CN107397748B - 一种具有抗感染作用的蟾酥提取物及其制备方法 - Google Patents
一种具有抗感染作用的蟾酥提取物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及中药技术领域，具体公开了一种具有抗感染作用的蟾酥提取物及其制备方法。所述的蟾酥提取物含有蟾蜍毒素类有效成分，所述蟾蜍毒素类有效成分中含有如下重量份的成分：沙蟾毒精30~60份；华蟾酥毒基35~60份；远华蟾蜍精10~25份；蟾毒它灵20~45份；华蟾毒它灵20~50份；蟾毒灵25~45份；酯蟾毒配基15~40份；嚏根草配基5~15份。所述的蟾酥提取物抗感染效果显著，此外所述的提取物有效成分种类以及含量清楚，细胞毒性小，有利于提取物的质量控制以及用药安全。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种具有抗感染作用的蟾酥提取物及其制备方法。
背景技术
蟾酥是蟾蜍耳后腺及表皮腺体的分泌物，白色乳状液体或浅黄色浆液，有毒。蟾酥提取浆液，干燥，上色，密封保存后可以入药。具有解毒、镇痛、开窍、抗肿瘤等多种功能而被广泛应用。
但现有上市的药物中主要还是以蟾酥提取物等作为有效成分，但对于提取物中的有效成分种类以及各成分的含量并不明确，此外，由于蟾酥中的蟾蜍毒素类物质具有一定的毒性；这进一步限制蟾酥类药物的应用。因此，开发一种有效成分种类以及含量明确、且抗感染效果好的蟾酥提取物具有重要的意义。
发明内容
本发明所要阶级的技术问题是，提供一种具有抗感染作用的蟾酥提取物，所述的蟾酥提取物抗感染效果显著，对人体的毒性小。
本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
一种具有抗感染作用的蟾酥提取物，其含有蟾蜍毒素类有效成分，所述蟾蜍毒素类有效成分中含有如下重量份的成分：
沙蟾毒精30～60份；华蟾酥毒基35～60份；远华蟾蜍精10～25份；蟾毒它灵20～45份；华蟾毒它灵20～50份；蟾毒灵25～45份；酯蟾毒配基15～40份；嚏根草配基5～15份。
优选地，所述蟾蜍毒素类有效成分中含有如下重量份的成分：
沙蟾毒精40～50份；华蟾酥毒基40～50份；远华蟾蜍精15～20份；蟾毒它灵30～40份；华蟾毒它灵20～30份；蟾毒灵30～40份；酯蟾毒配基20～30份；嚏根草配基10～15份。优选地，所述的蟾蜍毒素类有效成分占蟾酥提取物总重量的10％以上。
进一步优选地，所述的蟾蜍毒素类有效成分占蟾酥提取物总重量的30％以上；
更进一步优选地，所述的蟾蜍毒素类有效成分占蟾酥提取物总重量的30～80％。
优选地，所述的抗感染是指细菌感染或病毒感染。
一种具有抗感染作用的药物，其包含上述具有抗感染作用的蟾酥提取物。
所述的具有抗感染作用的蟾酥提取物的制备方法，其包含如下步骤：
(1)取蟾酥用乙醇浸提，得乙醇提取物；
(2)将乙醇提取物浓缩至无醇味，然后用非极性大孔树脂柱富集蟾蜍毒素类有效成分；
所述的非极性大孔树脂柱富集蟾蜍毒素类有效成分的具体方法为：将乙醇提取物上样于非极性大孔树脂柱后，先用水洗脱除杂，再用体积分数为40％～95％的乙醇水溶液洗脱非极性大孔树脂柱；收集乙醇洗脱部位，浓缩、干燥即得所述的提取物。
优选地，步骤(1)所述的乙醇为体积分数为50％以上的乙醇水溶液；步骤(1)所述的浸提是指采用浸渍法提取得到：具体为：取蟾酥加入8～15倍量的体积分数为50％以上的乙醇水溶液，在15～30℃下浸渍1～7天，过滤即得乙醇提取物。
上述8～15倍量是指1g蟾酥加入8～15mL的乙醇。
进一步优选地，步骤(1)所述的乙醇为体积分数为70％以上的乙醇水溶液；步骤(1)所述的浸提是指采用浸渍法提取得到：具体为：取蟾酥加入8～12倍量的体积分数为70％以上的乙醇水溶液，在15～30℃下浸渍3～5天，过滤即得乙醇提取物。
优选地，步骤(2)中先用水洗脱除杂，再用体积分数为60％～80％的乙醇水溶液洗脱非极性大孔树脂柱。
