、使用されてもよい。速められた創傷閉鎖、軽減された瘢痕化、および軽減された線維症は、未治療の対照と比べて測定してもよい。理論に限定されるものではないが、これらの効果は、ＴＧＦ−βに結合しＴＧＦ−βの線維形成促進活性を低下させることが少なくとも一因となって、達成されると考えられている。線維症は、歪んだ、非機能的な、または過剰に蓄積した瘢痕組織が、組織の正常な構造要素に取って代わることと定義することができる。おそらく、瘢痕組織は、線維症の最も有効な生物学的マーカーである。

本発明の１つの態様は、瘢痕化もしくは線維症を発症するリスクを有する対象を治療する際に使用するための、または既存の瘢痕もしくは線維症の治療と一緒に使用される、コラーゲン７、またはその機能的断片もしくは変異体、および１種以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象とする。本開示は、瘢痕化もしくは線維症を予防する際、または線維症もしくは瘢痕化の程度を小さくする際に使用するための、コラーゲン７、またはここで説明されるその機能的断片もしくは変異体、および１種以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を特徴とする。この態様による治療方法は、有効量のＣ７および／またはその機能的断片もしくは変異体を、それを必要とする患者に投与することを含む。

１つの態様において、治療される対象は、栄養障害型表皮水疱症（ＥＢ）に罹患している人であり、この疾患は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子、すなわち、タンパク質コラーゲン７をコードする遺伝子の変異が原因で起こる。表皮水疱症は、皮膚を極めて脆弱にし、水泡を形成しやすくさせる遺伝性の遺伝子病態のグループである。瘢痕化を伴うＥＢ（たとえば、ＤＥＢ、たとえば、ＲＤＥＢまたはＤＤＥＢ）の症状には、拘縮、たとえば（たとえば、四肢の）屈曲拘縮；偽合指症、たとえば、手の偽合指症および足の偽合指症；癌腫（たとえば、扁平上皮癌）；直腸病変および肛門病変；尿道病変；粘膜病変；扁平上皮組織の病変；消化管の病変；水疱形成；手の外傷後の水疱形成；爪の変形；歯の変形；食道の狭窄；眼障害、貧血、栄養失調；二次的な皮膚感染症；敗血症；嗄声；尿道狭窄；包茎；角膜瘢痕化；吸収不良；ならびに成長障害が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ＥＢ患者では、有効量のコラーゲン７またはその機能的断片もしくは変異体が、瘢痕化を伴う少なくとも１つのＥＢ症状を有する患者に、通常、投与される。

栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）患者は、不治の皮膚脆弱性、水疱形成、および多数の皮膚創傷を有しており、その結果、広範囲の瘢痕形成、拘縮、およびミトン奇形が起こる。これは、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）をコードする遺伝子の変異によって引き起こされる。本発明者らは、マウスの皮膚創傷に組換えＣ７を局所適用すると、線維形成性トランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦ−β２）の発現が減少し、抗線維形成性ＴＧＦ−β３の発現が増加し、これに付随して、いくつかの線維症マーカー、たとえば、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）およびα−ＳＭＡ陽性筋線維芽細胞の発現が低下することを以前に示した。この研究において、本発明者らは、１０名のＲＤＥＢ患者または正常なヒト対象に由来する線維芽細胞およびケラチノサイトの皮膚試料および初代培養物を用いて、ＴＧＦ−βアイソフォームの発現およびＴＧＦ−β誘発性線維症シグナル伝達経路に関与する様々な遺伝子を比較した。ＲＤＥＢ患者由来の皮膚試料を免疫染色することにより、線維形成促進性ＴＧＦアイソフォーム（ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２）、古典的ＴＧＦ−β１シグナル伝達（リン酸化Ｓｍａｄ２／３、ＣＴＧＦ）、非古典的ＴＧＦ−β１シグナル伝達（ｐ−ＡＫＴ）、および細胞外基質（コラーゲン１、テネイシン、およびフィブロネクチン）の発現が増加していることが明らかになった。細胞抽出物の免疫ブロット解析により、ＲＤＥＢケラチノサイトにおけるＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β受容体１、ｐ−Ｓｍａｄ２／３、ＣＴＧＦ、ｐ−ＡＫＴ、およびＲＤＥＢ線維芽細胞におけるｐ−ＡＫＴ、ペリオスチン、Ｓｌｕｇ、およびコラーゲンＩの上方調節が示された。レンチウイルスベクターを介してＲＤＥＢ線維芽細胞もしくはケラチノサイト中で野生型ＣＯＬ７Ａ１を再発現させること、またはＲＤＥＢ細胞に組換えＣ７を添加することによって、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β受容体１、ｐ−Ｓｍａｄ２／３、ＣＴＧＦ、ｐ−ＡＫＴ、ペリオスチン、Ｓｌｕｇ、およびコラーゲン１の発現は減少した。さらに、正常な真皮の線維芽細胞およびケラチノサイトにおいてｓｉＲＮＡによってＣＯＬ７Ａ１を減少させると、ＴＧＦ−β１、ｐ−ＡＫＴ、およびＳｌｕｇの発現が増加した。これらの結果は、ＲＤＥＢ患者においてＣ７が減少すると、線維化促進性のＴＧＦ−βシグナル伝達が上方調節され、異なる線維化促進性の遺伝子発現プログラムを誘発することを示し、Ｃ７の局所投与が、ＲＤＥＢ患者で認められる線維症を制御するにあたって治療的効果を有し得ることを示唆している。（または、本発明者らのデータは、ＲＤＥＢ患者における線維症および瘢痕の発症を支える可能性がある分子メカニズムに対する新たな見識を与える）。

本発明の別の態様において、治療される対象は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子に変異がない人である。皮膚のケロイドおよび肥厚性瘢痕、腱癒着、神経損傷後の伝達遮断、強皮症、クローン病、食道狭窄、尿道狭窄、人工乳房の周囲の被膜、肝硬変、アテローム性動脈硬化症、および骨での線維性偽関節を含めて、多数の臨床的適応症が、ＥＢに罹患していない集団における瘢痕化および線維症に関連している。肥厚性瘢痕またはケロイドは、たとえば、熱傷、外科手術、およびざ瘡を含む外傷の結果として、形成される場合がある。ＥＢに罹患している人も、これらの同じ臨床的適応症に起因する線維症または瘢痕化のリスクを有する場合があり、コラーゲン７を用いる治療がＥＢに対する個別の治療として適応されない場合でさえ、本発明による治療の恩恵を同様に受ける可能性があることに、注目すべきである。

対象の選択
ここで説明する方法の使用によって利益を得る対象には、瘢痕化または線維症に罹患しているか、または発症するリスクを有する対象が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

