CN111202818B - 一种中药组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药技术领域,公开了一种中药组合物及其制备方法和应用。本发明所述中药组合物为龙胆草、半枝莲、苦参、芦根、仙鹤草、槲寄生、夏枯草、丹参和黄芪的盐酸提取物。本发明的中药组合物中仙鹤草、槲寄生、丹参、芦根合用具有直接抑制肿瘤细胞生长作用;黄芪、丹参联用具有益气补中、扶正祛邪;龙胆草归肝、胆经,具有保肝利胆作用。诸药合用共达病灶不仅能保肝利胆,增加机体自身免疫,解热镇痛,还具有抗肿瘤、扶正益气的功效。
Description
技术领域
本发明涉及中药制剂技术领域,具体涉及一种中药组合物及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤的发病率随着社会发展给环境带来的负面作用而逐年上升,目前对恶性肿瘤的治疗现代医疗手段主要是手术、药物化疗和放疗结合,但疗效也不太满意,其单药有效率仅10-20%,联合化疗有效率仅为30%-40%左右,且在术后及长期化疗后,肿瘤患者处于低免疫力状态,患第二肿瘤的风险极大增高,气虚瘀滞,生活质量下降。且化学药品的副作用已经在应用的过程中逐一出现,其副作用带来的后果有时大于其治疗效果的严重性。鉴于以上,能否针对性的研制出既能较有效控制肿瘤生长,同时药物相关不良反应事件也低的肿瘤药物成为研究重点。
手术、化疗、靶向治疗是目前结肝癌治疗的标准治疗,手术联合靶向治疗取得了显著成效,靶向治疗中表皮生长因子(EGF)、VEGF、IGF等多靶点及其受体成为重点研究对象,可以进一步作用于多靶点的中药提取药物抑制剂用于肝癌的综合治疗,将是一种具有潜在良好疗效的治疗方法。因此,使用低毒性,并且将能抑制肿瘤微环境中抗炎性细胞因子水平的中药提取药物用于肝癌辅助治疗和维持治疗是一个方向。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种中药组合物及其制备方法,使得所述中药组合物具备显著的体内、外抑制肝癌细胞的活性,并同时具备较高的药物安全性,不会对肝脏、肾脏及肠道等造成病理性损伤;
本发明的另外一个目的在于提供上述中药组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用以及一种治疗肝癌的中药制剂。
为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种中药组合物,为龙胆草、半枝莲、苦参、芦根、仙鹤草、槲寄生、夏枯草、丹参和黄芪的盐酸提取物。
在本发明的组方中,以仙鹤草、槲寄生、丹参、芦根抑瘤、清解血毒;黄芪益气补中、扶正祛邪;龙胆草保肝利胆。故肝癌病人使用后正气逐步恢复,气血疏通,脾胃通健,食欲得到恢复,癌痛减轻,气血疏通。按照现代医药理论认为该方配伍不仅能保肝利胆,增加机体自身免疫,解热镇痛,还具有抗肿瘤、扶正益气的功效。总结为:(1)扶正、益气,提高机体免疫力;(2)抗肿瘤作用;(3)止痛保肝。
作为优选,所述中药组合物各原料药的重量份数为:
龙胆草4-40份、半枝莲9-40份、苦参3-45份、芦根9-60份、仙鹤草10-35份、槲寄生6-30份、夏枯草4-45份、丹参8-37份、黄芪10-50份。
在本发明具体实施方式中,所述中药组合物各原料药的重量份数为:龙胆草6份、半枝莲9份、苦参6份、芦根20份、仙鹤草12份、槲寄生10份、夏枯草15份、丹参10份、黄芪20份
经药效学实验证实,本发明中药组合物对肝癌细胞在体内外模型抑制疗效显著,且未对肝脏、肾脏及肠道等造成病理性损伤;基于此,本发明提供了所述中药组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
依据上述应用,本发明提供了一种治疗肝癌的药物,包含本发明所述中药组合物以及药学上可接受的辅料。本发明所述药物可以根据辅料的不同而制成任何剂型,例如片剂、胶囊剂(软胶囊)、颗粒剂、滴丸剂、注射剂或锭剂。
所述颗粒剂的制备方法:取本发明中药组合物,加辅料适量,制成软材,过筛制粒,干燥,即得颗粒剂。
所述片剂的制备方法:取本发明中药组合物,加辅料适量,混匀,制粒,压片,包糖衣,即得片剂。
