CN101176739A - 一种蟾毒配基提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从蟾皮或蟾酥中提取得到的蟾毒配基提取物，其中蟾毒配基(以华蟾毒精计)重量百分含量可达55％以上。其提取方法为：蟾酥、蟾皮或干蟾用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂柱，先用水及低浓度的醇洗脱，再用高浓度的醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，干燥后或经萃取后即得。本发明还提供了以该提取物作为活性成分的药物组合物，以及该类提取物抑制肿瘤细胞活性的作用和在制备抗肿瘤药物中的应用。

Description

一种蟾毒配基提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种从蟾皮或蟾酥中提取得到的蟾毒配基提取物及其制备方法与应用。

背景技术

蟾蜍属动物有250多种，分布于世界各地。我国有近10种，主要分布的3种分别是：大蟾蜍华西亚种(Bufo bufo andrewsi Schmidt)、大蟾蜍中华亚种(Bufo bufo gargarizans Cantor)以及黑眶蟾蜍(Bufo melanostitus Schneider)。蟾蜍之名首载于《名医别录》，早在《神农本草经》就载有“虾蟆”的性味与主治。《本草蒙筌》：“味辛、气凉、微毒”，《本草再新》：入心、肝、脾、肺四经。古今验方广泛应用蟾蜍拔毒消肿、定痛杀虫、强心利尿。

以蟾蜍为基原的常用中药材有蟾酥、蟾皮、干蟾，其化学成分相当复杂，按溶解性可分为脂溶性甾族类(蟾毒配基类、蟾蜍毒素类)、水溶性吲哚生物碱类(如5-羟色胺，蟾蜍色胺、蟾蜍噻咛等)。

蟾毒配基属乙型强心甾族类化合物，在C₁₇上接有一个A-吡喃酮基，又名蟾蜍二烯类酯(Bufodienolide)，主要存在于蟾蜍耳后腺及皮肽腺的分泌物中，现已知有20余种，例如蟾毒灵(bufalin)、日蟾毒它灵(gamabufotalin)、蟾毒它灵(bufotalin)、华蟾毒精(cinobufagin)、脂蟾毒配基(resibufogenin)等【江成亮、竺叶青，蟾蜍抗肿瘤作用研究进展，天然产物研究与开发，2000.12(1)，67～72】。

已经有大量文献报道华蟾毒精、蟾毒灵、脂蟾毒配基等具有强心、抗肿瘤等作用【森下倍一，华蟾毒配基及含蟾酥制剂等对开胸豚鼠的强心作用，国外医学.中医中药分册，1987，9(2)：42；JingYetal，Selective inhibitory effect of bufalin on growth of human tumor invitro：association with the induction of apotosis in leukemia HL-60Cell.Jpn.J.CancerRes.1994，85：645；王传社，李燕燕等，脂蟾毒配基对人宫颈癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用，北京中医药大学学报，2006.29(3)：184-187；金向群，蟾蜍化学与药理作用的研究进展，中草药，1996.27(4)：246-248】

然而，目前的蟾蜍制剂，例如蟾酥镇痛膏、蟾酥注射液、华蟾素注射液和复方蟾皮胶囊等都仍然是以粗提取物入药，成分极为复杂，除含有蟾毒配基、蟾蜍毒素、吲哚类生物碱(如5-羟色胺，蟾蜍色胺、蟾蜍噻咛等)外，还含有氨基酸、还原糖、甾类、肽类等多种类型的化学成分。因此，在临床使用中，蟾蜍制剂具有以下两个主要缺点：①对肿瘤细胞的杀伤率低，②出现过敏反应，血管刺激症状，消化道和心脏毒性等不良反应的发生率高，这都是由于未能去除无效、不良反应成分，未能对真正的有效的成份进行控制造成的。

