CN1264541C - 抗乙型肝炎病毒活性增高的龙芽草属植物提取物的制备方法、药物和食品组合物 - Google Patents

抗乙型肝炎病毒活性增高的龙芽草属植物提取物的制备方法、药物和食品组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于预防或治疗肝病的药物组合物和食品组合物，其含有一种药物有效量的欧洲龙芽草提取物。本发明还公开了一种制备预防或治疗肝病功效得到提高的龙芽草属植物的水溶性提取物的方法，其特征在于在约20℃至30℃下将龙芽草属植物的被粉碎的产物与水的混合物加热约7天或更长的时间，以及用于预防或治疗肝病的药物组合物和食品组合物，其含有一种按照该方法制备的水溶性提取物。本发明还公开了一种制备预防或治疗肝病功效得到提高的龙芽草属植物的有机溶剂可溶性提取物的方法，该方法包括利用一种有机溶剂对龙芽草属植物进行提取，和除去水相从而获得一种有机溶剂可溶性部分，和含有一种按照该方法制备的提取物的用于预防或治疗肝病的药物和食品组合物。

Description

抗乙型型肝炎病毒活性增高的龙芽草 属植物提取物的制备方法、药物和食品组合物
技术领域
本发明涉及从属于龙芽草属的植物中制备提取物的方法，该提取物的抗乙型肝炎病毒活性增高。本发明还涉及用于预防和治疗肝脏疾病的含有这种提取物的药物和食品组合物。
背景技术
已知本身是一种DNA病毒的乙型肝炎病毒(HBV)在人类中能够引起慢性肝炎以及急性肝炎，因而成为临床研究的一个主要目标。如果慢性肝炎持续时间较长，则能够诱发肝硬化和肝细胞癌(Peter J.Grob.疫苗(Vaccine)，16：S11-S16(1998))。乙型肝炎病毒大都通过非肠道途径感染宿主。尤其是，HBV对婴儿的感染是一个全球关注的主要问题。如果母亲患有慢性HBV感染，那么胎儿或新生儿则受到母亲所传播的HBV感染。世界上超过两亿的人患有HBV感染，而且这些人当中的3,500,000人处于慢性感染状态继而发展为肝硬化和肝细胞癌，结果导致高死亡率(Davey S.世界范围内的疫苗和免疫状态(State ofthe World’s Vaccines and Immunization).日内瓦：WHO，1996：76-82)。然而，目前还缺乏治疗HBV感染的有效治疗剂。
在这方面，针对预防或治疗HBV感染正在进行着大量的研究工作。结果，已经研制出的治疗剂按照自身特性被分成免疫调节剂、抗病毒剂和核苷类似物。具有代表性的免疫调节剂的例子有干扰素，以及抗病毒剂的例子包括病毒唑、阿糖腺苷、阿糖腺苷酸(ara-AMP)、阿昔洛韦、苏拉明和齐多夫定。还有，核苷类似物包括拉米夫定和最近已经得到美国食品和药物管理局(FDA)批准的用于治疗乙型肝炎的阿地福韦(adefovir)。
由于Greenberg H.B.报道了白细胞IFN对HBV的增殖具有抑制活性(Greenberg H.B.等，新英格兰医学杂志(N Engl J Med)，295：517-522(1976))，所以在这些治疗剂当中，干扰素(INF)针对慢性肝炎患者的治疗效果得到了积极的研究。在研究早期，对INF进行的临床研究因供给不足和剂量以及治疗的持续时间不明确而受到限制。随着重组技术的发展，促进了IFN的利用，IFN-α-2b(在下文中被称作“α-IFN”)目前可以由商业途径得到并且已被批准用作治疗慢性乙型肝炎的药物。然而，患有慢性乙型肝炎的患者对α-IFN表现出低于25％的低反应性。β-IFN和γ-IFN只对HBV感染少于4个月的患者具有疗效。
皮质类固醇被证明对自身免疫肝炎有效，因而被研究用于治疗慢性乙型肝炎(Marsha A.病毒性肝炎(Viral Hepatitis).见：Dipiro JT等编辑的药物治疗：病理生理学方法(Pharmacotherapy：apathophysiologic approach).第三版.纽约：Elservier，829-852(1996))。皮质类固醇尽管具有减轻大多数肝炎患者的肝脏炎症的作用，但却使HBV的复制迅速增加。因此，当停止皮质类固醇治疗时，所述炎症活性增高。另外，已知皮质类固醇能使肝炎患者的病情恶化，因而限制了它们的应用范围。
抗病毒药物利巴韦林对于治疗慢性乙型肝炎有效，而且就可口服用药而言是有利的。然而，当停止利巴韦林用药时，所有实验结果表现出很高的HBV感染的复发率。阿糖腺苷及其衍生物阿糖腺苷酸不具有持续的药效并能引起严重的神经肌肉中毒。由于这些原因，阿糖腺苷和阿糖腺苷酸没有被用于治疗肝炎。其它几种抗病毒剂由于对细胞核DNA和线粒体DNA以及病毒DNA具有负面影响，同时临床数据量非常有限因而具有潜在的毒性。
