CN1899341B - 美洲一枝黄花总黄酮提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及美洲一枝黄花总黄酮提取物及其制备方法和用途。美洲一枝黄花总黄酮提取物的总黄酮主要包括槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸等，能够预防和/或治疗老年痴呆，各种炎症引起的呼吸道疾病如咽喉炎、气管炎等，食道癌药物等，而这些疾病已逐渐成为影响人口生活质量的重要致病原因。该提取物的制备工艺简单，提取效率高；该提取物药理作用较强，性质稳定，安全低毒，质量可控。美洲一枝黄花作为外来入侵性植物，已严重破坏中国的自然资源和生态环境，很多地方已把其作为一种杂草除掉，本发明能变废为宝，为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究这些疾病及其相关疾病提供了一种新的药物来源。

Description

美洲一枝黄花总黄酮提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药、食品、饮料技术领域，具体地说是涉及中药提取物及其制备方法和用途，更具体地说是涉及一种中药美洲一枝黄花的总黄酮提取物及其制备方法和用途。

背景技术

(一)美洲一枝黄花的研究概况

1、概述

美洲一枝黄花，又称加拿大一枝黄花，为菊科植物一枝黄花属(Solidago)植物加拿大一枝黄花(Solidago Canadensis)的全草或根。美洲一枝黄花始载于《植物名实图考》山草类，其主要分布于华东、中南以及陕西、台湾等地。

一枝黄花属(Solidago)为菊科(Compositae)中的一属。一枝黄花属植物全球大约120种，在中国的分布有4种，分别为一枝黄花(Solidago decurrens Lour.)、新疆一枝黄花(Solidago virgaurea)、朝鲜一枝黄花(Solidago pacifica)和加拿大一枝黄花(SolidagoCanadensis)，另外，东北和新疆有一个变种：Solidago virgaureal.var.dahurica kitag.也是同等入药。

美洲一枝黄花是原产于北美的菊科多年生草本植物，适合于在低温的环境中生长，秋季开黄花。现在中国已经广泛引种栽培，由于其适应性非常强，生长旺盛，其花能散发出清香气味，花店已经作为插花材料使用。

一枝黄花在中国药用历史比较悠久，得到广泛应用。随着药学及其相关学科以及科研设备的发展，人们对于一枝黄花的认识也越来越丰富。一枝黄花中主要含有黄酮、皂苷以及甾醇类等化学成分，具有广泛的生理活性。由于近年来人们发现美洲一枝黄花具有良好的临床应用，已逐渐成为新的研究热点。

2、采制方法

美洲一枝黄花以全草入药，成熟时采收，洗净，晒干。

3、化学成分研究

美洲一枝黄花的化学成分研究甚少，就其化学研究，目前调查到的国内外研究材料的主要内容有：

(1)萜类化合物

Danuta从波兰产的美洲一枝黄花叶子和茎中分离鉴定了18种精油成分，其中主要含有γ2-Cadinenes(γ2-杜松烯，27.1％)、α-Pinene(α-蒎烯，13.0％)、柠檬烯(limonene，12.0％)和δ-Cadinenes(杜松烯，7.5％)。

Peter等从波兰产的美洲一枝黄花中利用GC-MS鉴定了主要成分是异大香叶烯-D(Germacrene D)，α-蒎烯和柠檬烯。

中国学者夏文孝等从杭州产的美洲一枝黄花中分析并鉴定了精油成分，其主要成分为异大香叶烯-D，另外还含有α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯，双环大香叶烯等挥发油成分。

Kasali等从美洲一枝黄花中分离得到两种新的精油成分，分别为6-epi-α-cubebene和6-epi-β-cubebene，其中后者含量高达20.5％。

(2)黄酮类成分

T.Anthonsen报道从美洲一枝黄花的根中分离得到一枝黄花酮(Solidagenone)成分。到目前为止，黄酮类报道的成分主要有以下化合物。Budzianowski从美洲一枝黄花的花中分离得到槲皮素(quercetin)、槲皮素-3-O-β-D-芸香苷(quercetin-3-O-β-D-rutinoside)、槲皮素-3-O-βD-葡萄糖苷(quercetin-3-O-β-D-galactoside)、山奈酚(Kaemoferol)、山奈酚-3-O-α-L-芸香苷(Kaemoferol-3-O-α-L-rutinoside)、绿原酸(chlorogrnic acid)、咖啡酸(caffeicacid)、异鼠李素(isorhamnetin)、山奈酚-3-O-α-L鼠李糖苷(Kaemoferol-3-O-α-L-rhamnoside)、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷(isorhamnetin-3-O-β-D-glycosides)。

(3)三萜(皂苷)类化合物

Murach从美洲一枝黄花中分离得到一个2，23-二羟基齐墩果酸(bayogenin)成分。

Reznicek等从美洲一枝黄花中分离得到4个新的齐墩果酸类型的皂苷化合物，分别为Canadensissaponins 1、Canadensissaponins 2、Canadensissaponins 3、Canadensissaponins 4、Canadensissaponins 5、Canadensissaponins 6、Canadensissaponins 7、Canadensissaponins 8。

Chaturvedula等从美洲一枝黄花的根中分离得到四种新的羽扇型三萜酸化合物：3β-(3R-acetoxyhexadecanoyloxy)-lup-20(29)-ene、3β-(3-ketohexadecanoyloxy)-lup-20(29)-ene、3β-(3R-acetoxyhexadecanoyloxy)-29-nor-lupan-20-on和3β-(3-hetohexadecanoyloxy)-29-nor-lupan-20-one，并且这几种化合物具有阻止DNAβ-聚合酶的裂解活性。

另外，Apati等从美洲一枝黄花中分离得到许多的矿物成分，如Al、Ca、Co、Cr、Cu、Fe、K、Mg、Mn、Na、P、S、Ti、Zn等。

4、药理作用研究

(1)抗氧化活性

McCune通过对加拿大国家的35种药用植物研究发现，美洲一枝黄花的甲醇提取物具有很强的抗氧化性，对于自由基的DPPH指标测试分析来看，美洲一枝黄花的提取物抗氧化能力明显强于绿茶提取物和抗坏血酸。

韩为民等研究发现，美洲一枝黄花植物的花具有良好的保鲜作用。

(2)利尿作用

研究表明，利用美洲一枝黄花提取物经小鼠皮下注射有一定的利尿作用，但是剂量比较大的时候反而使得尿量减少。

(3)抗炎作用

美洲一枝黄花水提取物或醇提物具有较好的抑制膀胱炎的作用，可以调节肾功能的紊乱。

(4)抗菌作用

实验表明，美洲一枝黄花煎剂对于金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌均有不同程度的抑制作用，对于红色癣菌及禽类癣菌有极强的杀菌作用。另外研究表明，美洲一枝黄花水煎醇提液有抗白色念珠菌作用，其疗效与制霉菌素相当。

(5)平喘祛痰作用

对于家兔实验性支气管炎(吸入氨蒸气法)，美洲一枝黄花煎剂，可以解除喘息症状，亦有祛痰作用。

(6)其他

根据文献记载，美洲一枝黄花全草具有清热解毒，消肿止痛的作用，可以用于感冒热头痛，咽喉肿痛以及肺热咳喘等病症。

5、美洲一枝黄花的临床应用研究

(1)治疗流行性感冒，上呼吸道感染

用美洲一枝黄花(鲜品)、马鞭草(鲜品)各50g(儿童酌减)，切碎，水煎服，每日1剂。共治疗60例，其中流感50例，上感10例。结果：除了1例因严重并发症改用其它药物外，均单用本方治愈，疗程最短1天，最长3天，大多数只服1剂即愈。

(2)治疗急性扁桃体炎

用美洲一枝黄花15g，煎服。每日1剂，以愈为度。治疗31例均痊愈，其中1剂治疗者4例，2剂14例，3剂13例。追访观察半年，无1例复发。另用美洲一枝黄花鲜品适量，捣烂绞汁，加入食盐和醋少许拌匀，徐徐含咽，共治小儿急性扁桃体炎300例。结果是服药1～3剂治愈率78％，服药4～6剂治愈率98％。美洲一枝黄花治疗本病有退热快，止痛佳，疗效快等特点。

(3)治疗真菌性阴道炎

每日用100％美洲一枝黄花水煎液揩洗阴道1次，10天为1疗程；另用制霉菌素50万单位片治疗(每日1片置阴道后穹隆部)，8～10天为1疗程)作对照。两组均在1疗程结束后第4天复检阴道分泌物，镜检阴性及症状消失者为有效。结果是用美洲一枝黄花组50例，有效44例，有效率为88％；用制霉菌素组26例，有效23例，有效率为88.4％，两组疗效无显著差异(P＞0.05)，提示美洲一枝黄花与制霉菌素疗效相当。

(4)预防口腔霉菌感染

黄飞翔等对充血性心力衰竭并发肺部感染患者用美洲一枝黄花煎液预防口腔霉菌感染，取得了良好的疗效。心衰并发肺部感染患者(观察组)122例，用美洲一枝黄花30g煎液100ml，分3次漱口，对照组用生理盐水漱口。结果是观察组中仅有1例出现口腔霉菌感染，对照组中出现12例口腔霉菌感染，两组比较非常显著差异。美洲一枝黄花煎液漱口可以有效的预防心衰患者口腔霉菌感染，价格低廉且无毒副作用，值得临床推广应用。

(5)治疗乳腺小叶增生

马国精利用美洲一枝黄花鲜品50g，荔枝核7粒，橘核7粒，鲜橘子叶3片，米酒200ml，炖服。药渣捣烂外敷忠处12小时，1日1剂，1个疗程5天。结果治愈率93.75％。

(6)治疗食管癌

以美洲一枝黄花内服、外用，配合服食老鼠肉，治疗晚期食管癌引起的疼痛、吞咽困难，延长存活期，疗效比较显著。

(二)阿尔茨海默症的研究进展

1、概述

痴呆症包括阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease，或称阿尔兹海默症，简称AD)、多重梗塞型痴呆(Multimfarct Dementia)、酒精性痴呆(Alcoholic Dementia)及正常脑压水脑症(Normal Pressure Hychocephalus)。

AD是一种慢性原发、进行性脑变性疾病，是发生于老年期或老年前期的一种进行性的神经退行性疾病，是进入暮年后的一种常见病态反应，属于非正常衰老状态的早老性痴呆病症。由于AD好发病于60岁以上老年人，所以习惯被称为老年痴呆症或早老性痴呆症。

AD以记忆减退、认知障碍，行为异常和语言能力丧失位特征，主要表现为大脑皮层获得性高级功能的全面障碍和认知功能明显受损，脑功能退化衰亡，即记忆功能迅速衰减及识别能力障碍，并伴有行为或人格方面的改变。

该类疾病病程一般较长，约为3～20年。对AD患者常年的护理费用是巨大的，不仅对整个社会的医疗保障系统有极大影响，对中国未来社会的小家庭模式也是极大的挑战。因此，其发生给社会、家庭均带来了沉重的经济负担和精神负担，也给患者自身带来极大的痛苦。目前，该疾病仍是全球较为棘手的病症之一，积极研究开发新的治疗方法是一件刻不容缓的事情。

2、病理表现及发病机制

AD的主要病理表现是在前脑基底、海马和大脑皮层细胞外神经炎斑的形成，细胞内神经纤维缠结的出现以及神经细胞和突触数目的减少。斑点主要由淀粉样前体蛋白(简称：APP)的蛋白水解产物β淀粉样蛋白(简称：Aβ)聚集组成。在正常情况下，APP水解产物是可溶性的Aβ₄₀，而在病理条件下，APP水解产物是长的易形成纤维的Aβ_1-42，它先以一种未成熟的、非纤维状的分散的斑点形式存在，最终经过构象改变，聚合成一种有毒的纤维状物质，即形成斑点。神经纤维缠结主要存在于锥状神经元的胞内和异常的神经轴突中，为一非水溶性结构，其主要组成为直径10nm的双螺旋纤维结构(简称：PHF)，主要成分是一种微管结合蛋白，即tau蛋白，正常的tau蛋白能稳定微管蛋白的相互作用，而PHFs中的tau蛋白则以超磷酸化的形式存在。

AD的病因学复杂，目前主要有两种假说：tau蛋白假说和淀粉样蛋白假说。tau蛋白假说的主要论点是：由于tau蛋白的超磷酸化导致微管蛋白的不稳定，引起高尔基体结构发生改变，从而影响APP的代谢，产生过量的Aβ。该假说还未在细胞或者动物个体水平得到证实。淀粉样蛋白假说的主要论点是：在细胞外神经病变发生的周围淀粉样蛋白的聚集，导致神经炎斑的形成和随后神经纤维缠结的形成。因此，淀粉样蛋白是AD病理链形成的起因。支持淀粉样蛋白假说的证据很广泛。

在AD病人中，对神经元的功能缺失和死亡起关键警示作用的是APP的蛋白水解过程，由此导致了Aβ的产生增加，并在大脑中以神经毒性形式聚集。Aβ是一种含有40～43个氨基酸的蛋白结构，一部分嵌在细胞膜内，另一部分则裸露在细胞外。Aβ蛋白的前身是淀粉样前体蛋白(简称：APP)，共长695～770个氨基酸，其绝大部分裸露在细胞外，一小部分嵌在细胞膜内及细胞质中。能够切除APP的3种酶是：α分泌酶、β分泌酶(beta-siteAPP-cleaving enzyme，简称：BACE)及γ分泌酶。Aβ的形成需要APP在β分泌酶作用下断裂形成N端的Aβ和在γ分泌酶作用下断裂形成C端的Aβ。α分泌酶能够在Aβ内部断裂APP，从而阻碍了Aβ的形成。由α分泌酶及γ分泌酶切除之产物则比Aβ小一点，称为P3蛋白。Aβ及P3皆会自细胞膜上游离出去，其中游离的Aβ又会自行凝聚成团，形成所谓的斑点。

以神经退行级联的特殊位点为靶点的药物正在研发中，由于在AD病理形成过程中，从APP转化成神经毒性的Aβ形式是一个决定性事件，研发能够阻断β分泌酶或γ分泌酶的药物是一个热点。能够降低Aβ生成的特殊的γ分泌酶抑制剂被开发出来，但由于它有阻断γ分泌酶断裂Notch和其它蛋白底物的副作用，它在人体的应用并不可行。BACE缺乏的小鼠能降低Aβ的生成而无明显异常生理现象，证实BACE抑制剂能够减少Aβ生成而无明显副作用，但是有可能存在除APP外的其他的有重要生理学意义的BACE的底物，抑制它们的形成可能引起其他严重问题。尽管在抑制β分泌酶和γ分泌酶方面作了许多努力，直接作用于α分泌酶却被忽视。目前极少有人考虑以α分泌酶作为药物靶点，α分泌酶在Aβ序列内部断裂，产生一条大的、可溶性的细胞外片段(简称：sAPPa)和一条小的细胞内片段(简称：C83)，这些片段并未表现出病理毒性，并且sAPPa还可能具有神经保护性能。由于α分泌酶和β分泌酶竞争APP，促进α分泌酶能够导致减少的病理性片段。理论上，直接或间接的α分泌酶的促进剂都有利于AD治疗。

3、流行病学情况

随着发达国家和发展中国家人均寿命的提高，患痴呆症的老年人数迅速增加。在所有的痴呆症中，以AD所占的比例最高(约50％～60％)。

据资料报道，随着年龄的增长，在人体组织老化和基因的影响下，痴呆现象的发生率不断升高；其中，AD随年老急剧上升，从60岁起，每4年～5年上升一倍；AD的发病率在65岁左右的老年人中约占10％，在85岁以上的老年人中约占47％，已经成为人类的第四号杀手。

过去学术界曾认为中国是AD低危险性国家，然而，早前于安徽屯溪召开的第二届中国老年人痴呆症和抑郁症学术研讨会暨国际老年痴呆学术研讨会上，这一观点受到挑战。有5份研究报告表明，中国也是AD高危国家，这次会议报道的大量研究成果还表明，中国对AD的研究正在迅速接近国际先进水平。

目前全球的AD病人估计在1200万左右，中国现有老年痴呆患者大约为300万～400万，且呈迅速上升趋势，确诊后一般约7年～9年内死亡。有资料表明，中国60岁以上人口早在1998年已达1.2亿，并以年均3.2％的速度递增，大大高于人口增长速度。75岁以上的老人有2000万，80岁以上老人有800万，并以年均5.4％的速度增加，下世纪中叶可达4亿左右，将成为世界上老龄人口最多的国家。

1988年中美上海调查研究表明，中国65岁以上老年人的痴呆发生率为4.6％，其中AD的比重为63％，多发梗塞性痴呆为28％，脑组织损伤后遗症、化学药物中毒以及神经系统失调或营养缺乏导致的痴呆约占10％。