コラーゲン７ならびにその機能的断片および変異体の調製
コラーゲン７ならびにその機能的断片および変異体は、標準的な細胞株、たとえば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、線維芽細胞、またはケラチノサイト細胞において、標準的な分子生物学技術によって合成することができる。標準的な細胞培養手順および条件を、ここで説明する宿主細胞の培養のために使用してもよく、これらは当業者に公知である。（ＣｈｅｎらＪＢｉｏＣｈｅｍ２７７（１８）：２１１８−２１２４（２００２））、（ＣｈｅｎらＪＢｉｏＣｈｅｍ２７５：３２（１１）：２４４２９−２４４３５（２０００））、（ＣｈｅｎらＪＢｉｏＣｈｅｍ２７６（２４）：２１６４９−２１６５５（２００１））において参照されるように、組換えコラーゲン７の発現のために培養される宿主細胞、たとえばＨＥＫ２９３細胞は、ごく普通に使用される細胞培養培地（たとえば、用途に応じて血清、抗生物質などを適切に添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ハムＦ−１２（１：１））中で培養してもよい。

宿主細胞は、組換えコラーゲン７の産生を最適化するために、他のタンパク質を発現するように操作されてもよい。これには、コラーゲン７核酸配列または組換え発現ベクターを含む宿主細胞において、単離核酸または適切な核酸配列をコードする組換え発現ベクターを外因的に導入することにより、プロセシング酵素であるプロリルヒドロキシラーゼ、プロリダーゼ、またはグリコシルトランスフェラーゼを同時発現させることが含まれてもよいが、それらに限定されるわけではない。コラーゲン７の三重らせんのアセンブリーには、水酸化および宿主細胞増殖培地中にアスコルビン酸が存在することが、しばしば必要となる。参照文献（ＣｈｅｎらＪＢｉｏＣｈｅｍ２７７（１８）：２１１８−２１２４（２００２））において実例で示されているように、アスコルビン酸の存在下でＨＥＫ２９３細胞から産生、回収、および精製された組換え７型コラーゲンは、約９００ｋＤａのタンパク質として分泌され、これは、３つの７型コラーゲン単量体の会合に対応している（各単量体は２９０ｋＤａ）。アスコルビン酸は、組換えタンパク質の適切なプロセシングおよびアセンブリーを助けるために、宿主細胞培養条件において使用されてもよい。

ここで使用するための適切なベクターは、コラーゲン７、プロリルヒドロキシラーゼ、プロリダーゼ、もしくはグリコシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的部分を発現できるものである。ここで説明するタンパク質を発現させるために、適切なタンパク質または機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入することができる。適切なベクターは、挿入された核酸配列を発現させるための、必要かつ適切な転写および翻訳制御配列を含む。当業者に公知である標準的方法を使用して、ここで説明する核酸配列を含む組換え発現ベクターを構築してもよい。これらの方法には、ｉｎｖｉｔｒｏ組換え技術、合成技術、およびｉｎｖｉｖｏ組換え／遺伝的組換えが含まれるが、それらに限定されるわけではなく、方法の選択は、個々のヌクレオチド断片の性質に依存し、当業者によって決定されてもよい。

ここで使用するための適切なベクターは、複製起点および制限エンドヌクレアーゼ配列部位を含んでいてもよい。当業者は、宿主細胞で使用するために適切な複製起点および制限エンドヌクレアーゼ配列に関する知識を持っているはずである。ここで使用するための適切なベクターは、限定されるわけではないが、プロモーターおよびエンハンサーエレメントを含めた、転写を助ける配列エレメントを含んでいてもよい。当業者は、限定されるわけではないが、プロモーター、誘導性プロモーター、およびエンハンサーエレメントを含めて、宿主細胞において適切であると思われる様々な転写制御エレメントに関する知識を持っているはずである。また、ここで使用するための適切なベクターは、宿主細胞が特定の条件下で増殖し生き残るのに必要な生成物をコードして、ベクターが導入された宿主細胞を選択するのに役立つ、選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。典型的な選択遺伝子には、抗生物質、薬物、または毒素（たとえば、テトラサイクリン、アンピシリン（ampicilin）、ネオマイシン、ヒグロマイシンなど）に対する耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子が含まれてもよいが、それらに限定されるわけではない。当業者は、宿主細胞で使用するために適切な選択マーカーおよびレポーター遺伝子のコード配列に関する知識を持っているはずである。

ここで説明する発現ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって宿主細胞中に導入することができる。形質転換およびトランスフェクション技術には、（米国特許第６，６３２，６３７号（ＭｃＧｒｅｗ）において参照されるような）リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクタミン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介トランスフェクションが含まれるが、それらに限定されるわけではない。当業者は、宿主細胞／ベクター組合せに基づく適切な形質転換およびトランスフェクション方法に関する知識を持っているはずである。組換えタンパク質を長期にわたって高収量で産生させるために、組換えタンパク質の安定な発現が優先されてもよい。組換えタンパク質を安定に発現する宿主細胞を、人工的に作り出してもよい。

ここで説明する組換え発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入してもよく、この宿主細胞には、所定の組換え発現ベクターからタンパク質コード領域を発現することができる生細胞が含まれてもよい。「宿主細胞」という用語は、特定の対象細胞だけではなく、その特定の対象細胞の子孫または潜在的子孫も意味する。いくつかの改変が、変異または環境の影響の何れかの理由から、後続の世代において生じる場合があるため、このような子孫は、実際は、親細胞と同一でない場合があるが、それでもなお、ここで使用される用語の範囲内に含まれる。様々な宿主細胞発現系が、ここで説明する核酸分子を発現させるために利用されてもよい。これらには、適切な核酸配列を含む組換え酵母もしくは真菌発現ベクターで形質転換された酵母もしくは真菌；組換えウイルス発現ベクターに感染するか、もしくは適切な核酸配列を含む組換えプラスミド発現ベクターで形質転換された昆虫細胞株；または適切な核酸配列を含む発現ベクターをトランスフェクトされた哺乳動物細胞株（たとえば、霊長類細胞、ヒト細胞、げっ歯動物細胞など）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。適切な宿主細胞には、限定されるわけではないが、（米国特許第６，６３２，６３７号（ＭｃＧｒｅｗ）において参照されるような）線維芽細胞、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、Ｃ１２７、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫなどを含めて、初代細胞株または形質転換細胞株が含まれてもよい。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。