最近，由核酸产生的药物已被研制成一种用于治疗乙型肝炎患者的新治疗剂，例子有泛昔洛韦、拉米夫定、洛布卡韦(lobucavir)和adefovir dipivoxil(Erik De Clercq，国际抗微生物剂杂志(Int JAntimicrob Agent)，12：81-95(1999))。早期，这种由HIV治疗剂衍生的对反转录酶具有抑制作用的双脱氧核苷类似物(ddNs)或针对某些疱疹病毒感染的治疗剂被研制用于治疗其它病毒感染，而且表明对治疗HBV感染也有效。通过对泛昔洛韦和拉米夫定进行非常深入的研究，得出该两种药物可以口服用药的结论。据报道在泛昔洛韦或拉米夫定的治疗过程中，某些患者血清中的HBV-DNA水平急剧下降，HBeAg(一种HBV包膜抗原)消失了，并且肝脏-特异性酶水平也正常了。在对乙型肝炎患者施用一年的拉米夫定的初步临床治疗中，观察到HBeAg向HBeAb的血清转变率低至22％，而丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平被标准化。然而，当停止拉米夫定治疗时，在大多情况下，炎症复发并且肝脏的酶水平也增高了，并且在几个月内出现了对拉米夫定具有抗性的HBV突变株。过去几年的临床数据表明进行长期拉米夫定治疗能引起对药物具有抗性的HBV突变株的出现，拉米夫定治疗几个月后大约14％的患者出现药物抗性HBV突变株，拉米夫定治疗两年后大约30％的患者出现药物抗性HBV突变株(Alen MI，肝脏病学(Hepatology)，27：1670-1677(1998))。尤其是，据报道患有HBV感染的肝脏移植病人中出现了药物抗性HBV突变株(Yao FY，肝脏移植手术(Liver Transplant Surgery)，5：491-496(1999))。药物抗性HBV突变株在HBV聚合酶基因中含有点突变，主要是在高度保守的YMDD基元中，其中YMDD突变赋予了HBV对拉米夫定的抗性，同时维持病毒的复制。还有，由于HBV感染复发率高，所以肝脏移植作为一种治疗HBV感染的方法存在不利之处。
另一方面，已知从包括甘草、儿茶素和水飞蓟素在内的从植物中分离出的组分对肝炎病毒具有抑制作用。尽管对肝炎病毒的复制具有一种抑制作用以及对肝脏具有很好的保护功能(交替性医学评论(Altern Med Rev)1999年8月；4(4)：220-38，中国中西医结合杂志1992年8月；12(8)：480-2)，但是这类组分仍然没有被研制成肝炎的治疗剂。
而且，已经证明已知被用于临床治疗各种癌症的化学治疗剂对肝细胞癌无效。作为一个有代表性的例子，对患有肝细胞癌的病人进行的II期临床实验结果表明从塔紫杉中分离出的对某些恶性肿瘤细胞具有抑制活性的紫杉酚对肝细胞癌没有明显的疗效(英国癌症杂志(British Journal of Cancer)，78(1)，34-39，1998))。许多杂志中报道了对肝细胞癌具有活性的物质。例如，根据美国专利US5,411,943的记载，促生长素抑制素的一种八肽衍生物对肝细胞瘤具有疗效。美国专利US 5,981,774公开了一些γ-吡喃酮化合物，环桑根皮素、环阿托明宁(cycloartomunin)，二氢环阿托明宁(dihydrocycloartomunin)，artomunoxanthotrione epoxide，二氢异环阿托明宁(dihydroisocycloartomunin)，artomunoxanthone，cyclocommunol，环桑素，和环可明宁(cyclocommunin)，这些化合物是从Formosan tripterospermum植物的根皮中分离出来的并且对人肝细胞瘤具有细胞毒性作用。欧洲专利EP 0652469A1和公开号为WO01/15675的国际专利申请中分别记载了有效治疗肝细胞癌的阿糖胞苷酯和多西他奇。另外，韩国专利10-0187881公开了一种以前胡醇酯(decursinol angelate)作为一种有效成分的肝细胞癌治疗剂，以及公开号为2000-0046779的韩国专利申请公开了一种用于治疗肝炎或肝细胞瘤的以一种大荨麻(Urtica dioca)植物提取物作为有效成分的组合物。
仍然需要进一步研制用于治疗肝炎和肝细胞瘤的有效和改善的治疗剂，这也是本发明的一个目的。如韩国专利10-0351755和10-0327762中所记载的，本发明人以前发现了用于治疗肝相关疾病的以一种独行菜或龙芽草植物提取物作为有效成分的治疗剂，该治疗剂具有抑制HBV表面抗原产生的活性。
本发明的公开
本发明人深入和全面地研究了从龙芽草属不同种的植物中分离出的提取物对肝病的疗效，结果发现当向被通常用于评价药物对乙型肝炎病毒(HBV)的疗效的细胞培养物中加入一种龙芽草属植物欧洲龙芽草的提取物时，该提取物由于明显抑制HBV表面抗原和包膜抗原的产生、HBV本身的复制以及参与HBV复制的病毒DNA聚合酶的活性而成为一种非常有效的肝病治疗剂。另外，本发明人还发现通过将整株龙芽草属植物与水混合，然后在约55℃或更高的温度下加热该混合物而制成的一种水溶性龙芽草属植物提取物对肝病的治疗效果显著提高，并且通过将整株龙芽草属植物与水混合，然后在约20-30℃的温度下将该混合物加热7天或更长的时间而制成的一种水溶性龙芽草属植物提取物对肝病的治疗效果也显著提高。本发明人还发现通过利用一种有机溶剂提取整株龙芽草属植物而制备的一种有机溶剂可溶性提取物在治疗肝病方面比水溶性提取物更有效。
因此，本发明一方面提供了一种用于预防或治疗肝病的药物组合物，该组合物含有一种药物有效量的作为有效成分的欧洲龙芽草植物提取物。
