KR20210058164A - 아그리모니 추출물의 제조방법 및 그 추출물을 포함하는 간기능 개선용 또는 간질환 치료용 조성물 - Google Patents

아그리모니 추출물의 제조방법 및 그 추출물을 포함하는 간기능 개선용 또는 간질환 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유효성분의 회수율이 증대되고 생체이용률을 증대시키는 아그리모니 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 간기능 개선용 또는 간질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 본 발명은 아그리모니를 사이클로덱스트린을 용해시킨 용매로 추출하여 유효성분의 회수율을 증가시키는 것은 물론 생체이용률이 증가된 아그리모니 추출물 제조방법을 제공하고, 아그리모니 추출물을 포함하는 효능이 증대된 간기능 개선용 건강기능식품 또는 간질환 치료제를 제공한다.

Description

아그리모니 추출물의 제조방법 및 그 추출물을 포함하는 간기능 개선용 또는 간질환 치료용 조성물{Method for Producing Agrimony Extract, and Composition for Improving Liver Function or Treating Liver Desease Containing the Same}
본 발명은 유효성분의 회수율이 증대되고 생체이용률을 증대시키는 아그리모니 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 간기능 개선용 또는 간질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 본 발명은 아그리모니를 사이클로덱스트린을 용해시킨 용매로 추출하여 유효성분의 회수율을 증가시키는 것은 물론 생체이용률이 증가된 아그리모니 추출물 제조방법을 제공하고, 아그리모니 추출물을 포함하는 효능이 증대된 간기능 개선용 건강기능식품 또는 간질환 치료제를 제공한다.
간은 약 삼천억 개가 넘는 간세포로 이루어진 우리 몸에서 가장 큰 장기로, 성인에서는 무게가 1.2~1.5 kg에 달하며 체내 물질을 처리하고 저장하는 중요한 기능을 맡고 있다. 간은 간동맥과 간문맥 양쪽 모두에서 혈액 공급을 받으며, 이 중에서 간문맥은 위와 장에서 흡수한 여러 물질들이 가득 들어 있는 일종의 정맥으로, 이렇게 들어온 영양분은 간에서 가공되어 우리 몸에 필요한 물질이 되고 인체에 해로운 성분은 해독된다. 그리고 소화작용을 돕는 담즙산을 만들며, 면역세포가 있어 우리 몸에 들어오는 세균과 이물질을 제거하는 중요한 일을 하는 장기이다.
일반적인 간세포 보호 효과가 있는 것으로 알려진 성분들로는 글리시리진(glycyrrhizin), 카테킨(catechin), 실리마린(silymarin) 등이 알려져 있는데, 간염 바이러스의 복제를 억제하고 간 보호기능이 우수하다는 결과가 보고되어 있으나, 치료제로서의 개발 가능성이나 사용량이 많은 단점을 가지고 있다.
아그리모니(Agrimonia eupatoria)의 잎은 구형으로 톱니 모양의 테두리를 가지고 있으며, 4 내지 5 쌍의 불규칙하게 얇은 판 형태로 되어 있다. 꽃의 개화는 4 월에 시작하여 10 월까지 지속되며, 열매는 2 개 또는 드물게 하나의 씨를 포함하고 있다. 아그리모니는 류마티스 및 근육 형태의 항염증성, 항염증제, 충혈 완화제, 항알레르기성, 저혈당성, 설사 방지제, 방부제 및 진경제 등의 효능을 나타내어 위장염의 식물 치료제로 사용되며, 간장 염증, 전립선 염 및 양성 전립선 비대, 담낭 질환, 간장 부종, 항응고제, 구강 내 항염증제 (인후염, 편도선염, 염증 및 출혈성 잇몸, 구내염), 알레르기성 비염 및 가려움성 피부염, 결막염 등에도 사용되고 있다.
이와 같이 간세포 보호에 대한 효과에 대한 선행문헌으로 대한민국 등록특허 제10-327762호 및 출원 중인 대한민국 특허출원 제10-2003-0030922호에는 용아초(짚신나물) 속에 속하는 각종 식물이 B형 간염 바이러스 억제 효과를 가짐을 입증함으로써, 짚신나물속 식물의 추출물을 이용한 B형 간염 치료에 효과적인 약제학적 조성물을 개시한 바 있다.
대한민국 등록특허 제10-0327762호는 식물 짚신나물 전초에서 분리한 B형 간염 바이러스의 표면항원 생성을 억제하는 물질, 그 분리방법, 및 간염/간암 치료제 용도에 관한 것으로, 구체적으로, B형 간염 바이러스의 표면항원 생성을 억제할 수 있으므로, B형 간염 바이러스 감염으로 유발된 간염 및 간암을 치료하는데 사용할 수 있다고 보고하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0557015호에서는 약학적으로 유효한 양의 큰등골짚신나물 추출물을 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료에 대해 보고하고 있다. 또한 짚신나물 추출물이 대표적 간 손상 지표인 AST 및 ALT 수치를 회복시킴으로써, 간 기능 보호효과를 나타내는 것을 개시하고 있다 (Korean Journal of Pharmacognosy 37.1 (2006): 28.). 간 기능 보호에 대한 특허로 대한민국 공개특허 제2011-0010601호에서는 부작용이 없으면서 간독성의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 아그리모니 유래의 페놀산계 및 플라보노이드계 화합물 또는 이의 염과, 이를 포함하는 간보호용 조성물에 관한 것으로, 아그리모니 유래의 페놀산계 및 플라보노이드계 화합물들은 사염화탄소로 독성을 유발한 인간 유래의 간세포주인 HepG2 세포들에 대해 세포 생존율을 상승시키고 간세포에 대한 독성을 감소시킬 수 있어, 부작용이 없으면서 간보호 효능을 가지고 있다고 보고하고 있다.
