KR100847225B1 - 사이클로 덱스트린의 분자 인식 기능을 이용한이소플라본의 추출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이소플라본 함유 식물체로부터 이소플라본을 선택적으로 추출해 내는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특징은 베타 사이클로덱스트린 또는 각종 사이클로 덱스트린 유도체의 분자 인식 기능을 활용하여 이소플라본 함유 식물체로부터 이소플라본을 선택적으로 결합시켜 고함량의 이소플라본을 얻는데 있다. 본 발명에 따르면 기존의 이소플라본 추출에 사용되는 유기용매법에 비해 공정이 단순하며, 열수 추출법에 비해 고함량의 이소플라본을 얻을 수 있을 뿐 아니라 컬럼에 흡착하여 분리하는 복잡한 분리공정이 필요 없기 때문에 공정이 매우 간단하다는 장점이 있다.

이소플라본, 사이클로 덱스트린, 결합, 역추출

Description

사이클로 덱스트린의 분자 인식 기능을 이용한 이소플라본의 추출방법{Method for extraction of isoflavone from plant material using molecular recognition function of cyclodextrin}

도 1은 본 발명에 의한 이소플라본의 추출방법을 단계별로 나타낸 도면이다.

도 2는 본 발명에 의한 이소플라본의 추출방법의 추출 효율을 종래의 방법에 의한 추출 효율과 비교한 그래프이다.

도 3은 본 발명에 의한 이소플라본의 추출방법에 있어서, 추출 시간에 따른 추출 효율을 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명에 의한 이소플라본의 추출방법에 있어서, 사이클로 덱스트린의 함량에 따른 추출 효율의 변동을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 이소플라본을 함유한 식물체로부터 기능성 생물 소재인 사이클로 덱스트린(Cyclodextrin), 그 유도체 또는 그 중합체들의 분자인식기능을 이용하여 이소플라본을 분리하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 이소플라본 함유 식 물체 또는 그 혼합물을 열수에 현탁하고 이소플라본에 대한 분자 인식기능이 우수한 베타 사이클로덱스트린 또는 그 유도체를 첨가하여 이소플라본을 선택적으로 인식하게 하여 이소플라본을 추출해 내는 방법에 관한 것이다.

기능성 식품의 관심도가 세계적으로 증가하면서 천연 식물체로부터 새로운 건강 기능성을 가지는 소재를 발굴하려는 시도가 증가하고 있다. 이소플라본은 자연계에 존재하는 천연 식물성 호르몬 중에 하나로 콩과 식물, 칡, 클로버 및 기타 식물족에 존재하는 것으로 알려져 있다.특히, 콩에는 다이드진(daidzin), 글리시틴(glycitin), 제니스틴(Genistin)과 그 배당체, 6-O-아세틸 다이드진, 6-O-아세틸 제니스틴, 6-O-말로닐 다이드진, 6-O-말로닐 제니스틴 등이 존재하고 칡의 뿌리에는 다이드진, 다이드제인 등이 존재하며 그 외 식물족에도 다양한 이소플라본 및 그 유도체들이 존재한다.

이들 이소플라본류는 유방암, 전립선암, 피부암 및 결장암 등의 예방 및 치료에 효과가 있다고 보고 되고, 골다공증을 포함하는 폐경기와 관련된 다양한 증상도 감소시키거나 예방할 수 있다.