限定されるわけではないが、タンパク質産物のグリコシル化、リン酸化（phosphyorylation）、水酸化、およびプロセシングを含む、修飾は、タンパク質の機能にとって重要な場合がある。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾のために様々な特徴およびメカニズムを有する。ベクター中に含まれる核酸配列の発現を調節するか、またはベクター核酸配列の発現を調節するか、またはベクター配列においてコードされる遺伝子産物を特殊な様式で修飾およびプロセシングできる宿主細胞が、選択されてもよい。哺乳動物宿主細胞は、組換えタンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするように選択されてもよい。このような哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ヒト線維芽細胞、およびヒトケラチノサイトが含まれてもよいが、それらに限定されるわけではない。

ここで説明する組換え法によって作製されるタンパク質は、当技術分野において公知の標準プロトコル（たとえば、沈殿、遠心分離など）に従って宿主細胞培養系から回収されてもよい。ここで説明する組換えコラーゲン７は、宿主細胞培地中に分泌され、次の参照文献（ＣｈｅｎらＪＢｉｏＣｈｅｍ２７７（１８）：２１１８−２１２４（２００２））において実例で示されているように、硫酸アンモニウム沈殿法およびそれに続く遠心分離によって回収されてもよい。ここで説明する組換えおよび分子生物学の方法によって作製され回収されたタンパク質は、当技術分野において公知の標準プロトコル（たとえば、透析、塩による段階的な可溶化、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳゲル電気泳動など）に従って精製されてもよい。ここで説明する組換えコラーゲン７は、次の参照文献（ＣｈｅｎらＪＢｉｏＣｈｅｍ２７７（１８）：２１１８−２１２４（２００２））において実例で示されているように、イオン交換クロマトグラフィーによって均質になるまで精製されてもよい。

任意に、コラーゲン７またはその機能的断片は、さらに精製されてもよい。精製は、限定されるわけではないが、アフィニティークロマトグラフィー、たとえば抗コラーゲン７抗体カラム；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動手順、たとえば、等電点分離法、溶解度による区別（たとえば、硫酸アンモニウム沈殿法）、または抽出などを含めて、当技術分野において公知である任意の方法を用いて達成されてもよい。

医薬組成物
本開示は、コラーゲン７またはその機能的断片もしくは変異体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、任意の許容される医薬製剤の形態をとってもよい。医薬組成物は、様々な異なる形態、たとえば、液体、半固体、および固体の剤形、たとえば、溶液剤（たとえば、注射用および注入用の溶液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム、および坐剤に製剤化することができる。好ましい形態は、意図される投与様式および治療用途に依存し得る。

例示的な医薬組成物を以下に説明する。医薬組成物には、非経口（静脈内、皮下、皮内、筋肉内、および関節内を含む）、局所（真皮、経皮、経粘膜、頬側、舌下、および眼内を含む）、および直腸内投与に適したものが含まれるが、最も適切な経路は、たとえば、受け手の病態および障害に左右され得る。

非経口投与用の組成物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および組成物を意図された受け手の血液と等張性にする溶質を含んでいてもよい水性および非水性の無菌注射液剤；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性の滅菌懸濁剤が含まれる。組成物は、単位投与用容器または多回投与用容器、たとえば、密閉されたアンプルおよびバイアルに入れて提供されてもよく、また、使用する直前に、無菌の液状担体、たとえば、生理食塩水または注射用水の添加のみを必要とする、フリーズドライさせた（凍結乾燥させた）状態で保存されてもよい。用時溶解注射用の液剤および懸濁剤は、先に述べた種類の無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製されてもよい。非経口投与のための例示的な組成物には、たとえば、適切な非毒性の、非経口的に許容される希釈剤または溶媒、たとえば、ＥＤＴＡ、マンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンガー溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、または他の適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を含んでよい、注射用の溶液剤または懸濁剤が含まれる。組成物は、限定されるわけではないが、ＥＤＴＡ、たとえば０．５ｍＭＥＤＴＡ；ｐＨ調整剤および緩衝剤ならびに／または浸透圧調整剤、たとえば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン；少量の非毒性補助物質、たとえば、湿潤剤もしくは乳化剤または保存剤を含めて、薬学的に許容される物質または補助剤を含んでいてもよい。

特に上記に挙げた成分の他に、組成物は、該当する製剤のタイプを考慮して、当技術分野において慣例的に使用される他の作用物質を含んでいてもよいことを理解すべきである。

長期投与計画
ここで説明する方法を実践する際、コラーゲン７またはその機能的断片もしくは変異体を長期にわたって投与してもよい。長期投与は、一定期間にわたる、複数用量の作用物質の投与を含んでもよい。長期投与は、長期間の、典型的には、ある人が瘢痕化または線維症のリスクを有している期間にわたる、規則的な投与を含んでもよい。

併用治療
本開示は、追加の作用物質または治療計画の、コラーゲン７またはその機能的断片もしくは変異体との併用投与を包含する。追加の作用物質には、抗生物質、鎮痛薬、オピオイド、抗ウイルス物質、抗炎症剤、または栄養補助食品が含まれてもよいが、それらに限定されるわけではない。

１つの態様において、追加の作用物質または治療計画は、対象を瘢痕化または線維症のリスクにさらす基礎疾患または基礎病態を治療するように設計された作用物質または治療計画であってもよい。

別の態様において、追加の作用物質または治療計画は、治癒を速めるかまたは促進するように設計された、別の作用物質または治療計画であってもよい。

１つの態様において、追加の作用物質または治療計画は、瘢痕化または線維症を治療および／または予防するように設計された別の作用物質／治療計画であってもよい。このような作用物質または治療計画には、コルチコステロイド注射、シリコンシーティング（silicon sheeting）、外科手術、瘢痕切除、イミキモド、パルスレーザー技術（典型的には、５８５ｎｍパルスダイレーザーを使用する）、病巣内ベラパミル、フルオロウラシル、ブレオマイシン、およびインターフェロンα−２ｂ注射が含まれてもよいが、それらに限定されるわけではない。

［実施例］
例１：コラーゲン７の係留線維へのアセンブリー
図１は、プロα１（ＶＩＩ）鎖のドメイン構成およびコラーゲン７分子の係留線維へのアセンブリーの概略図である。図１（Ａ）に示すように、プロα１（ＶＩＩ）ポリペプチドは、いくつかの非らせんセグメントを含むＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列を繰り返すことを特徴とするコラーゲンセグメント（ＴＨ）からなる。コラーゲンドメインの隣には、アミノ末端の大型非コラーゲンドメイン（ＮＣ−１）およびカルボキシ末端の短い非コラーゲンドメイン（ＮＣ２）がある。図１（Ｂ）（１）および（２）に示すように、３本のコラーゲン７α鎖は、ホモ三量体を形成する。図１（Ｂ）（３）では、細胞外空間で、ＮＣ−２の一部分がタンパク質分解によって除去されると、プロα１（ＶＩＩ）３鎖が整列して逆平行二量体になる。図１（Ｂ）（４）に示すように、次いで、コラーゲン７逆平行二量体は、横方向に集合して係留線維を形成する。この係留線維は、透過型電子顕微鏡を用いて観察される特徴的な中心対称性のしま模様によって見分けることができる。