上海的流行病学调查显示，中国55岁、65岁以上痴呆的患病率分别为2.57％和4.6％。北京老年病医疗研究中心对北京地区2788名60岁以上老人的调查发现，有208名老人患有痴呆症，患病率达7.5％。其中女性病人139人，患病率达9.7％，显著高于男性的5.8％。他们的研究还表明，高龄、低教育水平、居住在农村是老年痴呆症的高危因素。而解放军总医院对1728名离退休老干部的调查表明，有痴呆家庭史、“文革”中受迫害、电磁场暴露、脑外伤亦是老年痴呆症的危险因素。在广州城区75岁以上老年人痴呆患病率的调查中，AD患病率为7.49％。

4、老年痴呆症的治疗药物

AD是老年人的常见病之一，是一种渐进性的神经功能退化性失调症，目前本病的病因尚未得到充分阐明，一直是治疗上的一个棘手问题。

抗痴呆药物的研究和开发已引起世界各国医药界的高度重视。近年来，随着对老年人神经生理、生化、药理等方面研究的不断深入，导致相关药物的开发研究不断取得进展。2001年有1270多种产品投放市场，这些产品中90％是80年代发现、90年代研究与开发成功的，此类药物开发的新产品数目超过了任何其它治疗类药物开发的数目。

经过近10年的临床表明，乙酰胆碱酯酶(简称：AChE)抑制剂对AD具有一定的治疗作用，其主要药物他克林、利斯的明、多奈哌齐、加兰他敏已是这一领域中的代表性品种，从而也推动了痴呆治疗药品市场的发展进程。

(1)脑代谢激动剂

研究发现，老年痴呆症患者存在有糖代谢及核酸、蛋白质、脂质等代谢系统障碍，同时其脑血流量及耗氧量明显低于同龄正常人。因此，脑代谢激动剂和脑循环改善剂，特别是具有脑血管扩张作用的脑代谢激动剂就成为治疗本病可供选用的药物。此类药物有吡拉西坦、脑复康、吡硫醇、脑复新、氢化麦角碱、喜得镇、都可喜、长春胺、长效长春胺、长春乙酯、尼莫地平、尼莫通、桂利嗪、环扁桃酯、氯酯醒、己酮可可碱、巡能泰、麦角溴烟酯等。这些药物对老年痴呆症的某些症状如记忆力减退、适应环境能力降低等，有程度不同的改善作用。

(2)拟胆碱药

现已知脑内乙酰胆碱含量与记忆密切相关，老年或痴呆病人脑内乙酰胆碱量减少，补充胆碱类药物能改善其记忆和思维能力。但直接给予胆碱或卵磷脂并不能使乙酰胆碱增加。有人试以胆碱或卵磷脂与能通过血脑屏障的胆碱酯酶抑制剂毒扁豆碱合用于本病患者，可使其记忆力有提高，而单独给予卵磷脂效果不明显。另有人单用毒扁豆碱给本病患者静注，记忆测定成绩较安慰剂提高约20％，并发现对行为障碍也有效。研究认为，胆碱酯酶抑制剂可延迟乙酰胆碱的代谢分解，从而延长突触后受体的兴奋。另外，国内研制的哈伯因(石杉碱甲)，系中国学者从石杉属植物千层塔中分离到的一种新生物碱，药理实验证明，本品具有很强的拟胆碱活性，是一种高效、可逆的胆碱酯酶抑制剂。

(3)乙酰胆碱酯酶抑制剂(Acetylcholinesterase Inhibitors)

乙酰胆碱酯酶抑制剂包括毒扁豆碱(商品名Synapton，Forest实验室生产)、四氢氨基吖啶(他克林，商品名Cognex，Parke-Davis公司生产)、donepezil(商品名Aricept，辉瑞/卫材公司生产)、metrifonate(拜耳公司生产)和rivastigmine(商品名Exelon，诺华公司生产)。这些化合物通过抑制乙酰胆碱酯酶在神经腱内浓缩乙酰胆碱，并能持续更长的作用时间。

四氢氨基吖啶是第一个通过FDA并在临床上治疗阿尔茨海默病的胆碱酯酶抑制剂，但规定仍需作改进。该品生物利用度要低于rivastigmine和donepezil，并有较大的副作用。多奈哌齐(Donopozil)是第二代也是第二个被美国FDA特许用于治疗阿尔默海茨病(老年痴呆)的胆碱酯酶抑制剂，于1997年被FDA批准用于临床，可促进轻、中度老年痴呆病人的认知能力以及改善病人的精神状态和保持脑功能活性等作用。与第一代胆碱酯酶抑制剂相比，该品有多项优点：(1)作用时间长，每日只须口服一次；(2)药效强、疗效高；(3)安全性高、选择性高，药物不良反应小。目前该品已进入中国销售，国内也有厂家生产。

Sanochemia Pharmazeutika AG公司(维也纳、奥地利)宣布第一个在欧洲上市的乙酰胆碱酯酶抑制剂-Reminyl(加兰他敏)。该品被批准在瑞典上市，并报送欧盟以期获准进入欧洲其它市场。

麦的NeuroSearch公司最近利用NS2330进行临床研究开发。NS2330增加多巴胺和去甲肾上腺素的活性，同时也激活其抑制机制以刺激乙酰胆碱在大脑皮层(包括感知部位)的释放。这样所有三个神经传递素的功能都将受到阿尔茨海默病的影响。该公司希望NS2330能够具有较好的治疗效果，目前该药的I期临床工作已经完成，FDA也同意该公司继续II期临床工作。

其它用来研究的化合物还包括xanomeline(诺和诺德/礼来公司生产)、besperidine(赫司特公司生产)和talsaclidine(勃林格殷格翰/法玛西亚普强公司)。

①他克林

他克林的化学名为四氢氨基吖啶(简称：THA)，商品名Cognex，该药是美国华纳-兰伯特公司开发并第一个上市的中枢系统的非竞争、可逆性胆碱酯酶抑制剂，1993年获得FDA批准后首先在美国上市，是改善AD认知症新药和老年益智药物，同年在英国、法国、加拿大等国上市，其化合物专利于1996年到期，目前市场上主要是美国派德-戴维斯的产品。

他克林尤其对女性AD症具有显著的疗效，与卵磷脂合用可获得理想的效果，能明显改善患者的记忆力，因此他克林已被认为是治疗、预防早老性痴呆仅有的几种药物之一。

他克林的不足之处是对肝功能及转氨酶指数有较大影响，制约了市场的开发，其销售额的增长也远不如其它AD药物。经过进一步的研究，在他克林母核的基础上加成筛选，由德国赫斯特鲁塞尔公司研制出维那克林。该药是他克林1位羟基衍生物，其药物作用机制得到相应的改善，但仍有一些不良反应，随着医学的发展，将被新一代乙酰胆碱酯酶抑制剂所替代。

②多奈哌齐

多奈哌齐是具有高度选择性、可逆性治疗AD的药物，为第二代中枢性乙酰胆碱酯酶抑制剂，是日本卫材制药公司开发的药物，1996年11月25日获得FDA的特许批准用于临床，商品名安理申。1997年初首先在美国上市，由卫材/辉瑞共同开发全球市场，1999年10月安理申在中国上市，目前已形成了世界50多个国家地区的销售网络。

多奈哌齐是第二个获准治疗老年痴呆症的药物，其最大优势是治疗达标剂量小、毒副作用低，耐受性好。专家普遍认为，该药在AD治疗药物中处于领先地位，在四个主要品种中占据了60％的市场份额，预计这一优势将延续到能够对疾病治疗产生重要影响的新药问世为止。

据Pharma Business杂志报道：在2000年全球最畅销500种药品中，日本卫材公司销售额为4.31亿美元，辉瑞公司的销售额为1.19亿美元，分别比上一年增长了27.3％和30.8％。2001年多奈哌齐在全球排第101名，销售额合计约6.83亿美元，2002年在全球超过了1100亿日元，已是AD市场中的佼佼者。

2001年中国医药研究开发中心、重庆桑田药业开发了多奈哌齐原料药及其片剂产品，国家药品监督管理局批准其以四类新药生产。

③利斯的明

利斯的明是氨基酸甲酸类脑选择性胆碱酯酶抑制剂，属于该类药的第二代产品，由瑞士诺华制药英国公司开发，商品名艾斯能，1997年12月首先在瑞士上市，次年在英国上市。2000年4月21日获得FDA批准，同年6月底在美国上市，从而扩展了阿尔茨海默症治疗药物市场的格局。

研究结果显示：该药虽然半衰期相对较短，但对胆碱酯酶抑制作用可达10小时，该药不经肝脏及P450代谢，对轻、中度早老性痴呆症耐受性较好，同时具有抑制脑内的丁酰胆碱酯酶作用，在欧洲、美国等45个国家进行的一项前瞻性、随机多中心双盲研究中获得较高的评价。

由于利斯的明在药物市场中获得越来越多的份额，2000年的销售额比上一年增长了83％，为1.195亿美元，2001年利斯的明在全球销售额增加101％，已达2.4亿美元。

④加兰他敏

加兰他敏属于第二代乙酰胆碱酯酶抑制剂药物，其药物成份与欧洲山区水仙花鳞茎提取的生物碱相同，该植物药在一些国家、地区已经有过30多年的临床应用，用于治疗逆转神经肌肉阻滞、重症肌无力和幼儿脑型麻痹症等。

加兰他敏是希雷与强生公司合作开发的化学合成药物，制剂有片剂、胶囊、口服液等，临床用于改善AD患者总体功能。该药具有双重作用机制，能较好的刺激和抑制乙酰胆碱酯酶，并且能够调节脑内的烟碱受体位点，可显著改善轻、中度早老性痴呆病人的认知功能，延缓脑细胞功能减退的进程。

加兰他敏于2000年7月被欧盟批准后在英国、爱尔兰首次上市，2001年获美国FDA许可用于治疗阿尔茨海默症，现已在25个国家上市。希雷公司负责在英国、爱尔兰的销售，强生公司负责美国和其它欧洲国家的销售。国外报道2001年加兰他敏销售额为1.36亿美元。

1998年上海申兴制药厂已生产加兰他敏原料药，1999年国家药品监督管理局批准苏州第六制药厂生产四类新药氢溴酸加兰他敏胶囊，2001年上海申兴产量同比增长3倍，年产量达到30kg。该药进入市场后，临床推广长足迈进，2000年已在中国主要城市重点医院抗痴呆药品中崭露头角。

近几年，乙酰胆碱脂酶抑制剂已成为AD的一线治疗药物，确认了其有效缓解认知功能障碍的地位，产品销售量占据了抗痴呆药物中的最大份额，研究表明石杉碱甲、毒扁豆碱、美曲磷脂对阿尔茨海默症也有一定的治疗作用，中科院上海药物所开发的石杉碱甲化合物已申请了国际专利，其作用机制正在进行深入的研究，北京四环制药、宁波立华制药、上海汉殷药业和上海医科大学红旗药厂获得了新药证书和生产文号。

(4)钾通道阻滞剂

研究表明，非选择性的钾通道阻滞剂通过延迟去极化和延长突触前神经末梢的钙流入引起神经递质(包括Ach)释放增加。若要想这类药物用于治疗老年痴呆，则所用药物应具备能增加乙酰胆碱的释放而不减少膜磷脂酰胆碱组成的优点，而减少膜磷脂酰胆碱的组成可能是AchE抑制剂存在的副作用。磷脂酰胆碱是胆碱的贮存库，被神经元用来合成Ach。膜磷脂酰胆碱的损失使乙酰胆碱的合成受到限制，导致胆碱输出量减少。临床研究已表明非选择性钾通道阻滞剂对改善患者的识别能力仅有中度作用，其作用不强可能是这些药物的中枢神经系统穿透力低，选择性差或活性不够等，有待于进一步研究加以完善。

(5)谷氨酸受体调控剂

在老年疾呆症患者的大脑中，皮质皮层和离皮层途径的锥体细胞发生了神经纤维混乱和退化。据报道，这些锥体细胞以谷氨酸为兴奋递质。这些神经元受损，功能丧失时会导致老年痴呆症；但若功能过强，则会产生兴奋性毒性，引起神经元死亡，造成多种神经退化性疾病。因此，调控退化的谷氨酸神经元的突触活性有望治疗老年痴呆症。研究表明，直接活化突触后受体将有利于谷氨酸的传递，其部分激动剂具有这样的优点，即当内源性谷氨酸低于正常水平时起激动剂作用，而当谷氨酸释放过量时起拮抗剂作用，因此，部分激动剂会对兴奋毒性情况产生神经保护作用。已有报道的药物如美金刚胺(memantine)，当谷氨酸以病理量释放时，美金刚胺会减少谷氨酸的神经毒性作用；当谷氨酸释放过少时，美金刚胺可以改善记忆过程所需谷氨酸的传递，临床研究表明，美金刚胺用于老年痴呆症患者具有较好的耐受性，在精神病理学和行为测定中产生温和的有统计学意义的显著改善。

(6)5-羟色胺3受体拮抗剂

5-羟色胺3(简称：5-HT3)受体拮抗剂原用于止吐，现有研究根据5-HT3受体在大脑中的分布状态，推测此类拮抗剂应有其它中枢神经系统的作用。如5-HT3拮抗剂昂丹司琼枢复宁能改善胆碱能神经功能正常和不足的动物如鼠、狨等的识别能力；在50岁以上与老年有关的记忆力受损(AAMI)病人的临床试验中，昂丹司琼能使相当于丧失6年的记忆力得到改善。因此，昂丹司琼及其他5-HT3受体拮抗剂(托烷司琼、格拉司琼等有可能给老年痴呆患者带来福音。

(7)天然药物方面的研究

现今很多医药公司还把目光移向天然药物，试图从中开发出有效的治疗药物。在这方面同样也取得了一定的进展。

①阿朴脂蛋白E4(ApoE4)

众所周知，阿尔茨海默病的发病情况与遗传基因有着较为紧密的联系，阿朴脂蛋白E4ApoE4是特别值得让大家去注意并朝着治疗和预防阿尔茨海默病的方向进行研究。在药物开发中，ApoE4已经进行过人体药物临床试验，并极有可能成为疗效比较确切的药品。

②β-淀粉素(体)(Beta-amyloid)

β-淀粉素是一种不能溶解的多肽。该种物质能够有效防止激烈氧化过程中导致的二乙基溴乙酰胺的破坏。在从事阿尔茨海默病研究理论中就是利用β-淀粉素限制自由基的产生以及清除自由基，以防止自由基所带来的损害。这种类型的化合物包括idebenone(武田公司、Osaka日本)，该化合物既是一种自由基的清道夫也是某种神经增长因子的刺激物。早期研究表明，idebenone能有效治疗中度痴呆症。尽管葛兰素威康公司(英国)和美国家用产品公司已经在少数一些国家上市，但它已经从日本退出市场，而且其III期临床试验已经被停止。

(8)其它类型药物的研究进展

2000年上半年，一些研究表明，雌激素替代疗法可以较明显地延缓妇女阿尔茨海默病的发作，并能降低阿尔茨海默病的病情严重化。个别临床研究也发现雌激素治疗能够提高感知度。雌激素对抗氧剂和抗炎药的作用能力可以减少发病的机率，推动乙酰胆碱的产生、促进神经细胞的生长和存活。

2000年年中，日本的Toyama Chemical公司期望开始在英国进行T-588的II期临床研究，并能在美国进行较早的试验。在纽约大学的合作下，公司发现T-588可以保护大脑神经细胞。

日本藤泽制药公司的FK-960在日本和美国进行。该药能够提高感知度，具有新的作用机制。在最近有关研究报道是表明，咀嚼可以防止上年纪的人记忆力衰退，但其作用机制现在仍然没有明确。研究人员通过研究小鼠的遗传改变来研究人体老化的迹象。实验表明，拔除牙齿以防止咀嚼的小鼠的记忆力要逊于正常对照小组。此外，研究人员还研究了咀嚼时大脑的活动情况，并发现下巴的活动可以增强脑部海马区的信号。

来自肯塔基州立大学的研究人员发现减少食用量可以保护大脑避免因年龄引起紊乱，这种紊乱类似于阿尔茨海默病。最近出版的研究论文表明，通过喂养减少食物量的小鼠，研究人员发现它们大脑的损伤能减少。对热量摄入量和人体神经变性疾病的研究还没有开始，但有一些相关性研究显示，相比于美国和加拿大，中国和日本由于摄入较少的热量，因此相应的阿尔茨海默病的发病率也减少。

加拿大的神经生物技术公司在2000年上半年宣布了一个较为确切的产品memantine。该产品是一种非竞争性N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)阻断剂，在美国进行了III期临床试验，主要用于治疗阿尔茨海默病。

5、老年痴呆症的市场发展前景

2000年世界七大药品市场表明，AD药品市场已从90年代中期的4亿多美元增长了近一倍，2001年全球AD市场价值已近12亿美元；国外分析家预测在未来十年内AD患者将会增加到20％左右，AD药品市场的增长速度将有较大幅度的上升。