일반적으로 이소플라본의 제조는 이소플라본이 함유되어 있는 식물들을 수성 유기용매등을 이용하여 용이하게 추출할 수 있다. 수성 유기용매로는 에탄올, 메탄올, 또는 저급알코올 및 아세톤 등을 예로 들 수 있다(미국 특허 제5679806호, 미국특허 제6004558호). 또한, 열수, 가성소다를 이용한 알칼리 수용액, 또는 금속산화물 수용액 등을 이용한 이소플라본의 추출방법 등이 제시 되어 있다(미국 특허 제4428876호, 미국 특허 제6458406호, 대한민국 특2001-0060419호). 그러나 상기 방법 중 유기용매 추출법은 추출율이 높아 식물체의 대부분의 이소플라본을 효과적으로 회수할 수 있지만 추출에 이용되는 유기용매의 종류에 따라 추출된 이소플라본의 안전성에 영향을 줄 수 있으며 각종 유기용매에 의해 다른 색소 등과 같은 이 물질의 추출로 그 순도가 현저히 떨어지는 단점이 있다. 따라서 필연적으로 추출된 이소플라본의 수율을 높이기 위해서는 여러 단계의 여과 정제 과정을 거쳐야만 하고 추출용매의 가격이 비싸 용매의 회수를 위한 별도의 공정이 필요로 하는 등 제조 비용이 다소 높아지는 문제가 있다. 또한 이소플라본이 식품, 화장품 등으로 활용범위가 확대되고 있는 실정에서 유기용매에 의한 추출방법은 바람직하지 못한 방법으로 평가되고 있다. 그리고, 열수 및 다양한 수용액을 이용한 추출방법은 그 수율이 상당히 낮은 편이며 고농도의 이소플라본 분리를 위해 적당한 수지가 충진된 컬럼을 사용하는 등의 분리공정을 거쳐야 하고 투입된 보조 물질의 제거를 위해 별도의 여과 정제 공정이 필요하다는 단점이 있다. 따라서 유기용매를 사용하지 않고 간단한 공정으로 이소플라본을 분리하는 방법의 개발은 이소플라본 뿐만이 아니라 천연 식물성 호르몬 유사체들의 산업적 활용도를 증대시킬 것으로 기대된다.

사이클로 덱스트린은 천연 생물 소재로서 6~8개의 포도당 분자가 고리모양의 a-1,4 결합의 형태로 이루어진 비환원성 말토올리고당이다. 환상형의 도우넛 구조로 이루어져 있고, 내측에 소수성 공동을, 분자 외부에는 친수성을 갖는 독특한 특성을 가지고 있다. 이를 이용하여 내측 공동에 각종 소수성 유기화합물을 인식하여 우수한 물성의 포접화합물을 형성하는 특성을 가지고 있다. 이러한 성질을 이용하여 사이클로 덱스트린은 식품, 의약품, 화장품 및 농약제 분야에 널리 응용되고 있 는데, 특히, 지방산, 지용성 비타민류, 휘발성 물질, 후라보노이드 등 각종 소수성 화합물의 포접에 대한 연구가 보고 되고 있다. 이러한 연구들은 후라보노이드에 대한 사이클로 덱스트린의 포접능을 이용하여 특정 물질만을 인식하여 분리할 수 있는 가능성을 제시하고 있다 이러한 사이클로덱스트린을이용한 선택적인 분리방법의 개발은 유기용매를 사용하지 않고 식물성 유사 호르몬 등을 추출해내는 방법을 제시함으로써 쉽게 화장품 및 식품소재로서 이용될 수 있을 것으로 예상된다.

