CN111217790B - 一种酚类缩醛衍生物的制备及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，涉及从桑科波罗蜜属植物猴子瘿袋中提取、分离得到的一种新化合物酚类缩醛衍生物Ⅰ，通过对1)制备提取物浸膏；2)分离纯化两个步骤所制备得到，该化合物体外酪氨酸酶抑制活性试验表明，该化合物对酪氨酸酶具有显著的抑制活性，因此可用来制备酪氨酸酶抑制剂，也可用于制备治疗色素沉着性疾病，如黑色素瘤、色斑等皮肤病的药物。

Description

一种酚类缩醛衍生物的制备及其用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体地涉及一种从桑科波罗蜜属植物猴子瘿袋中分离得到的含缩醛酚类新化合物及该化合物的制备和应用。
背景技术
波罗蜜属Artocarpus为桑科(Moraceae)植物中一个非常重要的属，全世界约有50种，广泛分布于东南亚的热带地区，如印度尼西亚、泰国和斯里兰卡。我国有约15种，主要分布于云南
酪氨酸酶(Tyrosinase)是一种含铜的金属酶，广泛存在于人体、动植物及微生物中，是生物体内黑色素合成的关键酶。参与决定哺乳动物皮肤、毛发的颜色，与人的衰老、昆虫的伤口愈合与发育、果蔬的褐变有密切关系。酪氨酸酶具有单酚酶和二酚酶双重催化功能，在单酚酶的作用下，酪氨酸被羟基化成L-多巴(L-DOPA)，在二酚酶的作用下，L-DOPA被氧化生成多巴醌，多巴醌再经过一系列的反应之后生成黑色素。
酪氨酸酶异常过量表达可导致人体的色素沉着，因此，酪氨酸酶抑制剂在临床上可用于治疗某些与黑色素过度色素沉着的皮肤病性疾病如黑色素瘤、色斑等常见多发病。酪氨酸酶抑制剂能够有效地降低体内酪氨酸酶的催化活性，使得酪氨酸向黑色素的转化过程受阻，黑色素的合成量减少，能够使皮肤脱色，从而达到的美白效果。
近来有研究表明，桑科波罗蜜属植物中存在着大量抗酪氨酸酶活性的烯丙基酚类化合物，目前国内外尚未有本发明新化合物Ⅰ及其应用的报道，本发明从猴子瘿袋中提取分离的含缩醛的酚类新化合物Ⅰ在酪氨酸酶抑制剂药物的制备、抗色素性沉着皮肤病药物的研究具有重要的意义和前景。
发明内容
基于现有技术还未有本发明化合Ⅰ及其应用的报道，本发明拟从桑科波罗蜜属植物猴子瘿袋中分离得到的含缩醛的酚类新化合物Ⅰ。并且开发其应用。
本发明的一个目的是提供结构式为Ⅰ的新化合物。
本发明的另一个目的是提供所述化合物的制备方法。
本发明的进一步目的是提供所述化合物的用途。具体地说，所述化合物在制备酪氨酸酶活性抑制剂的药物中的应用，进一步在制备治疗皮肤病药物中的应用。
本发明从猴子瘿袋植物中发现了一个含缩醛的酚类新化合物Ⅰ，其化学结构如下所示：
Figure BDA0002387223990000021
上述化合物Ⅰ的制备方法为：
1)制备提取物浸膏
将干燥的猴子瘿袋小枝粉碎后用乙醇按常规浸渍提取，得提取液，将提取液减压浓缩回收乙醇，得粗浸膏；
2)分离纯化
A:将上述提取物分散于水中成混悬液，将混悬液用乙酸乙酯萃取三次，所得萃取液浓缩得到乙酸乙酯提取浸膏；
B：将乙酸乙酯浸膏进行MCI柱层析，以甲醇/水梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流份得到10个组分Fr.1-Fr.10；其中组分Fr.7即甲醇/水体积比8:2洗脱部分经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到式8个亚组分Fr.7A-Fr.7H；其中亚组分Fr.7C即石油醚/乙酸乙酯体积比3:2洗脱部分再经SephadexLH-20凝胶柱层析，以甲醇为洗脱剂，得到3个亚组分Fr.7C1-Fr.7C3；其中Fr.7C2经HPLC精制，以乙腈/水35:65制备得到式Ⅰ化合物。
在上述制备方法中，在制备提取物浸膏步骤中，所述提取采用的乙醇为95％乙醇。
在上述制备方法中，在分离纯化步骤中，所述Fr.7C2组分是用半制备型反相高效液相色谱以乙腈/水35:65，流速3.0mL/min在保留时间25.1min得到式Ⅰ化合物。