本申请人经过深入研究，从蟾蜍中提取分离得到一种蟾毒配基提取物，其提取方法简单方便、适合于工业化生产，该提取物的抗肿瘤活性明显增强，克服了蟾蜍制剂存在的缺陷。

发明内容

本发明提供了一种蟾毒配基提取物，蟾毒配基(以华蟾毒精计)在该提取物中的重量百分含量为55％-100％，优选为80％-100％，更优选为90％-100％。

所说的蟾毒配基中含有华蟾毒精、脂蟾毒配基，其在该提取物中的重量百分含量分别为15％～25％。

蟾毒配基中还含有沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵和蟾毒灵等。

蟾毒配基提取物的含量可以采用常规的测定方法，但是优选本发明所提供的方法：以华蟾毒精(或脂蟾毒配基)计，用紫外分光光度法，在300nM下进行测定。或以华蟾毒精及脂蟾毒配基为对照品，用HPLC法测定(用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.5％磷酸二氢钾溶液-乙腈(50∶50)为流动相；检测波长为296nm；柱温40℃)，面积归一化法计算含量。

本发明还提供了蟾毒配基提取物的制备方法：蟾酥、蟾皮或干蟾用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂柱，先用水及低浓度的醇洗脱，再用高浓度的醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，干燥后或经萃取后即得。

其中所说的低浓度乙醇是指10-50％的乙醇，优选为30-40％；所说的高浓度乙醇是指60-100％的乙醇，优选为70-100％。

其中所说的大孔树脂可以选择非极性或者极性大孔树脂，所说的非极性大孔树脂可以选自HPD-100、700，AB-8，D101，X-5，D4020等；极性大孔树脂可以选自HPD400、450、600、HPD800，S-8，NAK-9等。其中优选HPD-100、AB-8。

蟾毒配基提取物最优选的制备方法为：取干燥蟾酥用95％的乙醇提取2次，用醇量为10倍，每次提取的时间为90分钟，合并滤液，滤液减压回收乙醇至无醇味，上HPD-100大孔树脂柱，先用水洗脱，再用40％乙醇洗脱，再用95％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，干燥即得。

本发明还提供了以蟾毒配基提取物作为活性成分的药物组合物。

本发明提供了蟾毒配基提取物对肿瘤细胞的抑制作用，以及在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

本发明所提供的蟾毒配基提取物可以以口服或非口服形式给药，单元剂量0.01-200mg，优选为0.05-100mg，更优选为0.1-20mg，给药量因药物不同而各有不同。

经口服给药时，可以与常规的药用辅料如填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、包衣剂等混合，将其制成颗粒剂、胶囊、软胶囊、片剂、滴丸或乳剂等形式给药。非口服形式给药时，可以制备成注射液、冻干粉针剂、输液剂等。制备上述制剂时，可使用常规的制剂技术，但优选本发明所提供的方法。

具体实施方式

以下实施例更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例一：蟾毒配基提取物的制备

取干燥蟾皮10kg用80％的乙醇提取4次，用醇量为9倍，每次提取的时间为120分钟，合并滤液，滤液减压回收乙醇至无醇味，上AB-8大孔树脂柱(天津南开大学化工厂生产)，先用水洗脱，再用30％乙醇洗脱，再用80％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，水溶液先以乙酸乙酯等量萃取2次，乙酸乙酯层减压回收溶剂，干燥得到蟾皮提取物42g，蟾毒配基的含量为55.3％，其中含华蟾毒精15.1％，含脂蟾毒配基15.8％。

实施例二：蟾毒配基提取物的制备

取干燥蟾酥1kg用80％的乙醇提取4次，用醇量为9倍，每次提取的时间为120分钟，合并滤液，滤液减压回收乙醇至无醇味，上AB-8大孔树脂柱(天津南开大学化二工厂生产)，先用水洗脱，再用30％乙醇洗脱，再用80％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，干燥得到蟾毒配基提取物172g，以华蟾毒精计，蟾毒配基的含量为70.3％，其中含华蟾毒精20.1％，含脂蟾毒配基17.8％。

实施例三：蟾毒配基提取物的制备

取干燥蟾酥2kg用95％的乙醇提取2次，用醇量为10倍，每次提取的时间为90分钟，合并滤液，滤液减压回收乙醇至无醇味，上AB-8(天津南开大学化工厂生产)大孔树脂柱，先用水洗脱，再用40％乙醇洗脱，再用95％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，干燥得到蟾毒配基提取物332g，以华蟾毒精计，蟾毒配基的含量为85.6％，其中含华蟾毒精21.4％，含脂蟾毒配基20.3％。