용아초의 간세포 보호 활성에 관여하는 유효성분은 Korean Journal of Pharmacognosy 37.1 (2006): 28에서 제시되고 있는데, 이소퀘르시트린 (isoquercitrin), 퀘르시트린(quercitrin), 루테올린-7-0-글루쿠로니드(luteolin-7-O-glucuronide), 아스트라갈린(astragalin), 루틴(rutin) 등 9종의 유효화합물이 보고되고 있다. 이 중 isoquercitrin은 간보호 효능을 나타내는 어성초, 노각, 오이 등에 함유되어 있으며, 흰쥐(Rat)를 활용한 동물 실험에서도 간 손상 지표인 AST 및 ALT 수치를 회복시킴으로써, 간 기능 보호효과를 나타내는 것을 확인하였다 (Oncotarget, 2017, Vol. 8, (No. 60), pp: 101545-101559). isoquercitrin의 이성질체인 qurecitrin 및 Luteolin-7-O-glucuronide도 간보호 효능에서 탁월한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으며, 선행특허 및 문헌 등에서 간보호 효과가 우수한 것으로 보고되고 있다.
사이클로덱스트린(cyclodextrin)은, 당이 환상형태로 결합된 올리고당으로, 환상 원형의 내측에는 소수성(hydrophobic), 외부로는 친수성(hydrophilic)을 띤다. 이 때문에 사이클로덱스트린은 올리고당으로서의 기능보다는 hydrophobic 물질의 포접에 사용하여 용해도를 증가시키고, 생체이용률을 증대시키며, 포접물질의 안정성 증대를 위한 목적으로 많이 사용하고 있다. 최근에는 포접성을 높이기 위해 결합된 당에 분자구조를 변형시켜 포접능력과 안정화 능력을 개선하는 기술도 사용되고 있다.
사이클로덱스트린은 몇 개의 당이 환상형태를 구성하는가에 따라 알파, 베타, 감마사이클로덱스트린으로 구성되는데, 포접가능 화합물은 3차원적 크기에 따라 제한이 있게 된다. 따라서 다양한 화합물을 포함하고 있는 천연물을 포접하기 위한 최적의 사이클로덱스트린을 선택하는 것은 용이한 일이 아니다.
한편 포접물을 이용한 생체이용률의 증대는 선행특허 등에서 많이 알려진 것이지만, 추출물을 포접하기 위해서는 추출물을 다시 재용해 시키고 이를 적당한 pH로 조정한 후 가온하고 안정화시키는 작업이 반복되어야하므로 공정시간과 비용이 많이 증가되게 된다.
간에 대한 효능을 나타내는 아그리모니 추출물의 경우 단순한 물 추출이거나 물과 주정의 혼합에 의한 단순 용매 추출방법인데, 효능을 나타내는 물질들의 상당수가 물에는 녹지 않기 때문에 이를 회수하기 위해서는 과도하게 온도를 상승시키거나 물 이외의 용매 비율을 높여야하는 단점이 있다. 또한 단순한 추출물의 경우, 수 난용성 성분들이 가열추출 후 냉각시 응집이 발생하거나 추출잔사에 흡착되는 경우가 발생한다.
물 또는 C1~C4 저급알콜 혼합용액에 사이클로덱스트린을 일정비율 먼저 용해시킨 후 포접 추출을 할 경우, 유효 지표성분이 포접되어 생체이용률이 높아지고 기존 추출물 대비 같은 용량에서 생체 효능까지 높아진다는 것을 발견하였다. 여기에 더하여 일반 추출의 경우 여러 유효성분들이 추출잔사에 재부착하거나 추출물에서의 높은 농도로 인한 추출효율의 저하가 있을 수 있는데, 추출과 동시에 사이클로덱스트린에 포접되어 수용화가 증대되어 결과적으로 추출 수율까지 증대된다 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 포접 추출을 통해 수율을 향상시키고, 간기능 개선 유효성분의 회수율을 증가시키며, 생체이용률이 증대되는 아그로모니 추출물의 제조방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 아그로모니 포접 추출물로부터 분리된 유효성분들과 이를 포함하는 아그로모니 포접 추출물이 ALT, AST, ALP 수치 등의 간기능 평가 지표 및 간 조직병리학적 분석을 통한 간세포 손상 보호 효과에 대해 효능이 증대된 식품 조성물 또는 약학 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 일 양태를 따르면, 본 발명은 a) 사이클로덱스트린(cyclodextrin)을 포함하는 유기용매를 사용하여 아그리모니로부터 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 아그리모니 추출물의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 수득하는 단계는 a-1) 유기용매에 사이클로덱스트린을 첨가하여 추출용매를 준비하는 단계; 및 a-2) 상기 추출용매에 아그리모니를 첨가하여 추출물을 수득하는 단계를 포함한다.