由于患者的不断增多，AD治疗药物的市场销售额也一直在稳步增长。90年代该类药物已成为畅销药物，1995年世界销售额已达50亿美元。21世纪初，该类药物的销售额超过了排列在前三位的治疗心血管病药物、治疗胃肠道病药物和抗感染药物市场的份额，其发展势头看好。

目前，该类疾病已越来越受到中国国家和社会的高度重视，而且由于该类疾病类似于糖尿病等富贵病，一样需要长期服用治疗药物，因此其用药市场随着人口老龄化而逐渐扩大，市场前景看好。基于此，为及时了解中国治疗AD药物的市场状况，中国国家食品药品监督管理局南方医药经济研究所信息中心选取中国六个主要用药城市(北京、上海、广州、南京、杭州、成都)的百家抽样医院、60名医生专家和120名消费者，对中国国内老年痴呆症用药市场(1999年及2000年)及其主要竞争品种进行了全面的市场调研活动。

(1)1999年～2000年中国治疗老年痴呆药物医院用药金额情况分析

从1999年～2000年六城市(北京、上海、广州、南京、杭州、成都)抽样医院治疗老年痴呆症用药金额构成情况来看，2000年六城市抽样医院销售总金额较1999年同比增长28.49％。而在治疗老年痴呆药主要品种中，使用金额百分比较大的品种排名依次为吡拉西坦、银杏叶制剂、氢化麦角碱、阿米三嗪/萝巴新、阿尼西坦、尼麦角林、胞磷胆碱、石杉碱甲、多奈哌齐、吡硫醇、长春西汀、加兰他敏、氯酯醒、艾地苯醌。其中前四位品种市场份额(金额百分比)较大。

具体品种中，吡拉西坦的市场份额(金额百分比)2000年较1999年上升了8个百分点，仍居首位，金额增长率达55.59％。银杏叶制剂、氢化麦角碱保持较稳定的市场份额，使用金额都保持一定的增长。使用金额增长较快的品种有石杉碱甲、加兰他敏，其中加兰他敏增长幅度最高。阿米三嗪/萝巴新、阿尼西坦、尼麦角林、胞磷胆碱、长春西汀和吡硫醇总体市场出现萎缩，而艾地苯醌基本退出市场竞争。多奈哌齐由于是较新的品种，在1999年未见销售，但在2000年市场份额(使用金额百分比)占0.45％，显示出一定的市场潜力。

(2)1999年～2000年中国治疗老年痴呆药物医院用药金额走势分析

从1999年～2000年六城市老年痴呆用药金额走势情况来看，2000年整体用药水平要明显高于1999年整体用药水平，出现上升趋势。其中1999年用药金额高峰期和2000年用药金额高峰期均出现在二季度(2000年用药量高峰期是第三季度)，表明在2000年二季度高价品种的使用量相对要高。从六城市用药情况中可以反映出中国城市的一个用药趋势。

(3)主要用药城市医院用药情况分析

从各品种在各城市的用药金额排序情况来看，其销售情况表现得较好的品种主要有银杏叶制剂、吡拉西坦、氢化麦角碱和阿米三嗪/萝巴新。其中银杏叶制剂2000年在上海、广州、杭州和成都地区排在第一位，在北京地区排名第二，南京地区排名第三，表现得相当好，较1999年有所增长，其几个主打品牌达纳康、银杏天保、活血宁胶囊、百路达胶囊、天保宁、银可络的市场反应有口皆碑；其次表现较好的则为吡拉西坦，该品2000年在北京和南京地区占据第一的位置，在其它几个城市也是前三名之列，只有在杭州地区较弱(排名第5)；氢化麦角碱总体情况排在第三位，不过2000年排名较1999年排名有所提高。氢化麦角碱在各城市的排名基本保持不变，并在个别城市如上海和成都地区排名上升，而在南京地区排名下降一个位置。

(4)其它方面的市场评价

随着治疗AD药物临床推广的普及，AD已越来越受到社会和家庭的重视，从调查的医生信息反馈来看，68％的医生认为社会大众已经开始关心和重视AD，与此同时，8.16％的医生认为市场供给严重不足，63.2％的医生认为市场供给不足。可见，AD用药市场供给不足，市场仍有空间，有近八成医生认可市场前景较好。

同样，随着近年来OTC市场的蓬勃发展，有相当部份品种(口服剂型)也在零售药店中进行销售，由于长期服药的特点，越来越多的患者选择直接从药店进行购药治疗。从中国国家药品监督管理局南方医药经济研究所零售研究部对这类药品的监测结果显示，银杏叶制剂的市场份额(销售金额百分比)约占市场的4成左右，中成药较受零售市场的青睐，都可喜(阿米三嗪/萝巴新)的市场份额约占3成左右，其余品种则占据余下的市场份额。从所调查的消费者情况反映，有67.80％的消费者是从医院药房获得所需药品的；而有27.97％的消费者直接到药店购买；4.24％的病患者从所在单位门诊部获得；还有0.85％的病患者到批发商处购买。这表明，目前来说，医院虽然是老年人用药的主要销售渠道，但也可以看出，零售渠道也占有不可忽视的比例。

AD的治疗占世界药品市场的第七位，到2005年底价值61亿美元。而目前抗AD药物主要是缓解症状，并不遏制病情的发展。因此，研究出一种有效的治疗方法来阻止潜在的发病过程是很必要的，所以本发明认为研制用于预防、诊断、检测、保护和治疗AD等方面的产品特别是药物能够具有显著的社会效益和经济效益。阿尔茨海默症(Alzheimer’sDisease，或称阿尔兹海默症，简称AD)，是一种慢性脑变性疾病，是发生在老年期或老年前期的一种进行性神经退行性疾病，属于非正常衰老状态的早老性痴呆病症。

AD以记忆减退、认知障碍，行为异常和语言能力丧失为特征，主要表现为大脑皮层获得性高级功能的全面障碍和认知功能明显受损，脑功能退化衰亡，即记忆功能迅速衰退及认知能力障碍，并伴有行为或人格方面的改变。

该病病程一般较长，约为3～20年。对AD患者常年的护理费用是巨大的，不仅对整个社会的医疗保障系统有极大影响，对中国未来社会的小家庭模式也是极大的挑战。因此，其发生给社会、家庭均带来了沉重的经济负担和精神负担，也给患者自身带来极大的痛苦。目前，该疾病仍是全球较为棘手的病症之一，积极研究开发新的治疗方法是一件刻不容缓的事情。

2、流行病学情况

随着发达国家和发展中国家人均寿命的提高，患YY疾病的老年人数迅速增加。在所有的YY疾病中，以AD所占的比例最高(约50％～60％)。

据资料报道，随着年龄的增长，在人体组织老化和基因的影响下，痴呆现象的发生率不断升高；其中，AD随年老急剧上升，从60岁起，每4年～5年上升一倍；AD的发病率在65岁左右的老年人中约占10％，在85岁以上的老年人中约占47％，已经成为人类的第四号杀手。

3、AD的治疗药物

AD是老年人的常见病之一，是一种渐进性的神经功能退化性失调症，目前本病的病因尚未得到充分阐明，一直是治疗上的一个棘手问题。

经过近10年的临床表明，乙酰胆碱酯酶(简称：AChE)抑制剂对AD具有一定的治疗作用，其主要药物他克林、利斯的明、多奈哌齐、加兰他敏已是这一领域中的代表性品种，从而也推动了痴呆治疗药品市场的发展进程。主要有以下几类：

(1)脑代谢激动剂

(2)拟胆碱药

(3)乙酰胆碱酯酶抑制剂

(4)钾通道阻滞剂

(5)谷氨酸受体调控剂

(6)5-羟色胺3受体拮抗剂

(7)天然药物方面的研究：阿朴脂蛋白E4(ApoE4)、β-淀粉素(体)(Beta-amyloid)

(8)其它类型药物的研究进展：2000年上半年，一些研究表明，雌激素替代疗法可以较明显地延缓妇女阿尔茨海默病的发作，并能降低阿尔茨海默病的病情严重化。个别临床研究也发现雌激素治疗能够提高感知度。雌激素对抗氧剂和抗炎药的作用能力可以减少发病的机率，推动乙酰胆碱的产生、促进神经细胞的生长和存活。

4、AD的市场发展前景

2000年世界七大药品市场表明，AD药品市场已从90年代中期的4亿多美元增长了近一倍，2001年全球AD市场价值已近12亿美元；国外分析家预测在未来十年内AD患者将会增加到20％左右，AD药品市场的增长速度将有较大幅度的上升。

由于患者的不断增多，AD治疗药物的市场销售额也一直在稳步增长。90年代该类药物已成为畅销药物，1995年世界销售额已达50亿美元。21世纪初，该类药物的销售额超过了排列在前三位的治疗心血管病药物、治疗胃肠道病药物和抗感染药物市场的份额，其发展势头看好。

目前，该类疾病已越来越受到中国国家和社会的高度重视，而且由于该类疾病类似于糖尿病等富贵病，一样需要长期服用治疗药物，因此其用药市场随着人口老龄化而逐渐扩大，市场前景看好。基于此，为及时了解中国治疗AD药物的市场状况，中国国家食品药品监督管理局南方医药经济研究所信息中心选取中国六个主要用药城市(北京、上海、广州、南京、杭州、成都)的百家抽样医院、60名医生专家和120名消费者，对中国国内YY疾病用药市场(1999年及2000年)及其主要竞争品种进行了全面的市场调研活动。

(1)1999年～2000年中国治疗老年痴呆药物医院用药金额情况分析

从1999年～2000年六城市(北京、上海、广州、南京、杭州、成都)抽样医院治疗老年痴呆症用药金额构成情况来看。2000年六城市抽样医院销售总金额较1999年增长28.49％。

(2)1999年～2000年中国治疗老年痴呆药物医院用药金额走势分析

从1999年～2000年六城市老年痴呆用药金额走势情况来看，2000年整体用药水平要明显高于1999年整体用药水平，出现上升趋势。其中1999年用药金额高峰期和2000年用药金额高峰期均出现在二季度(2000年用药量高峰期是第三季度)，表明在2000年二季度高价品种的使用量相对要高。从六城市用药情况中可以反映出中国城市的一个用药趋势。

(3)其它方面的市场评价

随着治疗AD药物临床推广的普及，AD已越来越受到社会和家庭的重视，从调查的医生信息反馈来看，68％的医生认为社会大众已经开始关心和重视AD，与此同时，8.16％的医生认为市场供给严重不足，63.2％的医生认为市场供给不足。可见，AD用药市场供给不足，市场仍有空间，有近八成医生认可市场前景较好。

经文献检索等，到目前为止，尚未发现有中药美洲一枝黄花的活性部位总黄酮用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗氧化及其相关疾病方面的报道。

(三)咽喉炎的研究概况

咽喉是人体重要器官之一，是吞咽食物、呼吸空气、发音的器官。现代医学研究表明，患有不同程度的咽喉炎病人占人群中的40％。慢性咽喉炎如久治不愈易成链球菌、链霉菌、葡萄球菌、肺炎双球菌等细菌及病毒流注关节及脏腑，出现心脏病、类风湿关节炎、肺结核、咽喉肿瘤、食道肿瘤等难治之症。咽喉炎发病的典型表现是咽喉分泌物增多，咽部溃疡、咽后壁有明显淋巴滤泡增生。咽中有异物感、吞之不下、吐之不出，午后或劳累后加重、严重时声音嘶哑，呼吸有时咽喉有灼热感、胸部胀闷、头晕、头痛、失眠多梦、四肢无力、腰酸软等症。目前西药治疗只能临时控制病情，服用太多消炎药，抗生素或磺胺类药会导致人体阴阳失去平衡、免疫功能低下，抵抗力减退，致使病情反复难愈。

本发明是在研究美洲一枝黄花药理活性的基础上，选择以美洲一枝黄花的乙醇提取物作为原料，通过合理的配方，开发出具有治疗咽喉炎的美洲一枝黄花药物制剂。不仅可以有效的控制美洲一枝黄花带来的生物破坏性，同时还可以明显改善患有咽喉炎的健康状况，提高人们的生活质量。

(四)食管癌的研究概况

管癌(carcinoma of esophagus)是食管鳞状上皮的恶性肿瘤，进行性咽下困难为其最典型的临床症状。本病是人类常见的恶性肿瘤之一。中国是食管癌的高发国家，也是本病死亡率最高的国家。全世界每年食管癌新发病例约31.04万，而中国占16.72万。

食道癌的放疗不同于其它部位的肿瘤治疗，由于肿瘤始终与食管于一体，在规划靶区时，管腔和病变一起被划入，如果和照射其它部位的肿瘤一样，一次大剂量照射势必会引起食管粘膜的损伤，甚至穿孔，有发现在肺部肿瘤的定向放射时，食管接受24～30Gy量，即可出现放射性损伤，后期表现食管局部性狭窄。又由于食道癌患者就症时绝大多数已属晚期，不仅局部病变已广泛浸润，而且已有亚临床病灶的远处播散或淋巴结转移，尸检发现，许多临床认为局部早期的病例死亡时，已有半数以上伴远处转移，70％以上有广泛的淋巴结受侵，真正能根治性切除的病例不足1/3，常规放疗5年生存率仅为13％，局部复发也是食道癌手术和放疗失败的主要原因，占80％以上，由此可以看出，食道癌的治疗仅靠手术和放疗是远远不够的。

1、发病率：欧、美和大洋洲诸国的食管癌发病率一般在20/10万，前苏联的中亚地区高达100/10万以上；中国北方各省的发病率和死亡率均高于南方，河南省林县35？4岁男性食管癌发病率高达478.87/10万，是世界高发地区之一。

2、死亡率：目前中国是世界上食管癌死亡率最高的国家之一，年平均死亡率为14.59/10万。据1990年的统计资料，部分城市恶性肿瘤死亡率位次为肺癌、胃癌、肝癌、食管癌，其死亡率分别为32.89/10万、21.51/10万、20.1/10万和9.70/10万。

3、性别和年龄：男女发病比例为1.37∶1。发病年龄以高龄组为主，35岁以前的构成比例很小，35岁以后随年龄增长而构成比增高，以60～64岁组最高(17.95％)，其次为65～69岁组，70岁以后逐渐降低。

食管癌的发病主要与以下5点有关：(1)亚硝胺类：亚硝胺类化合物是一种很强的致癌物质，研究表明食管癌高发区林县食用酸菜的居民，胃液、尿液中存在有诱发食管癌的甲基苄基亚硝胺、亚硝基吡咯烷、亚硝基胍啶。并发现食用酸菜量和食管癌发病率成正比。(2)食管粘膜的损伤：长期喜进烫食、粗食，饮浓茶，多食辣椒等刺激性食物可引起食管粘膜损伤、引起食管粘膜增生间变，也可能是致癌因素之一。吸烟、饮烈性酒与食管癌发病有一定关系。各种长期不愈的食管炎可能是食管癌的癌前病变。(3)霉菌致癌因素：用霉变食品可以诱发小鼠食管和胃的癌前病变或鳞状上皮癌。这类霉菌与亚硝胺促癌有协同作用。(4)微量元素：食道癌高发区人群中血清钼、发钼、尿铝及食管癌组织中的钼都低于正常。林县食管癌高发区水土中缺少钼，钼的抑癌作用被多数学者证实。(5)遗传因素：食管癌具有显著的家族聚集现象，高发区连续三代或三代以上患病家族屡见。

从食道癌的长期病例普查来看，食道癌细胞的发展过程是从轻度增生开始逐步发展到重度增生，原位癌和浸润癌，从食管粘膜轻度增生到原位癌发展较慢，有认为这一演变过程大约5到10年时间，一旦形成浸润癌，其发展速度相当快，当病人有明显吞咽梗阻症状，此间的治愈率很低。食道癌的治疗目前仍以手术和放疗为主，由于化疗对人体的毒副反应较大，仅作为一种辅助手段。而在目前的手术治疗容易在短期内重新复发并扩散，且有很多患者由此拒绝接受手术治疗。在放疗中，一旦患者有恶液质。穿孔、CT证实有严重的气管或大血管受侵或严重的胸背部疼痛，白细胞升高等都不宜再放疗，相对禁忌。

化学药物治疗常用药有顺铂、平阳霉素等，虽然其有效率在50％左右，但其远期疗效并不理想。

由于在化疗过程中，伴有极大的副反应及并发症，即使通过放疗结合化学治疗，其5年生存率也仅13％左右。生存5年以上者，对于后期的生活质量也大受影响，不能从根本上有效地来治疗食道癌，更不能做到防患于未然。

