CN107014933A - 一种刺毛峨参挥发油的提取纯化和检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种刺毛峨参挥发油的提取纯化和检测方法及其应用。本发明首次采用水蒸气蒸馏和有机萃取技术提取纯化得到刺毛峨参挥发油，提取纯化方法工艺简单，成本低，制备工艺中的蒸馏水和有机溶剂能够重复利用，经本发明制备工艺获得的挥发油含水率低，同时经试验验证具有良好的抗氧化、抑菌和抗癌活性，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌均有良好的抑菌作用，对人肝癌细胞和人乳腺癌细胞具有良好的抗癌抑癌效果，适合工业化生产应用。

Description

一种刺毛峨参挥发油的提取纯化和检测方法及其应用

技术领域

本发明属于医药产品研究开发技术领域，具体涉及一种刺毛峨参挥发油的提取纯化和检测方法及其应用，尤其涉及刺毛峨参挥发油成分的发现和鉴定以及刺毛峨参挥发油成分的同时抗氧化、抑菌和抗癌功能。

背景技术

挥发油(volatile oils)又称精油(essential oils)，是一类在常温下能挥发的、可随水蒸汽蒸馏的、与水不相混的油状液体的总称。大多数挥发油具有芳香气味。挥发油是一类重要的活性成分，临床上除直接应用主要含挥发油的生药外，还可应用从中精制的挥发油，如桉叶油、薄荷油等。挥发油具有发散解表、芳香开窍、理气止痛、祛风除湿、活血化瘀、祛寒温里、清热解毒、解暑祛秽、杀虫抗菌等作用，如薄荷油用驱风健胃，当归油镇痛，柴胡油退热，土荆芥油驱肠虫等，此外挥发油还广泛应用于香料、食品与化妆品等的生产。

挥发油成分十分复杂，且来源不同，功效各异，挥发油可在心脑血管系统、中枢神经系统、呼吸系统、胃肠道系统、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒及促进药物吸收等多方面具有作用。如川芎挥发油：其主要成分均为藁苯内脂、二氢藁本内酯及丁烯基酜内酯等，川芎挥发油对牛蛙心脏具有显著的减慢心率和减弱心肌收缩力的作用，且量效关系明显，有升高血清总胆固醇的作用，能够改善微循环、降低血压、增加脑血流量及镇痛、调节心血管功能、抗凝血等作用；陈皮挥发油：柠檬烯、蒎烯、松油烯、月桂烯为陈皮挥发油主要组分，挥发油能松弛气管平滑肌、阻断或解除氯化乙酰胆碱或磷酸组胺所致的气管平滑肌的收缩痉挛、对豚鼠药物性哮喘具保护作用、能解除肠肌的收缩痉挛状态及抗过敏作用；莪术挥发油：关怀等采用水蒸气蒸馏法提取温莪术的挥发油鉴定其主要成分有桉油精、龙脑、榄香烯、石竹烯、蛇床烯、吉马烯D、莪术醇、新莪术二酮等，挥发油有直接抑制或破坏癌细胞，影响癌细胞核酸代谢、诱导肿瘤细胞凋亡、提高免疫保护效应、减少化疗副作用等，此外，莪术挥发油具有行气破血、消积止痛、抗炎、抗病毒、增强免疫功能和抑制血栓形成等作用。

现有技术也有多项植物挥发油的专利申请，CN101264111A公开了菱角挥发油在制备抑瘤药物中的应用，CN102002439A公开了药食两用植物突托蜡梅精油及其制备方法和用途，CN102357117A公开了广藿香挥发油及制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，CN102604741A公开了乳白香青挥发油的制备方法及其应用，CN103585190A公开了壁衣提取物在制备抗肝癌药物中的应用。

刺毛峨参(Anthriscus caucalis M.Bieb.)，属于伞形科科、峨参属植物。峨参属植物全世界20余种，主要分布于欧洲、亚洲、非洲和美洲。中国有2种，其中一种为刺毛峨参，其为一年生草本，株高45～100cm，花果期4～6月，适宜海洋性气候的低海拔地区，中国连云港后云台山有生长。

虽然现有技术有关于峨参成分的研究，但现有技术中尚未有关于刺毛峨参挥发油的报道。因此为拓展刺毛峨参应用领域，有必要对刺毛峨参挥发油进行研究。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种刺毛峨参挥发油的分离提取方法及刺毛峨参挥发油的应用，所述提取纯化方法提取效率高、工艺简单、成本低，获得的挥发油含水率低，具有良好的抗氧化、抑菌和抗癌活性。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