사이클로 덱스트린에 의한 추출법은 다양하게 응용이 되고 있는데, 미국 특허 제5780097호에서는 표고버섯 추출물의 파우더 제조를 위한 공정에서 사이클로 덱스트린을 이용하여 추출물을 추출 및 안정화 시켰다. 또한 미국 특허 제5780096호에서는 클로렐라 추출물 제조시에 사이클로 덱스트린을 이용하여 기존의 추출 방법보다 활성물질의 추출 수율을 증대시켰다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 상기와 같은 사이클로 덱스트린의 특성에 착안하여 본 발명에서는 이소플라본 함유 식물체로부터 이소플라본을 추출해 내는 방법에 있어서 유기용매 추출 후 고농도 분리를 위해 여러 분리 공정을 거치는 것이 아니라 이들 식물체에 단순히 적정 농도의 사이클로 덱스트린이 포함된 열수를 첨가하여 이소플라본을 선택적으로 인식하게 하여 분리해 냄으로써 유기용매를 사용하지 않아 환경 친화적이며 제조공정이 단순한 이소플라본 생산 공정을 제시하고자 한다. 즉, 본 발명에서는 이소플라본을 함유하고 있는 대두, 대두배아, 콩과 식물, 칡, 클로버 및 기타 식물족으로부터 유기용매 추출법 등 의 기존의 복잡한 분리공정 대신에 천연 생물 소재인 사이클로 덱스트린의 분자 인식 기능을 활용함으로써 단순하고 효율적으로 이소플라본을 분리하는 공정을 제공하고자 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 이소플라본의 추출방법은, 이소플라본이 함유된 식물체 또는 식물 가공품을 사이클로 덱스트린 또는 그 유도체 또는 그 중합체의 용액에 첨가하여 이소플라본을 상기 사이클로 덱스트린 또는 그 유도체 또는 그 중합체에 결합시켜 추출하는 제1단계 및 상기 추출로 형성된 추출액에 응집제를 투여하여 상기 추출액으로부터 이소플라본과 사이클로 덱스트린의 결합체를 분리하는 제2단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 이소플라본의 추출방법은, 상기 제 2단계 이후에, 상기 분리된 이소플라본과 사이클로 덱스트린의 결합체를 건조하여 그대로 사용하거나, 상기 분리된 결합체로부터 이소플라본을 역추출하는 제3단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 이소플라본의 추출방법에 있어서, 상기 사이클로 덱스트린 또는 그 유도체 또는 그 중합체의 용액은, 사이클로 덱스트린 또는 그 유도체 또는 그 중합체를 전체 용액에 대해 0.5 내지 20%(w/v) 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 이소플라본의 추출방법에 있어서, 상기 제2단계의 응 집제는 전체 용액에 대해 0.1 내지2%(w/v)의 양으로 투여되는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 이소플라본의 추출방법에 있어서, 상기 제3단계는, 물 또는 10 내지 100%의 에탄올 또는 메탄올 등의 저급알코올 용액을 사용하여 이소플라본을 역추출하는 것을 특징으로 한다.

상기 역추출 용매는 70 내지 100%의 에탄올 수용액인 것이 가장 바람직하다.

상기한 본 발명에 의한 이소플라본의 추출방법에 있어서, 상기 제2단계의 응집제는 CaCl₂, CaSO₄, MgCl₂, MgSO₄ 및 유기 또는 무기산류로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 이소플라본의 추출방법에 있어서, 상기 제1단계에서 상기 결합체를 형성시켜 추출 하기 위한 반응 시간은 20 내지 24시간인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명에 의한 이소플라본의 추출방법을 단계별로 더욱 상세히 설명한다.

1) 제1단계

본 발명에서 중요한 특징은 유기용매 대신에 사이클로 덱스트린 용액을 사용한다는 것이다. 바람직하게는 사이클로 덱스트린 수용액을 사용한다. 더욱 바람직하게는 적정 농도의 사이클로 덱스트린이 함유된 열수를 사용한다.

이소플라본이 함유된 식물체 및 식물 가공품을 베타 사이클로 덱스트린이 0.5~20%(중량/부피) 농도로 함유된 수용액에 첨가하고 6~36시간 동안 50~100℃의 온도에서 교반하면서 결합체를 형성하게 한다. 더욱 바람직하게는 결합체 형성을 위한 반응 시간은 20 내지 24시간이다.

2) 제2단계

상기 결합체를 포함하는 혼합물에 응집제를 약 0.1~2%(중량/부피)를 첨가하여 현탁액을 형성하고, 다시 50~100℃에서 1~2시간 가열한 후 여과 또는 원심분리 등을 통해 결합체를 함유한 상등액을 분리해 낸다.

3) 제3단계

상기 분리된 상등액을 진공 감압 농축하고 건조하여 분말형으로 사용하거나 또는 여기에 다시 열수 또는 저급 알코올을 첨가하여, 바람직하게는 80% 에탄올 수용액을 첨가하여 베타 사이클로 덱스트린 결합체로부터 50 ~ 70℃ 에서 1~3 시간 동안 이소플라본을 역추출 하고 여과 또는 원심분리하여 상등액을 회수하여 건조하는 과정을 통해 고함량의 이소플라본을 분리할수 있게 된다.

상기 각 단계를 도 1에 요약하여 나타내었다.