상기 a-1) 단계는 유기용매에 사이클로덱스트린을 첨가한 후 20 내지 100℃에서 3 내지 8시간 동안 가열하여 추출용매를 준비하는 것일 수 있다.
상기 유기용매는 당업계에 공지된 C1~C4 저급 알코올을 제한 없이 사용할 수 있으며, 1종 이상의 용매를 혼합하여 사용할 수 있다. 유기용매의 일례로는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올, 2-부탄올 및 3-부탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는, 에탄올 또는 발효주정일 수 있다.
상기 사이클로덱스트린은 알파사이클로덱스트린, 베타사이클로덱스트린 및 감마사이클로덱스트린으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는, 감마사이클로덱스트린일 수 있다. 이때, 사이클로덱스트린은 a-2) 단계의 아그리모니 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 50 중량부일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 40 중량부, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 30 중량부일 수 있다.
상기 사이클로덱스트린의 용해 온도는 20 내지 100℃일 수 있으며, 바람직하게는 60 내지 90℃일 수 있다. 이때, 사이클로덱스트린의 유기용매에 대한 용해도를 증가시키기 위해, 적절하게 pH를 조절할 수 있다.
상기 a-2) 단계는 추출용매에 아그리모니를 첨가한 후 20 내지 100℃에서 1 내지 40시간 동안 추출하여 추출물을 수득하는 것일 수 있다.
상기 추출 조건에서, 온도는 20 내지 100℃일 수 있으며, 바람직하게는 알코올 또는 물의 끓는점에 비해 낮은 40 내지 90℃일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 60 내지 80℃일 수 있다. 시간은 1 내지 40시간일 수 있으며, 온도에 따라 시간이 달라질 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 24시간, 더욱 바람직하게는 3 내지 10시간일 수 있다.
상기 아그리모니는 용아초 또는 짚신나물이라고도 하며, 추출물을 얻기 위해 아그리모니의 뿌리, 줄기, 잎 및 이를 포함한 전초를 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하게는, 아그리모니의 전초일 수 있다. 이때, 아그리모니는 가공하지 않은 원재료이거나 건조한 상태, 또는 이들을 혼합한 상태일 수 있으며, 유효성분을 효율적으로 추출할 수 있도록 잘게 분쇄한 상태일 수 있다. 아그리모니는 추출용매 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 50 중량부일 수 있으며, 바람직하게는 0.05 내지 30 중량부, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10 중량부일 수 있다.
상기 추출물은 아그리모니에서 분리된 유효성분(활성성분)을 포함하며, 특히 아그리모니의 난용성 성분을 포함할 수 있다. 이러한 유효성분 성분의 일례로는 이소퀘르시트린, 퀘르시트린, 루테올린-7-O-글루쿠로니드, 아스트라갈린, 루틴, 아피제닌-7-O-글루쿠로니드(apigenin-7-O-β-D-glucuronide) 등일 수 있으며, 바람직하게는 이소퀘르시트린, 퀘르시트린, 루테올린-7-O-글루쿠로니드 및 아스트라갈린으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 이때, 추출물은 포접체 함량으로서 유효 지표성분인 루테올린-7-O-글루쿠로니드를 0.1 내지 5 중량%로 포함할 수 있다.
상기 a) 단계 이후, b) 상기 추출물을 여과하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 b) 단계는 당업계에 공지된 여과 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 추출물 내 불순물을 제거하기 위해 1회 이상 반복 수행될 수 있다. 여과 방법의 일례로는 필터프레스, 원심분리기, 여과지 등을 사용할 수 있다. 이때, 추출물로부터 여과액과 여과 후 남은 고형물인 여과 잔여물을 분리할 수 있다.
상기 b) 여과하는 단계 이후, 추출물로부터 분리된 여과 잔여물을 재사용하여 추출물을 더 수득할 수 있다. 구체적으로는, b') 사이클로덱스트린을 포함하는 유기용매를 사용하여 여과 잔여물로부터 추출물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 사이클로덱스트린 및 유기용매는 전술한 바와 같으며, 추출물을 수득하는 단계 또한 전술한 바와 같다. 이러한 b') 단계는 1회 이상 반복 수행될 수 있다. 여과 잔여물로부터 수득된 추출물 (2차 추출물)은 b') 단계의 여과액 (1차 추출물)과 혼합하여 이후 과정에서 사용될 수 있다.
상기 a) 단계 이후, c) 상기 추출물을 농축하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또는, 상기 b) 단계 또는 b') 단계 이후, c) 상기 추출물을 농축하는 단계를 수행할 수 있다.
상기 c) 단계는 추출용매를 증발시키고 고형분의 농도를 증가시키기 위해 당업계에 공지된 농축 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 농축 방법의 일례로는 감압농축, 한외여과, 원심분리 등일 수 있다.