首先，针对刺毛峨参所含挥发油成分绝大部分在水中溶解度极低的特点，本发明提供一种刺毛峨参挥发油的提取纯化方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜刺毛峨参洗净晾干后粉粹至粒径为50-100目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，得含挥发油水系；

(2)向含挥发油水系中加入有机溶剂进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的有机溶剂中加入脱水干燥剂脱水，过滤回收有机溶剂即得到干燥纯净的挥发油。

为了便于快速有效提取以及防止原料焦化的问题，进一步的，本发明在上述步骤(1)中所述洗净晾干后的刺毛峨参与蒸馏水的质量比控制为1：2～6，进一步优选为1:3.5；所述刺毛峨参粉粹粒径优选为60目；而且发明人在实验研究中发现，粉粹颗粒较大，会使水蒸汽从原料间隙流出，从而使得提取率降低，且浪费资源；而粉粹粒径过小，则使得水蒸汽无法均匀透过原料，导致蒸汽从冲开的原料中逸出，同样导致提取率不高。

针对刺毛峨参所含挥发油的主要成分特征，以及避免加热过程造成挥发油成分中热敏性、易分解、易氧化成分损失，进一步的，本发明所述水蒸汽蒸馏提取时间控制为3-6h；适宜的提取时间能够保证尽可能由刺毛峨参中提取出挥发油组分，同时也避免提取时间过长造成的资源浪费，避免造成挥发油活性损失和挥发油品质降低。

进一步的，针对刺毛峨参所含挥发油的主要活性成分获取和分离，为了更为有效的从水蒸气蒸馏的油水系中尽可能较全的分离纯化刺毛峨参挥发油主活性成分，避免成分损失，提高挥发油成分提取率(包括成分种类和活性成分含量)，本发明所述有机溶剂采用乙酸乙酯、丙烯酸乙酯、正己烷、乙醚中的一种或几种，更为优选为乙醚；申请人发现，乙醚对刺毛峨参挥发油组分萃取效果最佳，相较于其他的有机溶剂具有更好的提取率，能够有效的将其40多种组分尽皆提取出来。

进一步的，所述脱水干燥剂选自无水硫酸钠或无水硫酸钙，优选为无水硫酸钠；

所述刺毛峨参挥发油的提取纯化方法，最优工艺为：

(1)取新鲜刺毛峨参洗净晾干后粉粹至粒径为60目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为4h，得含挥发油水系；其中，所述洗净晾干后的刺毛峨参与蒸馏水的质量比为1：3.5；

(2)向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚即得到干燥纯净的挥发油。

其次，本发明提供了一种由上述提取纯化方法制备得到的刺毛峨参挥发油。

所述刺毛峨参挥发油的主要化学成分包括β-甜没药烯、γ-杜松烯、(Z,E)-α-金合欢烯、γ-依兰油烯、α-金合欢烯、β-石竹烯、α-雪松烯和δ-杜松烯。

更为全面的，本发明所述刺毛峨参挥发油的主要化学成分包括：顺-罗勒烯、γ-萜品烯、萜品油烯、十一烷、沉香醇、乙酸-3-辛酯、青枝烯、对-甲基-1,5-二烯-8-醇、麝香草酚甲醚、十三烷、α-荜澄茄油烯、α-蒎烯、β-荜澄茄油烯、β-榄香烯、α-香柑油烯、异大香叶烯-D、α-雪松烯、β-石竹烯、(E)-β-金合欢烯、(Z)-β-金合欢烯、β-金合欢烯、大根香叶烯D、γ-依兰油烯、(Z,E)-α-金合欢烯、γ-杜松烯、α-金合欢烯、β-甜没药烯、双环大牻牛儿烯、δ-杜松烯、α-依兰油烯、γ-杜松烯、橙花叔醇、绿花白千层醇、β-榄烯酮、石竹素、τ-依兰油醇、荜澄茄油烯醇、τ-杜松醇、α-杜松醇、α-红没药醇、顺-金合欢醇、3-氧代-7,8-二氢-α-紫罗兰醇、新植二烯、棕榈酸、植醇。

优选的，本发明所述刺毛峨参挥发油组成如表2所示。

针对刺毛峨参挥发油的主要化学成分的有效提取，也便于更为有效的对刺毛峨参挥发油提取工艺进行过程质量控制，本发明提供一种由上述提取纯化方法制备得到的刺毛峨参挥发油的检测方法，所述方法包括采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析检测，检测条件为：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟4min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以15℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min；

检测并控制所述刺毛峨参挥发油化学成分，包括β-甜没药烯、γ-杜松烯、(Z,E)-α-金合欢烯、γ-依兰油烯、α-金合欢烯、β-石竹烯、α-雪松烯和δ-杜松烯等成分指标的检测和控制；