(五)常用中草药有效成分的提取分离方法

1、溶剂提取法

(1)原理：溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。当溶剂加到中草药原料(需适当粉碎)中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出，继续多次加入新溶剂，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。中草药成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为亲水性有机溶剂及亲脂性有机溶剂，被溶解物质也有亲水性及亲脂性的不同。有机化合物分子结构中亲水性基团多，其极性大而疏于油；有的亲水性基团少，其极性小而疏于水。各类溶剂的性质，同样也与其分子结构有关。这样，发明人就可以通过对中草药成分结构分析，去估计它们的此类性质和选用的溶剂。总的说来，只要中草药成分的亲水性和亲脂性与溶剂的此项性质相当，就会在其中有较大的溶解度，即所谓“相似相溶”的规律。这是选择适当溶剂自中草药中提取所需要成分的依据之一。

(2)溶剂的选择：运用溶剂提取法的关键，是选择适当的溶剂。溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶剂要注意以下三点：①溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；②溶剂不能与中药的成分起化学变化；③溶剂要经济、易得、使用安全等。常见的提取溶剂可分为以下三类：

①水：水是一种强的极性溶剂。中草药中亲水性的成分，如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及苷类等都能被水溶出。为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及碱水作为提取溶剂。

②亲水性的有机溶剂：也就是一般所说的与水能混溶的有机溶剂，如乙醇(又称：酒精)、甲醇(又称：木精)、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好，对中草药细胞的穿透能力较强。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。难溶于水的亲脂性成分，在乙醇中的溶解度也较大。还可以根据被提取物质的性质，采用不同浓度的乙醇进行提取。用乙醇提取比用水量较少，提取时间短，溶解出的水溶性杂质也少。乙醇为有机溶剂，虽易燃，但毒性小，价格便宜，来源方便，有一定设备即可回收反复使用，而且乙醇的提取液不易发霉变质。由于这些原因，用乙醇提取的方法是历来最常用的方法之一。甲醇的性质和乙醇相似，沸点较低(64℃)，但有毒性，使用时应注意。

③亲脂性的有机溶剂：也就是一般所说的与水不能混溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提出亲水性杂质。但这类溶剂挥发性大，多易燃(氯仿除外)，一般有毒，价格较贵，设备要求较高，且它们透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。如果药材中含有较多的水分，用这类溶剂就很难浸出其有效成分，因此，大量提取中草药原料时，直接应用这类溶剂有一定的局限性。

(3)提取方法：用溶剂提取中草药成分，常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等。同时，原料的粉碎度、提取时间、提取温度、设备条件等因素也都能影响提取效率，必须加以考虑。

①浸渍提取法(简称：浸渍法)：浸渍法系将中草药粉末或碎块装入适当的容器中，加入适宜的溶剂(如乙醇、稀醇或水)，浸渍药材以溶出其中成分的方法。本法比较简单易行，但浸出率较差，且如用水为溶剂，其提取液易发霉变质，须注意加入适当的防腐剂。

②渗漉提取法(简称：渗漉法)：渗漉法是将中草药粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。当溶剂渗进药粉、溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。但应控制流速，在渗渡过程中随时自药面上补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止。或当渗滴液颜色极浅或渗涌液的体积相当于原药材重的10倍时，便可认为基本上已提取完全。在大量生产中常将收集的稀浸出液作为另一批新原料的溶剂之用。

③煎煮提取法(简称：煎煮法)：煎煮法是中国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。

④加热回流提取法：应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内装药材约为容量的20％～60％，溶剂浸过药材表面约1～2cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾3～6小时，放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。

⑤连续回流提取法：应用挥发性有机溶剂提取中草药有效成分，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少，提取成分也较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。连续提取法，一般需数小时才能提取完全。提取成分受热时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。

2、分离和纯化方法

上述提取法所得到的中草药提取液或提取物仍然是混合物，需进一步除去杂质，分离并进行精制。

(1)溶剂分离法：一般是将上述总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步进行提取分离。水浸膏或乙醇浸膏常为胶状物，难以均匀分散在低极性溶剂中，故不能提取完全，可拌入适量惰性填充剂，如硅藻土或纤维粉等，然后低温或自然干燥，粉碎后，再以选用溶剂依次提取，使总提取物中各组成成分，依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。利用中草药化学成分，在不同极性溶剂中的溶解度进行分离纯化，是最常用的方法。

(2)溶剂萃取法：

①萃取法：溶剂提取萃取法又简称萃取法，是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。萃取时如果各成分在溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高；如果在水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行萃取，如果有效成分是偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。还可以在氯仿、乙醚中加入适量乙醇或甲醇以增大其亲水性。提取黄酮类成分时，多用乙酸乙脂和水萃取。提取亲水性强的皂苷则多选用正丁醇、异戊醇和水作萃取。不过，一般有机溶剂亲水性越大，与水作萃取的效果就越不好，因为能使较多的亲水性杂质伴随而出，对有效成分进一步精制影响很大。

②逆流连续萃取法：是一种连续的溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多的萃取管。管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充，以增加溶剂萃取时的接触面。如果一种中草药的水浸液需要用比水轻的苯、乙酸乙酯等进行萃取，则需将水提浓缩液装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位容器内。萃取是否完全，可取样品用薄层层析、纸层析及显色反应或沉淀反应进行检查。

③逆流分配法：逆流分配法又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法与溶剂逆流萃取法原理一致，但加样量一定，并不断在一定容量的溶剂中，经多次移位萃取分配而达到混合物的分离。

④液滴逆流分配法：液滴逆流分配法又称液滴逆流层析法。为近年来在逆流分配法基础上改进的溶剂萃取法。对溶剂系统的选择基本同逆流分配法，但要求能在短时间内分离成，并可生成有效的液滴。由于移动相形成液滴，在细的分配萃取管中与固定相有效地接触、摩擦不断形成新的表面，促进溶质在溶剂中的分配，故其分离效果往往比逆流分配法好。

(3)大孔吸附树脂法：大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的一类有机高聚物吸附剂，具有良好的吸附性能，近十余年来逐渐被应用于中草药化学成分的提取分离和中药新药的开发研制。

大孔吸附树脂为吸附和筛选原理相结合的分离材料。它的吸附性是由于范德华引力或生成氢键的结果。筛选原理是由于其本身多孔性结构所决定。由于吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而分开。这使得有机化合物尤其是水溶性化合物的提纯得以大大简化。大孔吸附树脂的骨架由苯乙烯和二乙烯苯缩聚而生成，由于改性剂的加入，大孔吸附树脂的极性发生改变，按照树脂的表面性质，吸附树脂一般分为非极性、中极性和极性三类。

非极性吸附树脂是由偶极矩很小的单体聚合物制得的不带任何功能基的吸附树脂。典型的例子是苯乙烯-二乙烯苯体系的吸附树脂，如D101、XAD-1、DiaionHP-10大孔吸附树脂。

中极性吸附树脂指含酯基的吸附树脂，如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯与双甲基丙烯酸酯等交联的一类共聚物。它是在非极性大孔吸附树脂的基础上，加入丙烯酸甲酯或丙烯腈缩聚而成，如中国国内经常使用的AB-8大孔吸附树脂。

极性吸附树脂是指含酰胺基、腈基、酚羟基等含氮、氧、硫极性功能基的吸附树脂。此外，有时把含氮、氧、硫等配体基团的离子交换树脂称作强极性吸附树脂，强极性吸附树脂与离子交换树脂的界限很难区别。极性大孔吸附树脂可以由甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺或亚砜类缩聚而成，如日本三菱化工的Diaion HP 2MG、美国Rohm-hass公司的XAD-10，XAD-9大孔吸附树脂。

与活性炭和其它吸附剂相比，大孔吸附树脂具有很多的优点，如对某种物质的吸附选择性较高；物理化学稳定性和机械强度较好；品种规格较多，可根据需要改变树脂物理或化学结构；吸附树脂一般为球状颗粒，流体阻力较小等等。因而被广泛应用于化工、医药等领域，近年来关于大孔吸附树脂在天然产物提取分离中的应用研究报道越来越多。大孔吸附树脂对中草药化学成分如生物碱、黄酮、皂苷、香豆素及其他一些苷类成分都有一定的吸附作用。对糖的吸附能力很差，对色素的吸附能力较强。

(4)沉淀法：是在中草药提取液中加入某些试剂使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法。如铅盐沉淀法：铅盐沉淀法为分离某些中草药成分的经典方法之一。由于醋酸铅及碱式醋酸铅在水及醇溶液中，能与多种中草药成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。然后将铅盐沉淀悬浮于新溶剂中，通以硫化氢气体，使分解并转为不溶性硫化铅而沉淀。

(5)盐析法：盐析法是在中草药的水提液中，加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离。常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。

(6)透析法：透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制。

(7)结晶、重结晶和分步结晶法：鉴定中草药化学成分，研究其化学结构，必须首先将中草药成分制备成单体纯品。在常温下，物质本身性质是液体的化合物，可分别用分馏法或层析法进行分离精制。一般地说，中草药化学成分在常温下多半是固体的物质，都具有结晶体的通性，可以根据溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。

3、常用干燥方法

(1)真空干燥：是基于这样一基本原理：水的饱和蒸气压与温度紧密相关，在真空状态下，水的沸点降低，即在真空下操作也就是在低温下操作，可避免在高温下营养成分如维生素等的破坏，同时提高了干燥速度。真空干燥在食品、制药、化工等行业有广泛的应用，中国也开发和引进了各种真空干燥设备，其结构形式多种多样。常用的形式主要有箱式真空干燥器、双锥式真空干燥器、带式真空干燥器等。这些传统的真空干燥装置主要采用热风，蒸汽或电等加热，利用热传导、对流或辐射原理将热量从外部传到物料内部。真空干燥具有干燥温度低，干燥室内相对缺氧，可避免脂肪氧化，色素褐变等一系列优点，适合于热敏感性食品物料的干燥，此外设备成本、干燥费用也相对较低。

(2)喷雾干燥：是流化技术用于液态物料干燥的一种方法。因是瞬间干燥，特别适用于热敏性物料，故所得产品质量好，保持原来的色香味，且易溶解。利用喷雾干燥来制备微囊的研究正在进行，它是将心料混悬在衣料的溶液中，经离心喷雾器将其喷入热气流中，所得的产品是衣料包心料而成的微囊，这种微囊粉末可采用于直接压片，也可制备胶囊剂、糖浆剂或混悬剂。

(3)冷冻干燥：是将干燥液体物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用冰的升华性能，使物料低温脱水而达到干燥的一种方法。由于物料在高度真空及低温条件下干燥，故对某些极不耐热物品的干燥很适合。王大林报道了一种喷雾通气冻干新技术，是利用冷的空气或氮气作为介质，迅速流经冻结物使水升华，喷雾冻干制得的产品微粒小、干燥快、时间短、均匀、流动性好，并具良好的速溶性。近年来，对膏状物料和粘稠物料干燥的研究取得了较大进展，流态化技术、喷射技术、惰性载体技术，则是在此研究基础上发展起来的。旋转闪蒸干燥机、热喷射气流干燥机、惰性载体干燥机均适合热敏性物料和膏状物料的干燥。这些新的研究成果用于中药制剂生产，将大大改善中药加工的技术水平，提高生产效率。

(4)远红外加热干燥法：是一项新的干燥技术，其干燥原理是将电能转变为远红外辐射，从而被药材的分子吸收，产生共振，引起分子和原子的振动和转动，导致物体变热，经过热扩散、蒸发和化学变化，最终达到干燥的目的。远红外干燥可节省电能20％～50％，效果较好。

(5)微波干燥法：是一项20世纪60年代迅速发展起来的新技术，微波干燥实际上是通过感应加热和介质加热，使被干燥物中的水分和脂肪不同程度地吸收微波能量，并把它转变为热量从而达到干燥的目的。微波干燥可杀灭微生物和霉菌，并具有消毒作用。目前中国生产的微波加热成套设备有915mhz和2450mhz两个频率。

4、超临界CO₂萃取方法

(1)有关动、植物脂肪油成分的提取方法有：水煮法、水媒分离法、分子蒸馏和减压蒸馏法、金属加合法、萃取结晶法、分盘冷冻压榨法和有机溶剂法等。

采用水煮加热法，因加热时间长、温度高，易使对热不稳定的挥发成分发生变化，如一些不饱和脂肪酸的氧化。水媒分离法，此分离法的明显优点是消除了有机溶剂法造成的高费用和公害，但是这种技术的缺点是得到的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的纯度或级别不如有机溶剂分离法高。分子蒸馏和减压蒸馏法为减少热变性，需用尿素加合物等方法来除去大部分饱和脂肪酸，在得到的产品中必须将其除去；虽然可得到较纯的脂肪酸，但需几步才能达到目标，较费时、费力，增加了生产成本。金属加合法分离需要较低的低温处理，最后还要设法去除金属离子，清除不尽还会造成金属离子污染。萃取结晶法得到脂肪酸纯度较高，在较低的温度下进行，能防止脂肪酸的氧化，但时间较长，不太适用于大规模的工业化生产。分盘冷冻压榨法缺点是，安放盘架和液压机的冷冻室需要数千平方米的面积和庞大的冷却系统，大的设施需要多人操作，劳动强度高，分离速度缓慢，效率低，不能连续操作。有机溶剂法是采用石油醚或乙醚有机溶剂在水浴上加热情况下，进行回流循环提取；由于所采用的有机溶剂如石油醚或乙醚等均为一种低沸点物质，易燃易爆，同时，有机溶剂的使用一方面会污染环境，另一方面有机溶剂有可能在提取物中有残留，会影响提取物在医药上的进一步应用。

(2)有关动、植物脂肪油成分的超临界CO₂萃取方法：一种流体当处在其临界温度和压力状态时，被称为超临界流体。由于超临界流体的密度接近于液体，具有与液体溶剂相当的萃取能力。又具有与气体相当的低粘度，扩散能力比液体要大100倍，因而具有较高的传质性。采用超临界萃取的时候，利用超临界流体的这些性质，使之与待分离的物质相接触穿透基体，从中萃取出目标物质。然后利用降压和/或升温的办法降低其密度，从而降低溶质在其中的溶解度，使被萃取物与溶剂分离。因为不同的物质在相同的萃取条件下溶解度是不同的，因而有可能借助这种差异将它们进一步分开。超临界流体萃取常常选用CO₂等临界温度低且化学惰性的物质为萃取剂，它特别适用于热敏物质和易氧化物质的分离，因此非常适用于对于动物油脂的提取分离。因此，本发明采取该方法，能够制备高纯度的被提取物的脂肪油。

超临界CO₂萃取方法是这样提取的：把干燥的被提取物的粗粉放在超临界萃取设备中用CO₂进行萃取，减压后即得被提取物的脂肪油，室温条件下呈浅黄色透明油状；提取的被提取物的脂肪油中总脂肪酸的纯度在40以上，优于其他提取方法；总脂肪酸一般包括油酸、亚油酸、棕榈酸以及余量的其他组分等。

超临界CO₂萃取被提取物的脂肪油的方法包括如下步骤：

(1)将干燥的被提取物粉碎至10～30目后，置于超临界萃取釜中，连续地通入超临界状态下的CO₂进行萃取，优选的条件一般是：CO₂流量10～55kg/h·kg原料、压力5～50Mpa、温度15～75℃、时间0.5～6h；进一步优选的条件一般是：CO₂流量45kg/h·kg原料、压力35Mpa、温度50℃、时间1h；

(2)将萃取了被提取物的脂肪油的CO₂减压至1～12MPa，即可获得在室温条件下被提取物的脂肪油，被提取物的脂肪油中总脂肪酸的纯度在40％以上，萃取物的理化性状和脂肪酸纯度都优于其他提取方法。

萃取条件的选择是通过以下办法实现的：首先选定四因素、三水平，根据正交设计方法，按L9(34)正交设计表安排实验(正交实验设计安排参考郭祖超主编的《医学统计学》，人民军医出版社，1999年第一版)。从正交实验结果，分析得到萃取工艺条件。

对超临界CO₂萃取的被提取物的脂肪油进行脂肪酸甲酯化后，进行气相色谱-质谱分析。

超临界CO₂萃取被提取物的脂肪油的制备方法不使用有机溶剂等物质，不会污染环境，也不存在有害溶剂残留等问题，而且操作简便、萃取时间短、产品纯度高，使用的CO₂廉价而且可重复循环使用，工业生产成本低廉。

经文献检索等，到目前为止，尚未发现有对美洲一枝黄花总黄酮提取物及其制备方法和用途的有关报道。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题是公开了中药美洲一枝黄花的活性部位，以及该活性部位的抗氧化、抗肿瘤、抗炎作用，即该活性部位是用于制备抗氧化产品、抗肿瘤产品、抗炎产品的活性成分，以克服现有技术存在的上述缺陷。