例２：コラーゲン７およびＮＣ１は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３に結合する
図２は、コラーゲン７およびＮＣ１中の増殖因子結合部位の同定を示す。固相リガンド結合アッセイを用いて、トランスフォーミング増殖因子α、β１、β２、およびβ３（ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３）、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、およびＢＳＡへの、ＮＣ１またはコラーゲンの何れかの結合を測定した。増殖因子はすべて、１．２５μｇ／ｍｌの濃度でＥＬＩＳＡプレートに加えた。２μｇの精製した組換えコラーゲン７およびＮＣ１を、ＰＢＳＴ中で各タンパク質と共に２０℃で２時間、インキュベートした。ウサギ抗ＮＣ１ポリクローナル抗ＮＣ１抗体（１：１０００）、続いて、アルカリホスファターゼを結合させた二次抗体（１：３００）を用いて、結合を検出した。コラーゲン７およびＮＣ１は、構造的に関連したＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３に結合することに注目されたい。コラーゲン７はＰＤＧＦ−ＢＢに結合するがＮＣ１は結合せず、このことは、この増殖因子に対する結合部位がＮＣ２ドメインまたはＴＨの何れかに存在することを暗示している。

例３：コラーゲン７およびＮＣ１は、ＴＧＦ−βアイソフォームに用量依存的に結合する
図３は、３種のＴＧＦ−βアイソフォームすべてに対するコラーゲン７およびＮＣ１の用量依存的結合を示す。ＴＧＦ−βアイソフォームの何れかでＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、次いで、指定量の組換えコラーゲン７、ＮＣ１の何れかと共に、またはタンパク質を伴わずに、インキュベートした。コラーゲン７／ＮＣ１とＴＧＦ−βのアイソフォームすべてとの間に用量依存的相互作用があったことに注目されたい。これらの結果は、ＴＧＦ−β結合のための活性領域がコラーゲン７のＮＣ１ドメインの内部にあることを示す。

１：２０００に希釈したポリクローナル抗ＮＣ１抗体または抗ＧＳＴ抗体と、それに続く、アルカリホスファターゼを結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：４００）（ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａ−Ｃａｐｐｅｌ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）とのインキュベーションを、検出のために使用した。ｐ−ニトロ−フェニルホスファート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を基質として用いる比色反応の発色を、４０５ｎｍでの生成物の吸光度を読み取ることによって（ＬａｂｓｙｓｔｅｍｓＭｕｌｔｉｓｋａｎＭｕｌｔｉｓｏｆｔ、Ｆｉｎｌａｎｄ）測定した。対照波長は、６２０ｎｍで測定した。

例４：ＮＣ１サブドメインを含むポリペプチドの概略図
図４は、ＮＣ１のサブドメインを含む細菌融合タンパク質の概略図を示す。この概略図は、ＮＣ１ドメイン全体を含む５つの組換え融合タンパク質を示す。これらのＧＳＴ融合タンパク質を細菌から発現させ、ＧＳＴアフィニティーカラムを用いて精製した。右側の図は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解したこれらの精製タンパク質のクーマシーブルー染色を示す。

例５：ＮＣ１のＦＮＩＩＩサブドメインは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３への結合を媒介する
図５は、ＦＮＩＩＩのサブドメインがＴＧＦ−βへのＮＣ１の結合を媒介することを示す。固相リガンド結合アッセイを用いて、ＴＧＦ−βの３種のアイソフォームすべてに対する組換え融合タンパク質の結合を測定した。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３、またはＢＳＡをＥＬＩＳＡプレートに加え、図に示した融合タンパク質と共に室温で２時間インキュベートした。アフィニティー精製したポリクローナル抗ＧＳＴ抗体（１：２０００）、続いて、アルカリホスファートを結合させた二次抗体（１：３００）を用いて、結合を検出した。ＰＣＲ３およびＰＣＲ２は３種のＴＧＦ−βアイソフォームすべてに対して顕著な親和性を有していたのに対して、他の断片はどれも、ほとんど結合活性を示さなかったことに注目されたい。

例６：ＮＣ１サブドメインは、用量依存的にＴＧＦ−βに結合する
図６は、３種のＴＧＦ−βアイソフォームすべてに対するＮＣ１サブドメインの用量依存的結合を示す。ＴＧＦ−βアイソフォームの何れかでＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、次いで、指定量のＰＣＲ３、ＰＣＲ２何れかと共に、またはタンパク質を伴わずに、インキュベートした。両方のＮＣ１断片とＴＧＦ−βのアイソフォームすべてとの間に用量依存的相互作用があったことに注目されたい。これらの結果は、あらゆる形態のＴＧＦ−βに対する２つの結合部位が存在すること、ならびにＴＧＦ−β結合のための活性領域がＮＣ１のＰＣＲ３およびＰＣＲ２サブドメインの内部にあることを示す。

例７：ＮＣ１サブドメインＰＣＲ２およびＰＣ３は、用量依存的にＴＧＦ−βに結合する
図７は、ＰＣＲ３およびＰＣＲ２の内部の細菌融合タンパク質の概略図である。図７の概略図は、ＰＣＲ３とＰＣＲ２の両方の内部の５つの融合タンパク質を示す。これらの融合タンパク質を細菌から発現させ、ＧＳＴアフィニティーカラムを用いて精製した。右側の図は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解したこれらの精製タンパク質のクーマシーブルー染色を示す。

例８：ＮＣ１のＦＮＩＩＩサブドメインは、ＴＧＦ−βアイソフォームへの結合を媒介する
図８は、ＦＮＩＩＩのサブドメインがＴＧＦ−βへのＮＣ１の結合を媒介することを示す。図８において、固相リガンド結合アッセイを用いて、ＴＧＦ−βの３種のアイソフォームすべてに対する組換え融合タンパク質の結合を測定した。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３、またはＢＳＡをＥＬＩＳＡプレートに加え、融合タンパク質と共に室温で２時間インキュベートした。アフィニティー精製したポリクローナル抗ＧＳＴ抗体（１：２０００）、続いて、アルカリホスファートを結合させた二次抗体（１：３００）を用いて、結合を検出した。ＰｐｕＭＩ、ＦＰ１５、およびＦＰ１６断片が、それらの親ドメインと比べて、ＴＧＦ−βアイソフォームへの結合を再現する（またはさらに、強化を示す）ことに注目されたい。他の断片はすべて、ＢＳＡ対照と比べると、ほとんど結合活性を示さなかった。