更为全面的，检测所述刺毛峨参挥发油的主要化学成分包括：顺-罗勒烯、γ-萜品烯、萜品油烯、十一烷、沉香醇、乙酸-3-辛酯、青枝烯、对-甲基-1,5-二烯-8-醇、麝香草酚甲醚、十三烷、α-荜澄茄油烯、α-蒎烯、β-荜澄茄油烯、β-榄香烯、α-香柑油烯、异大香叶烯-D、α-雪松烯、β-石竹烯、(E)-β-金合欢烯、(Z)-β-金合欢烯、β-金合欢烯、大根香叶烯D、γ-依兰油烯、(Z,E)-α-金合欢烯、γ-杜松烯、α-金合欢烯、β-甜没药烯、双环大牻牛儿烯、δ-杜松烯、α-依兰油烯、γ-杜松烯、橙花叔醇、绿花白千层醇、β-榄烯酮、石竹素、τ-依兰油醇、荜澄茄油烯醇、τ-杜松醇、α-杜松醇、α-红没药醇、顺-金合欢醇、3-氧代-7,8-二氢-α-紫罗兰醇、新植二烯、棕榈酸、植醇。

针对刺毛峨参挥发油的主要化学成分分析，其成分仅含量明显有异与其他物种，因此上述检测方法可以用于刺毛峨参挥发油的鉴别以及将上述分离方法结合检测方法用于刺毛峨参的鉴别。

此外，本发明研究了所述刺毛峨参挥发油的系列可能功用，公开了上述刺毛峨参挥发油的应用。

具体的，本发明公开了所述刺毛峨参挥发油作为抗氧化剂应用于食品、药品、化妆品或保健品的用途。

另外，本发明还公开了上述刺毛峨参挥发油的应用，所述刺毛峨参挥发油作为抑菌剂应用于食品、药品、化妆品或保健品；进一步的，所述刺毛峨参挥发油作为金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的抑菌剂。

进一步的，本发明公开了上述刺毛峨参挥发油的应用，所述刺毛峨参挥发油作为抗癌制剂应用于食品、药品或保健品；进一步的，所述刺毛峨参挥发油作为肝癌和乳腺癌的抗癌制剂。

例如药品，以刺毛峨参挥发油为原料，根据不同的剂型选配相应的药学上可接受的载体，制成口服的混悬剂、胶囊剂、乳状剂，直接通过肠胃吸收用于抗癌作用；可以制成泡沫剂、乳状剂和混悬剂，直接涂抹或喷洒在病灶部位，外用药的原理是利用挥发油的渗透作用，通过皮肤或者粘膜吸收后作用于病灶，外用药例如治疗乳腺癌。

本发明取得了以下有益效果：

(1)本发明首次采用水蒸气蒸馏和有机萃取技术提取纯化得到刺毛峨参挥发油，所述提取工艺针对刺毛峨参挥发油成分特点，可以有效防止原料焦化、避免加热过程造成挥发油成分中热敏性、易分解、易氧化成分损失、避免造成挥发油活性损失和挥发油品质降低，提高挥发油成分(包括成分种类和活性成分含量)的提取率；并且提取纯化方法工艺简单，成本低，制备工艺中的蒸馏水和有机溶剂能够重复利用，经本发明制备工艺获得的挥发油含水率低，挥发油主活性成分较全面保留。

(2)本发明首次建立了刺毛峨参挥发油的组成及量化分析，通过刺毛峨参挥发油的特点与峨参或其他物种挥发油活性成分的不同，分别建立了刺毛峨参挥发油提取工艺的质量控制检测方法和刺毛峨参挥发油的鉴别以及于刺毛峨参的鉴别方法。

(3)本发明所述于刺毛峨参挥发油，经试验验证同时具有良好的抗氧化、抑菌和抗癌活性，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌均有良好的抑菌作用，对HepG2(人肝癌细胞)和MCF-7(人乳腺癌细胞)具有良好的抗癌抑癌效果，适合工业化生产应用。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中挥发油成分十分复杂，且来源不同，功效各异，而刺毛峨参营养丰富，因此为进一步开发新的挥发油以及拓展刺毛峨参应用领域，有必要对刺毛峨参挥发油进行研究，然而现有技术中尚未有关于刺毛峨参挥发油的报道。

本申请的一种典型的实施方式中，提供一种刺毛峨参挥发油的提取纯化方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜刺毛峨参洗净晾干后粉粹至粒径为50-100目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，得含挥发油水系；

(2)向含挥发油水系中加入有机溶剂进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的有机溶剂中加入脱水干燥剂脱水，过滤回收有机溶剂即得到干燥纯净的挥发油。