有益效果：本发明提供了一种抗细菌和病毒感染效果显著的蟾酥提取物，所述的提取物中含有的沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基以及酯蟾毒配基等有效成分能产生协同抗菌或抗病毒的效果；此外所述的提取物有效成分种类以及含量清楚，细胞毒性小，有利于提取物的质量控制以及用药安全。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例1具有抗感染作用的蟾酥提取物的制备
(1)取蟾酥100g加入1L体积分数为95％的乙醇水溶液，在25℃下浸渍3天，过滤即得乙醇提取物；
(2)将乙醇提取物浓缩至无醇味，然后用非极性大孔树脂柱富集蟾蜍毒素类有效成分；
所述的非极性大孔树脂柱富集蟾蜍毒素类有效成分的具体方法为：将乙醇提取物上样于非极性大孔树脂柱(D101大孔树脂柱)后，先用水洗脱除杂，再用80％的乙醇洗脱非极性大孔树脂柱；收集乙醇洗脱部位，浓缩、干燥即得所述的提取物。
经检测，该实施例制备得到的提取物中蟾蜍毒素类有效成分占蟾酥提取物总重量的72％，其中，蟾蜍毒素类有效成分中含有如下重量份的具体成分：沙蟾毒精47份；华蟾酥毒基47份；远华蟾蜍精18份；蟾毒它灵38份；华蟾毒它灵27份；蟾毒灵36份；酯蟾毒配基24份；嚏根草配基12份。
上述各成分的检测方法采用液相色谱进行检测，具体条件为：用Agilent ZorbaxSB C18(柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％乙酸铵溶液为流动相B，检测波长为296nm；柱温30℃，流速为1.0mL/min。采用梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1：
表1.梯度洗脱条件
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 10 | 90 |
| 5～10 | 10→23 | 90→77 |
| 10～27 | 23 | 77 |
| 27～32 | 23→30 | 77→70 |
| 32～44 | 30 | 70 |
| 44～49 | 30→40 | 70→60 |
| 49～64 | 40 | 60 |
| 64～69 | 40→60 | 60→40 |
| 69～90 | 60 | 40 |
实施例2具有抗感染作用的蟾酥提取物的制备
(1)取蟾酥100g加入1L体积分数为95％的乙醇水溶液，在25℃下浸渍3天，过滤即得乙醇提取物；
(2)将乙醇提取物浓缩至无醇味，然后用非极性大孔树脂柱富集蟾蜍毒素类有效成分；
所述的非极性大孔树脂柱富集蟾蜍毒素类有效成分的具体方法为：将乙醇提取物上样于非极性大孔树脂柱(D101大孔树脂柱)后，先用水洗脱除杂，再用60％的乙醇洗脱非极性大孔树脂柱；收集乙醇洗脱部位，浓缩、干燥即得所述的提取物。
经检测，该实施例制备得到的提取物中蟾蜍毒素类有效成分占蟾酥提取物总重量的63％，其中，蟾蜍毒素类有效成分中含有如下重量份的具体成分：沙蟾毒精55份；华蟾酥毒基36份；远华蟾蜍精21份；蟾毒它灵45份；华蟾毒它灵26份；蟾毒灵27份；酯蟾毒配基20份；嚏根草配基13份。
实施例3具有抗感染作用的蟾酥提取物的制备
(1)取蟾酥100g加入1L体积分数为80％的乙醇水溶液，在25℃下浸渍2天，过滤即得乙醇提取物；
(2)将乙醇提取物浓缩至无醇味，然后用非极性大孔树脂柱富集蟾蜍毒素类有效成分；
所述的非极性大孔树脂柱富集蟾蜍毒素类有效成分的具体方法为：将乙醇提取物上样于非极性大孔树脂柱(D101大孔树脂柱)后，先用水洗脱除杂，再用40％的乙醇洗脱非极性大孔树脂柱；收集乙醇洗脱部位，浓缩、干燥即得所述的提取物。
经检测，该实施例制备得到的提取物中蟾蜍毒素类有效成分占蟾酥提取物总重量的45％，其中，蟾蜍毒素类有效成分中含有如下重量份的具体成分：沙蟾毒精57份；华蟾酥毒基37份；远华蟾蜍精24份；蟾毒它灵45份；华蟾毒它灵22份；蟾毒灵26份；酯蟾毒配基16份；嚏根草配基13份；。
实施例4本发明蟾酥提取物抗菌效果试验
在无菌培养基中加入0.5mL浓度为5×106个/mL的菌液(具体菌种类见表1)，用经过灭菌的L型涂抹棒均匀涂抹，室温干燥10min，用经过灭菌的镊子将牛津杯放置培养皿中，并在牛津杯中加入100μL浓度为1g/mL的药液。
将培养皿放入37℃的培养箱中培养24h，然后测抑菌圈的直径(抑菌圈的直径越大，抑菌效果越好)，重复试验3次，取平均直径。测试效果见表2所示。