例９：ＰｐｕＭｉ、ＦＰ１５、およびＦＰ１６サブドメイン
図９は、３種のＴＧＦ−βすべてに対するＰＣＲ３およびＰＣＲ２サブドメインの用量依存的結合を示す。図９に示すように、ＴＧＦ−βアイソフォームの何れかでＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、次いで、指定量のＰｐｕＭｉ、ＦＰ１５、ＦＰ１６の何れかと共に、またはタンパク質を伴わずに、インキュベートした。３種のＮＣ１小断片すべてとＴＧＦ−βのアイソフォームすべてとの間に用量依存的相互作用があったことに注目されたい。これらの結果は、あらゆる形態のＴＧＦ−βに対して、コラーゲン７のＮＣ１ドメインの内部に２つの結合部位が存在することをさらに裏付ける。

図１０は、コラーゲン７およびサブドメインへのＴＧＦ−β１結合が温度感受性であることを示す。ＥＬＩＳＡプレートをＴＧＦ−β１でコーティングし、次いで、上記に示した温度で５分間前処理した等モル量の指定タンパク質と共にインキュベートした。小型のサブドメインは、６５℃以上の温度でＴＧＦ−β１結合活性を失うことに注目されたい。対照的に、コラーゲン７およびＮＣ１は、温度による失活に対する耐性が高く、１００℃で結合活性を失う。

例１０：Ｃ７の方がフィブロネクチンよりも強くＴＧＦ−βに結合する
フィブロネクチンも、ＴＧＦβアイソフォームに結合することが公知である。図１１は、ＴＧＦβアイソフォームおよび増殖因子ＰＤＦＧ−ＢＢへのフィブロネクチンおよびｒＣ７の結合を比較している。Ｃ７およびＮＣ１の方がフィブロネクチンよりも有意に強く、ＴＧＦβ１および２に結合することに注目して頂きたい。興味深いことに、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合については、Ｃ７とフィブロネクチンとの間に有意な差異はない。図１１Ａは、本実験で使用された精製組換えＮＣ１、フィブロネクチン、およびＣ７のクーマシーブルー染色した６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥスラブゲルを示す。

例１１：ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２へのＣ７／ＮＣ１の結合能力は、温度を上げても保持される
タンパク質とタンパク質の結合相互作用の強さの１つの指標は、高温でのそれらの親和性の持続である。図１２に示すように、本発明者らは、Ｃ７またはＮＣ１を２０、４５、６５、および１００で５分間プレインキュベートし、次いで、それらを結合アッセイに加えた。図１２Ａおよび１２Ｂに示すように、ＴＧＦ−β１および２へのｒＣ７およびＮＣ１の結合能力はそれぞれ、６５度ほどの高さの温度では保持されるが、１００度に加熱すると活性が失われる。

例１２：ＴＧＦ−βアイソフォームは、ＮＣ１への結合に対して競合する
図１３Ａに示す実験において、本発明者らは、組換えＮＣ１を各ＴＧＦβアイソフォームと混合し、次いで、抗ＮＣ１抗体を用いる免疫沈降を行った。次に、本発明者らは、その沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流し、各ＴＧＦβアイソフォームに対する抗体を用いる免疫ブロットを実施した。抗原対抗原ＥＬＩＳＡデータと一致して、免疫沈降により、ＮＣ１は３種のＴＧＦ−βアイソフォームすべてに結合することに注目して頂きたい。図１３Ｂに示すように、本発明者らは、抗原対抗原ＥＬＩＳＡ競合アッセイによって、ＮＣ１が３種のＴＧＦ−βアイソフォームすべてに対して同じ結合部位を利用するかを検査した。ＴＧＦβ１へのＮＣ１の結合が、１０倍過剰量のＴＧＦ−β２およびβ３が存在することによって、それぞれ５０％および９０％阻害されたことに注目して頂きたい。これらのデータから、３種のＴＧＦ−βアイソフォームがＮＣ１の同じ部位に結合することが示される。

例１３：ＲＤＥＢ患者の皮膚では、線維症に関連付けられているマーカーの発現が増加している
ＲＤＥＢ創傷は、過剰な瘢痕形成を伴って治癒するため、本発明者らは、線維形成促進性アイソフォームであるＴＧＦ−β１および２に対する抗体ならびに皮膚瘢痕化の公知のマーカーに対する抗体を用いて、ＲＤＥＢ患者２名に由来する皮膚生検材料のＩＦ染色を実施した。図１５に示すように、正常な皮膚と比べて、ＲＤＥＢ患者の皮膚の方が、何れも線維症および瘢痕化のマーカーである、ＴＧＦβ１、β２、ｐ−Ｓｍａｄ２／３（ＴＧＦβシグナル伝達の下流要素）、Ｉ型コラーゲン、テネイシン、フィブロネクチン、およびＣＴＧＦの発現増加を示していることに注目されたい。

例１４：組換えＣ７は、ＲＤＥＢ線維芽細胞による増殖因子誘発性ＦＰＣＬＣを抑制する
ＲＤＥＢ線維芽細胞は、機能的なＶＩＩ型コラーゲンを欠いている。本発明者らは、組換えＶＩＩ型コラーゲンの存在により、ＲＤＥＢ線維芽細胞がコラーゲン格子を過剰収縮させる能力を抑制できるかどうかを判定した。図１６に示すように、コラーゲン格子収縮アッセイに組換えＣ７を加えると、ＲＤＥＢ線維芽細胞の増殖因子誘発性収縮だけでなく、基礎収縮も抑制された。

ＲＤＥＢ線維芽細胞は、機能的なＶＩＩ型コラーゲンを欠いている。本発明者らは、組換えＶＩＩ型コラーゲンの存在により、ＲＤＥＢ線維芽細胞がコラーゲン格子を過剰収縮させる能力を抑制できるかどうかを次に判定した。図１７に示すように、コラーゲン格子収縮アッセイに組換えＣ７を加えると、ＲＤＥＢ線維芽細胞の増殖因子誘発性収縮だけでなく、基礎収縮も抑制された。