本发明的另一方面提供了一种供肝病患者食用的食品组合物，该组合物含有一种作为有效成分的欧洲龙芽草植物提取物。
本发明还提供了一种制备有效预防或治疗肝病的欧洲龙芽草植物的水溶性提取物的方法，该方法包括以下步骤：将欧洲龙芽草植物进行粉碎，将被粉碎的产物与水混合，加热该混合物从而得到一种提取物溶液，从该提取物溶液中除去不溶于水的组分。
本发明还提供了一种制备有效预防或治疗肝病的龙芽草属植物的水溶性提取物的方法，该方法包括以下步骤：将龙芽草属植物进行粉碎，将被粉碎的产物与水混合，在约55℃或更高的温度下加热该混合物从而得到一种提取物溶液，从该提取物溶液中除去不溶于水的组分从而得到一种水溶性提取物。
本发明还提供了一种供用于预防或治疗肝病的含有一种龙芽草属植物水溶性提取物的药物组合物，所述提取物通过以下步骤制成：将龙芽草属植物进行粉碎，将被粉碎的产物与水混合，在约55℃或更高的温度下加热该混合物从而得到一种提取物溶液，从该提取物溶液中除去不溶于水的组分从而得到一种水溶性提取物。
本发明还提供了一种供肝病患者食用的含有一种龙芽草属植物的水溶性提取物的食品组合物，所述提取物通过以下步骤制成：将龙芽草属植物进行粉碎，将被粉碎的产物与水混合，在约55℃或更高的温度下加热该混合物从而得到一种提取物溶液，从该提取物溶液中除去不溶于水的组分从而得到一种水溶性提取物。
本发明还提供了一种从龙芽草属植物中制备一种对肝病的预防或治疗效果得到提高的水溶性提取物的方法，该方法包括以下步骤：将龙芽草属植物进行粉碎，将被粉碎的产物与水混合，在约20-30℃或更高的温度下将该混合物加热7天或更长的时间从而得到一种提取物溶液，从该提取物溶液中除去不溶于水的组分从而得到一种水溶性提取物。
本发明还提供了一种用于预防或治疗肝病的含有一种龙芽草属植物的水溶性提取物的药物组合物，所述提取物通过以下步骤制得：将龙芽草属植物进行粉碎，将被粉碎的产物与水混合，在约20-30℃或更高的温度下将该混合物加热7天或更长的时间从而得到一种提取物溶液，从该提取物溶液中除去不溶于水的组分从而得到一种水溶性提取物。
本发明还提供了一种供肝病患者食用的含有一种龙芽草属植物的水溶性提取物的食品组合物，所述提取物通过以下步骤制得：将龙芽草属植物进行粉碎，将被粉碎的产物与水混合，在约20-30℃或更高的温度下将该混合物加热7天或更长的时间从而得到一种提取物溶液，从该提取物溶液中除去不溶于水的组分从而得到一种水溶性提取物。
本发明还提供了一种从龙芽草属植物中制备一种有机溶剂可溶性提取物的方法，该方法包括以下步骤：利用一种有机溶剂提取一种龙芽草属植物，然后除去含水相从而得到一种有机溶剂可溶性部分，后者对肝病的预防或治疗效果得到提高。
本发明还提供了一种预防或治疗肝病的含有一种龙芽草属植物的有机溶剂可溶性提取物的药物组合物，所述提取物通过以下方法制得：利用一种有机溶剂提取一种龙芽草属植物，然后除去含水相从而得到一种有机溶剂可溶性部分。
本发明还提供了一种供肝病患者食用的含有一种龙芽草属植物的有机溶剂可溶性提取物的食品组合物，所述提取物通过以下方法制得：利用一种有机溶剂提取一种龙芽草属植物，然后除去水相从而得到一种有机溶剂可溶性部分。
附图的简要描述
本发明的上述和其它目的、特征和其它优点通过以下结合附图进行的详细描述将被理解得更加清楚，其中：
图1是一种方法的流程图，该方法是利用一种有机溶剂对一种欧洲龙芽草植物进行处理从而获得一种具有抗HBV活性的有机溶剂可溶性提取物；
图2是一个表示欧洲龙芽草的水溶性提取物对PLC/PRF/5细胞系中的HBV表面抗原(HBsAg)产生的抑制活性的条形图；
图3是一个表示欧洲龙芽草的水溶性提取物对HepG22.2.15细胞系中的HBV包膜抗原(HBeAg)产生的抑制活性的条形图；
图4是显示欧洲龙芽草的水溶性提取物对HepG22.2.15细胞系中的HBV复制的抑制活性的琼脂糖凝胶电泳结果；
图5是显示欧洲龙芽草的水溶性提取物对肝炎患者体内的HBV DNA聚合酶的抑制活性的琼脂糖凝胶电泳结果；
图6是表示欧洲龙芽草、龙芽草、托叶龙芽草和Pilosella Satake的托叶龙芽草(A.coreana N.for.pilosella Satake)的水溶性提取物对PLC/PRF/5细胞系中的HBV表面抗原(HBsAg)的抑制活性的条形图；
图7是表示在各种温度下同一时间段(1小时)提取的欧洲龙芽草的水溶性提取物对PLC/PRF/5细胞系中的HBV表面抗原(HBsAg)产生的抑制活性的条形图；
图8是表示在相同温度(25℃)下不同时间段提取的欧洲龙芽草的水溶性提取物对PLC/PRF/5细胞系中的HBV表面抗原(HBsAg)产生的抑制活性的条形图；
图9是表示通过干燥和粉碎整株欧洲龙芽草植物，然后利用一种相同体积的不溶于水的有机溶剂，己烷、氯仿或丁醇对被粉碎的产物与蒸馏水的混合物进行提取所获得的部分对HepG2 2.2.15细胞系中的HBV表面抗原(HBsAg)产生的抑制活性的条形图；
图10是表示通过干燥和粉碎整株欧洲龙芽草植物，然后利用一种相同体积的不溶于水的有机溶剂，己烷、氯仿或丁醇对被粉碎的产物与蒸馏水的混合物进行提取所获得的部分对HepG2 2.2.15细胞系中的HBV包膜抗原(HBeAg)产生的抑制活性的条形图；和