也就是说，本发明意在明确一种中药活性部位即总提取物及其制备方法和用途；即本发明涉及一种中药总黄酮提取物及其制备方法和用途。

该活性部位是抗氧化、抗肿瘤、抗炎的活性成分，能够用于制备抗氧化产品、抗肿瘤产品、抗炎产品。

所述的抗氧化产品是指用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究因过氧化引起的疾病如痴呆症疾病特别是老年痴呆等的起因、早期发生发展，或后期的发病，以及过氧化引起的相关疾病的产品中的一种或多种；也就是说主要针对过氧化的起因、发生发展到后期的发病全过程。所述的因过氧化引起的疾病及其相关疾病是包括老年性疾病及其相关疾病等各类疾病等中的一种或多种，所述的老年性疾病的相关疾病是包括衰老、肿瘤、炎症、脑缺血等疾病和病理生理现象中的一种或多种；优选痴呆症疾病，进一步优选阿尔茨海默症、多重梗塞型痴呆、酒精性痴呆及正常脑压水脑症等中的一种或多种，再进一步优选阿尔茨海默症。

所述的抗炎产品是指用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究各种炎症，优选咽喉炎。

所述的抗肿瘤产品是指用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究各种肿瘤，优选食管癌。

所述的抗氧化产品、抗肿瘤产品、抗炎产品均是包括医药、食品或饮料等领域产品中的一种或多种，例如包括药物、试剂、食品、保健食品、添加剂或饮料等中的一种或多种，优选药物、保健食品或添加剂等中的一种或多种，进一步优选药物。

(一)技术构思

自主开发创新药物是中国目前的一项紧迫任务。中国中医药学具有悠久的历史，用中草药预防和治疗疾病方面也积累了丰富的经验，因此中药的开发利用是一条有效的途径，也是发挥中国药物研制的优势之所在。

根据发明人的研究结果显示，美洲一枝黄花中含有不同类型的化学成分，如大量的黄酮类成分、挥发油、极性较大的三萜皂苷类成分，但是美洲一枝黄花尚未被中国2005版药典收载。

发明人检索了《新编国家中成药》、《临床常用方剂手册》、《中国常用中成药大全》等书籍，并对美洲一枝黄花的医院用药和市售药进行了调查统计分析，发现由于对其化学成分研究不深入，药理筛选不足，导致活性部位和活性成分不明确以及没有可行的质量标准，限制了美洲一枝黄花的进一步开发和利用。

经过化学成分研究，证明美洲一枝黄花活性部位中的主要成分为黄酮类成分。而根据文献检索，发明人发现黄酮类成分大多具有多种显著的药理活性，发明人从而推测美洲一枝黄花的抗氧化作用、抗炎作用和抗肿瘤作用及治疗多种疾病的临床药效，应主要是通过活性部位美洲一枝黄花总黄酮类成分的药效来发挥的，研究结果也证明和证实了美洲一枝黄花总黄酮提取物具有显著的药理活性。

也就是说，本发明通过对包括美洲一枝黄花药材的总黄酮提取物进行系统的活性和应用研究，并筛选和证明该复方的组成和用途。

(二)美洲一枝黄花的总黄酮提取物

发明人通过对美洲一枝黄花进行系统的实验研究和理论探索，包括化学成分分离、纯化和结构鉴定、药理、药剂、中药配伍等实验研究和分析，发现：

美洲一枝黄花总黄酮提取物的总黄酮的含量为55％～90％(重量百分比，下同)，主要包括槲皮素(quercetin)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(quercetin-3-O-β-D-galactoside)、山奈酚(kaemoferol)、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(kaemoferol-3-O-α-L-rhamnoside)和绿原酸(chlorogrnic acid)等，其中槲皮素的含量为10％～50％(重量百分比，下同)。

所述美洲一枝黄花总黄酮提取物的总黄酮的含量优选为55％～80％，进一步优选为55％～70％；

所述美洲一枝黄花总黄酮提取物的槲皮素的含量优选为10％～40％，进一步优选为10％～30％。

优选的，所述美洲一枝黄花总黄酮提取物含有槲皮素，以及选自槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷)、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸的至少两种。

更优选的，所述美洲一枝黄花总黄酮提取物含有槲皮素，以及选自槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷)、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸的至少三种。

再优选的，所述美洲一枝黄花总黄酮提取物同时含有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸。

最优选的，所述美洲一枝黄花总黄酮提取物同时含有的槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸的重量比为10～50∶2～28∶1～17∶2～24∶0.5～13。

本发明所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物，是指采用目前现有的任何提取方法从菊科(Compositae)一枝黄花属(Solidago)的美洲一枝黄花(Solidago Canadensis)的全草中提取获得的、以总黄酮类化学成分作为主要组分的提取物。因此，美洲一枝黄花总黄酮提取物为所含各个活性成分协同起效的混合物，它不同于活性单体，它的药效也不同于各个活性成分药效的简单加和。本发明所述的提取物中，总黄酮的含量≥55％，本领域技术人员通常将这样的提取物称为有效部位。

所述的槲皮素(CAS登录号：117-39-5)，其分子式：C₁₅H₁₀O₇，分子量：302.2。

采用紫外分光光度法，以槲皮素为对照品，在266nm测定美洲一枝黄花总黄酮提取物中总黄酮的含量。

当色谱条件为：C₁₈色谱柱，规格为4×250mm，柱温30℃，流动相为水和乙睛，梯度洗脱，洗脱程序为0min时，水∶乙腈为88∶12；20min时，水∶乙睛为72∶28，60min时，水∶乙睛为40∶60，流速为1ml/分钟，用高效液相色谱法检测，在标准品槲皮素的保留时间为12.3分钟时，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的保留时间为13.8±0.3分钟时，和/或山奈酚的保留时间为22.3±0.2分钟，和/或山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷的保留时间为24.1±0.2分钟，和/或绿原酸的保留时间为31.3±0.2分钟。在本发明的一个具体实施方式中，使用Hypersil BDSC₁₈填料常规色谱柱进行检测。

(三)美洲一枝黄花总黄酮提取物的制备方法

本发明所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物能够通过下述方法制备得到：

1)药材用含水乙醇提取；

2)减压浓缩步骤所得提取液；

3)以水稀释浓缩液，并作澄清处理，取上清液；

4)利取上清液，过大孔树脂柱吸附，弃流出液；然后用水洗涤所述吸附柱，弃水洗液；之后，采用乙醇洗脱吸附柱并收集该乙醇洗脱液；

5)浓缩、干燥乙醇洗脱液，得到美洲一枝黄花总黄酮提取物。

(四)美洲一枝黄花总黄酮提取物的用途

1、概述

根据本发明的再一个方面，本发明提供了所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物特别是美洲一枝黄花总黄酮提取物在制备预防和/或治疗老年痴呆的应用。药效试验结果表明，美洲一枝黄花总黄酮提取物的抗氧化作用具有一定的量效关系，随着剂量的增加而增急性毒性试验结果表明，美洲一枝黄花总黄酮提取物经灌胃给药途径，ICR小鼠的食量、体重未见异常，LD₅₀＞16.5g/Kg，表明毒性低，具有很好的用药安全性，而未经该工艺处理的乙醇提取物和超临界提取物具有一定的毒性。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了所述美洲一枝黄花总黄酮提取物在制备抗炎药物中的应用。由于本发明的美洲一枝黄花总黄酮提取物有效的去除了具有刺激咽喉黏膜作用的非黄酮类杂质，因此该提取物尤其适合于预防和/或治疗各种炎症引起的呼吸道疾病，如咽喉炎、气管炎等。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了所述美洲一枝黄花总黄酮提取物在制备预防和/或治疗食道癌药物中的应用。

药效学实验结果表明，结果表明，美洲一枝黄花总黄酮提取物对小鼠耳廓二甲苯致炎和大鼠角叉胶致足肿胀均有明显的抑制作用，与对照组相比具有显著性差异，其作用与阿司匹林相似，显示本发明的总黄酮提取物具有良好的抗炎作用。

2、美洲一枝黄花总黄酮提取物的使用方法与要求

本发明美洲一枝黄花总黄酮提取物可以单独使用或与其它活性组分联合使用，包括用于制备用于诊断、检测、治疗或研究相关疾病的产品，包括药物、试剂、食品或饮料等，尤其是药物。

在具体使用方面，本发明所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物能够单独使用，还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解美洲一枝黄花总黄酮提取物的副作用等，这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、食品、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种或多种；优选包括医药学上可接受的载体或者食品等中的一种或多种；进一步优选医药学上可接受的载体。

所述的有活性的化学物质是包括有治疗作用的化学物质，或者是对治疗有辅助作用的化学物质等中的一种或多种。有治疗作用的化学物质是包括免疫调节剂(免疫增强剂或免疫抑制剂)等中的一种或多种，对治疗有辅助作用的化学物质包括抗炎、抗菌、镇痛或解毒等物质中的一种或多种。

本文使用的“医药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等等及其组合物中的一种或多种。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。医药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种，它们增强了美洲一枝黄花总黄酮提取物的有效期或效力。

从具体的分类上看，所说的医药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体，包括赋形剂，如淀粉或水等中的一种或多种；润滑剂，如甘油、硬脂酸镁或聚乙二醇等中的一种或多种；崩解剂，如琼脂、碳酸氢钠或微晶纤维素等中的一种或多种；吸收促进剂，如季铵化合物等；填充剂，如淀粉或乳糖等中的一种或多种；粘接剂，如预胶化淀粉、糊精、纤维素衍生物、藻酸盐或明胶等中的一种或多种；渗透压调节剂，如葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种；稀释剂，如水等；表面活性剂，如十六烷醇等；吸附载体，如高岭土或皂粘土等中的一种或多种；另外，还可以在组合物中加入其它辅剂，如香味剂或甜味剂等中的一种或多种。

例如，将活性组分美洲一枝黄花总黄酮提取物溶解、混悬或乳化于适宜的水性溶剂中(例如，蒸馏水、生理盐水或格林溶液等中的一种或多种)或油性溶剂中(例如，植物油例如橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一种或多种)中，即可制得注射制剂，其中溶剂中可含有分散剂(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一种或多种)、渗透压调节剂(例如，氯化钠、甘油、D9一甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一种或多种)。在这种情况下，如有必要，可加入添加剂，例如增溶剂(例如，水杨酸钠或醋酸钠等中的一种或多种)、稳定剂(例如，人血清白蛋白等)、止痛剂(例如，苯甲醇等)等。

本发明所述及的美洲一枝黄花总黄酮提取物还可以以组合物的形式联合使用，特别是与用其它化学物质如药物对动物尤其是哺乳动物包括人或其他动物进行治疗所用的组合物或者是类似的组合物。所述哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种。例如，可以将本发明美洲一枝黄花总黄酮提取物加入适于给与受治疗者的药用组合物中。

通常，该药用组合物包含本发明美洲一枝黄花总黄酮提取物和药学上可接受的载体和/或赋形剂。例如，一种药物组合物可以是将美洲一枝黄花总黄酮提取物和药学上可接受的载体和/或赋形剂按照一定的配比混合而成；还可以是将美洲一枝黄花总黄酮提取物、其它中药提取物和药学上可接受的载体和/或赋形剂按照一定的配比混合而成。

美洲一枝黄花总黄酮提取物的组合物特别是药物组合物可以有各种形式，按照常规制剂方法配制成可供给药的形式，包括经口或胃肠外给药形式，例如液体、半固体和固体等剂量形式中的一种或多种；其中所说的药物组合物包括治疗有效量的美洲一枝黄花总黄酮提取物为活性成分，以及一种或多种医药学上可接受的载体。

美洲一枝黄花总黄酮提取物的药物组合物可以采用本领域公知的常规生产方法制成各种剂型，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、锭剂、栓剂、贴剂、凝胶剂、粉剂或液体制剂(如口服或无菌胃肠外溶液或悬浮液，例如混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂)等中的一种或多种，还可以根据需要制备成缓控释制剂或靶向制剂，采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗氧化、抗肿瘤、抗炎及相关病症的诊断、检测、治疗或科学研究。

药物组合物优选含有重量比为0.5％～99％的活性成分美洲一枝黄花总黄酮提取物，进一步优选含有重量比为1％～95％的活性成分美洲一枝黄花总黄酮提取物，最优选含有重量比为5％～90％的活性成分美洲一枝黄花总黄酮提取物。

美洲一枝黄花总黄酮提取物的药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的美洲一枝黄花总黄酮提取物与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将美洲一枝黄花总黄酮提取物加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。通过在该组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐或明胶)可以达到注射组合物的延长吸收。

用于患者时，本发明所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物剂量为5～20mg/kg·d，该剂量或用量通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。

本发明美洲一枝黄花总黄酮提取物及其药用组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明美洲一枝黄花总黄酮提取物。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间下有效达到所需治疗效果的量，即在该剂量下，本发明的提取物能够改善或减轻疾病症状，或能够抑制或阻断疾病的发展。美洲一枝黄花总黄酮提取物的治疗有效量可以根据诸如个体的病况、年龄、性别和体重以及美洲一枝黄花总黄酮提取物在该个体引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦指美洲一枝黄花总黄酮提取物的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”是指在必要剂量和时间下有效达到所需预防效果的量。因为预防剂量用于患病前或疾病早期的受治疗者，预防有效量通常小于治疗有效量。本发明美洲一枝黄花总黄酮提取物的治疗或预防有效量的典型的非限制性范围是5～20mg/kg，更优选为5～10mg/kg。应注意，剂量值将根据欲减轻的疾病类型和严重性变化，也就是说用于患者时，本发明所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物的剂量或用量，通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。另外，应理解，对于任何特定受治疗者，应随着时间根据个体需要和给与或监督给与所述组合物的人的专业判断调整特定剂量制度，并且本文设定的剂量范围仅为例证性的，并不会限制要求保护的组合物的范围或实践。

也就是说，需要根据治疗的对象、给药途径、所治疗疾病和状况等，变化本发明美洲一枝黄花总黄酮提取物的每次和/或每日的剂量或用量。例如，经静脉给予哺乳动物，尤其是成年人(如体重60kg)，所述美洲一枝黄花总黄酮提取物的单剂量约为5～10mg，优选约10mg，优选每日给药1～3次。可以调整剂量单位，以提拱最佳所需反应(例如治疗或预防应答)。例如，可以单次大剂量给药，可以在一段时间内给予几个均分量或根据治疗情况的迫切性按比例降低或增加剂量。配制易于给药和剂量统一的剂量单位形式的非肠道组合物尤其有利。本文使用的剂量单位形式，指适于欲治疗的哺乳动物受治疗者的单元剂量的物理分离单位；每个单位含有预定量的计算用于与所需药用载体一同产生所需治疗效果的活性物美洲一枝黄花总黄酮提取物。本发明的剂量单位形式的规格，由以下确定并直接取决于以下(a)美洲一枝黄花总黄酮提取物的独特特征和欲达到的特定治疗或预防效果，和(b)在混合这种用于治疗个体敏感性美洲一枝黄花总黄酮提取物的技术中的内在限制。

3、美洲一枝黄花总黄酮提取物的药物剂型和给药途径

本发明所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物制备抗炎性反应产品，其中按照饮料、食品技术领域的要求制备的产品能够抗氧化、抗肿瘤、抗炎以及诊断、检测、治疗或研究抗氧化、抗炎、抗肿瘤方面的疾病及其相关病症；按照医药技术领域的要求制备的产品能够用于患者的治疗或保健，既能够单独直接用于制备治疗或保健的药物，也能够与许多化学物质进行混合或组合，直接或间接用于制备治疗或保健的药物。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。

在本发明中，所需物料包括本发明的原料、上述配套使用的化学物质等，均应根据实际情况和需要，采用食品级或药用级的物料。

本发明所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物，可以用本领域已知的各种方法给药，尽管在许多治疗用途中推荐的给药途径/给药方式是喷雾剂或口服给药。但是，技术人员会理解给药途径/给药方式随所需的结果而变化。在某些具体实施中，该活性化合物可以与保护该化合物免于快速释放的载体一同制备例如空释制剂，包括移植物传递系统、透皮贴传递系统或微囊传递系统等中的一种或多种。此外，还可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一种或多种。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知(参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，纽约，1978)。

本发明所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物，通常通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药等中的一种或多种方式，施用于需要这种治疗的患者。

用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊等中的一种或多种，它们可以含有常现赋形刑如粘合剂像糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄若胶、羟两基中基纤维素或聚乙烯毗咯烷酮：填充剂如乳糖、蔗糖、玉米淀粉。磷酸钙、山梨醇或盲氨酸；压片润滑剂如硬脂酸镁；崩解剂如淀粉、聚乙烯毗咯烷酮、交聚维酮、羟乙酸淀粉钠或微晶纤维素或药学上可接受的润湿剂如十二烷基硫酸钠。在实施时，本发明美洲一枝黄花总黄酮提取物可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。美洲一枝黄花总黄酮提取物(和共它成分，如果需要)亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药，可以将所述美洲一枝黄花总黄酮提取物与赋形剂一起加入并以可食片剂、颊含片剂、酊剂、胶囊、悬液、糖浆或糯米纸囊剂等等中的一种或多种形式使用。