所述化合物在酪氨酸酶抑制剂药物、抗色素性沉着皮肤病药物制备中的应用。
本发明的有益效果为：
(1)式1化合物为新化合物，目前尚未有人报道
(2)式Ⅰ的新化合物进行体外酪氨酸酶活性抑制试验，结果表明化合物对酪氨酸酶有显著的抑制活性。因此，可用来制备酪氨酸酶活性抑制剂，用于制备治疗皮肤病药物。
附图说明
图1：结构式Ⅰ化合物的氢谱(氘代试剂：Acetone-d6)。
图2：结构式Ⅰ化合物的碳谱(氘代试剂：Acetone-d6)。
图3：结构式Ⅰ化合物的DEPT谱(氘代试剂：Acetone-d6)。
图4：结构式Ⅰ化合物的HSQC谱(氘代试剂：Acetone-d6)。
图5：结构式Ⅰ化合物的HMBC谱(氘代试剂：Acetone-d6)。
图6：结构式Ⅰ化合物的COSY谱(氘代试剂：Acetone-d6)。
图7：结构式Ⅰ化合物的高分辨质谱。
图8：结构式Ⅰ化合物的高分辨二级质谱。
图9：结构式Ⅰ化合物的紫外光谱。
具体实施方式
在如下的实施例中所指的化合物Ⅰ的化学结构式(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)
Figure BDA0002387223990000041
实施例1
结构式Ⅰ化合物的制备:1.制备猴子瘿袋小枝提取物浸膏
(1)制备提取液
将4kg干燥的猴子瘿袋A.pithecogallus(采自云南西双版纳)分别用30L的95％乙醇于室温浸渍提取三次，每次浸渍7天，合并提取液；将提取液减压浓缩回收乙醇，得粗浸膏。
(2)制备提取物浸膏
将上述提取液在温度≤45℃减压浓缩回收乙醇，得粗浸膏220.0g；
2.分离纯化
A:将上述提取物浸膏分散于水中成混悬液，将混悬液用乙酸乙酯(1.5L)萃取三次，所得萃取液减压浓缩得到乙酸乙酯提取浸膏(146.0g)；
B:将乙酸乙酯浸膏进行MCI柱层析，以甲醇/水梯度洗脱；梯度洗脱的浓度以此为体积比3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1和10:0，根据TLC显色合并相似流份得到10个组分(Fr.1-Fr.10)；组分Fr.7即甲醇/水体积比8:2洗脱部分经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，梯度洗脱的浓度以此为体积比2:1、3:2、2:2、2:3和2:4，根据TLC显色合并相似流份得到8个亚组分(Fr.7A-Fr.7H)；
亚组分Fr.7C即石油醚/乙酸乙酯体积比3:2洗脱部分经SephadexLH-20凝胶柱层析，以甲醇为洗脱剂，得到3个亚组(Fr.7C1-Fr.7C3)；
Fr.7C2经HPLC精制，以乙腈/水35:653.0mL/min在保留时间25.1min处制备得到一淡黄色无定形粉末，即本发明的式Ⅰ化合物，经鉴定为新化合物。
按常规经NMR、HRESIMS、HR-MS/MS、和UV等多种现代光谱技术，确定了化合物Ⅰ的化学结构，其理化性质如下：
淡黄色无定形粉末,分子式为C15H10O7；
紫外光谱UV(MeOH)λmax(logε)2269(3.13),317(2.65)nm；
高分辨质谱(+)HRESIMS m/z 325.0314[M+Na]+(calcd for C15H10O7Na+,325.0319)；(-)HRESIMS m/z 301.0349[M-H]-(calcd for C15H9O7 -,301.0354)；
核磁共振氢谱1HNMR(600MHz)及核磁共振碳谱13C NMR(150MHz)数据见表一所述化合物Ⅰ的1H和13C NMR
表1
Figure BDA0002387223990000061
实施例2
酪氨酸酶抑制活性的测试：
测试原理：左旋多巴在酪氨酸酶的催化作用下转化成棕褐色多巴醌色素，多巴醌色素在475nm处有特征吸收，因此，加入待测样品以后，可通过测定吸光度的变化来计算样品对酪氨酸酶的抑制率。从而评价样品的酪氨酸酶活性抑制作用。
试剂与仪器：0.1mol/LpH 6.8磷酸盐缓冲液(PBS)；左旋多巴；酪氨酸酶；DMSO；曲酸；酶标仪；96孔培养板。