图11是表示从整株欧洲龙芽草中制备一种具有抗-HBV活性的水溶性提取物的流程图。
实施本发明的最好方式
已知某些属于龙芽草属的植物含有具有抗肿瘤作用和免疫调节作用的组分。在这些组分中，龙芽草素是一种含在欧洲龙芽草中的鞣酸并且通过增强免疫应答而起着免疫调节剂的作用，以及通过诱导产生白细胞介素-1而起着抗肿瘤剂的作用。而且，欧洲龙芽草的提取物能够有效治疗糖尿病。然而，除了象韩国专利10-0327762中记载的描述一种欧洲龙芽草的水溶性提取物对HBV表面抗原具有抑制作用的专利外，还没有关于龙芽草属植物提取物具有抑制HBV作用的报道。
当研制一种治疗剂时，对其体外和/或体内效果的评价是非常重要的。黑猩猩或土拨鼠通常被用作体内模型(Raymond F Schinazi，抗病毒化学&化学治疗(Antiviral Chem&Chemother)，10：99-114(1999))，由人肝肿瘤细胞产生的细胞系被用于体外研究，所述细胞系包括来源于肝肿瘤细胞HepG2的HepG2 2.2.15细胞系和来源于肝肿瘤组织的Hep3B和PLC/PRF/5细胞系。HepG2细胞不携带HBV基因组。而PLC/PRF/5和HepG2 2.2.15细胞在它们的基因组DNA中含有HBV基因组(Mary A.Sells，P.N.A.S.84：1005-1009(1987))。这种细胞系，PLC/PRF/5和HepG2 2.2.15细胞象被HBV感染的肝细胞一样具有产生HBV表面抗原和包膜抗原以及HBV病毒粒的能力，因而被用于评价治疗剂抗HBV感染的效力。
本发明中使用的属于龙芽草属的植物包括下列物种：欧洲龙芽草；龙芽草；托叶龙芽草；pilosella Satake的托叶龙芽草；Agrimoniagryposepala；Agrimonia rostellata；Agrimonia pubescens；Agrimonia parviflora；Agrimonia striata；Agrimonia ordorata；Agrimonia incisa；Agrimonia polyphylla；Agrimonia microcarpa；Agrimonia bracteata；Agrimonia repens；Agrimonia platycarpa；Agrimonia pumila；和Agrimonia asiatica.
按照以下三种方法中的任意一种方法制备一种本发明的龙芽草属植物提取物。根据第一种方法，通过将所述植物与水混合后加热该混合物来制备一种水溶性提取物。根据本发明的第二种方法，如图11所示，通过利用一种有机溶剂对所述植物进行提取后从所述提取物中除去有机溶剂可溶性部分来制备一种水溶性提取物。通过第三种方法，如图1所示，通过利用一种有机溶剂对所述植物进行提取后从该提取物中除去水相来制备一种有机溶剂可溶性部分。根据本发明，当所有提取物被加到能够评价治疗剂对HBV效力的细胞中时，所述提取物都对HBV表面抗原和包膜抗原的产生、HBV复制和HBV DNA聚合酶活性具有抑制作用。尤其是，在抑制HBV表面抗原和包膜抗原产生、HBV复制以及HBV DNA聚合酶活性方面，欧洲龙芽草提取物比龙芽草属的其他物种的提取物的效力高出约1.6至2倍。因此，本发明提供了一种用于预防或治疗肝病的含有药物有效量的欧洲龙芽草提取物的药物组合物。另一方面，本发明提供了一种供肝病患者食用的以欧洲龙芽草提取物作为有效成分的食品组合物。本发明还提供了一种由欧洲龙芽草植物制备一种水溶性提取物的方法，该方法包括以下步骤：将欧洲龙芽草植物粉碎后，将该被粉碎的产物与水混合，对该混合物进行加热从而获得一种提取物溶液，从该提取物溶液中除去不溶于水的组分，该水溶性提取物预防或治疗肝病的效力被提高了。
根据本发明，由一种龙芽草属植物制备的水溶性提取物，详细地由包括以下步骤的方法来制备并且可以以液体或干燥形式进行使用：将整株龙芽草属植物进行干燥和粉碎，将被粉碎的产物悬浮在蒸馏水中，加热该悬浮液，离心除去该悬浮液中的不溶于水的组分。在本发明的一个实施方案中，加热的温度和时间对最终水溶性提取物的效力影响很大，其中通过在约55℃或更高温度下加热制备的水溶性提取物的效力有显著的提高。因此，本发明提供了一种从龙芽草属植物中制备一种预防或治疗肝病的效力得到提高的水溶性提取物的方法，该方法包括以下步骤：将一种龙芽草属植物粉碎，将该被粉碎的产物与水混合，在约55℃或更高温度下加热该混合物从而获得一种提取物溶液，并从该提取物溶液中除去不溶于水的组分。本发明还提供一种用于预防或治疗肝病的含有一种龙芽草属植物的水溶性提取物的药物组合物，所述提取物通过以下步骤制得：将一种龙芽草属植物粉碎，将该被粉碎的产物与水混合，在约55℃或更高温度下加热该混合物从而获得一种提取物溶液，并从该提取物溶液中除去不溶于水的组分从而制成一种水溶性提取物。本发明还提供一种供肝病患者食用的含有一种龙芽草属植物的水溶性提取物的食品组合物，所述提取物通过以下步骤制得：将一种龙芽草属植物粉碎，将该被粉碎的产物与水混合，在约55℃或更高温度下加热该混合物从而获得一种提取物溶液，并从该提取物溶液中除去不溶于水的组分从而制成一种水溶性提取物。