实施例四：蟾毒配基提取物的制备

取干燥蟾酥2kg用95％的乙醇提取2次，用醇量为10倍，每次提取的时间为90分钟，合并滤液，滤液减压回收乙醇至无醇味，上HPD-100大孔树脂柱(沧州宝恩化工有限公司生产)，先用水洗脱，再用40％乙醇洗脱，再用95％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，干燥得到蟾毒配基提取物332g，以华蟾毒精计，蟾毒配基的含量为90.6％，其中含华蟾毒精22.3％，含脂蟾毒配基21.5％。

实施例五：蟾毒配基提取物乳剂的制备

将实施例四制备得到的蟾毒配基提取物0.5g、200g大豆油、100g大豆磷脂、2g等渗剂等混合，加热至60～80℃，全部溶融，加入高速捣碎机中，同时加入适量的水，高速搅拌3分钟以上，反复3次以上，直到得到均匀的乳剂。

实施例六：蟾毒配基提取物滴丸的制备

称取处方量的880g聚乙二醇-6000在85℃～95℃下熔融，缓慢加入实施例四制备得到的蟾毒配基提取物1g搅拌，依次加入15g硬脂酸、4.5g吐温-80、0.5g亚硫酸钠、充分搅拌均匀后，将混合在75～85℃恒温条件下滴入液体石蜡冷却液中冷凝成丸，再用毛边纸吸去多余的石蜡即得。

实施例七：蟾毒配基提取物软胶囊的制备

称取200g氢化棕榈油，加入到1300g药用豆油中，加热混匀，制得软胶囊基质，将1g实施例四制备得到的蟾毒配基提取物加入到基质中，搅拌均匀，胶体磨研磨，制得软胶囊内容物。按明胶∶甘油∶水(1∶0.3∶1)制胶，采用软胶囊机压丸，制得1000粒软胶囊。

实施例八：蟾毒配基提取物片剂的制备

称取实施例四制备得到的蟾毒配基提取物1g，100g淀粉，40g预胶化淀粉、9g羧甲基淀粉钠，充分混合均匀，过80目筛，加入95％乙醇适量制成软材，12目制粒，60℃干燥3小时，12目筛整粒，加入颗粒总重0.3％的硬脂酸镁，调整片重约150mg，压片，共制得1000片。

实施例九：蟾毒配基提取物胶囊的制备

称取实施例四制备得到的蟾毒配基提取物1g，淀粉50g，糊精49g，充分混合均匀，过80目筛，用95％乙醇制粒，过12目筛，填充于1号胶囊中，共制得1000粒。

试验例1.蟾毒配基提取物对SMMC-7721和ECV304及对高转移人源乳腺癌细胞MDA-MB435s、

MDA-MB468、MDA-MB231的细胞毒活性

材料：实施例四制备得到的蟾毒配基提取物

华蟾素注射液：安徽金蟾生化股份有限公司

本实验选用SMMC-7721和ECV304及高转移人源乳腺癌细胞MDA-MB435s、MDA-MB468、MDA-MB231肿瘤细胞，采用噻唑蓝还原法(MTT)，对蟾蜍提取物的细胞毒活性进行了研究。

按文献方法【沈玲玲，等.贝叶多孔菌提取物对小鼠移植现代应用药学，1994，11(4)：9-10】，取对数生长的细胞2-2.5×10⁵/mL，放入96孔板，每孔0.2mL，设盐水对照组，溶剂对照组和不同浓度的实验组，以及华蟾素注射液阳性对照组，每组设3～5个平行孔。实验组分别加入不同浓度的药物2μL，对照组和溶剂对照组分别加入等量的生理盐水和DMSO，而阳性对照组加入不同浓度的华蟾素注射液2μL。37℃温箱孵育45h后，各孔加入10μL的MTT液(10mg/mL)，继续培养至48h，吸去上清后加入DMSO 100μL，待结晶溶解后，即用酶标仪在570nm波长测量各孔的OD值，计算细胞生长抑制率。结果见表1，利用学生t测验进行组间比较。