所述锭剂的制备方法:取本发明中药组合物,打粉混匀,制粒,压锭剂,即得锭剂。
所述胶囊剂的制备方法:取本发明中药组合物,加辅料适量,混匀,干燥、整粒、加入硬脂酸镁,装入明胶胶囊中,即得胶囊剂。
所述软胶囊剂的制备方法:取本发明中药组合物,加辅料适量,将明胶置于溶胶罐中,搅拌均匀,真空除去气泡后保温静置,与乳化剂和助悬剂等混合均匀,再和制备好的明胶一起置于旋转压囊机中,压制成软胶囊,定性,干燥,即得软胶囊。
所述滴丸剂的制备方法:取本发明中药组合物,加辅料适量,将浸膏加水制成均匀糊状,加入溶融的聚乙二醇4000基质液,加热溶融成澄清液体,加入滴丸器中,制成滴丸,干燥,即得滴丸剂。
所述注射剂的制备方法:取本发明中药组合物,加辅料适量,加水,加活性炭,保持pH7.0,加热,冷却,加注射水至全量,装罐,灭菌,冷藏,滤过,滤液浓缩,喷雾干燥,封装,即得注射剂。
此外,本发明还提供了了所述中药组合物的制备方法,取中药原料药龙胆草、半枝莲、苦参、芦根、仙鹤草、槲寄生、夏枯草、丹参和黄芪,然后用盐酸水溶液浸泡后超声提取,提取后浓缩并用氨水将pH调至10,离心弃去沉淀,然后用二氯甲烷对上清液进行萃取,浓缩并回收二氯甲烷,将二氯甲烷萃取部位的浓缩液水浴干燥,获得所述中药组合物。
其中,所述盐酸水溶液为0.2-1.0%盐酸水溶液,在本发明具体实施方式中,所述盐酸水溶液为0.5%盐酸水溶液。
作为优选,所述超声提取的超声时间10-40min/次、超声频率10-20KHz、加液倍量6-10倍量/次、重复提取2-4次;超声提取后可浓缩至2/3-1/2体积。
作为优选,所述二氯甲烷和上清液的比例为1:1-3:1。
由以上技术方案可知,本发明的中药组合物中仙鹤草、槲寄生、丹参、芦根合用具有直接抑制肿瘤细胞生长作用;黄芪、丹参联用具有益气补中、扶正祛邪;龙胆草归肝、胆经,具有保肝利胆作用。诸药合用共达病灶不仅能保肝利胆,增加机体自身免疫,解热镇痛,还具有抗肿瘤、扶正益气的功效。
附图说明
图1所示为本发明中药组合物药物成分分析结果;其中,a为中药提取物(AH-05)大类分析结果;b为中药提取物(AH-05)薄层色谱分析结果,b图下方标注依次表示苦参碱标准品,槐定碱标准品,苦参药材对照,苦参药材对照,本品(AH-05),本品(AH-05),KS,KS,LDC,LDC;
图2所示为本发明中药组合物高效液相分析实验结果;其中,A图为本发明中药组合物的HPLC结果,B和C图分别为槐定碱对照品和苦参碱对照品的HPLC结果;峰型1表示槐定碱,峰型2表示苦参碱;S1-S3依次表示本发明中药组合物(二氯甲烷萃取部位S1);槐定碱对照品(S2);苦参碱对照品(S3);
图3所示为本发明中药组合物抑制肝癌细胞H22和HepG2的MTT实验结果;其中,A为针对H22的折线图和柱形图;B为针对HepG2的折线图和柱形图;
图4所示为本发明中药组合物抑制肝癌细胞HepG2的MTT实验细胞形态结果;
图5所示为本发明中药组合物抑制肝癌细胞H22的MTT实验细胞形态结果;
图6所示为本发明中药组合物抑制肝癌细胞HepG2的结晶紫实验结果;其中,CTR表示空白对照组;
图7所示为本发明中药组合物抑制肝癌细胞H22和HepG2的流式细胞术检测结果;其中,A1和A2表示HepG2细胞系的检测结果;B1和B2表示H22细胞系的检测结果;
图8所示为本发明中药组合物AH-05动物体内药学结果;其中,A图为肿瘤经本品(AH-05)治疗后肿瘤大小变化大体解剖标本结果;B图从左至右依次为对照组与实验组肿瘤质量对比统计结果、对照组与实验组肿瘤体积对比、AH-05实验过程中肿瘤体积动态变化统计结果;C图从左至右依次为对照组与实验组小鼠体重对比结果及对照组与实验组小鼠体重动态变化统计结果;
图9所示为本发明中药组合物AH-05对小鼠模型脾脏中CD4+和CD8+T的影响;其中,A图为对照组与实验组小鼠动物模型脾脏大小的大体观察结果,B图为对照组与实验组小鼠动物模型脾脏质量的对比统计结果,C图为流式细胞技术分析对照组与实验组小鼠动物模型脾脏中,CD4-/CD8-、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+免疫细胞的趋化表现结果,D图为流式细胞技术分析对照组与实验组小鼠动物模型脾脏中,CD4-/CD8-、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+免疫细胞的趋化表现统计结果;