在本发明的另一个实施方案中，当通过在约20至30℃下加热约7天或更长时间来制备水溶性提取物时，所述水溶性提取物对肝病的疗效得到明显提高。因此，本发明提供了一种从龙芽草属植物中制备一种预防或治疗肝病的疗效得到提高的水溶性提取物的方法，该方法包括以下步骤：将一种龙芽草属植物粉碎，将该被粉碎的产物与水混合，在约20至30℃的温度下将该混合物加热约7天或更长的时间从而获得一种提取物溶液，并从该提取物溶液中除去不溶于水的组分从而制成一种水溶性提取物。本发明还提供了一种用于预防或治疗肝病的含有一种龙芽草属植物的水溶性提取物的药物组合物，所述提取物通过以下步骤制得：将一种龙芽草属植物粉碎，将该被粉碎的产物与水混合，在约20至30℃或更高温度下将该混合物加热约7天或更长时间从而获得一种提取物溶液，并从该提取物溶液中除去不溶于水的组分从而制成一种水溶性提取物。本发明还提供一种供肝病患者食用的含有一种龙芽草属植物的水溶性提取物的食品组合物，所述提取物通过以下步骤制得：将一种龙芽草属植物粉碎，将该被粉碎的产物与水混合，在约20至30℃或更高温度下将该混合物加热约7天或更长时间从而获得一种提取物溶液，并从该提取物溶液中除去不溶于水的组分从而制成一种水溶性提取物。
根据本发明，一种龙芽草属植物的提取物详细地按照包括以下步骤的方法来制备：利用一种有机溶剂如甲醇提取整株龙芽草属植物，采用一种不溶于水的有机溶剂进行处理从而将提取物分成一个有机溶剂相和一个水相，利用另一种不溶于水的有机溶剂处理所述的水相，结果形成一种分离的有机溶剂相和一个最终的水相。在本发明的一个实施方案中，由龙芽草属植物得到的有机溶剂相在抑制HBV表面抗原和包膜抗原产生、HBV复制和HBV DNA聚合酶活性方面的效力比所述最终水提取相高出约1.5至3倍。因此，本发明提供了一种制备龙芽草属植物的有机溶剂可溶性提取物的方法，该方法包括以下步骤：利用一种有机溶剂提取龙芽草属植物，除去水相后得到一种有机溶剂可溶性部分，该有机溶剂可溶性部分对肝病的预防或治疗效果得到提高。本发明还提供一种用于预防或治疗肝病的含有一种龙芽草属植物的有机溶剂可溶性提取物的药物组合物，该提取物通过以下步骤制得：利用一种有机溶剂提取龙芽草属植物，除去水相后得到一种有机溶剂可溶性部分。本发明还提供了一种供肝病患者食用的含有一种龙芽草属植物的有机溶剂可溶性提取物的食品组合物，该提取物通过以下步骤制得：利用一种有机溶剂提取龙芽草属植物，除去水相后得到一种有机溶剂可溶性部分。
本发明使用的有机溶剂包括，但不限于，醇如乙醇、甲醇、丁醇、异丙醇和乙二醇，卤代烃如二氯甲烷、氯仿和四氯化碳，四氢呋喃，己烷，DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，DMSO(二甲亚砜)，和乙酸乙酯。
乙型肝炎病毒(HBV)，是一种DNA病毒，作为人慢性肝炎和急性肝炎的诱因而具有临床上的重要性。如果慢性肝炎持续的时间长，则能够导致肝硬化和肝细胞癌(Peter J.Grob.疫苗(Vaccine)，16：S11-S16(1998))。由于对HBV表面抗原和包膜抗原的产生、HBV复制和HBV DNA聚合酶活性具有明显的抑制作用，所以本发明的龙芽草属植物的提取物对预防和治疗肝硬化和肝细胞癌以及肝炎非常有用。
另外，本发明的龙芽草属植物的提取物可以以一种药物有效量单独或与一种药用载体、稀释剂或赋形剂结合成为药物组合物用药。本文使用的术语“药物有效量”是指一种足以治疗或预防疾病的量，该量与一种适合于医疗或预防的合理的效益/风险比相称。然而，应当理解为一名医生能够利用他/她的合理医学判断能力来确定龙芽草属植物提取物及其药物组合物的每日剂量。龙芽草属植物提取物及其药物组合物用于一名患者的有效剂量可以根据患者的疾病和发病状态；所使用的提取物的活性；所使用的组合物；患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食；用药时间、用药途径和所用提取物的排泄速率；持续治疗时间；与一种所用提取物结合使用或同时使用的药物；以及医学领域已知的其它因素来确定。例如，本技术领域的技术人员非常了解本发明的提取物应当以低于所需浓度的水平开始用药，然后逐渐加大剂量直到获得理想的治疗效果。
对一名60kg体重的成人来说，龙芽草属植物提取物的药物有效量的有效剂量优选地是以10ml的液体形式每日用药三次，至少持续12个星期，或以20mg干重的片剂或胶囊形式每日用药三次，至少持续12个星期，而且根据使用目的可以重复进行这种用药方式。所述提取物的单位剂量可以根据患者的年龄、体重、健康状况、性别、发病状态和饮食、提取物的用药时间、用药途径和排泄速率等进行适当的改变。
本发明的龙芽草属植物提取物可以通过一种常规的途径，例如以一种口服剂量形式如片剂、胶囊、糖衣片剂或包膜片剂、液体溶液或悬浮液，或者以一种非口服剂量形式如直肠栓剂，或肌内、静脉内和/或鞘内和/或脊柱内注射或输液进行用药。