제1단계에서 사용된 이소플라본 함유 식물체 및 식물 가공품은 대두, 대두배 아 및 탈지 대두 플레인, 대두가루, 칡, 클로버류, 감초 알팔파, 석류, 아마인 등이 1종 이상의 재료로 사용될 수 있으나 이에 국한되지는 않는다. 또한 상기 사용된 사이클로 덱스트린은 그 연결된 포도당 수에 따라 알파-, 베타-, 감마 사이클로 덱스트린으로 나뉘어진다. 이외에도 사이클로 덱스트린의 난용성 및 불안정성 등의 문제점을 해결하기 위해 다양한 사이클로 덱스트린 유도체들이 존재한다. 또한 포도당을 1~ 수개 를 부가한 분지형 사이클로덱스트린, 사이클로 덱스트린 수개를 결합하여 제조한 중합형 사이클로 덱스트린등이 있다. 특히 본 발명에서는 베타 사이클로 덱스트린을 이용하였을 때 가장 좋은 결과를 나타내었다. 하지만, 앞서 소개한 모든 사이클로 덱스트린 형태를 사용할 수 있으며 본 발명의 제조 방법에 사용된 물질을 베타 사이클로 덱스트린으로 한정하는 것은 아니다. 예컨대, 헵타키스 2,6-디메틸-β-사이클로 덱스트린, 헵타키스 2,3,6-트리-o-메틸-β-사이클로 덱스트린과 같은 사이클로 덱스트린의 유도체가 사용될 수 있으며, 수용성 β-사이클로 덱스트린 중합체(분자량이 10,000인 교차 결합된 중합체)가 사용될 수 있다.

또한, 결합 화합물 형성 조건에 있어서, 사이클로 덱스트린의 첨가량, 결합 화합물의 형성 방법 및 조건들은 본 발명의 실시자에 의해 다양하게 변형될 수 있다. 그러나, 사이클로 덱스트린의 첨가량은 전체 반응액의 0.5~20%(w/v) 인 것이 바람직하다. 사이클로 덱스트린의 첨가량이 0.5%(w/v) 미만인 경우에는 결합율이 현저히 떨어져 추출효율이 낮아지며, 20%를 넘으면 더 이상 추출효율이 증가하지 않고 포화되므로 비용면에서 20%이하인 것이 바람직하다. 사이클로 덱스트린과 이소플라본의 결합방법은 단순교반, 가열 이외에도 초음파 처리 등의 방법이 사용될 수 있다. 따라서 결합체를 형성하기 위한 방법이 위에 국한된 것만은 아니다. 한편, 결합체 형성을 위한 추출시간은 20 내지 24시간인 것이 바람직하다. 20시간 미만인 경우에는 추출효율이 떨어지며, 24시간 넘게 추출하여도 추출 효율이 시간에 비례하여 증가하지 않고 거의 포화하므로 비용면에서 24시간을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

제2단계에서 혼합물에 첨가하는 응집제는, 단순한 가교 또는 변성에 의해 추출 목적인 이소플라본 이외의 다른 물질들, 즉 단백질 또는 다당류의 불용성 응집물을 형성할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용될 수 있다. 구체적으로, CaCl₂, CaSO₄, MgCl₂, MgSO₄, 유기 또는 무기산류 등이 사용될 수 있다. 하지만, 응집제를 반응액의 2%(w/v)를 초과하여 너무 많이 첨가하면 상기 이소플라본 결합체가 함께 침전되어 그 수율이 낮아질 수가 있다. 또한, 응집제를 0.1%(w/v) 미만으로 너무 적게 첨가하면 결합 화합물과 쉽게 분리되지 않는 경향이 있다. 따라서, 응집제의 첨가량은 반응액의 0.1 내지 2%(중량/부피)가 바람직하다. 상기 추출물에는 CaCl₂ 를 사용하였다.