상기 a) 단계 이후, d) 상기 추출물을 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또는, 상기 c) 단계 이후, d) 상기 추출물을 건조하는 단계를 수행할 수 있다.
상기 d) 단계는 당업계에 공지된 건조 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 건조 과정을 통해 추출물을 분말화할 수 있다. 건조 방법의 일례로는 동결건조, 진공건조, 분무건조, 열풍건조 등일 수 있다. 바람직하게는, 분말의 함습도가 10%를 초과하지 않는 것일 수 있다.
상기 방법으로 제조된 아그리모니 추출물은 추출 수율이 20% 이상일 수 있으며, 종래 방법으로 제조된 아그리모니 추출물에 비해 수율 및 생체이용률이 증대된 특성을 가지며, 보다 낮은 용량으로도 간기능 손상 지표인 ALT, AST 등 수치를 개선시킴으로써 간기능 개선 효능을 발휘할 수 있다.
따라서, 상기 아그리모니 추출물은 간기능 개선용 식품 조성물 또는 간질환 치료용 약학 조성물로 이용될 수 있다. 이때, 조성물 내 추출물의 유효성분 함량이 건조 중량 당 0.01 내지 20%일 수 있으며, 바람직하게는 0.03 내지 10%일 수 있다. 예를 들면, 유효 지표성분으로 루테올린-7-0-글루쿠로니드의 함량이 건조 중량 당 0.01 내지 20%일 수 있으며, 바람직하게는 0.03 내지 10%일 수 있다.
상기 식품 조성물 또는 약학 조성물의 용도로 사용가능한 추출물의 용량은 성인 기준 20 내지 1000 mg/day일 수 있으며, 바람직하게는 40 내지 500 mg/day, 경제성을 고려하여 더욱 바람직하게는 80 내지 250 mg/day일 수 있다. 상기 식품 조성물 또는 약학 조성물에 대한 아그리모니 추출물은 최종 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 100 중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.05 내지 90.0 중량%일 수 있다.
상기 간기능 개선용 식품 조성물은 식품 첨가제 또는 기능성 식품에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있으며, 일례로 용액, 유탁액, 점성형 혼합물, 분말, 과립, 정제, 캡슐 등일 수 있다. 이때, 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어뜨리지 않는 범위 내에서 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 이러한 첨가제들의 배합량은 제형 또는 사용 목적에 따라 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들면, 식품 조성물의 전체 중량을 기준으로, 첨가제 0.01 내지 5 중량%, 보다 구체적으로는 0.1 내지 3 중량%일 수 있다.
상기 간질환 치료용 약학 조성물은 의약품에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있으며, 일례로 고체, 반고체 또는 액상 형태의 경구 투여제 또는 비경구 투여제일 수 있다. 경구 투여를 위한 제제는 정제, 환제, 과립제, 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제, 시럽제, 펠렛제 등일 수 있다. 비경구 투여 위한 제제는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 등일 수 있다. 이때, 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어뜨리지 않는 범위 내에서 담체, 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 이러한 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 등으로 투여될 수 있다. 약학 조성물의 유효성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 1일 투여 용량은 0.01 내지 100 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 50 mg/kg일 수 있다.
본 발명에 따르면 간기능 개선에 효과적인 유효화합물의 회수율이 증가된 아그리모니 추출물을 제조할 수 있다. 또한 신규 방법으로 아그리모니 추출물 제조시 사이클로덱스트린의 포접을 위해 추가적인 공정을 도입할 필요 없이 경제적으로 유효성분이 포접된 추출물을 제공할 수 있다. 또한 이렇게 제조된 추출물은 생체이용률이 높아져 보다 적은 용량에서 ALT, AST, ALP 등의 간기능 평가 지표의 개선을 확인하고, 간 조직병리학적 분석을 통한 간세포 손상 보호 효과를 확인함으로써 간기능 개선에 대해 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 양태에 따라 간기능 개선 유효성분의 회수율을 증가시키는 신규 아그리모니 추출물의 제조방법을 나타낸 공정도이다.
도 2는 본 발명의 준비예 1에 따른 사이클로덱스트린 종류별 포접 추출물의 유효 지표성분인 루테올린-7-O-글루쿠로니드의 Caco-2 세포 흡수율 실험 결과이다.
도 3은 본 발명의 준비예 1에 따른 사이클로덱스트린 종류별 침전물 및 고형분 회수 결과이다; (a)는 0.5% 수용액을 2시간 정치한 후 침전물을 육안으로 비교한 사진이고, (b)는 상등액을 원심분리하여 고형분을 건조시킨 후 건조된 투입한 시료 무게에 대한 백분율로 고형분 회수율을 계산한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 준비예 1에 따른 추출물의 지용성 물질에 대한 수화도 증가를 HPLC로 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 준비예 2에 따른 사이클로덱스트린 농도 및 포접 추출 온도 조건의 수득률 결과이다.
도 6은 본 발명의 준비예 2에 따른 사이클로덱스트린 농도 및 포접 추출 온도 조건별 포접 추출물의 유효 지표성분인 루테올린-7-O-글루쿠로니드의 Caco-2 세포 흡수율 실험 결과이다.