本发明的龙芽草属植物提取物以一种与一种药用载体、稀释剂或赋形剂结合的药物组合物的形式来提供，该组合物中含有一种特定量的龙芽草属植物提取物。该药物组合物可以通过常规方法被配制成各种药物用药形式，并且以一种药物适用的形式进行用药。例如，用于口服用药的固体制剂可以含有一种稀释剂(例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉)，一种润滑剂(例如，二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或钙和/或聚乙二醇)，一种粘合剂(例如，淀粉、阿拉伯树胶、甲基纤维素明胶、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮)，一种崩解剂(例如，淀粉、藻酸、藻酸盐或淀粉乙醇酸钠)，一种染色剂，一种甜味剂，一种湿润剂(例如卵磷脂，聚山梨醇酯，硫酸月桂酯)和其它本领域中通常使用的药动学非活性物质。通过本技术领域中的普通技术人员熟知的常规方法能够制备龙芽草属植物提取物的药物制剂，例如，通过实施包括混合、造粒、形成片剂和用糖或膜包衣步骤的方法来制备。
作为本发明龙芽草属植物提取物的另一种口服用药方式，可以把龙芽草属植物提取物配制成液体分散液，该分散液通常是糖浆、乳液和悬浮液。乳液和悬浮液可以含有一种载体如天然树胶、琼脂糖、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。
根据使用目的，用于肌内注射的本发明的龙芽草属植物提取物的悬浮液或溶液可以含有一种药用载体如灭菌水、橄榄油、油酸乙酯、乙二醇(例如丙二醇)以及一种活性成分，和一种适量的盐酸利多卡因。用于静脉注射或输液的龙芽草属植物提取物的溶液可以含有作为载体的无菌水，优选地是无菌等渗盐水，或一种丙二醇载体。
龙芽草属植物提取物的用药栓剂可以与活性成分一道含有一种药用载体，所述载体例如是可可脂、聚乙二醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯表面活性剂或卵磷脂。
另外，本发明提供了一种含有一种龙芽草属植物提取物的食品组合物，该组合物在预防和治疗肝病中起辅助作用。所述食品组合物可以以多种食品的形式来提供，所述多种食品形式包括功能性食品、营养补充物、营养物、药用食品、保健食品、营养药物、特制食品和食品添加剂。本技术领域的技术人员能够理解按照本技术领域中通用的方法可以将所述食品组合物制成上述的多种形式的食品。例如，保健食品是被用作民间药物的可饮用茶、汁液、胶冻和保健饮料。另外，功能性食品可以是糖果、酸奶、饼干、黄油、人造黄油等形式。所述食品添加剂可以是粉或浓缩液的形式。所述龙芽草属植物提取物在一种食品中的适宜浓度范围是每100g食品重量约含1至5mg。
本发明将通过下列实施例和附图得到更详细的说明。然而，下列实施例只是用来说明本发明的，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1：由龙芽草属植物制备提取物
将整株欧洲龙芽草、龙芽草、托叶龙芽草和pilosella Satake的托叶龙芽草干燥和粉碎后，将1g被粉碎的产物分别与40ml蒸馏水混合，并在60℃下提取1小时。然后，高速离心每种提取物溶液，并将所得到的上清液通过一种0.2μm的膜进行过滤以除去不溶性组分，由此得到一种提取物。测得每种提取物的干重是2.2mg/ml上清液。
实施例2：龙芽草属植物提取物抑制HBV表面抗原产生的活性测定
实验实施例1：欧洲龙芽草的水溶性提取物抑制HBV表面抗原产生的活性测定
将2，4或6μl的实施例1中制备的欧洲龙芽草的水溶性提取物(2.2mg/ml)加到含有被培养的人肝细胞瘤细胞系PLC/PRF/5的96孔板的每个孔中，该肝细胞瘤细胞系PLC/PRF/5合成和分泌HBV表面抗原(HBsAg)，其中每孔的总体积是100μl。培养48小时后，将100μl的培养基转移到另一个附着了HBV表面抗原(HBsAg)的抗体的96孔板中并于37℃下培养1小时。将25μl缀合了过氧化物酶的表面抗体的溶液加到每个孔中，然后培养30分钟。用磷酸盐缓冲液冲洗五次后，向每孔中补加含有一种过氧化物酶底物的溶液，然后进行显色。利用ELISA读数器在450nm测定所产生溶液的吸光度。将不含欧洲龙芽草水溶性提取物的培养基用作对照组，而将HBV-阳性血清(P.S)和HBV-阴性血清(N.S)用作比较组。
图2给出了结果。如图2所示，发现欧洲龙芽草的水溶性提取物以剂量依赖的方式降低了肝细胞瘤细胞系PLC/PRF/5的培养基中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的水平。
实验实施例2：欧洲龙芽草的水溶性提取物抑制HBV包膜抗原产生的活性测定