제3단계에서는 결합체 용액을 진공 감압농축하여 얻어진 농축액에 에탄올 등을 이용하여 결합체로부터 이소플라본을 추출하게 되는데, 여기에서는 에탄올 이외에 메탄올, 아세톤과 같은 다른 수성 유기용매의 사용도 가능하다. 그러나, 역 추출 용매는 70 ~ 100 % 에탄올 수용액이 바람직하다. 역 추출 용매의 에탄올 농도가 70% 미만일 경우에는 이소플라본의 재추출율이 현저히 떨어져 추출 효율이 낮아 지게 된다. 또한 필요에 따라 얻어진 이소플라본-사이클로 덱스트린 결합체를 그대로 건조하여 분말형의 제품으로도 사용할 수 있다. 이 경우 수용성의 특징을 가질 것으로 기대된다.

본 발명의 제조 방법의 특징은 상기한 바와 같이, 이소플라본 추출에 유기용매를 사용하여 다단계로 추출하거나 수지가 충진된 컬럼을 사용하여 고함량으로 분리하는 것이 아니라, 사이클로 덱스트린의 분자 인식 능력을 이용하여 선택적으로 결합체를 형성하는 단일 추출 과정을 거쳐 고함량으로 분리하는데 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명에 대한 예시 일뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

<실시예 1: 증류수 및 유기용매를 이용한 추출과 사이클로 덱스트린 수용액을 이용한 추출에서의 이소플라본 함량 비교>

사이클로 덱스트린을 이용한 추출은 대두 배아 20g을 100ml의 물에 현탁시킨 후 여기에 사이클로 덱스트린을 5%(중량/부피) 농도로 첨가하여 50℃에서 24시간 동안 반응시켜 결합체를 형성시켰다. 그런 다음에, CaCl₂ 0.2g을 첨가하고 다시 100 에서 1시간 교반한 후 그 여과액을 분석에 사용하였다.

대조군인 유기용매 추출군은 동일한 양의 대두 배아에 100ml의 70% 에탄올 또는 메탄올을 넣고 동일 반응조건 및 시간에서 추출하고 여과하여 분석에 사용하였다.

증류수 추출은 상기 사이클로 덱스트린 수용액 공정에서 사이클로 덱스트린을 제외하고 동일한 순으로 진행하였다.

얻어진 추출액들은 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC는 Mightysil RP-18 GP 250-4.6(5m) 컬럼으로 15% 아세토니트릴 수용액에 1ml/min의 유속으로 40분간 확인하였다. 검출기는 254nm로 설정하여 분석하였다.

그 결과는 도 2에 나타나 있다. 도 2의 그래프는, 증류수 및 유기용매와 사이클로 덱스트린 수용액으로 각각 추출한 이소플라본의 양을 나타낸 그래프이다. 메탄올을 이용하여 추출된 양을 100%로 했을 때 다른 추출방법들로부터 얻어진 이소플라본(Daidzin, Glycitin, Genistin)을 비교하였는데, 사이클로 덱스트린 수용액을 이용하여 추출한 방법에서 Daidzin 91.5%, Glycitin 90.5%, Genistin 75.8% 로 분포의 차이는 있지만 70% 에탄올로 추출한 방법과 비슷한 이소플라본 양이 추출되고 있음을 확인할 수 있었다.

<실시예 2: 반응 최적 시간 결정>

상기 실시예1과 동일한 방법으로 대두 배아 20g을 100ml의 물에 현탁시킨 후 여기에 사이클로 덱스트린을 5%(중량/부피)의 농도로 첨가하고 50℃를 유지하며 반 응을 시킨 후 시간별로 이소플라본의 변화량을 확인 하였다. 분석은 상기 HPLC 분석 방법을 사용하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에서 나타난 바와 같이, 약 20~24 시간 정도의 추출시간이 최적 시간임을 확인할 수 있었다.

<실시예 3: 사이클로 덱스트린의 최적 사용량 결정 >

사이클로 덱스트린의 최적 사용량을 결정하기 위해 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 대두 배아 20g에 증류수 100ml 와 베타 사이클로 덱스트린을 0.5, 2.5, 5, 10, 15, 그리고 20%(중량/부피) 농도로 첨가하고 85℃를 유지하며 24시간 동안 추출하고 이소플라본을 추출량을 확인하였다. 분석은 상기 HPLC 분석 방법을 사용하였다. 그 결과는 도 4에 나타나 있다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 사이클로 덱스트린 첨가량이 증가함에 따라 이소플라본 추출량이 증가함을 확인 할 수 있었고, 베타 사이클로 덱스트린 농도가 15~20%(중량/부피)사이에서 추출에 적정함을 확인 할 수 있었다.