峨参属的植物现有已发现90余种化合物，这些化合物的结构主要为木脂素类、苯丙素类、黄酮类、香豆精类、有机酸类、醇类、烃类、皂苷类、氨基酸及多糖、挥发油等，而发明人发现刺毛峨参挥发油有自己的特点和化合物种类(如表2所示)，发明人前期研究刺毛峨参挥发油的特点，采用多种方式尝试提取刺毛峨参挥发油，并通过GC-MS检测，发现刺毛峨参所含挥发油成分绝大部分化合物在水中溶解度极低，相对更适宜通过水蒸气蒸馏法进行提取，因此提出本方案，其相较于其他挥发油提取方式而言，挥发油提取效率以及挥发油种类比例提取更高。

其中，水蒸气蒸馏法提取刺毛峨参挥发油过程中，极易产生原料焦化的问题，发明人实验发现，控制刺毛峨参干粉的粒径是一个至关重要的因素，将粒径限制在50目以上，焦化现象明显消失，在此基础上，发明人进一步的采用合适的刺毛峨参与蒸馏水的比例，减缓原料焦化问题和辅助提取。

具体的实施方案中，本发明所述洗净晾干后的刺毛峨参与蒸馏水的质量比为1：2～6，进一步优选为1:3.5；所述刺毛峨参粉粹粒径优选为60目；发明人在实验研究中发现，粉粹颗粒较大，会使水蒸汽从原料间隙流出，从而使得提取率降低，且浪费资源；而粉粹粒径过小，则使得水蒸汽无法均匀透过原料，导致蒸汽从冲开的原料中逸出，同样导致提取率不高。

此外，由于刺毛峨参的提取工艺是新建立的，在本发明期间，发明人参考了其他植物挥发油的提取工艺，然而与之不同的是，本发明所述挥发油含有较多易氧化成分(以烯类居多)，为避免加热过程造成挥发油成分中热敏性、易分解、易氧化成分损失，本发明所述水蒸汽蒸馏提取时间限制在3-6h；适宜的提取时间能够保证尽可能由刺毛峨参中提取出挥发油组分，同时也避免提取时间过长造成的资源浪费。

所述有机溶剂选自乙酸乙酯、丙烯酸乙酯、正己烷、乙醚中的一种或几种，优选为乙醚；申请人对于水蒸气蒸馏-有机溶剂萃取法进行单因素实验发现，乙醚对刺毛峨参挥发油组分萃取效果最佳，相较于其他的有机溶剂具有更好的提取率。

所述脱水干燥剂选自无水硫酸钠或无水硫酸钙，优选为无水硫酸钠。

本发明的优选的一个实施方式中，刺毛峨参挥发油的提取纯化方法，包括：

(1)取新鲜刺毛峨参洗净晾干后粉粹至粒径为60目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为4h，得含挥发油水系；其中，所述洗净晾干后的刺毛峨参与蒸馏水的质量比为1：3.5；

(2)向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚即得到干燥纯净的挥发油。

本发明的一个实施方式中，提供一种由上述提取纯化方法制备得到的刺毛峨参挥发油。

所述刺毛峨参挥发油的主要化学成分包括β-甜没药烯、γ-杜松烯、(Z,E)-α-金合欢烯、γ-依兰油烯、α-金合欢烯、β-石竹烯、α-雪松烯和δ-杜松烯。

更为全面的，本发明所述刺毛峨参挥发油的主要化学成分包括：顺-罗勒烯、γ-萜品烯、萜品油烯、十一烷、沉香醇、乙酸-3-辛酯、青枝烯、对-甲基-1,5-二烯-8-醇、麝香草酚甲醚、十三烷、α-荜澄茄油烯、α-蒎烯、β-荜澄茄油烯、β-榄香烯、α-香柑油烯、异大香叶烯-D、α-雪松烯、β-石竹烯、(E)-β-金合欢烯、(Z)-β-金合欢烯、β-金合欢烯、大根香叶烯D、γ-依兰油烯、(Z,E)-α-金合欢烯、γ-杜松烯、α-金合欢烯、β-甜没药烯、双环大牻牛儿烯、δ-杜松烯、α-依兰油烯、γ-杜松烯、橙花叔醇、绿花白千层醇、β-榄烯酮、石竹素、τ-依兰油醇、荜澄茄油烯醇、τ-杜松醇、α-杜松醇、α-红没药醇、顺-金合欢醇、3-氧代-7,8-二氢-α-紫罗兰醇、新植二烯、棕榈酸、植醇。

为了便于更为有效的对刺毛峨参挥发油提取工艺进行过程质量控制，本发明优选的实施方式为，一种由上述提取纯化方法制备得到的刺毛峨参挥发油的检测方法，所述方法包括采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析检测，检测条件为：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟4min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以15℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min；