도 7은 본 발명의 준비예 2에 따른 사이클로덱스트린 농도 및 포접 추출 온도 조건 결과이다; (a)는 0.5% 수용액을 2시간 정치한 후 침전물을 육안으로 비교한 사진이고, (b)는 상등액을 원심분리하여 고형분을 건조시킨 후 건조된 투입한 시료 무게에 대한 백분율로 고형분 회수율을 계산한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실험예 1에 따른 아그리모니 추출물의 간 손상 지표인 AST, ALT 측정을 수행한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실험예 1에 따른 아그리모니 추출물의 간손상 보호 효과 분석 사진으로, 흰쥐 간의 조직병리학적 검사를 수행한 결과이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하며 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
준비예 1. 사이클로덱스트린 종류 선정
사이클로덱스트린 종류별 아그리모니 포접 추출물을 제조하기 위해 (주)지유본초를 통해 구입한 아그리모니 잎을 사용하였다.
구체적으로, 아그리모니 잎의 이물질을 제거하고, 50% 발효 주정에 각각 대조군으로 덱스트린 및 처리군으로 알파사이클로덱스트린, 베타사이클로덱스트린, 감마사이클로덱스트린을 액량 대비 0.13% (원재료 대비 2%) 첨가하여 용해액을 제조하였다. 아그리모니 시료 50 g에 제조된 각 용해액을 시료 무게의 15배 첨가하여 80℃에서 300 rpm으로 5시간 교반 추출한 후 filter paper에 1차 걸러냈다. 여과 잔여물에 새로운 각각의 덱스트린 또는 사이클로덱스트린 용해액을 14배 첨가하여 80℃에서 300 rpm으로 5시간 교반 추출하여 filter paper에 거른 후 여과액을 1차 추출물과 합하여 60℃에서 감압농축 한 뒤 동결 건조하여 최종 추출물을 제조하였다.
1-1. 수율 및 함량 측정
추출 수율은 동결 건조시킨 중량을 추출물 제조에 사용한 시료의 무게에 대한 백분율로 계산하였다.
제조된 아그리모니 추출 분말 (대조군) 및 포접 분말 (처리군)의 유효성분인 Luteolin-7-O-glucuronide의 함량을 측정하기 위하여 고성능 액체크로마토그래피 (Infinity 1260, Agilent, USA)를 사용하였고, 컬럼은 X Select HSS C18 Column, Waters (4.6*250 mm, 5 μm particle size)을 사용하였으며, 검출 스펙트럼은 UV 350 nm에서 측정하였다. 이동상 A는 0.1% 인산을 함유한 증류수를 사용하였고, 이동상 B는 100% ACN을 사용하였다. 시간에 따른 이동상의 조건은 0~20분에 이동상 A를 90%으로 유지하고, 20~35분에 이동상 A를 90%에서 88%, 35~60분에 이동상 A를 88%으로 유지하고, 60~70분에 88%에서 70%, 70~72분에 70%에서 20%, 72~75분에 20%로 유지하고, 75~76분에 20%에서 90%, 76~90분에 90% 유지로 분석하였고, 유속은 1.6 ㎖/min, 시료량은 5 ㎕로 하였다. 표준물질 제조는 유효성분 및 전구체 표준품 20 ㎎을 20 ㎖ 용량 플라스크에 넣고 DMSO에 녹여 표준용액으로 하고 농도별로 희석하여 분석 후 검량선을 작성하여 각 유효성분의 함량을 측정하였다. 검액 제조는 시료 500 mg을 50 ml 용량 플라스크에 넣고 70% MeOH에 녹여 초음파로 진탕하고 0.45 ㎛ 필터 여과 후 유효성분인 Luteolin-7-O-glucuronide 함량을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타냈다.
　 대조군(Con) α-CD β-CD γ-CD
실제 수율
(%)		 22.7 23.2 22.0 24.6
유효성분 함량
(mg/g)		 6.5 6.7 6.1 7.1
수득률(수율X함량) 147.4 155.2 134.0 174.9
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 감마사이클로덱스트린을 첨가한 용매로 추출하였을 때, 대조군에 비해 수율 및 함량이 증가하는 경향으로 나타났으며, 특히 수득률이 대조군 대비 18%가 증가한 것으로 확인되었다.
1-2. 생체이용률 측정
아그리모니 포접 추출물의 흡수율을 평가하기 위해, Caco-2 세포를 이용하여 측정하였다.
먼저, Caco-2 세포를 Trans-well에 접종하고 20% FBS를 포함하는 MEM 배지를 사용하여 배양을 진행한 후 막이 형성될 때까지 MEM 배지를 교체하며 배양하였다. 아그리모니 추출물을 배지에 녹여 insert well에 투입한 후 30분 후에 basolateral well의 배지를 수득하였다. 각각 수득한 배지를 HPLC 분석을 통해 insert well에서 basolateral well로 이전된 값을 측정하여 흡수율 평가를 수행하였다. 그 결과는 도 2에 나타냈다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 모든 실험군이 Control군에 비해 Caco-2 cell 흡수율이 높았으며, 특히, 감마사이클로덱스트린으로 포접 추출한 군의 흡수율은 약 18%로 알파 또는 베타사이클로덱스트린 실험군에 비해 약 3배 이상 증가된 것으로 확인되었다.