各实验组的药液组成如下：
阳性对照组使用四环素；
药物处理组分别为：
药物处理组1为沙蟾毒精；
药物处理组2为嚏根草配基；
药物处理组3为远华蟾蜍精；
药物处理组4为蟾毒它灵；
药物处理组5为华蟾毒它灵；
药物处理组6为蟾毒灵；
药物处理组7为华蟾酥毒基；
药物处理组8为酯蟾毒配基；
药物处理组9为按如下重量份的成分组成的混合物：沙蟾毒精47份、华蟾酥毒基47份、、远华蟾蜍精18份、蟾毒它灵38份、华蟾毒它灵27份、蟾毒灵36份酯蟾毒配基24份以及嚏根草配基12份；
药物处理组10为按如下重量份的成分组成的混合物：沙蟾毒精55份、华蟾酥毒基36份、远华蟾蜍精21份、蟾毒它灵45份、华蟾毒它灵26份、蟾毒灵27份酯蟾毒配基20份以及嚏根草配基13份。
药物处理组11为按如下重量份的成分组成的混合物：沙蟾毒精57份、华蟾酥毒基32份、远华蟾蜍精24份、蟾毒它灵47份、华蟾毒它灵22份、蟾毒灵26份、酯蟾毒配基16份以及嚏根草配基18份。
药物处理组12为实施例1制备得到的蟾酥提取物。
药物处理组13为实施例2制备得到的蟾酥提取物。
药物处理组14为实施例3制备得到的蟾酥提取物。
表2本发明提取抑菌实验结果(单位mm)
从表2实验组1～8的数据可以看出，蟾酥提取物中的沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基以及酯蟾毒配基等单体对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌以及脑膜炎双球菌的抑菌圈的直径小于15mm，说明上述单体单独使用的抑菌作用并不明显。
从实验组9～11中的数据可以看出，沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基以及酯蟾毒配基按本发明提取物中的重量份配比混合后组成的混合物，其对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌以及脑膜炎双球菌的抑菌圈增大显著，均大于20mm，这说明沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基以及酯蟾毒配基按本发明提取物中的重量份配比混合后能够产生明显的协同抑菌作用。因此，也可说明提取物中只要含有按本发明提取物中的重量份配比的沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基以及酯蟾毒配基，均具有良好的抑菌效果。
从实验组12～14中的数据可以看出，本发明实施例1～3制备得到的具有抗感染作用的蟾酥提取物其具有明显的抗细菌感染效果，其对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌以及脑膜炎双球菌的抑菌圈在20mm左右，起抑菌作用均大于其中的任意单体。这是由于，提取物中含有的沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基以及酯蟾毒配基产生协同抗菌的效果。
由于本发明所述的具有抗感染作用的蟾酥提取物的抑菌效果显著，因此，以提取物作为抗细菌感染药物使用时，可以显著减少提取物的使用量；克服了现有技术中使用提取物作为药物时，需要大剂量使用提取物的不足。此外，本发明所述的提取物，其有效成分种类以及配比明确，有利于提取物的质量控制以及用药安全。
实施例5本发明蟾酥提取物抗病毒效果试验
在长满单层MDCK细胞层的96孔细胞培养板中，加入100TCID50(100倍半数感染量)病毒液(H1N1病毒或PIV3副流感病毒)100μL/孔，吸附1h，然后每孔分别加入，再加入用维持液稀释好的系列浓度样品溶液100μL，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育。48h后将96孔板中的旧液吸弃，再用CCK8溶液稀释10倍后分别按每孔100μL加入被测试孔中，在培养箱孵育1h后，用酶标仪在450nm测吸光度，测试各样品溶液的IC50值。