图10所示为本发明中药组合物对小鼠肿瘤组织中与肿瘤增殖相关的细胞因子的Western-blot实验结果;
图11所示为本发明中药组合物安全性评价实验结果(HE染色);
图12所示为本发明中药组合物安全性评价实验结果(血常规、肝功能、肾功能);
图13所示为不同组方间MTT药效学评价结果;其中,HepG-2-V1.0为龙胆草6份、半枝莲9份、苦参6份、芦根20份、仙鹤草12份、槲寄生10份、夏枯草15份、丹参10份、黄芪20份组方,HepG-2-V1.1为龙胆草6份、半枝莲9份、苦参9份、芦根20份、仙鹤草12份、槲寄生10份、夏枯草15份、丹参10份、黄芪20份组方,HepG-2-V1.2为龙胆草6份、半枝莲9份、苦参6份、芦根20份、仙鹤草12份、槲寄生15份、夏枯草15份、丹参10份、黄芪20份组方,HepG-2-V1.3为龙胆草6份、半枝莲9份、苦参9份、芦根20份、仙鹤草12份、槲寄生15份、夏枯草15份、丹参10份、黄芪20份组方。
具体实施方式
本发明公开了一种中药组合物及其制备方法和应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明所述中药组合物及其制备方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的中药组合物及其制备方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明采用的提取方法简单、稳定、重复性好、易于掌控。其中盐酸配合超声提取技术破坏植物药材的细胞,使溶剂渗透到药材细胞中,与原水煎液相比,更能缩短提取时间,提高提取率,使中药中治疗肝脏肿瘤及扶正益气的主要成分提取更充分,并通过二氯甲烷进一步萃取,获得纯度更高的生物碱有效成分。
同时,本发明中药复方制备工艺,对提取溶剂、提取温度、提取时间、提取次数、药材用量等条件进行了筛选优化、选用的方法易于推广、便于执行、适用于大批量工业化生产,具有良好的可行性。
本发明的制备工艺方法简单、药物有效成分提取率高、疗效显著、准确可靠、能更全面地保障中药复方的疗效和质量,适用于临床推广应用,具有良好的实用性。经药效学实验证实,本发明中药制剂对肝癌细胞在体内外模型抑制疗效显著,且未对肝脏、肾脏及肠道造成病理性损伤,此制备方法具有服用剂量小、服用方便、稳定性好、副作用小等优点。
在本发明中,所述中药组合物可简写为AH-05。
以下就本发明所提供的一种中药组合物及其制备方法和应用做进一步说明。
实施例1:本发明中药组合物
龙胆草6份、半枝莲9份、苦参6份、芦根20份、仙鹤草12份、槲寄生10份、夏枯草15份、丹参10份、黄芪20份。
制备方法:各原料药混合后粉碎成粗粉,然后用0.5%盐酸水溶液将药材粗粉于室温条件下浸泡2h,然后进行超声提取:超声时间40min/次、超声频率20KHz、加液倍量8倍量/次、重复提取2次;提取溶剂:0.2-1.0%盐酸水溶液,合并滤液,减压浓缩至2/3-1/2体积,然后用氨水将pH调至10,离心弃去沉淀,然后用二氯甲烷对上清液进行萃取(比例为1:1-3:1),反复萃取2次,合并二氯甲烷萃取部位,减压浓缩并回收二氯甲烷,将二氯甲烷萃取部位的浓缩液水浴干燥即得浸膏,为本发明中药组合物。出膏率为:0.09%-0.13%。
实施例2:本发明中药组合物药物成分分析
将本发明实施例1中药组合物进行大类成分分析。分析方法如下:
1.Dragendorff试剂法:
前液:0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸,加水40ml,溶解,即得。
临用前取5ml,加碘化钾溶液(4→10)5ml,再加冰醋酸20ml,用水稀释至100ml,即得。
检识方法:取1m1样品的稀酸溶液加1滴~2滴试剂,产生黄至桔红色浑浊或沉淀。
2.Hager试剂法
苦味酸1g溶于100ml水中。
检识方法:取1ml样品中性溶液,加入试剂1滴~2滴,产生黄色晶形沉淀。
3.Wagner试剂法
1g碘及10g碘化钾溶于50g水中,加2ml醋酸,再用水稀释至100m1。
检识方法:取lml样品稀酸溶液,加入试剂1滴~2滴,产生红棕色沉淀。