试剂配制：a.0.1mol/L(pH＝6.8)的磷酸盐缓冲液(PBS)的配制:准确称取磷酸二氢钠二水合物0.8376g，磷酸氢二钠0.6573g，用100mL去离子水溶解后，转移至容量瓶中定容，现配现用。b.2.0mmol/L左旋多巴的配制：准确称取左旋多巴4.0mg，用10mL PBS缓冲溶液溶解待用。c.2U/mL酶溶液的配制：准确称取规格为870U/mg的酶1.0mg，溶于43.5mL现配现用PBS缓冲溶液中配得20U/mL的酶溶液，再从20U/mL的酶溶液中取1mL溶于9mL现配现用PBS缓冲液中配得2U/mL酶溶液待用。
试验方法：用DMSO将样品溶解并稀释成100μM,50μM,25μM,10μM和5μM五组溶度梯度。本实验在96孔培养板中进行，总反应体系为200μL,左旋多巴作为酶活性测定的底物。取40μL左旋多巴溶液加入96孔板中，依次加入不同溶度梯度的受试品溶液40μL，80μL的PBS缓冲溶液，最后统一用2U/mL的酪氨酸酶溶液40μL。于室温下孵育30min，用酶标仪在波长475nm测定各个孔吸光值。实验以已知酪氨酸酶抑制剂曲酸作为对照品，平行三次。
Figure BDA0002387223990000081
表2
Figure BDA0002387223990000082
A表示底物、酪氨酸酶在样品溶剂存在下体系反应30min的吸光度；
A0表示不加酪氨酸酶，样品和溶剂存在下体系反应30min的背景吸光度；
B表示底物、酪氨酸酶孵育30min吸光度；
B0表示只加底物和溶剂体系反应30min的吸光度。
实验结果的评判与解释：
通过上述试验方法，对结构式Ⅰ化合物的酪氨酸酶抑制活性进行测评，以抑制率对抑制剂浓度作图，根据抑制曲线求得结构式Ⅰ化合物的IC50值(抑制率50％时的抑制剂浓度)，阳性对照曲酸的IC50为17.32μM。
实验结果：本发明式Ⅰ化合物对酪氨酸酶抑制活性的IC50为14.25μM实验结论：通过上述试验，可以得出化合物Ⅰ对酪氨酸酶具有显著的抑制活性。因此，本发明的化合物Ⅰ可用于制备治疗皮肤病药物中，为了改善性能还可以进一步的添加常用的药用辅料方便制成更易接受的药物形式。

Claims (5)

1.一种酚类缩醛衍生物I的化学结构式如下：
Figure FDA0003726461430000011
2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备提取物浸膏
将干燥的猴子瘿袋小枝粉碎后用乙醇按浸渍法提取，得提取液，将提取液减压浓缩回收乙醇，得粗浸膏；
2)分离纯化
A:将上述粗浸膏分散于水中成混悬液，将混悬液用乙酸乙酯萃取三次，所得萃取液浓缩得到乙酸乙酯提取浸膏；
B：将乙酸乙酯浸膏进行MCI柱层析，以甲醇/水梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流份得到10个组分Fr.1-Fr.10；其中组分Fr.7即甲醇/水体积比8:2洗脱部分经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到8个亚组分Fr.7A-Fr.7H；其中亚组分Fr.7C即石油醚/乙酸乙酯体积比3:2洗脱部分经Se phad exLH-20凝胶柱层析，再以甲醇为洗脱剂，得到3个亚组分Fr.7C1-Fr.7C3；其中Fr.7C2经HPLC精制，以乙腈/水35:65制备得到式Ⅰ化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，在制备提取物浸膏步骤中，所述乙醇为95％乙醇。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，在分离纯化步骤中，所述Fr.7C2亚组分是用半制备型反相高效液相色谱以乙腈/水35:65，流速3.0mL/min在保留时间25.1min得到式Ⅰ化合物。
5.权利要求1所述化合物在酪氨酸酶抑制剂药物、抗色素性沉着皮肤病药物制备中的应用。
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