IC50计算方式如下：细胞存活率＝(加药孔OD值－病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值－病毒对照组OD值)×100％；以药物浓度为X轴，细胞存活率为Y轴，在Origin作图，求出50％细胞存活率对应的浓度则为IC50。
药物处理组分别为：
药物处理组1为沙蟾毒精；
药物处理组2为嚏根草配基；
药物处理组3为远华蟾蜍精；
药物处理组4为蟾毒它灵；
药物处理组5为华蟾毒它灵；
药物处理组6为蟾毒灵；
药物处理组7为华蟾酥毒基；
药物处理组8为酯蟾毒配基；
药物处理组9为按如下重量份的成分组成的混合物：沙蟾毒精47份、华蟾酥毒基47份、、远华蟾蜍精18份、蟾毒它灵38份、华蟾毒它灵27份、蟾毒灵36份酯蟾毒配基24份以及嚏根草配基12份；
药物处理组10为按如下重量份的成分组成的混合物：沙蟾毒精55份、华蟾酥毒基36份、远华蟾蜍精21份、蟾毒它灵45份、华蟾毒它灵26份、蟾毒灵27份酯蟾毒配基20份以及嚏根草配基13份。
药物处理组11为按如下重量份的成分组成的混合物：沙蟾毒精57份、华蟾酥毒基32份、远华蟾蜍精24份、蟾毒它灵47份、华蟾毒它灵22份、蟾毒灵26份、酯蟾毒配基16份以及嚏根草配基18份。
药物处理组12为实施例1制备得到的蟾酥提取物。
药物处理组13为实施例2制备得到的蟾酥提取物。
药物处理组14为实施例3制备得到的蟾酥提取物。
各样品溶液的抗病毒效果测试数据见表3。
表3.本发明药物组合物抗流感病毒IC50测试结果
从表3实验组1～8的数据可以看出，蟾酥提取物中的沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基以及酯蟾毒配基等单体对H1N1病毒或PIV3副流感病毒均具有一定的抑制作用，但效果远远不及阳性对照药利巴韦林。
从实验组9～11中的数据可以看出，沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基以及酯蟾毒配基按本发明提取物中的重量份配比混合后组成的混合物，其对H1N1病毒或PIV3副流感病毒的抑制作用显著增强，且要优于阳性对照药利巴韦林，这说明沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基以及酯蟾毒配基按本发明提取物中的重量份配比混合后能够产生明显的协同抗病毒作用。因此，也可说明提取物中只要含有按本发明提取物中的重量份配比的沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基以及酯蟾毒配基，均具有良好的抗病毒效果。
从实验组12～14中的数据可以看出，本发明实施例1～3制备得到的具有抗感染作用的蟾酥提取物其具有明显的抗病毒感染效果，其对H1N1病毒或PIV3副流感病毒的抑制作用作用均大于其中的任意单体。这是由于，提取物中含有的沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基以及酯蟾毒配基产生协同抗抗病毒的效果。
由于本发明所述的具有抗感染作用的蟾酥提取物的抑病毒效果显著，因此，以提取物作为抗病毒感染药物使用时，可以显著减少提取物的使用量；克服了现有技术中使用提取物作为药物时，需要大剂量使用提取物的不足。此外，本发明所述的提取物，其有效成分种类以及配比明确，有利于提取物的质量控制以及用药安全。
实施例6本发明蟾酥提取物细胞毒性测试
将Hep-2细胞培养在96孔培养板中，待单层细胞长好后，加入用维持液稀释好的系列浓度样品溶液100μL，在5％CO2、37℃培养箱中培养3天；然后加入10μlMTT溶液，MTT溶液的浓度为5mg/mL，用缓冲溶液配置，继续培养4小时；吸出样品溶液，加入二甲亚砜，室温下，将96孔板置于微空孔板振荡器中振荡10分钟；用酶标仪测定各孔的OD值，测量波长为570nm，参比波长为630nm，计算样品对细胞的半数致死毒性浓度(CC50)。每组设4个平衡孔，每组实验重复3次。计算结果，画出曲线，求出半数毒性浓度(CC50)。
测试组1为沙蟾毒精；
测试组2为嚏根草配基；
测试组3为远华蟾蜍精；
测试组4为蟾毒它灵；
测试组5为华蟾毒它灵；
测试组6为蟾毒灵；
测试组7为华蟾酥毒基；
测试组8为酯蟾毒配基；
测试组9为实施例1制备得到的蟾酥提取物。
测试组10为实施例2制备得到的蟾酥提取物。