检测并控制所述刺毛峨参挥发油化学成分，包括β-甜没药烯、γ-杜松烯、(Z,E)-α-金合欢烯、γ-依兰油烯、α-金合欢烯、β-石竹烯、α-雪松烯和δ-杜松烯等成分的控制；

更为全面的，检测所述刺毛峨参挥发油的主要化学成分包括：顺-罗勒烯、γ-萜品烯、萜品油烯、十一烷、沉香醇、乙酸-3-辛酯、青枝烯、对-甲基-1,5-二烯-8-醇、麝香草酚甲醚、十三烷、α-荜澄茄油烯、α-蒎烯、β-荜澄茄油烯、β-榄香烯、α-香柑油烯、异大香叶烯-D、α-雪松烯、β-石竹烯、(E)-β-金合欢烯、(Z)-β-金合欢烯、β-金合欢烯、大根香叶烯D、γ-依兰油烯、(Z,E)-α-金合欢烯、γ-杜松烯、α-金合欢烯、β-甜没药烯、双环大牻牛儿烯、δ-杜松烯、α-依兰油烯、γ-杜松烯、橙花叔醇、绿花白千层醇、β-榄烯酮、石竹素、τ-依兰油醇、荜澄茄油烯醇、τ-杜松醇、α-杜松醇、α-红没药醇、顺-金合欢醇、3-氧代-7,8-二氢-α-紫罗兰醇、新植二烯、棕榈酸、植醇。

发明人研究发现，本发明所述刺毛峨参挥发油的主要化学成分成分含量明显有异与其他物种，如现有峨参属植物已报道的峨参叶、花中含有的苄醇、苯乙醇、苯酚、O-甲酚、丁香油酚；峨参叶中含有的p-甲酚、m-甲酚、邻甲氧基苯酚、β-法尼烯；峨参根、叶、花中含有的β-香叶烯、柠檬油精、松油烯、p-异丙基苯；峨参根、叶中含有的α-蒎烯；峨参花中含有的芳樟醇等，而刺毛峨参挥发油主要成分以烯类(β-甜没药烯、γ-杜松烯、(Z,E)-α-金合欢烯、γ-依兰油烯、α-金合欢烯、β-石竹烯、α-雪松烯和δ-杜松烯)为主，具体见表2。

因此，本发明的一个实施方案中将上述检测方法用于刺毛峨参挥发油的鉴别以及将上述分离方法结合检测方法用于刺毛峨参的鉴别。

例如，一种刺毛峨参挥发油的鉴别方法，所述方法包括将待测挥发油采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析检测，检测条件为：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟4min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以15℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min；

待测挥发油检测结果与刺毛峨参挥发油化学成分(β-甜没药烯、γ-杜松烯、(Z,E)-α-金合欢烯、γ-依兰油烯、α-金合欢烯、β-石竹烯、α-雪松烯和δ-杜松烯)比对。

一种刺毛峨参的鉴别方法，所述方法包括待测物种挥发油的提取和待测物种挥发油的检测，

所述待测物种挥发油的提取包括：(1)取待测物种洗净晾干后粉粹至粒径为50-100目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，得含挥发油水系；

(2)向含挥发油水系中加入有机溶剂进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的有机溶剂中加入脱水干燥剂脱水，过滤回收有机溶剂即得到干燥纯净的挥发油；

待测物种挥发油的检测包括：将待测物种挥发油采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析检测，检测条件为：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟4min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以15℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min；

待测挥发油检测结果与刺毛峨参挥发油化学成分(β-甜没药烯、γ-杜松烯、(Z,E)-α-金合欢烯、γ-依兰油烯、α-金合欢烯、β-石竹烯、α-雪松烯和δ-杜松烯)比对。

此外，本发明研究了所述刺毛峨参挥发油的系列可能功用，公开了上述刺毛峨参挥发油的应用。

发明人前期也研究过多种植物挥发油的功能，如錾菜挥发油、豆腐菜挥发油、五味子挥发油等，但不同植物挥发油成分十分复杂，且来源不同，功能也存在较大差异，据发明人了解，同时具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤活性多功能用途的挥发油种类仍较少，其功能仍主要跟活性成分及其相关比例有关，发明人前期发现了豆腐菜挥发油具有此功能，北五味子挥发油也具有该功效(牛莉萍等)，而在研究刺毛峨参挥发油过过程中，发明人发现该挥发油同时具有良好的抗氧化、抑菌和抗癌活性多种功能，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌均有良好的抑菌作用，对HepG2(人肝癌细胞)和MCF-7(人乳腺癌细胞)具有良好的抗癌抑癌效果。