胃肠外组合物(如胃肠外给药组合物)可以含有所述活性化合物和无菌溶媒，根据使用的浓度，所述活性化合物可以悬浮于或溶解于该溶媒中。制备胃肠外给药的溶液时，可以将本发明的组合物溶于注射用水中，过滤除菌，然后温装于适当的管制瓶或安瓿中并密封。最好将辅助剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂溶解于所述溶媒中。为增加稳定性，可以将该组合物灌装于管制瓶中后冷冻并真空去除水分。以基本相同的方法可以制各胃肠外悬浮液，但是所述活性化合物是悬浮于溶媒中而不是溶解于溶媒中，并且除菌不能通过过滤进行。

为了以非肠道给药之外给予本发明美洲一枝黄花总黄酮提取物，可能需要用防止其失活的材料对美洲一枝黄花总黄酮提取物包衣或与美洲一枝黄花总黄酮提取物一同给予。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在具体实施时，将本发明美洲一枝黄花总黄酮提取物与一种或多种可以用于治疗疾病的其它治疗药物共配制和/或共给予。这种联合使用，可以优越地利用较低剂量的该给予的治疗药物，因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。

制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂中的一种或多种，如糖浆或酏剂等中的一种或多种；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等中的一种或多种。

液体组合物(如日服液体组合物)可以制备为乳液、糖浆剂或酗剂形式，或者将它们制备为干燥产物形式，在使用前用水或其它适当的溶媒溶解。此类液体制剂可以含有常规的添加剂，如悬浮剂像山梨醇、糖浆。甲基纤维素。明胶、羟乙基纤维素、接甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶、氢化可食用脂肪；乳化剂如卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水溶性溶媒(可以包括食用油)如杏仁油、分馏椰子油、油性酯如甘油、丙二醇或乙醇的酯；防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨醇；并且如果需要可以含有常规的矫味剂或着色剂。

可以将所述化合物通过暴露于环氧乙烷中灭菌，然后将其悬浮于无菌溶媒中。

最好该组合物中含有表面活性剂或润湿剂以有助于活性组分的均匀分布。

以上所述的使用形式中，优选的形式是颗粒剂、片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂或注射剂等中的一种或多种，进一步优选颗粒剂、片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂或注射剂等中的一种或多种，特别优选颗粒剂、包衣片剂。

此外，美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料在某些情况下也能够单独直接用于制备抗炎性反应产品，也能够与许多化学物质进行混合或组合，以组合物的形式直接或间接用于制备抗炎性反应产品。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。

例如，美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的粉末用于制备抗炎性反应产品特别是药物的各种剂型，或者是美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的粉末与有关的辅料用于制备抗炎性反应产品尤其是药物的各种剂型，或者是美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的粉末与有关的制备抗炎性反应产品如药物一起用于制备抗炎性反应产品如药物的各种剂型，或者是美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的粉末与有关的辅助药物一起用于制备抗炎性反应产品如药物的各种剂型，如优选颗粒剂、片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂或注射剂等中的一种或多种，特别优选包衣片剂。

所述的方法之一是将美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的粉末灌装为胶囊剂，方法之二是将美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的粉末与有关的制备抗炎性反应产品如药物一起灌装为胶囊剂，方法之三是将美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的粉末与有关的辅助药物一起灌装为胶囊剂；方法之四是将美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的粉末与有关的辅料一起按常规方法直接压为片剂或颗粒剂，方法之五是将美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的粉末、有关的制备抗炎性反应产品如药物一起与有关的辅料按常规方法直接压为片剂或颗粒剂，方法之六是将美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的粉末、有关的辅助药物一起与有关的辅料按常规方法直接压为片剂或颗粒剂等。

除上述的六种基本方法外，还能够选择美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的其他形式或对美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料进行本领域公知的方法处理后，制备各种剂型的含有美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的产品如药物。但是，需要注意的是，在上述直接使用美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的时候，应先根据所使用的美洲一枝黄花总黄酮提取物的剂量要求，换算得到所需要使用的美洲一枝黄花总黄酮提取物所使用的药材原料的用量。

综上所述，本发明美洲一枝黄花总黄酮提取物可用于制备抗炎性反应产品，优选药物和食品，进一步优选药物。

(五)技术特长

本发明具备以下优点：1、本发明提供的美洲一枝黄花总黄酮提取物的制备工艺能有效地富集总黄酮，去除杂质，其总黄酮含量高，且其质量控制方法可通过紫外分光光度方法和高效派相分析方法进行含量测定和高效液相指纹图谱进行分析，该分析方法简单易控。

2、美洲一枝黄花总黄酮提取物具有明显的抗氧化的作用，高含量的总黄酮能够达到良好治疗效果：美洲一枝黄花总黄酮还具有显著的抗脑缺血和抗炎作用。

3、急性毒性试验结果表明，美洲一枝黄花总黄酮提取物的毒性低，具有很好的用药安全性，而未经该工艺处理的乙醇提取物和超临界提取物具有一定的毒性。这充分提示了本工艺制备的美洲一枝黄花总黄酮提取物的临床用药的安全性。

4、本发明提供的美洲一枝黄花总黄酮提取物制备工艺中采用树脂纯化方法，该方法简便、快捷、重视性好；所选用的大孔吸附树脂吸附量大，解吸率大，可反复使用；所选用的溶剂乙醇，价廉、无毒。

该工艺技术突出优点是：(1)提取效率高；(2)有效地富集了主要活性成分一黄酮类成分，且提取物体积小，提高了中药的内在质量；(3)充分祛除了其非黄酮类成分(具有刺激咽喉黏膜作用)等三萜类化合物、甾体等；(4)减少了产品的吸潮性：(5)去除了大量的无机盐、粘液质等，从而增强了产品的稳定性；(6)容易制备成外观美观的各种剂型；(6)大孔树脂再生处理方便，降低了工艺成本。

正因为以上优点，充分说明了该工艺适合工业化生产，具有很大的实用性。

本发明有针对性地研究美洲一枝黄花总黄酮提取物，该原料使用安全，互为兼顾，一物多用，最大限度地发挥了作用，而且使用范围特别广，因此容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。

也就是说，本发明的研究结果可被进一步深入开发为具有临床应用前景的防治抗氧化、抗炎、抗肿瘤产品尤其是新药。该产品具有疗效确切、有效剂量低、无毒副作用的优点，与同类产品相比具有显著的优势。这些疾病为临床常见病、多发病，随着全球大气污染的日益严重和环境的恶化，预计这些疾病的发病率将不断攀升。因此，本发明还可为后续的新药研究打下良好的基础，并进一步产生较大的经济效益和社会效益。

经过长期的药理学试验，美洲一枝黄花总黄酮提取物具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎及其相关病症的活性，直接使用美洲一枝黄花总黄酮提取物，作用更直接，从而克服了中药给药剂量难以控制的问题，并提高了生物利用度；而且美洲一枝黄花总黄酮提取物药理作用较强，其原料来源丰富，制备工艺简单。

(六)社会效益

根据农业部的最新统计显示，目前，入侵中国的外来生物已达400余种。近10年来，新入侵中国的外来生物至少20余种，平均每年递增两种。中国已经成为遭受外来入侵生物危害最严重的国家之一。在国际自然保护联盟(IUCN)公布的全球100种最具威胁的外来生物中，中国已经有50余种。2004年11月4日，在北京召开的“外来入侵生物预防与控制技术发展战略国际研讨会”上，包括中国、英国、美国等6个国家、3个国际组织以及世界银行等国际知名专家、学者、管理专家，为中国外来入侵物种的预防与管理献计献策。中国将启动外来入侵生物国家发展策略框架。

美洲一枝黄花作为外来入侵性植物，到目前为止，已经严重的破坏了中国的自然资源和生态环境，很多地方已经把美洲一枝黄花作为一种杂草除掉。通过本发明研究，可以有效的利用这样的杂草资源，同时还可以很好的提高人们的生活质量，可以起到变废为宝的作用。

总之，本发明积极适应了现代医疗和科研领域的工作需要和人性化服务的需要，是用于抗氧化、抗肿瘤、抗炎及其相关病症的安全原料。

附图说明

图1表示：TF对肝组织匀浆脂质过氧化的作用；

图2表示：TF对Vit C-Fe²⁺系统诱导肝线粒体形态改变的影响；

图3表示：美洲一枝黄花总黄酮低剂量、高剂量和对照组用苡仁提取物(wogonin)抑杀食道癌细胞的疗效比较；

图4表示：美洲一枝黄花总黄酮抑杀体外细胞培养实验中食道癌细胞生长的剂量曲线；

图5表示：黄霉素抑杀活体动物上移植食道癌的生长情况。

具体实施方式

本发明研究了一种中药的新的活性部位即总提取物及其制备方法和用途，提供了一种能够用于制备抗氧化、抗肿瘤、抗炎产品如药物及其相关病症产品特别是药物的原料，便于医疗行业和相关行业如食品、饮料等领域的安全使用，包括疾病治疗、科学研究等。

(一)美洲一枝黄花总黄酮提取物的制备方法

该提取物的制备方法包括以下步骤：

1)药材用含水乙醇提取；

2)减压浓缩步骤所得提取液；

3)以水稀释浓缩液，并作澄清处理，取上清波：

4)取上清液，过大孔树脂柱吸附，弃流出液；然后用水洗涤所述吸附柱，养水洗液；之后，采用乙醇洗脱吸附柱共收集该乙醇洗脱液；

5)浓缩、干燥乙醇洗脱液，得到美洲一枝黄花总黄酮提取物。

其中：

步骤1中，所述含水乙醇提取是指以含水乙醇作溶剂，采用本领域内已知的常规技术提取，例如，热回流提取、渗源法提取、连续逆流提取等，其中，所述含水乙醇是指10倍体积(与药材重量比)浓度为50～80％的乙醇水溶液。学例来说，对于热回流提取，其溶剂用量为药材重量的8～10倍(溶剂作积/药材重量，提取次数为2～3次；加热温度可以为60～85℃。

步骤2中，提取液浓缩后，其体积(L)优选为原药材(kg)的6～10倍体积。

步骤3中，浓缩液化选以加3～5倍体积的水稀释。

步骤4中，吸附柱吸附提取液后，优选用1～5BV(柱床体积)的水洗涤，洗脱液流速优选为0.5～2.5BV/小时；洗脱乙醇优选采用50～90％乙醇水溶液，洗脱液流通优选为0.5～2.5BV/小时。

所述大孔树脂通常为苯乙烯型共聚体的含有酯基或氰基的中等极性吸附树脂，其结构为大孔网状结构，例如D-101大孔树脂、SIPI-40大孔树脂、SIPI-21大孔树脂或SIPI-8大孔树脂等。

在上样前，应当对大孔树脂进行前处理，以防止有效成分从废液中流失。在树脂前处理时，通常先用5％HCl洗脱，后用纯化水洗至中性，再用2％NaOH洗脱，后用纯化水洗至中性，连续生产时，用95％乙醇洗柱，后用纯化水洗至蜂为零度，即可再次使用。

步骤5中，得到的美洲一枝黄花总黄酮提取物进行干燥处理，得到干燥形式的提取物，所用的干燥方法包括真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。

因此，进一步的，本发明所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物可以通过下述方法制备得到：

1)药材用50～80％的乙醇水溶液热回流提取2～3次，合并提取液；

2)减压浓缩步骤1)所得提取液至原药材的6～10倍体积；

3)以3～5倍体积的水稀释浓缩液，并作澄清处理，取上清液；

4)取上情液，过大孔树脂柱吸附，弃流出浓；然后用1～5BV的水，以0.5～2.5BV/小时的流速洗涤所述吸附柱，弃水洗液；之后，采用50～90％的乙醇，以0.5～2.5BV/小时的流速洗脱吸附柱，收集该乙醇洗脱液；

5)浓缩、干燥乙醇洗脱液，得到美洲一枝黄花总黄酮提取物。

上述BV(Bed Volumn)为树脂柱装载的树脂后的柱床体积。树脂柱的处理能力与它的树脂装载量成正比。洗脱液的流量和速率以BV或BV/hr为计算单位。

在采用上述工艺制备提取物之前，通常需要先将美洲一枝黄花药材进行前处理，即将美洲一枝黄花粉碎，洗净，晒干，粉碎，过筛。

美洲一枝黄花总黄酮提取物的其他提取方法如下：

方法一：

(1)将上述药才洗净，浸泡6～24小时后置入提取溶器内煎煮2～6次，每次煎煮的时间为0.5～3小时。

(2)将数次提取的药液合并，一齐进行浓缩成浸膏。

(3)将浸膏静置后，加入乙醇进醇沉，回收乙醇去沉淀。

(4)取醇沉后的上清液，浓缩成纯浸膏，该纯浸膏比重1.0～1.5(得率8～16％)

(5)加入辅料制粒干燥过200～400目筛。

(6)包装成10～15g/袋，成品颗粒。

方法二：

(1)将上述药材浸泡6～24小时，置入提取容器中，煎煮2～6次，每次煎煮的时间为0.5～3小时。

(2)将数次提取药液合并，一齐进行负压浓缩成稠膏，该稠膏比重1.0～1.5。

(3)将稠膏负压真空干燥-0.085±0.005mpa，70℃±5℃得干膏(水分＜3％)；粉碎过50～200目筛得干膏细粉，得率为6.8％。

现有的研究表明，其他成分对药效或药物的使用等方面至少没有负面的影响，而且分离这些成分成本较高，因此目前没有进一步纯化的必要。

(二)美洲一枝黄花总黄酮提取物的含量控制

本发明采用高效液相色谱法、高效液相色谱一电喷雾质谱法和薄层色谱等技术手段对所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物进行含量控制，对B纹图谱特征和非黄酮类杂质分析的研究。

1、含量控制：采用紫外分光光度法和高效液相色谱法(简称：HPLC)分别测定由实施例1和实施例2制备得到的美洲一枝黄花总黄酮提取物中总黄酮的含量和槲皮素的含量。以槲皮素为对照品，在266nm进行检测。分析测定结果表明其总黄酮的含量为55～90％(重量百分比)；鸯尾式的含量为10～50％(重量百分比)。

2、指纹图谱：采用高效液相色谱一电喷雾质谱法，对美洲一枝黄花总黄酮的主要成分进行了分析和鉴定，确定其黄酮主要为槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸。

以高效液相分析方法检测，以峰面积归一法计算，其相对峰比例分别为，槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸：1∶0.12～0.5∶0.10～0.3∶0.20～0.6∶0.1～0.3。

由此推算，槲皮索∶槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷∶山奈酚∶山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷∶绿原酸的重量比为10～50∶2～28∶1～17∶2～24∶0.5～13。

3、杂质分析：采用薄层色谱法，对美洲一枝黄花总黄酮提取物中所含杂质进行分析。根据本发明的另一个方面，本发明提供了所述美洲一枝黄花总黄酮提取物的制备工艺。本发明首次对美洲一枝黄花总黄酮进行大孔树脂吸附制备工艺的研究，提供了美洲一枝黄花总黄酮的大孔树脂吸附纯化方法，该纯化方法是将美洲一枝黄花液经上树脂柱、洗脱、收集沈脱液、浓缩、干燥，获得纯化的美洲一枝黄花总黄酮，从而有效地富集了总黄酮，并去除了杂质。

(三)美洲一枝黄花总黄酮提取物的各种剂型

下面以几个典型的剂型为例，详细阐述美洲一枝黄花总黄酮提取物各种剂型的具体制备方法。

本发明制备粉针剂一般采用常规的冷冻干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取美洲一枝黄花总黄酮提取物，加入赋形剂，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，灌装，半轧塞，冷冻干燥，压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖或右旋糖苷等中的一种或几种。每瓶含美洲一枝黄花总黄酮提取物10～100mg。

本发明制备粉针剂也可采用喷雾干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取美洲一枝黄花总黄酮提取物，加或不加赋形剂(赋形剂同上)，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，喷雾干燥，无菌分装，压塞轧盖即可。每瓶含美洲一枝黄花总黄酮提取物10～100mg。

本发明制备小针剂时，以注射用水作为溶媒配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯或二甲基乙酰胺等中的一种或几种。每支含美洲一枝黄花总黄酮提取物10～100mg。

本发明制备葡萄糖输液或氯化钠输液，以注射用水作为溶媒，加入适量葡萄糖或氯化钠配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯或二甲基乙酰胺等中的一种或几种。每瓶含美洲一枝黄花总黄酮提取物10～100mg。

本发明制备片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等口服制剂，辅料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸盐等，按常规技术制备。

在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实例均是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制发明的范围。

为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图，通过实施例对本发明作详细描述。本发明所用的美洲一枝黄花(干燥根茎)采自于上海江湾体育场，经鉴定为美洲一枝黄花的全草。本发明所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品。