これらの例から明らかないくつかの知見には、以下のものが含まれる：
・ＲＤＥＢ患者の皮膚は、高レベルの線維化促進性ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２を示す。
・ＲＤＥＢ患者の線維芽細胞は、正常な線維芽細胞と比べて、コラーゲン格子の過剰収縮を誘発する。
・ｒＣ７の存在により、コラーゲン格子のＲＤＥＢ線維芽細胞過剰収縮が元に戻る。
・ｒＣ７は、フィブロネクチンよりも強くＴＧＦ−βの３種の形態すべてに結合する。
・ＮＣ１またはＣ７は、３種のＴＧＦ−βアイソフォームすべてに対して同じ結合部位を利用する。
・ＴＧＦ−βへのｒＣ７の結合は、ＮＣ１の２つのサブドメインにより媒介される。

この結果から生じるいくつかの推測
・ＲＤＥＢにおける過剰な瘢痕化は、機能的Ｃ７が存在しないことに対して応答した、線維化促進性ＴＧＦ−βアイソフォームの本質的な増加に起因する可能性がある。
・Ｃ７それ自体は、線維化促進性ＴＧＦ−βアイソフォームへの結合メカニズムを介する抗瘢痕化特性を有している可能性がある。
・Ｃ７またはその抗線維化サブドメインの内の１つは、抗瘢痕化創傷治癒物質として開発するために有望である可能性がある。

材料および方法
コラーゲン７、ＮＣ１、およびＮＣ１サブドメインの構築および発現：（Ｃｈｅｎら、２００４）で説明されているように、完全長コラーゲン７をコードするレンチウイルスベクターを用いて安定に形質導入されたＲＤＥＢ真皮線維芽細胞に由来する無血清培地から、組換えコラーゲン７を精製した。（Ｃｈｅｎら、１９９７）で説明されているように、ＮＣ１をコードするｃＤＮＡを安定にトランスフェクトされた２９３細胞から、コラーゲン７のＮＣ１ドメインを精製した。（Ｌａｐｉｅｒｅら、１９９３）で説明されているように、コラーゲン７のＮＣ１ドメイン内部の別々のセグメントに対応する細菌融合タンパク質を発色させ、グルタチオン−セファロース４Ｂカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＵｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって精製した。

固相タンパク質結合アッセイ：
固定されたリガンド（ＴＧＦ−βアイソフォームまたは他の増殖因子）への可溶性コラーゲン７、ＮＣ１、およびＮＣ１の様々なサブドメインの結合とそれに続く比色酵素結合抗体反応を、以下に説明するように実施した。マルチウェルプレート（９６ウェル、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）を、１００ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ９．３において３７℃で１時間、ＴＧＦ−β（１２５ｎｇ／ウェル）でコーティングした。次いで、これらのウェルを、リン酸緩衝化生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）に溶かした２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によってブロックした。続いて、コーティングされたウェルを、指定濃度の精製された組換えＮＣ１、コラーゲン７、またはＮＣ１のサブドメインと共に室温で２時間、インキュベートした。１：２０００に希釈したポリクローナル抗ＮＣ１抗体または抗ＧＳＴ抗体と、それに続く、アルカリホスファターゼを結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：４００）（ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａ−Ｃａｐｐｅｌ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）とのインキュベーションによって、各ＴＧＦ−βアイソフォームへのコラーゲン７の結合を検出した。ｐ−ニトロ−フェニルホスファート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を基質として用いる比色反応の発色を、４０５ｎｍでの生成物の吸光度を読み取ることによって（ＬａｂｓｙｓｔｅｍｓＭｕｌｔｉｓｋａｎＭｕｌｔｉｓｏｆｔ、Ｆｉｎｌａｎｄ）測定した。対照波長は、６２０ｎｍで測定した。