<실시예 4>

대두 배아 20kg를 베타 사이클로 덱스트린이 15% 포함된 이온수 100L 와 혼합하고 85℃를 유지하며 24시간 동안 이소플라본을 추출 하였다. 여기에 CaCl₂를 1% 투여하여 혼합하고 다시 100℃에서 1시간동안 교반한뒤 Filter press를 사용하여 여과하고 여과액을 회수 하였다. 회수된 여과액을 진공감압 농축하여 상등액 양을 10L까지 줄이고 여기에 에탄올을 90L 첨가하고 여과한뒤 여과액을 진공 감압 건조 하여 이소플라본을 회수하였다. 회수된 이소플라본 양은 대두 배아 중량 대비 2.3% 였다.

<실시예 5>

상기 실시예4에서 대두 배아 대신에 대두 분말을 사용한 것을 제외하고는, 실시예4와 동일한 방법으로 추출을 수행하였다. 회수된 이소플라본의 양은 사용된 대두 분말 중량 대비 0.28%이었다.

<실시예 6>

상기 실시예4에서 대두 배아 대신에 칡 분말을 사용한 것을 제외하고는, 실시예4와 동일한 방법으로 추출을 수행하였다. 회수된 이소플라본의 양은 사용된 칡 분말 중량 대비 12% 였다.

상기 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 사이클로 덱스트린을 사용하여 이소플라본을 추출하는 방법은 기존의 유기 용매 추출법과 비교하여 공정이 간단하여 분리 정제의 비용이 상당히 절감되는 효과가 있다. 또한 이소플라본이 건강식품, 화장품 소재로 활용이 되고 있는 바 본 발명을 이용하면 환경 및 인체에 유해할 수 있는 유기용매의 사용을 줄일 수 있으므로, 환경 친화적인 장점이 있다. 또한, 사이클로 덱스트린을 이용하여 추출하는 공정에서 가장 적합한 공정 조건들을 설정함으로써 저비용으로도 고효율로 이소플라본을 추출할 수 있는 효과가 있다.

Claims (8)

1. 이소플라본이 함유된 식물체 또는 식물 가공품을 사이클로 덱스트린 또는 그 유도체 또는 그 중합체의 용액에 첨가하여 이소플라본을 상기 사이클로 덱스트린 또는 그 유도체 또는 그 중합체에 결합시켜 추출하는 제1단계 및

   상기 추출로 형성된 추출액에 응집제를 투여하여 상기 추출액으로부터 이소플라본과 사이클로 덱스트린의 결합체를 분리하는 제2단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이소플라본의 추출방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제 2단계 이후에, 상기 분리된 이소플라본과 사이클로 덱스트린의 결합체를 건조하여 그대로 사용하거나, 상기 분리된 결합체로부터 이소플라본을 역추출하는 제3단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이소플라본의 추출방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 사이클로 덱스트린 또는 그 유도체 또는 그 중합체의 용액은, 사이클로 덱스트린 또는 그 유도체 또는 그 중합체를 전체 용액에 대해 0.5 내지 20%(w/v) 함유하는 것을 특징으로 하는 이소플라본의 추출방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제2단계의 응집제는 전체 용액에 대해 0.1 내지 2%(w/v)의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 이소플라본의 추출방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제2단계의 응집제는 CaCl₂, CaSO₄, MgCl₂, MgSO₄ 및 유기 또는 무기산류로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 이소플라본의 추출방법.
6. 제2항에 있어서, 상기 제3단계는, 물 또는 10 내지 100%의 에탄올 또는 메탄올 등의 저급알코올 용액을 사용하여 역추출하는 것을 특징으로 하는 이소플라본의 추출방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 제3단계는 70 내지 100%의 에탄올 수용액을 사용하여 역추출하는 것을 특징으로 하는 이소플라본의 제조방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1단계에서 상기 결합체를 형성시키기 위한 반응 시간은 20 내지 24시간인 것을 특징으로 하는 이소플라본의 추출방법.

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