1-3. 수용화도 측정
사이클로덱스트린 종류별 아그리모니 포접 추출물 각각 1 g을 50 mL 정제수에 용해하고 상온에서 4000 rpm으로 20분간 원심분리하였다. 원심분리한 용액의 상등액을 수득하여 동결건조기를 이용하여 건조하였다. 건조된 시료의 무게를 측정하고, 회수율은 상등액을 건조시킨 시료 중량에서 투입한 시료 무게에 대한 백분율로 계산하였다. 그 결과는 도 3에 나타냈다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 감마사이클로덱스트린으로 포접 추출한 군의 침전물이 대조군에 비해 적은 것으로 확인되었고, 고형분 회수율이 대조군의 고형분 회수율에 비해 유의적으로 높은 것으로 확인되었다.
1-4. HPLC 측정
제조된 아그리모니 추출 분말 및 포접 분말의 지용성 물질 구간의 수용화도를 측정하기 위하여 고성능 액체크로마토그래피 (Infinity 1260, Agilent, USA)를 사용하여, 1-1.과 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과는 도 4에 나타냈다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 감마사이클로덱스트린으로 포접 추출한 군의 지용성 성분의 수용화도는 대조군에 비해 증가한 것으로 확인되었다.
1-5. 유효 지표성분 포접체로서의 함량 분석
사이클로덱스트린 포접체의 경우 비포접체에 비해 낮은 pH에서도 수용성이 유지된다는 사실이 이미 많은 문헌과 특허에서 증명된 바, 제조된 아그리모니 추출 분말 (대조군) 및 포접 분말 (처리군)의 유효 지표성분인 Luteolin-7-O-glucuronide의 포접체로서의 함량을 측정하기 위하여 각 포접 추출 분말 100 g을 정제수 1 L 에 용해시킨 후 2N HCl을 첨가하여 pH를 2.7로 맞추어 상온에서 4000 rpm으로 20분간 원심분리하여 침전물과 상등액을 각각 취하였다. 상등액을 농축하여 동결 건조하였고, 침전물을 정제수로 희석하여 동결 건조하였다. 각각의 건조된 시료의 무게를 측정하고, 수득량을 계산하였다. 수득량 계산 방법은 상등액과 침전물로부터 수득된 각각의 건조 시료 중량에서 최초 투입한 시료 무게 비로 계산하였다.
수득된 상등액 및 침전물의 건조 분말 내 유효 지표성분인 루테올린-7-O-글루쿠로니드 함량을 고성능 액체크로마토그래피 (Infinity 1260, Agilent, USA)를 사용하여, 1-1.과 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타냈다.
　 　 Control α-CD β-CD γ-CD
침전물
(비포접체)		 침전물 총 수득량
(g)		 71 59 62 32
침전물 내 루테올린-7-O-글루쿠로니드 함량
(mg/g)		 7.7 7.9 6.5 6.5
침전물의 루테올린-7-O-글루쿠로니드 수득량 545.6 466.9 404.4 206.6
상등액
(포접체)		 상등액 수득량
(g)		 29 41 38 68
상등액 내 루테올린-7-O-글루쿠로니드 함량
(mg/g)		 3.6 5.3 4.9 8.3
상등액 루테올린-7-O-글루쿠로니드 수득량 104.4 217.3 186.2 564.4
포접률
계산		 포접률
(상등액 루테올린-7-O-글루쿠로니드 수득량/전체 수득량*100)		 16.1 31.8 31.5 73.2
표 2에 나타낸 바와 같이, 감마사이클로덱스트린으로 포접 추출물의 포접률이 Control에 비해 5배 이상 높았으며, 포접된 유효 지표성분 (루테올린-7-O-글루쿠로니드)의 함량도 2배 이상 증가한 것으로 확인되었다.
위 실험들을 통해 감마사이클로덱스트린 용해액의 사용이 아그리모니의 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있다는 것을 확인하여 이후 실험에서는 감마사이클로덱스트린을 사용하였다.
준비예 2. 사이클로덱스트린 농도 및 포집 추출 온도 설정
감마사이클로덱스트린의 농도와 포접 추출 온도를 선정하기 위해 다음 실험을 수행하였다. 감마사이클로덱스트린의 사용량은 원재료 (아그리모니 잎) 무게 대비 0%, 2%, 4%이며, 포접 추출 온도는 60℃, 70℃, 80℃의 조건이였다.
구체적으로, 아그리모니 잎의 이물질을 제거하고, 50% 발효 주정에 덱스트린 및/또는 감마사이클로덱스트린 (하기 표 3 참조)을 첨가하여 용해액을 제조하였다. 아그리모니 시료 50 g씩을 3개의 Bottle에 각각 첨가하고, 제조된 용해액을 시료 무게의 15배 첨가하여 각각 60℃, 70℃, 80℃에서 300 rpm으로 5시간 교반 추출한 후 filter paper에 1차 걸러냈다. 여과 잔여물에 동일한 새로운 용해액을 14배 첨가하고 각 bottle의 1차 추출 온도와 같은 온도인 60℃, 70℃, 80℃에서 300 rpm으로 5시간 교반 추출하여 filter paper에 거른 후 여과액을 1차 추출물과 합하여 60℃에서 감압농축 한 뒤 동결 건조하여 최종 추출물을 제조하였다.