4.Ammonium reineckate
2%硫氰化铬铵溶液(临用时配制)。
检识方法:取1ml样品的弱酸性水溶液(pH5~6),加入1滴~2滴试剂,产生暗红色沉淀。结果见表1和图1。
表1
注:上表中“+”表示有沉淀现象;“-”表示无沉淀现象;“+”越多表示沉淀越多,沉淀现象越明显;“↓”表示沉淀。
由表1和图1结果可以看出,本发明中药组合物中含有苦参碱及槐定碱等生物碱成份。同时,将本发明中药组合物进行HPLC分析,结果见图2,证实从中药组合物可分离出苦参碱及槐定碱等生物碱成份。
实施例3:本发明中药组合物药学研究结果
MTT实验,用MTT和CCK-8测定细胞增值活力。将HepG2和H22细胞(3×103个细胞/孔)分别接种于96孔板上,分别暴露于不同浓度的AH-05(0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml和4.0mg/ml)下。24小时后,加入20μl 5mg/ml的MTT继续在37℃中孵化,4小时后加入200μl DMSO,并在492nm波长处测定对照组和实验组细胞吸光度。结果表明(图3)AH-05提取物能有效抑制H22和HepG2肝癌细胞增长,且其抑制增长作用呈剂量依赖性增强,当AH-05提取物为3mg/mL时其抑制增长作用达到平台期。在明场倒置显微镜下观察细胞形态发现,给与AH-05制剂干预的细胞能够以剂量依赖的方式抑制HepG2和H22细胞的增殖,给药后见细胞出现明显形态改变及细胞数量下降,当药物浓度高于3mg/ml后,H22及HepG2细胞基本死亡(图4和图5)。
结晶紫染色实验,将HepG2细胞(2×104个/孔)接种于24孔板中,孵育24小时后,给与不同浓度(0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml)AH-05药物连续干预72小时。4%多聚甲醛固定30min后,用结晶紫溶液染色2小时。结果显示,AH-05制剂对HepG2细胞长期增殖能力有明显抑制作用(图6)。结果显示,当浓度为1.5mg/mL时,给药组中的细胞数量明显减少,进一步说明本AH-05提取物具有较好的抗肿瘤作用。
流式细胞术检测,在细胞体外实验中,将H22和HepG2细胞(5×105个/孔)分别接种于6孔板中。细胞暴露于不同浓度AH-05(0.5mg/ml和1.5mg/ml)制剂24小时,收集细胞后用碘化丙啶(PI)和Annexin V试剂盒检测细胞凋亡状态。结果显示,AH-05制剂处理24小时后,PI阳性细胞和Annexin V阳性细胞的百分比明显增加,且呈浓度依赖性。在HepG2细胞组中,在0.5和1.5mg/ml浓度下,AH-05诱导的Annexin V阳性率分别为80.00%和73.11%,同时Annexin V/PI双阳性细胞率分别为33.10%和60.50%。在H22细胞系组中,AH-05诱导Annexin V阳性率分别为94.70%和95.7%,AnnexinV/PI双阳性细胞率分别为38.20%和64.30%(p<0.05)(图7)。
动物实验,本研究选用雌性SPF-KM小鼠,体重21±1.2g。接种H22细胞(1.0×106个/小鼠)移植于小鼠右背部。12只荷瘤小鼠分为2组(n=6)。对照组和实验组分别灌胃生理盐水和本品药物。每隔3天记录肿瘤体积和重量。实验表明,三批次小鼠H22细胞株肝癌动物实验证实,AH-05能显著抑制小鼠模型中肝癌细胞的生长(图8)。同时,小鼠动物实验中,制备对照组及实验组脾脏细胞悬液,使用CD4-PE和CD8-FITC抗体检测T细胞表面抗原表达情况,实验结果显示,AH-05诱导小鼠模型脾脏中(脾脏是免疫器官之一,肿瘤药物研究点之一就是考察脾脏中的免疫细胞变化情况,因此本发明亦考察了药物对小鼠模型脾脏中免疫细胞的化影响)的CD4+和CD8+T细胞增长(图9)。再者,分别取对照组及实验组小鼠肿瘤组织,提取肿瘤组织蛋白,并通过Western免疫印迹(Western-blot)实验,证实AH-05能抑制小鼠肿瘤组织中与肿瘤增值相关的细胞因子AKT,p-AKT,mTOR和NF-κB P50的表达,从抑制肿瘤生长(图10)。
实施例4:本发明中药组合物安全性评价试验