具体的实施方式中，本发明公开了所述刺毛峨参挥发油作为抗氧化剂应用于食品、药品、化妆品或保健品的用途。

另外，本发明还公开了上述刺毛峨参挥发油的应用，所述刺毛峨参挥发油作为抑菌剂应用于食品、药品、化妆品或保健品；进一步的，所述刺毛峨参挥发油作为金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的抑菌剂。

进一步的，本发明公开了上述刺毛峨参挥发油的应用，所述刺毛峨参挥发油作为抗癌制剂应用于食品、药品或保健品；进一步的，所述刺毛峨参挥发油作为肝癌和乳腺癌的抗癌制剂。

例如药品，以刺毛峨参挥发油为原料，根据不同的剂型选配相应的药学上可接受的载体，制成口服的混悬剂、胶囊剂、乳状剂，直接通过肠胃吸收用于抗癌作用；可以制成泡沫剂、乳状剂和混悬剂，直接涂抹或喷洒在病灶部位，外用药的原理是利用挥发油的渗透作用，通过皮肤或者粘膜吸收后作用于病灶，外用药例如治疗乳腺癌。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

预实验

水蒸气蒸馏法：

(1)取500g干刺毛峨参粉粹磨粉，加入1000g蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为4h，得含挥发油水系；

(2)向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚即得到干燥纯净的挥发油。

同时蒸馏萃取法：

称取500g干刺毛峨参粉粹磨粉于蒸馏烧瓶巾，加入1000g蒸溜水，同时量取乙醚于蒸馏烧瓶中，连接同时蒸德萃取装置，同时蒸留萃取收集乙醚液，并用无水硫酸钠脱水，乙醚萃取液于旋转蒸发仪真空浓缩，得到挥发油。

乙醚回流萃取法：

称取500g干刺毛峨参粉粹磨粉于蒸馏烧瓶巾，加入乙醚进行回流萃取。

表1预实验结果

实施例1刺毛峨参挥发油的提取纯化方法

(1)取500g新鲜刺毛峨参洗净晾干后粉粹至粒径为60目，加入1000g蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，蒸馏提取时间为4h，得含挥发油水系；

(2)向含挥发油水系中加入乙醚进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的乙醚溶液中加入无水硫酸钠脱水，过滤回收乙醚即得到干燥纯净的挥发油。

实施例2刺毛峨参挥发油的检测方法

采用GC-MS对实施例1得到的刺毛峨参挥发油进行检测，具体检测条件如下：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟4min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以15℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min。离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min。共检测出刺毛峨参挥发油中化学成分45种，具体化学成分及相对含量见表2。

表2刺毛峨参挥发油化学成分

实施例3刺毛峨参挥发油的抗氧化作用试验

1、DPPH测试液的配制0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004％的DPPH溶液，避光保存，备用。

2、实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液(0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml)1.0ml，放入10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率(％)＝A0-(As-Ac)/A0×100％

公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值，As—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值，Ac—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值，将实验重复三次，求得清除率的平均值。

用DPPH基础方案确定精油的抗氧化活性。通过分光光度计在517nm测量精油的自由基清除活性。在测定之前立即制备DPPH的甲醇溶液。将各种浓度的各2mL样品(0.100,0.150,0.200,0.250,0.300,0.350,0.400,0.450,0.500mg/mL)加入到2mL DPPH溶液中。将反应混合物振摇，并在阴凉处静置30分钟。通过分光光度计在517nm测量样品的吸光度。在该测定中，丁基化羟基甲苯(BHT)用作标准抗氧化剂以验证测定。实验重复三次。实验结果以DPPH自由基清除率表示，见表3。

表3刺毛峨参挥发油的抗氧化作用

由表3可以看出，刺毛峨参挥发油对自由基有良好的清除作用。

通过具体实施实例说明刺毛峨参挥发油可作为天然抗氧化剂用于食品、药品保健品或化妆品行业，代替有毒副作用的合成抗氧化剂。

实施例4刺毛峨参挥发油的抑菌作用

1、试验菌种和培养基

试验菌种：选择四种细菌菌株用于抑菌试验，包括革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)，枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)和革兰氏阴性菌：大肠杆菌(ATCC 25922)，绿脓杆菌(ATCC 27853)。

试验用培养基：细菌MHB(Mueller Hinton Broth)培养基。

2、试验方法

(1)灭菌：

将实验所需要的培养基、试管、培养皿、滤纸片(6mm)、枪头、蒸馏水等在121℃湿热灭菌20min，灭完菌将其放置超净工作台紫外灭菌30min。

(2)菌悬液的配制：

从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种于相应的MHB培养基中，放入恒温摇床中37℃条件下隔夜培养。分别吸取以上培养好的处于对数生长期的供试菌液0.5mL，用MH肉汤稀释成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。再用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后，得到1-2×10⁶CFU/ml备用。