2-1. 수율 및 함량 측정
추출 수율은 동결 건조시킨 중량을 추출물 제조에 사용한 시료의 무게에 대한 백분율로 계산하였다.
제조된 아그리모니 추출 분말 (대조군) 및 포접 분말 (처리군)의 유효성분인 Luteolin-7-O-glucuronide의 함량을 측정하기 위하여 고성능 액체크로마토그래피 (Infinity 1260, Agilent, USA)를 사용하였고, 1-1.과 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과는 하기 표 3 및 도 5에 나타냈다.
　 γ-CD 0% γ-CD 2% γ-CD 4%
용해액 덱스트린* 0.26% 0.13% -
감마사이클로덱스트린* - 0.13% 0.26%
수득률
(수율X함량)		 60℃** 134.1 188.8 168.5
70℃** 141.2 177.0 160.9
80℃** 147.7 174.8 165.2
* 액량 대비 각각 덱스트린 및/또는 감마사이클로덱스트린의 사용량
** 포접 추출 온도
상기 표 3 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 감마사이클로덱스트린 농도 2%에서 60℃로 추출하였을 때, 수득률이 가장 높은 것으로 확인되었다.
2-2. 생체이용률 측정
아그리모니 포접 추출물의 흡수율을 평가하기 위해, Caco-2 세포를 이용하여 1-2.와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과는 도 6에 나타냈다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 감마사이클로덱스트린 농도 2%에서 60℃로 추출하였을 때, 생체이용률이 가장 높은 것으로 확인되었다.
2-3. 수용화도 측정
포접 조건별 아그리모니 포접 추출물 각각 2.5 g을 사용하여 1-3.과 동일한 방법으로 회수율을 계산하였다. 그 결과는 도 7에 나타냈다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 감마사이클로덱스트린 농도 2%에서 60℃로 추출하였을 때, 고형분 회수율이 가장 높은 것으로 확인되었다.
위 실험들을 통해 감마사이클로덱스트린 농도를 원재료 대비 2%, 포접 추출 온도를 60℃로 설정하여 이후 실험들을 수행하였다.
실시예 1. 아그리모니 포접 추출물의 제조
최적화된 아그리모니 포접 추출물을 제조하기 위해 (주)지유본초를 통해 구입한 아그리모니 잎을 사용하였다.
구체적으로, 아그리모니 잎의 이물질을 제거하고, 50% 발효 주정에 감마사이클로덱스트린을 액량 대비 0.13% (원재료 대비 2%) 첨가하여 감마사이클로덱스트린 용해액을 제조하였다. 아그리모니 시료 50 g에 제조된 감마사이클로덱스트린 용해액을 시료 무게의 15배 첨가하여 60℃에서 300 rpm으로 5시간 교반 추출한 후 filter paper에 1차 걸러냈다. 여과 잔여물에 새로운 감마사이클로덱스트린 용해액을 14배 첨가하여 60℃에서 300 rpm으로 5시간 교반 추출하여 filter paper에 거른 후 여과액을 1차 추출물과 합하여 60℃에서 감압농축 한 뒤 동결 건조하여 최종 추출물을 제조하였다. 추출 수율은 25.93%로 동결 건조시킨 중량에서 추출물 제조에 사용한 시료의 무게에 대한 백분율로 계산하였다.
비교예 1. 아그리모니 추출물의 제조
아그리모니 추출물을 제조하기 위해 (주)지유본초를 통해 구입한 아그리모니 잎을 사용하였다.
구체적으로, 아그리모니 잎의 이물질을 제거하고, 50% 발효 주정에 덱스트린을 액량 대비 0.13% (원재료 대비 2%) 첨가하여 덱스트린 용해액을 제조하였다. 아그리모니 시료 50 g에 덱스트린 용해액을 시료 무게의 15배 첨가하여 80℃에서 300 rpm으로 5시간 교반 추출한 후 filter paper에 1차 걸러냈다. 여과 잔여물에 새로운 덱스트린 용해액을 14배 첨가하여 80℃에서 300 rpm으로 5시간 교반 추출하여 filter paper에 거른 후 여과액을 1차 추출물과 합하여 60℃에서 감압농축 한 뒤 동결 건조하여 최종 추출물을 제조하였다. 추출 수율은 22.68%로 동결 건조시킨 중량을 추출물 제조에 사용한 시료의 무게에 대한 백분율로 계산하였다.