将2.2，4.4或8.7μl的实施例1中制备的欧洲龙芽草的水溶性提取物(2.2mg/ml)加到含有被培养的HepG2 2.2.15细胞的96孔板的每个孔中，其中每孔的总体积是100μl。培养48小时后，将100μl的培养基转移到另一个附着了HBV包膜抗原(HBeAg)的抗体的96孔板中并于37℃下培养1小时。将25μl缀合了过氧化物酶的表面抗体的溶液加到每个孔中，然后培养30分钟。用磷酸盐缓冲液冲洗五次后，向每孔中加入含有一种过氧化物酶底物的溶液，然后进行显色。利用ELISA读数器在450nm测定所产生溶液的吸光度。将不含欧洲龙芽草水溶性提取物的培养基用作对照组，而将HBV-阳性血清(P.S)和HBV-阴性血清(N.S)用作比较组。
图3给出了结果。如图3所示，发现欧洲龙芽草水溶性提取物以剂量依赖的方式降低了HepG2 2.2.15细胞的培养基中的乙型肝炎包膜抗原(HBeAg)的水平。
实验实施例3：欧洲龙芽草的水溶性提取物抑制HBV复制的活性测定
在培养皿中培养HepG2 2.2.15细胞后，采用欧洲龙芽草水溶性提取物以25，50，100和200μg的不同量对被培养的HepG2 2.2.15细胞进行处理，然后在37℃下培养3天。以1,200rpm将该培养基离心10分钟。向得到的上清液中补加体积比为10％的聚乙二醇(PEG)，在4℃下培养1小时，然后以3,000rpm离心15分钟。将得到的沉淀物悬浮在一种1％的TNE(10mM Tris-Cl，100mM NaCl，1mM EDTA)的溶液中，进行苯酚提取，然后进行苯酚/氯仿提取以便除去杂质。通过向所述沉淀物中加入100％乙醇，然后在13,000rpm的条件下离心10分钟来收集病毒DNA。将被回收的病毒DNA样品在琼脂糖凝胶上进行电泳以便分析欧洲龙芽草提取物对HBV-DNA水平的影响。
图4给出了结果。如图4所示，发现欧洲龙芽草水溶性提取物以剂量依赖的方式降低了HBV-DNA水平。
实验实施例4：欧洲龙芽草的水溶性提取物抑制HBV聚合酶的活性测定
将1ml的肝炎患者的血液与20％蔗糖混合，然后在100,000×g下离心16小时。弃去上清液后，将沉淀物悬浮在一种100μl的50mMTris和50μl的缓冲液(100mM Tris(pH7.5)，300mM NH4Cl，4mMEDTA，100mM MgCl2，4％β-巯基乙醇，2％NP-40)的混合物中。向得到的悬浮液中补加8μl的每种dATP，dGTP和dTTP以及2μl 32P-标记的dCTP，然后平分到四支试管中。以0，31.25，62.5和125μg的不同量向每支试管中加入欧洲龙芽草水溶性提取物，然后在37℃下进行过夜培养。将反应混合物与10μl的蛋白酶K(10mg/ml)在37℃下反应2小时以便除去聚合酶。此后，通过先后进行苯酚提取和苯酚/氯仿提取以便除去杂质，然后利用异丙醇沉淀DNA。回收被同位素标记的DNA，用70％的乙醇对被沉淀的DNA进行冲洗，干燥并悬浮在蒸馏水中。利用琼脂糖凝胶对所述被同位素标记的DNA样品进行电泳分离，然后利用一个转移试剂盒转移到硝化纤维素(NC)膜上保持3小时。将得到的NC膜曝光于一种X-光胶片，然后将该X-光胶片进行显影。
图5给出了结果。如图5所示，发现欧洲龙芽草水溶性提取物以剂量依赖的方式降低了新合成的HBV-DNA水平，这表明所述提取物具有一种抑制HBV DNA聚合酶活性的活性。
实验实施例5：龙芽草属植物的水溶性提取物抑制HBV表面抗原产生的活性对比测定
分别将2和4μl的欧洲龙芽草、龙芽草、托叶龙芽草和pilosellaSatake的托叶龙芽草的每种提取物溶液(2.2mg/ml)加到含有被培养的人肝细胞瘤细胞系PLC/PRF/5的96孔板的每个孔中，其中每孔的总体积是100μl。培养48小时后，将100μl的培养基转移到另一个附着了HBV表面抗原(HBsAg)的抗体的96孔板中并于37℃下培养1小时。将25μl缀合了过氧化物酶的表面抗体的溶液加到每个孔中，然后培养30分钟。用磷酸盐缓冲液冲洗五次后，向每孔中加入含有一种过氧化物酶底物的溶液，然后进行显色。利用ELISA读数器在450nm测定所产生溶液的吸光度。将不含欧洲龙芽草水溶性提取物的培养基用作对照组。
图6给出了结果。如图6所示，发现龙芽草属的四个种的水溶性提取物都以剂量依赖的方式降低了肝细胞瘤细胞系PLC/PRF/5的培养基中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的浓度，而欧洲龙芽草提取物抑制HBsAg产生的活性最强。
实施例3：提取温度对欧洲龙芽草水溶性提取物抑制HBsAg产生的活性的影响
干燥并粉碎了整株欧洲龙芽草植物后，将1g的该被粉碎的产物与40ml的蒸馏水混合，然后在37，45，55和60℃的不同温度下提取1小时。然后，高速离心每种提取物溶液，并将得到的上清液通过一种0.2μm的膜进行过滤以便除去不溶性组分，从而得到一种提取物。测得每种提取物的干重是2.2mg/ml上清液。将含有2，4或6μl的欧洲龙芽草的每种水溶性提取物(2.2mg/ml)的100μl培养基加到含有被培养的人肝细胞瘤细胞系PLC/PRF/5的96孔板的每个孔中，其中每孔的总体积是100μl。培养48小时后，将100μl的培养基转移到另一个附着了HBV表面抗原(HBsAg)的抗体的96孔板中并于37℃下培养1小时。将25μl缀合了过氧化物酶的表面抗体的溶液加到每个孔中，然后培养30分钟。用磷酸盐缓冲液冲洗五次后，向每孔中加入含有一种过氧化物酶底物的溶液，然后进行显色。利用ELISA读数器在450nm测定所产生溶液的吸光度。将不含欧洲龙芽草水溶性提取物的培养基用作对照组。