实施例1、美洲一枝黄花总黄酮提取物的提取方法之一

取美洲一枝黄花药材500kg，加入5吨70％乙醇，加热回流提取3h，滤过，药渣继续加3吨乙醇回流提取Zh，滤过，两次提取液合并。减压回收溶剂，温度50～60℃，浓缩到原药材的8倍体积，将浓缩液加3借热水稀释，加入适量中药澄清剂，离心，去沉淀，取上清液，上样于大孔树脂柱(在L样前分别用酸、碱、水、醇对树脂柱进行前处理)，上样后先用3BV纯水冲洗，水溶液弃除，改用3BV的70％乙醇洗脱，洗脱液流速为1.SBV/h，收集该乙醇洗脱版。继续减压回收溶剂，收集浸育，喷雾干燥，即得。

实施例2、美洲一枝黄花总黄酮提取物的质量分析方法之一

下列质量分析中所用样品包括：

样品：按实施例1的方法，从美洲一枝黄花中提取美洲一枝黄花总黄酮提取物，共5个批号；

1、含量分析

1.1总黄酮的含量测定

采用紫外分光光度法测定美洲一枝黄花总黄酮提取物的含量，其中紫外分光光度为UV-2401PC型，运用标准曲线线性回归方法，以驾尾式为对照品，在266nm测定。

1.1.1标准品溶液配制

精密称取对照品槲皮素(自制)，HPLC归一法，含量为99％，16.20mg用适量乙醇溶解。定容于50ml容量瓶中，摇匀，作为储备液，精密吸取sml储备液，70％乙醇定客于50ml容量瓶中，分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml中，定容于10ml容量瓶中，进行紫外测定，记录吸收度值，以对照品浓度(x)为横坐标，吸收度(y)为纵坐标进行回归计算。

1.1.2测定方法

分别精密称取20mg样品，加20ml 70％乙醇，超声提取半小时，提取液过滤，药渣按前法再操作1次，过滤，两次滤液合并，定容至50mL的容量瓶中，吸取0.5mL续滤液，定容于25mL的容量瓶中持测定，记录吸收度，接线性方程计算含量。由吸收度值计算总黄酮的含量。

1.1.3结果

五批结果表明，其总黄酮的含量为分别为55％，60％，70％，65％，61％，平均含量为62.20％；

通过多批号检测证明，运用本发明工艺制备的美洲一枝黄花总黄酮提取物中总黄酮的含量范围在55％～90％重量。

1.2槲皮苷的含量测定

采用高效液相色谱法(简称：HPLC)，以槲皮素为对照品，测定美洲一枝黄花总黄酮提取物中槲皮苷的含量。

1.2.1色谱条件

高效液相色谱仪HP1100系列(美国惠谱公司)，Hypersil BDS C₁₈填料常规色谱柱(slim，4×250mm)，柱温(30℃)，水(A)和乙睛(B)为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为0min时，A∶B为88∶12；20min时为72∶28，60min时为40∶60，流速1ml/min，紫外检测器(简称：LV)，检测波长266nm。

1.2.2标准品溶液配制

称取对照品13.62mg，用适量70％乙醇溶解，定容于50ml的容量瓶中，摇匀，作储备液。精密吸取5ml储备液，70％乙醇定客于50ml的容量瓶中。分别吸取1，1.5，2，4，10mL，转移到10mL容量瓶中，用70％乙醇定客至刻度。以对照品浓度(x)为横坐标，吸收度(y)为纵坐标进行回归计算，得到回归方程Y＝43359.81x-8.43066，R＝0.9999，槲皮苷在0.002724～0.02724mg/ML范围内具良好的线性失系。

1.2.3测定方法

取样品适量，精密称定20mg左右，转移至50mL容量瓶中，加70％乙醇40mL，常温下超声30min，取出冷却到室温，加70％乙醇至刻度，摇匀，吸取2mL至10mL容量瓶中，70％乙醇定容至刻度，摇匀，即可测定。根据标准线即可计算槲皮苷的含量。

1.2.4结果

五批测定结果表明，其槲皮苷的含量分别为12％，18％，15％，16％，17％，平均含量为15.6％；

通过多批号检测证明，运用该工艺制备的美洲一枝黄花总黄酮中槲皮苷的含量范围在10％～50％重量。

2.指纹图谱分析

2.1样品溶液配制

分别取由实施例1和2得到的美洲一枝黄花总黄酮样品20mg，精密称定，置50ml量瓶中，加70％乙醇40ml，超声提取半小时，提取液过滤到50ml容量瓶中，冷解恒温，加适70％乙醇并稀释至刻度，摇匀，吸取2ml，定客到10ml的容量瓶中，作为供试品溶液。

2.2测定方法

高效液相色谱一电喷雾质谱法(简称：HPLC-EIMS)识别提取物化学组分，高效液相色谱法(简称：HPLC)检测各组分含量。

2.2.1高效液相色谱一电喷雾质谱法的检测条件

高效液相色谱系统条件同1.2.1；质谱仪器：ICQ advantage型质谱仪(美国Finnigan公司)，Thermo Fingan surveryer包括MS pump、Auto sampler-poADetector)：ESI离子源的鞘气(N₂)，流通70ml/min，辅助气以外，流通20ml/min；源电压4.SKV；正高于检测；碰撞气体为氦气；喷雾毛细管温度280℃，毛细管电压43V；采用全离子扫描方式，扫描范围m/Z＝200～1000。

2.2.2组分含量分析条件

高效液相色谱仪HP11 00系列(美国惠谱公司)，Hypersil BDS C18填料常规色谱往(5um，4×250mm)，柱温(30℃)，水(A)和乙睛(B)为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为0min时，A∶B为88∶12；20min时为72∶28，60min时为40∶60，流速1ml/min，紫外检测器(简称：UV)，检测波长266nm，以槲皮素为对照品，进行检测。

2.3结果

2.3.1提取物化学组分识别

采用高效液相色谱一电喷雾质谱法，对美洲一枝黄花总黄酮的主要成分进行分析和鉴定，确定其黄酮主要为槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸。

2.3.2提取物中各化学组分含量

根据HPLC-EIMS结果可知，保留时间(RT)为问.30min的色谱峰为槲皮素峰；RT为13.78min的色谱峰为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷；RT为22.30min的色谱峰为山奈酚峰；RT为24.09min的色谱峰为山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷峰；RT为引.31min的色谱峰为绿原酸峰。

以峰面积归一法计算槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸的相对峰比例。

五批结果相对峰面积比例分别为：

所以，美洲一枝黄花总黄酮五个峰(槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸)相对比例归纳为：1∶0.12～0.5∶0.10～0.3∶0.20～0.6∶0.1～0.3o

由此推算槲皮素、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸的百分含量依次为10.00～50.00％、2.80～8.00％、1.60～16.20％、2.33～23.30％、0.83～2.53％；槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸的重量比约为10～50∶2～28∶1～17∶2～24∶0.5～13。

3、杂质分析

采用薄层色谱法对从美洲一枝黄花中提取的美洲一枝黄花总黄酮提取物进行分析，展开剂：石油醚∶丙酮(8∶2)，硅胶GF254层析板，以二萜和美洲一枝黄花药材为参比。

由检测结果可知，本发明的美洲一枝黄花总黄酮中不含杂质二萜。

本发明对从驾尾中提取的美洲一枝黄花总黄酮提取物也进行如上的杂质分析，分析条件与结果均与上述相同，此处不作重复说明。

实施例3、美洲一枝黄花总黄酮提取物的体外抗氧化药理作用研究之一

1.1.美洲一枝黄花总黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用(Ponti V，Dianzani MV，Cheeseman KJ，et al.Studies on the reduction of nitroblue tetra-zolium chloride mediated throughthe action of NADH and phenazine methosulate[J].Chem Biol Interact，1978，23：281)

在16mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)中含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)73μmol/L，甲硫酸吩嗪(Phenazine methosulphate，PMS)15μmol/L，氮兰四唑(nitroblue tetrazolium，NBT)50μmol/L产生O^2-，空白管不加PMS，对照管不加美洲一枝黄花总黄酮(简称：TF)，TF的终浓度为20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L，总体积为3ml，于560nm处测吸收度，计算抑制率。结果显示，TF能明显清除NADH-PMS-NBT系统产生的超氧阴离子自由基，且呈量效关系(表1)。

表1、总黄酮对NADH-PMS-NBT系统产生的O^2-的清除作用Scavenging efiect of TF on O^2- produced by NADH-PMS-NBT system

分组	浓度(mg/L)	O<sub>2</sub><sup>-</sup>的浓度(A<sub>560nm</sub>)	清除率(％)
				对照	0	0.8846±0.0110	-
TF	20	0.61 35±0.0098<sup>*</sup>	30.65
					40	0.4774±0.0103<sup>**</sup>	46.03
	80	0.3896±0.0091<sup>**</sup>	55.96
					160	0.3112±0.0101<sup>**</sup>	64.82

n＝4， ^*P＜0.05^**P＜0.01 vs control group

1.2 TF对H₂O₂系统产生的羟基自由基的清除作用 以Smirnoff等(Smirnoff N，Cumbes Q J.Hyroxyl radical scavenging activity of compatible solutes.[J].Phytochemistry，1989，28(4)：1057-1060.)的方法为基础并改进。即采用亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基(·OH)方法。以·OH氧化水杨酸所得产物的吸收度示·OH多少，吸收度越大，·OH越多。最后加H₂O₂启动反应，37℃反应1h，在510nm处测定吸收度，吸收度越小，清除效果越好。

1.3.TF对诱导的H₂O₂小鼠红细胞溶血作用的影响(Wu YJ，Li WG，Zhang ZM，et al.Antioxidative activty of 4-oxy-and 4-hydroxy-nitroxides in tissues and eyethrocytes fromratsf[J].Acta Pharmacol Sin，199718：150) 小鼠经眼球取血，肝素抗凝，4℃离心3000r/min，10min，得红细胞，用冰冷生理盐水溶液洗3次，制成0.5％悬浮液。取红细胞悬液1ml，模型管加H₂O₂(使终浓度为100mmol/L)，受试物管中加入H₂O₂(终浓度为100mmol/L)以及不同浓度的TF(终浓度分别为20，40，80，160mg/L)，同时设未诱导溶血的空白对照管。上述各管混匀后37℃水浴中温育1h，以生理盐水稀释5倍，离心3000r/rain，10min，上清液在415nm波长处测吸收度。计算溶血率及抑制率：

溶血率＝(A受试物/A模型组)×100％，抑制率＝(模型组溶血率-受试物溶血率)/(模型组溶血率-空白组溶血率)×100％

与对照组比，H₂O₂明显诱导了红细胞溶血的发生，模型组的吸收度值明显升高(P＜0.01)；同时TF对由H₂O₂引起的该效应均有抑制作用，并表现出一定的量效关系(表2)。

表2、总黄酮对H₂O₂系统产生的O^2-的清除作用Scavenging effect of TF on for·OH produced by H₂O₂ system

分组	浓度(mg/L)	O<sub>2</sub><sup>-</sup>的浓度(A<sub>560nm</sub>)	清除率(％)
				Control	0	0.9146±0.0110	-
TF	20	0.8135±0.0098<sup>*</sup>	20.46
					40	0.6874±0.0103<sup>*</sup>	30.12
	80	0.5962±0.0091<sup>**</sup>	37.13
					160	0.5611±0.0108<sup>**</sup>	39.28

n＝4， ^*P＜0.05^**P＜0.01 vs control group

表3、总黄酮对H₂O₂引起的小鼠红细胞溶血的作用Effect of TF on the hemolysis of mouse RBC induced H₂O₂

分组	浓度(mg/L)	A415nm	溶血率(％)	清除率(％)
					Control	-	0.058±0.021	13.65	-
Model	-	0.425±0.085<sup>△△</sup>	100	-
					TF	20	0.361±0.024<sup>*</sup>	84.94	17.44
	40	0.314±0.038<sup>**</sup>	73.88	30.25
						80	0.302±0.043<sup>**</sup>	71.06	33.51
	160	0.288±0.025<sup>**</sup>	67.76	37.34

n＝4， ^△△P＜0.01 vs control group^*P＜0.05 ^**P＜0.0l vs model group

1.4.TF对肝组织匀浆脂质过氧化的作用(龚国清，刘同征，李立文，等。西红花酸的体外抗氧化作用的研究[J]。中国药科大学学报，2001，32(4)：306-309)小鼠脱颈椎处死，迅速取肝，置于4℃PBS中洗净表面残血，用滤纸吸干，制成10％的匀浆备用。取上述组织匀浆1ml，加入不同浓度的TF溶液0.5ml(终浓度分别为20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L)，以DMSO为阳性对照药(终浓度为1.5μmol/L)，终反应体积为1.5ml。37℃水浴中温育，且于不同时间点吸取0.1ml混悬液，按丙二醛测定试剂盒操作测定MDA的生成量(见图1)。由图1可见，肝匀浆在自氧化的过程中，氧化产物MDA生成量是随时间的延长而增加的，在0～1小时间，MDA的含量增长最快，在以后增长较缓慢。在各个时间段中，TF和DMSO对肝匀浆的自氧化有显著的抑制作用，且TF呈现良好的量效关系。

1.5.TF对Vit C-Fe²⁺系统诱导肝线粒体氧化损伤的影响(罗景慧，杨迎暴，林永成，等。海洋真菌Halorosellina oceanicum 323代谢产物的体外抗菌素氧化活性研究[J]。中药材，2004，27(3)：188-192)

1.5.1.线粒体的制备昆明种小鼠，脱颈椎致死，取肝脏置于预冷至0℃～4℃的0.25mol/L，PH 7.4的蔗糖溶液中洗涤，洗净血液，用滤纸吸去肝组织表面的溶液，称重，以1∶8的比例加入预冷的蔗糖溶液，将肝组织用剪刀剪碎，置于匀浆器中打成匀浆，以低温离心10min，取上清液低温离心10min，分离沉淀，用预冷的0.25mol/L的蔗糖溶液洗涤两次，每次离心10min，即得到纯化的线粒体，沉淀物用缓冲液(Tris-HCl 20mmol/L，pH7.0，KCl 175mmol/L)混悬，取线粒体混悬液涂片，用1％的詹纳斯绿B液染色20min，覆上盖玻片，显微镜鉴定，线粒体蓝绿色，呈小棒状或者哑铃状。用双缩脲测定线粒体蛋白含量。

1.5.2.TF对Vit C-Fe²⁺系统诱导肝线粒体形态改变的影响反应体系为：反应体积3ml，0.1mmol/LVitC，5μmol/LFeSO4，含有1.0mg线粒体蛋白质，加入各种浓度的TF或者缓冲液，37℃水浴中温育30min。于520nm处测线粒体悬液的浊度变化。光密度的下降表示线粒体膨胀度增加。结果表明TF能明显抑制由FeSO₄/Vit C所引起的线粒体的形态改变效应(见图2)。与对照组比较差异具有统计学意义。

2.讨论

超氧阴离子自由基、羟基自由基等活性氧自由基是在机体代谢过程中产生的。在生理状态下，活性氧自由基处于较低的水平，其产生和与清除处于动态平衡，但在某些病理情况下，这种平衡被打破，将导致机体损伤。其中羟基自由基的危害最大，可导致多种疾病的发生，许多病理生理现象如衰老、肿瘤、炎症、脑缺血等均与氧自由基有密切联系。本研究采用H₂O₂和Fe²⁺系统产生羟基自由基，利用NADH-PMS-NBT系统产生超氧阴离子自由基，来研究TF的清除自由基活性，结果表明TF于体外可清除O_2-、·OH。

另一方面活性氧可促发多不饱和脂肪酸的脂质过氧化(简称：LPO)，反应中产生的各种中间过氧化产物也具有损伤作用，LPO反应的终产物丙二醛(简称：MDA)可使含氨基的蛋白质、核酸、脑磷脂发生交联并丧失其活性。本研究结果显示TF能显著地抑制H₂O₂诱导的小鼠红细胞溶血和降低肝匀浆自氧化产物MDA的含量。

线粒体是细胞内能量代谢的主要场所，参与包括自由基生成、脂质代谢等在内的许多生理和生化过程。近年来的研究还表明，线粒体是多类药物的细胞内靶点。因此维持其结构和功能正常对生物体的正常活动有着至关重要的意义。本研究证实TF可降低Vit C-Fe²⁺系统诱导肝线粒体的肿胀，表明其对自由基过度生成而引起的线粒体功能损伤有一定的保护作用。