실험예 1. 아그리모니 추출물의 간손상 보호 효과 분석
실험동물은 6~7주령 Sprague-Dawley계 흰쥐(rat)를 사용하여 실내온도 22±2℃에서 사육하며 실험하였다. 실험을 위해 비슷한 체중을 가진 흰쥐를 4 그룹(group)으로 분류하여 사염화탄소(CCl4)를 처리하지 않는 군을 양성대조군으로, CCl4만 처리한 군을 음성대조군으로, 비교예 1의 아그리모니 추출 분말 50 mg/kg을 처리한 군과 실시예 1의 아그리모니 포접 추출 분말 50 mg/kg를 처리한 군을 실험군으로 설정하였다. 실험식이 공급은 자유음수로 제공하였으며 각각의 그룹은 하루에 한번씩 일정한 시간에 바꿔주며 섭취량을 기록하였다.
아그리모니 추출 분말과 포접 추출 분말의 급성 간독성 예방효과 및 항산화 효과를 알아보기 위해, 일주일을 주기로 1주간 실험식이를 공급 (대한민국 공개특허 제10-2012-0108797호 참조) 한 후 마지막 1주째에 CCl4를 투여, 24시간 절식 후 희생하였다. CCl4 투여량은 10% CCl4를 올리브 오일(olive oil)과 1:1로 섞어 1 ㎖/㎏으로 계산하여 투여하였다. 절식시킨 후, 복부대동맥에서 채혈하였으며 채혈한 혈액은 즉시 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 분석시료로 사용하였다. 또한 간과 신장 및 심장, 지라는 채혈 후 즉시 적출하여 생리식염수에 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 중량을 측정한 후, -70℃에 냉동 보관하였다.
혈청에서의 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase) 측정은 복부대동맥에서 채혈한 혈액을 즉시 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 AST 및 ALT 분석시료로 사용하였다. 그 결과는 표 4 및 도 8에 나타냈다.
　 CON CCL4 비교예 1 실시예 1
AST
(IU/L)		 105.3 573.4 416.0 321.5
ALT(IU/L) 35.6 547.3 391.8 306.7
표 4 및 도 8에 나타낸 바와 같이, AST 및 ALT 수치에서 대조군 (CON)에 비해 아그리모니 추출 분말 (비교예 1)을 처리한 군에서 낮아지는 경향을 보였고, 특히 아그리모니 포접 추출 분말 (실시예 1)을 처리한 군에서 현저히 낮은 것을 확인하였다.
아그리모니 추출 분말과 포접 추출 분말의 급성 간독성 예방효과 및 항산화 효과를 알아보기 위해 간조직병리학적 검사를 진행하였고, 그 결과는 도 9에 나타냈다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 각 그룹의 실험동물 간의 조직병리학적 검사를 수행한 결과, 사염화탄소만 처리한 대조군 (CCl4)의 간 조직에서 세포 파열(cell disruption)과 담관 증식(bile duct proliferation)을 포함한 간 손상의 급격한 변화를 확인할 수 있었다. 반면 아그리모니 추출 분말 (비교예 1)을 처리한 군에서 약간의 손상이 보였지만 대조군과 비슷하였고, 특히 아그리모니 포접 추출 분말 (실시예 1)을 처리한 군에서 거의 대조군과 같은 조직 소견을 보였다.

Claims (14)

  1. a) 사이클로덱스트린(cyclodextrin)을 포함하는 추출용매를 사용하여 아그리모니로부터 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 아그로모니 추출물의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 a) 단계는,
    a-1) 유기용매에 사이클로덱스트린을 첨가하여 추출용매를 준비하는 단계; 및
    a-2) 상기 추출용매에 아그리모니를 첨가하여 추출물을 수득하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 a-1) 단계는 유기용매에 사이클로덱스트린을 첨가한 후 20 내지 100℃에서 3 내지 8시간 동안 가열하여 추출용매를 준비하는 것인 방법.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 a-1) 단계의 유기용매는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, n-부탄올, 이소-부탄올, 2-부탄올 및 3-부탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상 것인 방법.
  5. 청구항 2에 있어서,
    상기 a-1) 단계의 사이클로덱스트린은 알파사이클로덱스트린, 베타사이클로덱스트린 및 감마사이클로덱스트린으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 방법.
  6. 청구항 2에 있어서,
    상기 a-1) 단계의 사이클로덱스트린은 a-2) 단계의 아그리모니 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 40 중량부인 방법.
  7. 청구항 2에 있어서,
    상기 a-2) 단계는 추출용매에 아그리모니를 첨가한 후 20 내지 100℃에서 1 내지 40시간 동안 추출하여 추출물을 수득하는 것인 방법.
  8. 청구항 2에 있어서,
    상기 a-2) 단계의 아그리모니는 추출용매 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 50 중량부인 방법.
  9. 청구항 2에 있어서,
    상기 a-2) 단계의 추출물은 난용성 성분을 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 2에 있어서,
    상기 a-2) 단계의 추출물은 포접체 함량으로서 유효 지표성분인 루테올린-7-O-글루쿠로니드를 0.1 내지 5 중량%로 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 a) 단계 이후, b) 상기 추출물을 여과하는 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 b) 단계 이후, b') 사이클로덱스트린을 포함하는 유기용매를 사용하여 여과 잔여물로부터 추출물을 수득하는 단계를 더 포함하는 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 추출물을 포함하는 간기능 개선용 식품 조성물.
  14. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 추출물을 포함하는 간질환 치료용 약학 조성물.
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