图7给出了结果。如图7所示，当在55℃或更高温度下进行提取时，发现欧洲龙芽草的水溶性提取物抑制HBsAg产生的效果得到显著提高。
实施例4：提取时间对欧洲龙芽草水溶性提取物抑制HBsAg产生的活性的影响
干燥并粉碎了整株欧洲龙芽草植物后，将1g的该被粉碎的产物与40ml的蒸馏水混合，然后在25℃下提取3、5和7天。然后，高速离心每种提取物溶液以便除去不溶性组分。将2或4μl的欧洲龙芽草的每种水溶性提取物(2.2mg/ml)加到含有被培养的人肝细胞瘤细胞系PLC/PRF/5的96孔板的每个孔中，其中每孔的总体积是100μl。培养48小时后，将100μl的培养基转移到另一个附着了HBV表面抗原(HBsAg)的抗体的96孔板中并于37℃下培养1小时。将25μl缀合了过氧化物酶的表面抗体的溶液加到每个孔中，然后培养30分钟。用磷酸盐缓冲液冲洗五次后，向每孔中加入含有一种过氧化物酶底物的溶液，然后进行显色。利用ELISA读数器在450nm测定所产生溶液的吸光度。将不含欧洲龙芽草水溶性提取物的培养基用作对照组。
图8给出了结果。如图8所示，当在25℃下提取7天时，发现欧洲龙芽草的水溶性提取物抑制HBsAg产生的效果得到显著提高。
实施例5：利用有机溶剂对欧洲龙芽草进行提取所得到的部分抑制HBsAg产生的活性测定
按照图1所示的提取方法，用甲醇对整株欧洲龙芽草植物(10.015g)进行提取。采用等体积的有机溶剂己烷处理得到的提取物从而将所述提取物分离成一个己烷相(0.145g)和一个水相。通过己烷处理得到的水相再次利用等体积的氯仿进行处理，从而产生一个氯仿相(0.329g)和一个水相。通过氯仿处理得到的水相利用等体积的丁醇进行处理，从而产生一个丁醇相(0.807g)和一个水相(0.462g)。然后，将每一部分彻底干燥，并溶解在一种甲醇溶液中后用于下列实验中。
采用2，5和10μg的每一部分将在96孔板中培养的肝细胞瘤细胞系HepG2 2.2.15处理48小时。然后，将100μl的培养基转移到另一个附着了HBV表面抗原(HBsAg)的抗体的96孔板中并于37℃下培养1小时。将25μl缀合了过氧化物酶的表面抗体的溶液加到每个孔中，然后培养30分钟。用磷酸盐缓冲液冲洗五次后，向每孔中加入含有一种过氧化物酶底物的溶液，然后进行显色。利用ELISA读数器在450nm测定所产生溶液的吸光度。将不含从欧洲龙芽草中获得的部分的培养基用作对照组。
图9给出了结果。其中H，C，B和Aq分别是指己烷部分，氯仿部分，丁醇部分和水部分。如图9所示，发现每一有机溶剂部分降低HbbsAg水平的活性都比水部分降低HbbsAg水平的活性高。
实施例6：利用有机溶剂对欧洲龙芽草进行提取所得到的部分抑制HBeAg产生的活性测定
分别将实施例5中制备的欧洲龙芽草的己烷、氯仿、丁醇和水部分以2，5和10μg的不同量加到含有被培养的HepG22.2.15细胞的96孔板的每个孔中，接着培养48小时。然后，将100μl的培养基转移到另一个附着了HBV包膜抗原(HBeAg)的抗体的96孔板中并于37℃下培养1小时。将25μl缀合了过氧化物酶的表面抗体的溶液加到每个孔中，然后培养30分钟。用磷酸盐缓冲液冲洗五次后，向每孔中加入含有一种过氧化物酶底物的溶液，然后进行显色。利用ELISA读数器在450nm测定所产生溶液的吸光度。将不含从欧洲龙芽草中获得的部分的培养基用作对照组。
图10给出了结果。如图10所示，发现己烷部分(H)，氯仿部分(C)和丁醇部分(B)降低HbbsAg水平的活性比水部分(Aq)降低HbbsAg水平的活性高。
                        工业实用性
如上文所述，本发明的龙芽草属植物的提取物，尤其是欧洲龙芽草的提取物具有明显的预防和治疗肝病的效果。

Claims (7)

1.一种用于预防或治疗肝病的药物组合物，其含有一种药物有效量的欧洲龙芽草提取物。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述提取物是水溶性的。
3.权利要求1所述的药物组合物，其中所述肝病是乙型肝炎、肝硬化或肝细胞癌。
4.权利要求1所述的药物组合物，其中所述提取物是有机溶剂可溶性的。
5.一种用于治疗肝病患者的食品组合物，其含有一种作为有效成分的欧洲龙芽草提取物。
6.一种制备预防或治疗肝病功效得到提高的欧洲龙芽草植物的水溶性提取物的方法，该方法包括以下步骤：
将一种欧洲龙芽草植物进行粉碎；
将被粉碎的产物与水混合；
加热该混合物从而得到一种提取物溶液；和
从该提取物溶液中除去不溶于水的组分从而制成一种水溶性提取物。
7.一种制备预防或治疗肝病功效得到提高的欧洲龙芽草的有机溶剂可溶性提取物的方法，该方法包括以下步骤：
利用一种有机溶剂对欧洲龙芽草进行提取；和
除去水相从而获得一种有机溶剂可溶性部分。
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