(3)供试药物：

对照药物：氯霉素；样品：实施例1所得刺毛峨参挥发油的5mg/mL稀释液。

(4)抑菌活性的测定：

采用滤纸片法测定抑菌活性。无菌条件下，在已灭菌的培养皿中倾入MHA培养基20mL，冷却凝固后制成固体平板。向每个固体平板中加入100μL已稀释好的菌悬液，涂布均匀，放置5min，使培养基充分吸收菌液。用记号笔在有菌琼脂平板上标号。用无菌镊子将灭完菌的干燥的滤纸片夹出，放入写相应对照编号的培养皿中，向灭完菌的干燥的滤纸片滴加配制好的样品溶液或氯霉素溶液10μL，每个样品做三个平行，放入37℃恒温培养箱培养24h。培养时间到后取出培养皿观察透明抑菌圈，采用十字交叉法用测微尺测量每个抑菌圈两个垂直方向的直径大小，取其平均值(mm)为测定结果，每项抑菌实验均平行重复3次。以抑菌圈直径的大小来进行抑菌活性强弱的判定，抑菌圈表现得越大，则表明其抗菌活性也就越强。

(5)MIC的测定：

吸取稀释好的菌液加于96孔细胞培养板中，每孔100μL，并加入已配置好的不同浓度的药物100μL。倒数第二孔不加药物(仅加培养基和细菌)加入稀释菌液100μL，为细菌生长对照孔。最后一列为阳性对照氯霉素。置于振荡器上振荡1min，使孔内溶液充分混匀后，将96孔板振荡摇匀后置于37℃恒温培养箱中培养16-18小时后，向每孔中加入用无菌水配置的1％TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)溶液20μL，振荡摇匀于37℃恒温培养箱中培养30到60分钟，观察每孔颜色变化。取未呈现颜色变化的最后一孔所含挥发油浓度为其最低抑菌浓度MIC。

重复所有MIC值的测量一式三份。

3、实验结果

抑菌效果用最小抑菌浓度MIC表示，测量结果见表4。

表4刺毛峨参挥发油抑菌活性

由表4可以看出，刺毛峨参挥发油对4种供试菌都有一定的抑制作用，其对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.150mg/mL，对枯草杆菌的最低抑菌浓度为0.095mg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.105mg/mL，对绿脓杆菌的最低抑菌浓度为0.320mg/mL。

通过具体实施实例说明刺毛峨参挥发油可作为天然抗菌剂用于食品、药品保健品或化妆品行业，代替有毒副作用的合成抗菌剂。

实施例5刺毛峨参挥发油的细胞毒性

1、细胞培养

HepG2(人肝癌细胞)和MCF-7(人乳腺癌细胞)细胞株用含10％新生牛血清以及青霉素、链霉素各100U/mL的RPMI1640培养基置于37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱中培养。

2、MTT法检测细胞活力

取对数生长期的肿瘤细胞悬浮于含10％胎牛血清以及2mM谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中，用玻璃吸管轻轻吹打成单细胞悬液，用TC10自动细胞计数仪计数。将细胞接种于96孔培养板，细胞密度为5×10³个/mL，每孔200μL。在37℃、5％CO₂的培养箱预培养24h使细胞粘附后，加入预先配制的浓度分别为0.016、0.031、0.063、0.125、0.250、0.500、1和2mg/mL的挥发油溶液对肿瘤细胞进行处理。并设阴性对照及空白对照。再分别连续培养24h、48h、72h，然后用MTT法测定。每孔加入10μL 5mg/mL的MTT溶液，继续培养2h后，吸去上清液。每孔加入100μL DMSO，置微量振荡器振荡10min使结晶完全溶解，于Multiskan Ascent酶标仪在波长570nm下测定吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率，该测定一式三份。细胞增殖抑制率如下计算。

细胞增殖抑制率/％＝[1-OD_处理组/OD_对照]×100％

3、实验结果

细胞毒性以抑制50％细胞生长时所需样品浓度即(IC50值)表示，测量结果见表5、表6。

表5刺毛峨参挥发油对HepG2细胞毒活性

表6刺毛峨参挥发油对MCF-7细胞毒活性

由表5、6可以看出，刺毛峨参挥发油对HepG2、MCF-7两种细胞都有一定的抑制作用，其对HepG2 72小时IC50为0.987mg/mL；对MCF-7 72小时IC50为0.807mg/mL。