コラーゲンＶＩＩ型の配列情報
Name: Collagen alpha-1(VII) chain precursor [Homo sapiens]
NCBI Reference Sequence: NP_000085.1
FEATURES Location/Qualifiers
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complex alloy of variable members of diverse protein
families defining structural integrity and various
physiological functions. The most abundant family is the
collagens with more than 20 different...; cd01482"
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internal repeats found in the plasma protein fibronectin.
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recognition sequence in a flexible loop between 2 strands.
Approximately 2% of all...; cd00063"
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internal repeats found in the plasma protein fibronectin.
Its tenth fibronectin type III repeat contains an RGD cell
recognition sequence in a flexible loop between 2 strands.
Approximately 2% of all...; cd00063"
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internal repeats found in the plasma protein fibronectin.
Its tenth fibronectin type III repeat contains an RGD cell
recognition sequence in a flexible loop between 2 strands.
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internal repeats found in the plasma protein fibronectin.
Its tenth fibronectin type III repeat contains an RGD cell
recognition sequence in a flexible loop between 2 strands.
Approximately 2% of all...; cd00063"
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internal repeats found in the plasma protein fibronectin.
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internal repeats found in the plasma protein fibronectin.
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internal repeats found in the plasma protein fibronectin.
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Region 1053..1204
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originally found in the blood coagulation protein von
Willebrand factor (vWF). Typically, the vWA domain is made
up of approximately 200 amino acid residues folded into a
classic a/b para-rossmann type of...; cd01450"
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binding]"
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Region 1170..1172
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details recorded"
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Region 1254..2784
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recorded"
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Region 1254..1477
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recorded"
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pfam01391"
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details recorded"
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Region 1764..1816
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pfam01391"
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Region 2008..2010
/region_name="Cell attachment site (Potential)"
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details recorded"
/note="propagated from UniProtKB/Swiss-Prot (Q02388.2)"
Region 2022..2074
/region_name="Collagen"
/note="Collagen triple helix repeat (20 copies);
pfam01391"
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Region 2108..2166
/region_name="Collagen"
/note="Collagen triple helix repeat (20 copies);
pfam01391"
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Site 2167
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recorded"
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Site 2176
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recorded"
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UniProtKB/Swiss-Prot (Q02388.2)"
Site 2185
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recorded"
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UniProtKB/Swiss-Prot (Q02388.2)"
Site 2188
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recorded"
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UniProtKB/Swiss-Prot (Q02388.2)"
Region 2242..2301
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pfam01391"
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Region 2324..2369
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pfam01391"
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Region 2466..2520
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pfam01391"
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Region 2527..2598
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pfam01391"
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details recorded"
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Site 2631
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recorded"
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UniProtKB/Swiss-Prot (Q02388.2)"
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Site 2664
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recorded"
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UniProtKB/Swiss-Prot (Q02388.2)"
Site 2667
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recorded"
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UniProtKB/Swiss-Prot (Q02388.2)"
Site 2673
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recorded"
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UniProtKB/Swiss-Prot (Q02388.2)"
Region 2785..2944
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recorded"
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Site 2821
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recorded"
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Region 2874..2930
/region_name="KU"
/note="BPTI/Kunitz family of serine protease inhibitors;
Structure is a disulfide rich alpha+beta fold. BPTI
(bovine pancreatic trypsin inhibitor) is an extensively
studied model structure; cd00109"
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Site order(2884..2888,2890)
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Site 2886..2887
/site_type="other"
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details recorded"
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UniProtKB/Swiss-Prot (Q02388.2)"
CDS 1..2944
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ORIGIN
1 mtlrllvaal cagilaeapr vraqhrervt ctrlyaadiv flldgsssig rsnfrevrsf
61 leglvlpfsg aasaqgvrfa tvqysddprt efgldalgsg gdvirairel sykggntrtg
121 aailhvadhv flpqlarpgv pkvcilitdg ksqdlvdtaa qrlkgqgvkl favgiknadp
181 eelkrvasqp tsdffffvnd fsilrtllpl vsrrvcttag gvpvtrppdd stsaprdlvl
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421 lrpvilgpts illswnlvpe argyrlewrr etgleppqkv vlpsdvtryq ldglqpgtey
481 rltlytlleg hevatpatvv ptgpelpvsp vtdlqatelp gqrvrvswsp vpgatqyrii
541 vrstqgvert lvlpgsqtaf dlddvqagls ytvrvsarvg pregsasvlt vrrepetpla
601 vpglrvvvsd atrvrvawgp vpgasgfris wstgsgpess qtlppdstat ditglqpgtt
661 yqvavsvlrg reegpaaviv artdplgpvr tvhvtqasss svtitwtrvp gatgyrvswh
721 sahgpeksql vsgeatvael dglepdteyt vhvrahvagv dgppasvvvr tapepvgrvs
781 rlqilnassd vlritwvgvt gatayrlawg rseggpmrhq ilpgntdsae irgleggvsy
841 svrvtalvgd regtpvsivv ttppeappal gtlhvvqrge hslrlrwepv praqgfllhw
901 qpeggqeqsr vlgpelssyh ldglepatqy rvrlsvlgpa gegpsaevta rtesprvpsi
961 elrvvdtsid svtlawtpvs rassyilswr plrgpgqevp gspqtlpgis ssqrvtglep
1021 gvsyifsltp vldgvrgpea svtqtpvcpr gladvvflph atqdnahrae atrrvlerlv
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1201 rrlapgmdsv qtffavddgp sldqavsgla talcqasftt qprpepcpvy cpkgqkgepg
1261 emglrgqvgp pgdpglpgrt gapgpqgppg satakgergf pgadgrpgsp gragnpgtpg
1321 apglkgspgl pgprgdpger gprgpkgepg apgqviggeg pglpgrkgdp gpsgppgprg
1381 plgdpgprgp pglpgtamkg dkgdrgergp pgpgeggiap gepglpglpg spgpqgpvgp
1441 pgkkgekgds edgapglpgq pgspgeqgpr gppgaigpkg drgfpgplge agekgergpp
1501 gpagsrglpg vagrpgakgp egppgptgrq gekgepgrpg dpavvgpava gpkgekgdvg
1561 pagprgatgv qgergppglv lpgdpgpkgd pgdrgpiglt gragppgdsg ppgekgdpgr
1621 pgppgpvgpr grdgevgekg degppgdpgl pgkagerglr gapgvrgpvg ekgdqgdpge
1681 dgrngspgss gpkgdrgepg ppgppgrlvd tgpgarekge pgdrgqegpr gpkgdpglpg
1741 apgergiegf rgppgpqgdp gvrgpagekg drgppgldgr sgldgkpgaa gpsgpngaag
1801 kagdpgrdgl pglrgeqglp gpsgppglpg kpgedgkpgl ngkngepgdp gedgrkgekg
1861 dsgasgregr dgpkgergap gilgpqgppg lpgpvgppgq gfpgvpggtg pkgdrgetgs
1921 kgeqglpger glrgepgsvp nvdrlletag ikasalreiv etwdessgsf lpvperrrgp
1981 kgdsgeqgpp gkegpigfpg erglkgdrgd pgpqgppgla lgergppgps glagepgkpg
2041 ipglpgragg vgeagrpger gergekgerg eqgrdgppgl pgtpgppgpp gpkvsvdepg
2101 pglsgeqgpp glkgakgepg sngdqgpkgd rgvpgikgdr gepgprgqdg npglpgergm
2161 agpegkpglq gprgppgpvg ghgdpgppga pglagpagpq gpsglkgepg etgppgrglt
2221 gptgavglpg ppgpsglvgp qgspglpgqv getgkpgapg rdgasgkdgd rgspgvpgsp
2281 glpgpvgpkg epgptgapgq avvglpgakg ekgapgglag dlvgepgakg drglpgprge
2341 kgeagragep gdpgedgqkg apgpkgfkgd pgvgvpgspg ppgppgvkgd lglpglpgap
2401 gvvgfpgqtg prgemgqpgp sgerglagpp gregipgplg ppgppgsvgp pgasglkgdk
2461 gdpgvglpgp rgergepgir gedgrpgqeg prgltgppgs rgergekgdv gsaglkgdkg
2521 dsavilgppg prgakgdmge rgprgldgdk gprgdngdpg dkgskgepgd kgsaglpglr
2581 gllgpqgqpg aagipgdpgs pgkdgvpgir gekgdvgfmg prglkgergv kgacgldgek
2641 gdkgeagppg rpglaghkge mgepgvpgqs gapgkeglig pkgdrgfdgq pgpkgdqgek
2701 gergtpgigg fpgpsgndgs agppgppgsv gprgpeglqg qkgergppge rvvgapgvpg
2761 apgergeqgr pgpagprgek geaalteddi rgfvrqemsq hcacqgqfia sgsrplpsya
2821 adtagsqlha vpvlrvshae eeervppedd eyseyseysv eeyqdpeapw dsddpcslpl
2881 degsctaytl rwyhravtgs teachpfvyg gcggnanrfg treacerrcp prvvqsqgtg
2941 taqd
//
PCR2 (AA 596 - 826)
ETPLAVPGLRVVVSDATRVRVAWGPVPGASGFRISWSTGSGPESSQTLPPDSTATDITGLQPGTTYQVAVSVLRGREEGPAAVIVARTDPLGPVRTVHVTQASSSSVTITWTRVPGATGYRVSWHSAHGPEKSQLVSGEATVAELDGLEPDTEYTVHVRAHVAGVDGPPASVVVRTAPEPVGRVSRLQILNASSDVLRITWVGVTGATAYRLAWGRSEGGPMRHQILPGNT
PCR3 (AA 202 - 602)
SILRTLLPLVSRRVCTTAGGVPVTRPPDDSTSAPRDLVLSEPSSQSLRVQWTAASGPVTGYKVQYTPLTGLGQPLPSERQEVNVPAGETSVRLRGLRPLTEYQVTVIALYANSIGEAVSGTARTTALEGPELTIQNTTAHSLLVAWRSVPGATGYRVTWRVLSGGPTQQQELGPGQGSVLLRDLEPGTDYEVTVSTLFGRSVGPATSLMARTDASVEQTLRPVILGPTSILLSWNLVPEARGYRLEWRRETGLEPPQKVVLPSDVTRYQLDGLQPGTEYRLTLYTLLEGHEVATPATVVPTGPELPVSPVTDLQATELPGQRVRVSWSPVPGATQYRIIVRSTQGVERTLVLPGSQTAFDLDDVQAGLSYTVRVSARVGPREGSASVLTVRREPETPLAVP
PpuMi (AA 202 - 360)
SILRTLLPLVSRRVCTTAGGVPVTRPPDDSTSAPRDLVLSEPSSQSLRVQWTAASGPVTGYKVQYTPLTGLGQPLPSERQEVNVPAGETSVRLRGLRPLTEYQVTVIALYANSIGEAVSGTARTTALEGPELTIQNTTAHSLLVAWRSVPGATGYRVTW
FP15 (AA 596 - 709)
ETPLAVPGLRVVVSDATRVRVAWGPVPGASGFRISWSTGSGPESSQTLPPDSTATDITGLQPGTTYQVAVSVLRGREEGPAAVIVARTDPLGPVRTVHVTQASSSSVTITWTRV
FP16 (AA 707 - 826)
TRVPGATGYRVSWHSAHGPEKSQLVSGEATVAELDGLEPDTEYTVHVRAHVAGVDGPPASVVVRTAPEPVGRVSRLQILNASSDVLRITWVGVTGATAYRLAWGRSEGGPMRHQILPGNT