从表1数据可知，蟾毒配基提取物对SMMC-7721，ECV304，MDA-MB435s、MDA-MB468、MDA-MB231肿瘤细胞均有明显的抑制活性，且抑制强度均远远强于华蟾素注射液。

表1 蟾毒配基提取物的体外细胞毒作用(μg/ml)

试验例2 口服蟾蜍配基提取物对肿瘤的抑制作用

材料：NIH小鼠，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供

实施例四制备得到的蟾毒配基提取物

华蟾素注射液：安徽金蟾生化股份有限公司

本实验选用NIH小鼠，采用经典的抗肿瘤药物初筛模型，对蟾毒配基提取物对小鼠移植肉瘤SI80生长的抑制作用及其对荷瘤小鼠寿命的影响进行了研究。

NIH性成熟雄性小鼠120只，分别按常规方法接种S180肉瘤细胞【徐叔云，等。药理实验方法学(第二版)北京：人民卫生出版社，1991，1423】。瘤龄10d的瘤源小鼠拉断脊椎处死，无菌剖取瘤块，取粉红色瘤组织部位，用灭菌生理盐水灭菌制成匀浆，调成1×10⁷个/mL浓度的瘤细胞悬液，拌种于实验小鼠右前肢腋下皮下，0.2mL/只。NIH小鼠分别按体重随机分组。按剂量给药。第1批小鼠于实验结束时拉断脊椎处死，完整剥离瘤体，观察瘤体形态及出血坏死情况，称量瘤重，计算各组平均瘤重及平均抑瘤率。第2批小鼠接种后按同样方法给药，标准条件喂养，任其生长，记录每只小鼠的死亡时间，计算存活时间和寿命延长率。

结果见表2，表3，利用学生t测验进行组间比较。

结果表明，0.1～20mg/kg蟾毒配基提取物灌胃给药，对小鼠移植肉瘤S180有显著抑制作用，能够延长S180荷瘤小鼠的寿命，且有一定的量效关系，其作用强度比华蟾素注射液强。

表2.蟾毒配基提取物对小鼠移植肉瘤S180的抑制作用(x±s，n＝10)

与模型组比较：^*，P＜0.05；^**，P＜0.01

表3.蟾毒配基提取物对小鼠寿命的影响(x±s，n＝12)

与模型组比较：^*，P＜0.05；^**，P＜0.01

Claims (10)

1.一种蟾毒配基提取物，其特征在于以华蟾毒精计，蟾毒配基的重量百分含量为55％-100％。

2.根据权利要求1所述的蟾毒配基提取物，其特征在于以华蟾毒精计，蟾毒配基的重量百分含量为80％-100％。

3.根据权利要求1所述的蟾毒配基提取物，其特征在于以华蟾毒精计，蟾毒配基的重量百分含量为90％-100％。

4.根据权利要求1-3所述的蟾毒配基提取物，其特征在于含有华蟾毒精和脂蟾毒配基，其重量百分含量分别为15％～25％。

5.根据权利要求1-4所述蟾毒配基提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：蟾酥、蟾皮或干蟾用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂柱，先用水及低浓度的醇洗脱，再用高浓度的醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，干燥后或经萃取后即得。

6.根据权利要求5所述蟾毒配基提取物的制备方法，其特征在于其中所说的低浓度乙醇是指10-50％的乙醇，高浓度乙醇是指60-100％的乙醇。

7.根据权利要求6所述蟾毒配基提取物的制备方法，其特征在于其中所说的低浓度乙醇是指30-40％的乙醇，高浓度乙醇是指70-100％的乙醇。

8.根据权利要求5-7所述蟾毒配基提取物的制备方法，其特征在于其中所说的大孔树脂可以选择非极性或者极性大孔树脂，所说的非极性大孔树脂可以选自HPD-100、700，AB-8，D101，X-5，D4020；极性大孔树脂可以选自HPD400、450、600、HPD800，S-8，NAK-9。

9.根据权利要求8所述蟾毒配基提取物的制备方法，其特征在于其中所说的大孔树脂为HPD-100、AB-8。

10.根据权利要求1-4所述蟾蜍提取物对肿瘤细胞的抑制作用，以及在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。