通过具体实施实例说明刺毛峨参挥发油可作为天然抗癌细胞剂用于食品、药品或保健品行业。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种刺毛峨参挥发油的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取新鲜刺毛峨参洗净晾干后粉粹至粒径为50-100目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，得含挥发油水系；

(2)向含挥发油水系中加入有机溶剂进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的有机溶剂中加入脱水干燥剂脱水，过滤回收有机溶剂即得到干燥纯净的挥发油。

2.如权利要求1所述的一种刺毛峨参挥发油的提取纯化方法，其特征在于，所述洗净晾干后的刺毛峨参与蒸馏水的质量比为1：2～6，优选为1:3.5；所述刺毛峨参粉粹粒径为60目。

3.如权利要求1所述的一种刺毛峨参挥发油的提取纯化方法，其特征在于，所述有机溶剂选自乙酸乙酯、丙烯酸乙酯、正己烷、乙醚中的一种或几种，优选为乙醚。

4.如权利要求1所述的一种刺毛峨参挥发油的提取纯化方法，其特征在于，所述脱水干燥剂选自无水硫酸钠或无水硫酸钙，优选为无水硫酸钠。

5.权利要求1-4任一项所述提取纯化方法制备得到的刺毛峨参挥发油，优选的，所述刺毛峨参挥发油的主要化学成分包括β-甜没药烯、γ-杜松烯、(Z,E)-α-金合欢烯、γ-依兰油烯、α-金合欢烯、β-石竹烯、α-雪松烯和δ-杜松烯；进一步优选的，所述刺毛峨参挥发油的主要化学成分包括：顺-罗勒烯、γ-萜品烯、萜品油烯、十一烷、沉香醇、乙酸-3-辛酯、青枝烯、对-甲基-1,5-二烯-8-醇、麝香草酚甲醚、十三烷、α-荜澄茄油烯、α-蒎烯、β-荜澄茄油烯、β-榄香烯、α-香柑油烯、异大香叶烯-D、α-雪松烯、β-石竹烯、(E)-β-金合欢烯、(Z)-β-金合欢烯、β-金合欢烯、大根香叶烯D、γ-依兰油烯、(Z,E)-α-金合欢烯、γ-杜松烯、α-金合欢烯、β-甜没药烯、双环大牻牛儿烯、δ-杜松烯、α-依兰油烯、γ-杜松烯、橙花叔醇、绿花白千层醇、β-榄烯酮、石竹素、τ-依兰油醇、荜澄茄油烯醇、τ-杜松醇、α-杜松醇、α-红没药醇、顺-金合欢醇、3-氧代-7,8-二氢-α-紫罗兰醇、新植二烯、棕榈酸、植醇；更为优选的，所述刺毛峨参挥发油组成如表2所示。

6.一种刺毛峨参挥发油的检测或质量控制方法，其特征在于，所述方法包括采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析检测，检测条件为：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟4min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以15℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min，离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min；

检测或控制指标为权利要求5所述刺毛峨参挥发油化学成分。

7.一种刺毛峨参的鉴别方法，所述方法包括待测物种挥发油的提取和待测物种挥发油的检测，

所述待测物种挥发油的提取包括：(1)取待测物种洗净晾干后粉粹至粒径为50-100目，加入蒸馏水后搅拌进行水蒸汽蒸馏，得含挥发油水系；

(2)向含挥发油水系中加入有机溶剂进行萃取，弃去分出的水层，向含挥发油的有机溶剂中加入脱水干燥剂脱水，过滤回收有机溶剂即得到干燥纯净的挥发油；

待测物种挥发油的检测包括：将待测物种挥发油采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析检测，检测条件为：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：氦气；流速：1.2mL/min，溶剂延迟4min；升温程序：初始温度为60℃，保持1min，以15℃/min升温到200℃，保持5min，再以5℃/min升到280℃，保持2min，离子化方式：EI，70eV；离子源温度：250℃；载气：氦气；柱流速：1.2mL/min；

待测挥发油检测结果与权利要求5所述刺毛峨参挥发油进行成分比对。

8.权利要求5所述刺毛峨参挥发油的应用，其特征在于，所述刺毛峨参挥发油用于制备应用于食品、药品、化妆品或保健品的抗氧化剂。

9.权利要求5所述刺毛峨参挥发油的应用，其特征在于，所述刺毛峨参挥发油用于制备应用于食品、药品、化妆品或保健品的抑菌剂；优选的，所述刺毛峨参挥发油作为金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的抑菌剂。

10.权利要求5所述刺毛峨参挥发油的应用，其特征在于，所述刺毛峨参挥发油用于制备抗肿瘤制剂；优选的，所述刺毛峨参挥发油作为肝癌和/乳腺癌的抗肿瘤制剂。