测试组11为实施例3制备得到的蟾酥提取物。
各样品的细胞毒性测试数据见表4。
表4.本发明药物组合物细胞毒性测试结果
| 组别 | CC50值(μM) |
| 测试组1 | 16.32 |
| 测试组2 | 18.23 |
| 测试组3 | 21.22 |
| 测试组4 | 17.32 |
| 测试组5 | 16.44 |
| 测试组6 | 25.44 |
| 测试组7 | 18.33 |
| 测试组8 | 19.21 |
| 测试组9 | 133.3 |
| 测试组10 | 135.4 |
| 测试组11 | 140.5 |
| 病毒唑 | 62.5 |
从表4实验组1～8可以看出，蟾酥提取物中的沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基以及酯蟾毒配基等单体的细胞毒性非常强，细胞毒性远远大于病毒唑。
从表4实验组9～11可以看出，本发明实施例1～3制备得到的具有抗感染作用的蟾酥提取物细胞毒性相对于单体而言大幅减小，且其细胞毒性也要远远小于病毒唑。
综上所述，本发明制备得到的具有抗感染作用的蟾酥提取物其对细菌或病毒均具有显著的抑制作用，且强于单体化合物。此外，所述的具有抗感染作用的蟾酥提取物具有较低的细胞毒性，其细胞毒性要远低于单体化合物的细胞毒性。因此，本发明所述的蟾酥提取物可以作为一种优异的抗感染药物使用。
Claims (9)
1.一种具有抗感染作用的蟾酥提取物，其特征在于，所述的蟾酥提取物含有蟾蜍毒素类有效成分，所述蟾蜍毒素类有效成分中含有如下重量份的成分：
沙蟾毒精30～60份；华蟾酥毒基35～60份；远华蟾蜍精10～25份；蟾毒它灵20～45份；华蟾毒它灵20～50份；蟾毒灵25～45份；酯蟾毒配基15～40份；嚏根草配基5～15份。
2.根据权利要求1所述的具有抗感染作用的蟾酥提取物，其特征在于，所述蟾蜍毒素类有效成分中含有如下重量份的成分：
沙蟾毒精40～50份；华蟾酥毒基40～50份；远华蟾蜍精15～20份；蟾毒它灵30～40份；华蟾毒它灵20～30份；蟾毒灵30～40份；酯蟾毒配基20～30份；嚏根草配基10～15份。
3.根据权利要求1所述的具有抗感染作用的蟾酥提取物，其特征在于，所述的蟾蜍毒素类有效成分占蟾酥提取物总重量的10％以上。
4.根据权利要求1所述的具有抗感染作用的蟾酥提取物，其特征在于，所述的蟾蜍毒素类有效成分占蟾酥提取物总重量的30％以上。
5.根据权利要求4所述的具有抗感染作用的蟾酥提取物，其特征在于，所述的蟾蜍毒素类有效成分占蟾酥提取物总重量的30～80％。
6.一种具有抗感染作用的药物，其特征在于，包含权利要求1～5任一项所述的具有抗感染作用的蟾酥提取物。
7.权利要求1～6任一项所述的具有抗感染作用的蟾酥提取物的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)取蟾酥用乙醇浸提，得乙醇提取物；
(2)将乙醇提取物浓缩至无醇味，然后用非极性大孔树脂柱富集蟾蜍毒素类有效成分；
所述的非极性大孔树脂柱富集蟾蜍毒素类有效成分的具体方法为：将乙醇提取物上样于非极性大孔树脂柱后，先用水洗脱除杂，再用体积分数为40％～95％的乙醇水溶液洗脱非极性大孔树脂柱；收集乙醇洗脱部位，浓缩、干燥即得所述的提取物；
步骤(1)所述的乙醇为体积分数为50％以上的乙醇水溶液；步骤(1)所述的浸提是指采用浸渍法提取得到：具体为：取蟾酥加入8～15倍量的体积分数为50％以上的乙醇水溶液，在15～30℃下浸渍1～7天，过滤即得乙醇提取物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的乙醇为体积分数为70％以上的乙醇水溶液；步骤(1)所述的浸提是指采用浸渍法提取得到：具体为：取蟾酥加入8～12倍量的体积分数为70％以上的乙醇水溶液，在15～30℃下浸渍3～5天，过滤即得乙醇提取物。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中先用水洗脱除杂，再用体积分数为60％～80％的乙醇水溶液洗脱非极性大孔树脂柱。
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