以上结果说明TF有明显的体外抗氧化作用，又是一种天然水溶性色素，对于进一步开发成抗衰老药物或保健食品辅料有较大的参考价值。

结果表明TF能明显清除H₂O₂系统产生的羟基自由基。与对照组比较差异具有统计学意义。

实施例4、美洲一枝黄花总黄酮提取物的抗炎作用实验

1、实验材料

1.1试验样品

有效部位1(简称1号)：从美洲一枝黄花中提取的美洲一枝黄花总黄酮(按实施例1工艺方案制备，含量大于50％)，200mg/kg低剂量

有效部位1(简称1号)：从美洲一枝黄花中提取的美洲一枝黄花总黄酮(按实施例1工艺方案制备，含量大于50％)，400mg/kg低剂量

阿司匹林：系sigma化学公司产品。

角叉菜胶：系sigma化学公司产品。

1.2试验动物

1.2.1昆明种小鼠，8～22g，购于中科院上海实验动物中心。

1.2.2SD大鼠，体重180～220g，购于中科院上海实验动物中心。

2、实验方案和结果

2.1小鼠耳廓二甲苯致敏试验

小鼠随机分成4组，每组10只，分成有效部位1(200mg/kg)、有效部位2(400mg/kg)、阿司匹林对照组(300mg/kg)及空白对照组。每日一次，连续5天，末次给药40min，各鼠左耳两面涂以二甲苯60ul致炎。右耳作对照，1h后脱颈椎处死，沿耳廓是部剪下两耳，用直径8mm打孔器取下相同部位耳片，称重。以对照耳片重量为100％，计算致炎耳炎症增重百分率。

结果见表4，结果表明，2小时即对甲苯致炎的小鼠耳肿胀有显著的抑制作用，与对照组相比有显著性差异。

2.2大鼠足角叉胶致炎试验

大鼠随机分为4组，每组10只，分设有效部位1(200mg/kg)、有效部位2(400mg/kg)，阿司匹林对照组(300mg/kg)及空白对照组。及空白对照组。每日一次，连续5d，末次给药30min，向大鼠左后足垫部皮下注射0.8％角叉菜胶0.1ml后，用游标卡尺(精密度0.02mm)测定致炎前和致炎后的1.0、2.0、3.0h大鼠足厚度的差值为肿胀度，比较各组肿胀度的差异。

结果见表5。结果表明，与对照组相比，美洲一枝黄花总黄酮提取物均对大鼠足角叉菜胶致炎有明显的减轻作用，上述两个致炎试验说明该提取物具有良好的抗炎作用，其效果与阿司匹林相似。

表4、美洲一枝黄花总黄酮对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

表5、对角叉胶所致大鼠足肠炎症的影响(n＝10)(X±SD)

与对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

实施例5、美洲一枝黄花总黄酮抑制裸鼠上移植食道癌内的血管生成状况

实验方法：先将食道癌细胞株接种在探鼠皮下。自第二周开始，总黄酮经皮下给药，每周3次。实验持续至第12周，每周测量一次肿瘤的表面积。实验结束后，将肿瘤自探鼠上分离下来，经化学固定和冰冻切片后，用人因子作抗体进行免疫组化染色。图片中棕色片段即为肿瘤血管断面。左图样本取自未用药组，右图样本取自用药组，用药剂量1mg/kg体重，可见血管数量明显减少。

结果如图3所示，该图表是美洲一枝黄花总黄酮低剂量、高剂量和对照组用苡仁提取物(wogonin)抑杀食道癌细胞的疗效比较。在离体性别培养实验中，美洲一枝黄花总黄酮低剂量、高剂量和苡仁提取物均有抑杀食道癌细胞的作用，但作用强度略有差异。相对强度：美洲一枝黄花总黄酮高剂量＞低剂量＞苡仁提取物。

实验方法：三种实验细胞株均采用相同的培养条件。1×10⁵细胞被种植在直径为15mm的培养盘上，培养液含有10％小牛血清。24小时待细胞贴壁后，将培养液换成无血清培养液以避免血清中存在的生长因子对细胞生长的影响。换液后24小时开始加药。加药5天后作细胞计数。计数前先用台潘兰将细胞染色以排除已死亡细胞对实验结果的影响。曲线中每一点为3次实验的平均值。

如图4所示，该表是美洲一枝黄花总黄酮抑杀体外细胞培养实验中食道癌细胞生长的剂量曲线。曲线1表示正常细胞，曲线2表示乳腺癌细胞，曲线3表示食道癌细胞。

从曲线中可见，用药浓度为0.1开始起效果(2％抑制)，浓度为外0.5ug/ml时，食道癌细胞生长的抑制为50％。而当浓度达到10ug/ml时，抑制可达95％。

实施例6、美洲一枝黄花总黄酮提取物的质量分析方法之一

实验方法：先将食道癌细胞林接种在裸鼠皮下，经1～2周后肿瘤开始生长。美洲一枝黄花总黄酮下注射自第二周开始，每周3次。实验动物被随机分成3个实验剂量组合一个对照组，每组10个裸鼠。实验持续至第12周，每周测量一次食道癌肿瘤的表面积。实验结束后，将食道癌肿瘤自裸鼠上分离下来，并做保存处理以备用作药理，免疫组化及生化检查。

如图5所示，是黄霉素抑杀活体动物上移植食道癌的生长。

实施例7、美洲一枝黄花总黄酮提取物的质量分析方法之一

本实验观察ICR小鼠单次灌服美洲一枝黄花总黄酮后，由于吸收所产生的毒性反应和死亡情况。结果表明本发明提供的美洲一枝黄花总黄酮6000mg/kg灌胃给药后，ICR小鼠的食量、体重未见异常。在给药后14大内，小鼠未发生死亡。因此，美洲一枝黄花总黄酮灌胃给药的LD50＞6000mg/kg。

1、试验材料

1.1动物

ICR小鼠，清洁级，20±3g，雌雄兼用，购手上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号为沪动合格率第152号。

1.2受试药物

样品1：从美洲一枝黄花中提取的总黄酮。(按实施例1工艺方法制备，含量大于50％)

样品2：以乙醇提取所得到的乙醇提取物，总黄酮含量为10％左右。

样品3：以超临界提取所得到的提取物，总黄酮含量为8％左右。

2、试验方法

ICR小鼠20只，给药前禁食12h(仅供水)。每只小鼠以受试药物(样品1)的最大可灌胃浓度(0.15g/ml)和小鼠的最大可灌胃容量(0.4ml/10g)给予6ug/kg，受试药物(样品2，样品3)的最大可灌胃浓度(0.16g/ml)和小鼠的最大可灌胃容量(0.4ml/10g)给予5g/Kg。观察记录给药后14天内动物全身状况。体重、呼吸。中枢神经系统、四肢活动等变化。若动物死亡，即立即进工尸检，记录病变情况。若有肉眼可见变化，则进行病理检查。

3、结果

结果可知，给药组和对照组ICR小鼠的体重均有所升高，两者之间比较无显著性差异。

4、结论

样品1灌胃给药的LD₅₀＞6000mg/kg，这个结果提示该药物在用于临床时毒性不大；样品2和样品3灌胃给药的LD₅₀为5000mg/kg。这说明经过本发明制备工艺处理后的样品明显无毒。

实施例8、美洲一枝黄花口服制剂的具体制备方法

1.美洲一枝黄花提取物的制备

选取一定量的美洲一枝黄花100份置于500～2500份的乙醇、甲醇或丙酮，或其中两种或三种溶液的混合液，在20～80℃条件下，搅拌0.5～3个小时，使之成为溶液或混合液，将溶剂回收，所余固体真空干燥，得到美洲一枝黄花提取物。

2.制剂的制备

将上述提取物过60～200目筛，并且根据制剂剂型的要求加入聚山梨酯80和其它辅料，具体的制备方法如下：

(1)美洲一枝黄花片、胶囊、颗粒剂的制备

将上述提取物过60～200目筛，所得到粉末中加入乳糖100～2000份及微粉硅胶100～500份混合均匀，得到混合物I，取淀粉100～2000份和混合物I混匀，得到混合物II，取10～2000份的聚山梨酯80和20～85％乙醇(润湿剂)，加入的量为500～2000份，干燥时去除。混匀喉慢慢加入混合物II，混匀。在上述混合物中加入20～80％的糖浆制成软材，按照美洲一枝黄花提取物100份计，糖浆量为50～400份，过10～80目筛制颗粒，40～60℃干燥2～12小时，过10～80目筛整粒，称重测定，加入滑石粉1～50份，装入铝塑袋中得到美洲一枝黄花颗粒剂；或根据美洲一枝黄花提取物装入硬胶囊克，制得美洲一枝黄花胶囊剂，或将颗粒经压片机制成片剂。

(2)美洲一枝黄花软胶囊剂的制备

将提取物过60～200目筛，所得到粉末中加入乳糖10～2000份聚山梨酯80、100～2000份PEG(分子量200～600)、20～200份1，2-丙二醇、1～50份水得混合液，研磨20～120min。使得全部过80～200目筛，静置过夜；将药液置于轧囊机得贮液槽中，保温40～50℃压囊。400～4000份明胶液，干燥20～24小时，无水乙醇洗涤，干燥，选粒即得。

本发明得美洲一枝黄花口服制剂及其方法，将美洲一枝黄花提取物与聚山梨酯80混合，可以增加美洲一枝黄花得水溶性和分散性，增加对于胃肠道黏膜得通透性，即可改善美洲一枝黄花的口服吸收，实验证明所用的辅料不与药物发生化学反应，不影响药物的测定及药理活性，所得制剂性质稳定，对机体无毒无刺激性，口服生物利用度显著提高。

实施例9、美洲一枝黄花颗粒剂的具体制备方法

选取美洲一枝黄花10kg，在50℃回流搅拌条件下使之溶于10倍的乙醇中，反应2h，回收乙醇，蒸干，50℃真空干燥10h得到美洲一枝黄花提取物，研磨过120目筛，取150g的提取物与600g的微粉硅胶、1500g的乳糖和600g的淀粉混匀，再取50％的乙醇1000g和180g的聚山梨酯80(分子量是1200.8)混匀后加入上述混合物中，混匀。然后用75％的糖浆200g做粘合剂制得软材，过30目筛，50℃干燥5h，过20目筛整粒，加入3g滑石粉，制得美洲一枝黄花颗粒剂。

实施例10、美洲一枝黄花片的具体制备方法

选取美洲一枝黄花10kg置于5倍量的80％的乙醇中，在70℃条件下，搅拌3h，使之成为溶液，将溶剂回收，所余固体真空干燥，得到美洲一枝黄花提取物。将上述提取物过100目筛，取150g的提取物与600g的微粉硅胶、1500g的乳糖和600g的淀粉混匀，再取50％的乙醇1000g和180g的聚山梨酯80(分子量是1200.8)混匀后加入上述混合物中，混匀。然后用70％的糖浆200g做粘合剂制得软材，过30目筛，50℃干燥5h，过50目筛整粒，加入5g滑石粉，将颗粒经压片机制成片剂。

实施例11、美洲一枝黄花胶囊的具体制备方法

选取美洲一枝黄花8kg置于4倍量的70％的乙醇中，在60℃条件下，搅拌2h，使之成为溶液，将溶剂回收，所余固体真空干燥，得到美洲一枝黄花提取物。将上述提取物过150目筛，取250g的提取物与1000g的微粉硅胶、1000g的乳糖和1000g的淀粉混匀，再取70％的乙醇1500g和200g的聚山梨酯80(分子量是1200.8)混匀后加入上述混合物中，混匀。然后用70％的糖浆100g做粘合剂制得软材，过60目筛，60℃干燥5h，过60目筛整粒，加入5g滑石粉，将颗粒制成胶囊。

实施例12、美洲一枝黄花软胶囊剂的具体制备方法

选取美洲一枝黄花15kg置于5倍量的80％的乙醇中，在60℃条件下，搅拌3h，使之成为溶液，将溶剂回收，所余固体真空干燥，得到美洲一枝黄花提取物。

将提取物研磨过100目筛，取100g的提取物，向其中加入乳糖200g聚山梨酯80，200g的PEG 400，50g的1，2-丙二醇和10g水得到混合液，研磨60min。使得全部过100目筛，静置过夜；将药液置于轧囊机得贮液槽中，保温40℃压囊，压囊用明胶浆500g，明胶浆为明胶∶甘油∶水＝1∶0.5∶1，冷风干燥24小时，无水乙醇洗涤，干燥，选粒即得美洲一枝黄花软胶囊。

Claims (8)

1.美洲一枝黄花总黄酮提取物在制备抗氧化产品中的应用，所述的该美洲一枝黄花总黄酮提取物中的总黄酮的含量为55％～90％重量百分比，该美洲一枝黄花总黄酮提取物中含有的槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸的重量比为10～50∶2～28∶1～17∶2～24∶0.5～13；

所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物的制备方法包括如下步骤：

提取步骤：

(1)药材用含水乙醇提取；

(2)减压浓缩步骤所得提取液；

(3)以水稀释浓缩液，并作澄清处理，取上清液；

分离步骤：

(4)取上清液，过大孔树脂柱吸附，弃流出液；然后用水洗涤所述吸附柱，弃水洗液；之后，采用乙醇洗脱吸附柱并收集该乙醇洗脱液；

(5)浓缩、干燥乙醇洗脱液，得到美洲一枝黄花总黄酮提取物；

所述的步骤(1)中，所述含水乙醇提取是指以含水乙醇作溶剂，采用本领域内已知的常规技术提取；其中，所述含水乙醇是指与药材重量比10倍体积、浓度为50～80％的乙醇水溶液；

所述的步骤(2)中，提取液浓缩后，其体积L为原药材kg的6～10倍体积；

所述的步骤(3)中，浓缩液以加3～5倍体积的水稀释。

所述的步骤(4)中，吸附柱吸附提取液后，用1～5BV柱床体积的水洗涤，洗脱液流速为0.5～2.5BV/小时；洗脱乙醇采用50～90％乙醇水溶液，洗脱液流通为0.5～2.5BV/小时；

所述的大孔树脂是D-101大孔树脂、SIPI-40大孔树脂、SIPI-21大孔树脂或SIPI-8大孔树脂；

所述的步骤(5)中，所用的干燥方法包括真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥。

2.美洲一枝黄花总黄酮提取物的组合物在制备抗氧化产品中的应用，所述的该美洲一枝黄花总黄酮提取物中的总黄酮的含量为55％～90％重量百分比，该美洲一枝黄花总黄酮提取物中含有的槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和绿原酸的重量比为10～50∶2～28∶1～17∶2～24∶0.5～13；

所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物的制备方法包括如下步骤：

提取步骤：

(1)药材用含水乙醇提取；

(2)减压浓缩步骤所得提取液；

(3)以水稀释浓缩液，并作澄清处理，取上清液；

分离步骤：

(4)取上清液，过大孔树脂柱吸附，弃流出液；然后用水洗涤所述吸附柱，弃水洗液；之后，采用乙醇洗脱吸附柱并收集该乙醇洗脱液；

(5)浓缩、干燥乙醇洗脱液，得到美洲一枝黄花总黄酮提取物；

所述的步骤(1)中，所述含水乙醇提取是指以含水乙醇作溶剂，采用本领域内已知的常规技术提取；其中，所述含水乙醇是指与药材重量比10倍体积、浓度为50～80％的乙醇水溶液；

所述的步骤(2)中，提取液浓缩后，其体积L为原药材kg的6～10倍体积；

所述的步骤(3)中，浓缩液以加3～5倍体积的水稀释。

所述的步骤(4)中，吸附柱吸附提取液后，用1～5BV柱床体积的水洗涤，洗脱液流速为0.5～2.5BV/小时；洗脱乙醇采用50～90％乙醇水溶液，洗脱液流通为0.5～2.5BV/小时；

所述的大孔树脂是D-101大孔树脂、SIPI-40大孔树脂、SIPI-21大孔树脂或SIPI-8大孔树脂；

所述的步骤(5)中，所用的干燥方法包括真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥。

3.根据权利要求1或2所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物的应用，其特征在于，所述的抗氧化产品是指用于预防、诊断、检测、治疗和研究因过氧化引起的疾病的起因、早期发生发展，或后期的发病的产品中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物的应用，其特征在于，所述的抗氧化产品是药物、试剂、食品或饮料中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物的应用，其特征在于，所述的抗氧化产品是指用于预防、诊断、检测、治疗和研究因过氧化引起的老年性疾病的起因、早期发生发展，或后期的发病的产品中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物的应用，其特征在于，所述的抗氧化产品是指用于预防、诊断、检测、治疗和研究因过氧化引起的阿尔茨海默症、多重梗塞型痴呆、酒精性痴呆和正常脑压水脑症的起因、早期发生发展，或后期的发病的产品中的一种或多种。

7.根据权利要求1或2所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物的应用，其特征在于，所述的该总黄酮提取物的总黄酮的含量为55％～70％。

8.根据权利要求1或2所述的美洲一枝黄花总黄酮提取物的应用，其特征在于，所述的该总黄酮提取物中的槲皮素的含量为10％～40％。

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