Claims

コラーゲン７の１つ以上の機能的断片またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
前記単離されたポリペプチドが、ヒト皮膚の表皮層と表皮層の間の係留線維を形成することはできないが、ＴＧＦ−β１に結合し、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の活性を阻害することはできる、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
前記単離されたポリペプチドが、ＦＮＩＩＩ領域１、ＦＮＩＩＩ領域２、ＦＮＩＩＩ領域３、ＦＮＩＩＩ領域４、ＦＮＩＩＩ領域５、ＦＮＩＩＩ領域６、ＦＮＩＩＩ領域７、ＦＮＩＩＩ領域８、ＦＮＩＩＩ領域９、およびそれらの各々の変異体からなる群から選択される１つ以上の機能的断片に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
前記単離されたポリペプチドが、コラーゲン７のＮＣ１ドメインのすべてまたは前記ＮＣ１ドメインの変異体に対応するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
前記単離されたポリペプチドが、中央のコラーゲンらせんドメインの１００個未満、５０個未満、４０個未満、２０個未満、もしくは１０個未満のアミノ酸残基および／またはカルボキシ末端のＮＣ２ドメインの４０個未満、２０個未満、もしくは１０個未満のアミノ酸残基の断片に対応するアミノ酸配列をさらに含む、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
前記単離されたポリペプチドが、ＦＮＩＩＩ領域１、ＦＮＩＩＩ領域５、およびＦＮＩＩＩ領域６、ＦＮＩＩＩ領域１の変異体、ＦＮＩＩＩ領域５の変異体、およびＦＮＩＩＩ領域６の変異体からなる群から選択される１つ以上の領域に対応するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
したがって、前記単離されたポリペプチドが、ＦＮＩＩＩ領域１またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
したがって、前記単離されたポリペプチドが、ＦＮＩＩＩ領域５に対応するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
したがって、前記単離されたポリペプチドが、ＦＮＩＩＩ領域６またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
したがって、前記単離されたポリペプチドが、ＰＣＲ１またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
したがって、前記単離されたポリペプチドが、ＰＣＲ２またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
本発明の別の態様は、ＰＣＲ３またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドである。
前記単離されたポリペプチドが、ＦＰ１５またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
前記単離されたポリペプチドが、ＦＰ１６またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
前記単離されたポリペプチドが、ＴＧＦ−β１および／またはＴＧＦ−β２に対するコラーゲン７の結合部位に対応する１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチド配列に含めるために具体的に選択されたのではない任意のＦＮＩＩＩ領域、もしくは他の任意のＮＣ１領域、もしくはコラーゲン７のコラーゲンドメインもしくはＮＣ２ドメイン、またはこれらの組合せの何れかに対応するアミノ酸配列を含まない、請求項１〜１３の何れかに記載の単離されたポリペプチド。
請求項１〜１６の何れか１項に記載の１つ以上の単離されたポリペプチドおよび担体を含む医薬組成物。
有効量の請求項１７に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、創傷治癒を速める方法。
治療を必要とする前記対象が、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子中に変異を有していない、請求項１９に記載の方法。
有効量の請求項１７に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、瘢痕化を予防、抑制、または軽減する方法。
治療を必要とする前記対象が、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子中に変異を有していない、請求項２１に記載の方法。
有効量の請求項１７に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、線維症を予防、抑制、または軽減する方法。
治療を必要とする前記対象が、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子中に変異を有していない、請求項２３に記載の方法。
有効量の請求項１７に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＴＧＦ−βを阻害する方法。
治療を必要とする前記対象が、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子中に変異を有していない、請求項２２に記載の方法。
コラーゲン７を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、瘢痕化を予防、抑制、または軽減する方法であって、治療を必要とする前記対象が、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子中に変異を有していない、方法。
コラーゲン７を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、線維症を予防、抑制、または軽減する方法であって、治療を必要とする前記対象が、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子中に変異を有していない、方法。
コラーゲン７を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＴＧＦ−βを阻害する方法であって、治療を必要とする前記対象が、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子中に変異を有していない、方法。
コラーゲン７を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、瘢痕化を予防、抑制、または軽減する方法であって、前記医薬組成物を局所的に投与する方法。
コラーゲン７を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、線維症を予防、抑制、または軽減する方法であって、前記医薬組成物を局所的に投与する方法。
コラーゲン７を含む有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＴＧＦ−βを阻害する方法であって、前記医薬組成物を局所的に投与する方法。
有効量の請求項１７に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＲＤＥＢを治療する方法。
有効量の請求項１７に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＲＤＥＢ患者において瘢痕化または過剰な線維形成を予防する方法。
有効量の請求項１７に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＲＤＥＢ患者において過剰収縮を軽減する方法。