验证实施例1中药组合物对肝脏、肾脏、肠道的安全性。通过对小鼠眼球采血,然后对其进行血生化检测、血细胞分析,以及肝脏、肾脏和肠道的HE染色,实验结果表明AH-05制剂对小鼠无肝、肾、肠道毒性作用以及血液学毒性作用(图11和图12)。
实施例5:不同组方间MTT药效学评价结果
1、对照1
对照1提供一种辅助治疗肝脏肿瘤的中药制剂,是由以下重量份数的中药组成的:龙胆草6份、半枝莲9份、苦参9份、芦根30份、仙鹤草12份、槲寄生10份、夏枯草15份、丹参10份、黄芪20份。
与实施例1相比,对照1组方中苦参增加至9份,芦根增至30份,采用与实施例1相同的提取方法。对照1与实施例1进行体外药效学对比研究,验证对照1组合物的药效学效果。通过建立HepG2肝癌细胞模型和MTT方法验证,实验结果表明,在0.5mg/ml低浓度时,对照1中的组合物对HepG2肝癌细胞抑制率低于实施例1组方,支持选用含有较低份数苦参和芦根的制剂组方(图13)。
2、对照2
对照2提供一种辅助治疗肝脏肿瘤的中药制剂,是由以下重量份数的中药组成的:龙胆草6份、半枝莲9份、苦参6份、芦根20份、仙鹤草12份、槲寄生15份、夏枯草15份、丹参10份、黄芪20份。
与实施例1相比,对照2组方中槲寄生增加至15份,采用与实施例1相同的提取方法。对照2与实施例1进行体外药效学对比研究,验证该实施例的药效学效果。通过建立HepG2肝癌细胞模型和MTT方法验证,实验结果表明,在0.5mg/ml低浓度时,对照2中的组合物对HepG2肝癌细胞抑制率低于实施例1组方,支持选用含有低份数槲寄生的制剂组方(图13)。
3、对照3
对照3提供一种辅助治疗肝脏肿瘤的中药制剂,是由以下重量份数的中药组成的:龙胆草6份、半枝莲9份、苦参9份、芦根20份、仙鹤草12份、槲寄生15份、夏枯草15份、丹参10份、黄芪20份。
与实施例1相比,对照3组方中苦参增加至9份,槲寄生增至15份,采用与实施例1相同的提取方法。对照3与实施例1进行体外药效学对比研究,验证该实施例的药效学效果。通过建立HepG2肝癌细胞模型和MTT方法验证,实验结果表明,在0.5mg/ml低浓度时,对照3组合物的制剂组方对HepG2肝癌细胞抑制率低于实施例1组方,支持选用含有低份数槲寄生的制剂组方(图13)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种治疗肝癌的中药组合物,其特征在于,为龙胆草、半枝莲、苦参、芦根、仙鹤草、槲寄生、夏枯草、丹参和黄芪的盐酸提取物;
各原料药的重量份数为:
龙胆草4-40份、半枝莲9-40份、苦参3-45份、芦根9-60份、仙鹤草10-35份、槲寄生6-30份、夏枯草4-45份、丹参8-37份、黄芪10-50份。
2.权利要求1所述中药组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
3.一种治疗肝癌的药物,其特征在于,由权利要求1所述中药组合物以及药学上可接受的辅料组成。
4.根据权利要求3所述药物,其特征在于,药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、注射剂或锭剂。
5.权利要求1所述中药组合物的制备方法,其特征在于,取中药原料药龙胆草、半枝莲、苦参、芦根、仙鹤草、槲寄生、夏枯草、丹参和黄芪,然后用盐酸水溶液浸泡后超声提取,提取后浓缩并用氨水将pH调至10,离心弃去沉淀,然后用二氯甲烷对上清液进行萃取,浓缩并回收二氯甲烷,将二氯甲烷萃取部位的浓缩液水浴干燥,获得所述中药组合物。
6.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于,所述盐酸水溶液为0.2-1.0%盐酸水溶液。
7.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于,所述超声提取的超声时间10-40min/次、超声频率10-20KHz、加液倍量6-10倍量/次、重复提取2-4次。
8.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于,所述二氯甲烷和上清液的比例为1:1-3:1。
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