KR20160136867A - 법제 하수오 추출물을 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스 개선용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 법제 하수오(Polygoni Multiflori Radix) 추출물을 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스 개선용 조성물 및 그 제조방법이 제공된다. 또한 법제 하수오 추출물 유래의 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드 (2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-glucoside), 레인 (rhein), 에모딘 (emodin) 및/또는 크리소파놀 (chrysophanol)을 활성성분으로 포함하는 산화적 스트레스 개선용 건강기능성 식품 조성물이 제공된다.
Description
본 발명은 법제 하수오(Polygoni Multiflori Radix) 추출물을 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스 개선용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 법제 하수오 추출물 유래의 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드 (2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-glucoside), 레인 (rhein), 에모딘 (emodin) 및/또는 크리소파놀 (chrysophanol)을 활성성분으로 포함하는 산화적 스트레스 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
21세기 생활수준의 향상과 의학기술의 눈부신 발전으로 인간의 평균수명이 증가된 고령화 사회로 접어들면서 건강하게 나이를 먹는 것에 대한 욕구가 강해지고 있다. 이러한 시대에 부응하여 건강기능식품 분야의 시장은 급속도록 성장하고 있다.
산화적 스트레스(Oxidative stress)는 활성산소 생산계 및 소거계의 균형에 의해 거의 일정하게 유지되고 있던 생체 산화수준이 약제, 방사선, 허혈, 노화 등 여러 가지 요인에 의해 이러한 균형이 무너진 상태를 가르키는 것으로, 과도한 자유 라디칼을 발생시켜 인체의 항산화 기전의 균형을 깨드리고, 산화적 스트레스 결과 세포상해(특히 세포막 지질과 산화), DNA염기 수식에 의한 돌연변이, 세포사(apotosis) 유도 등을 일으켜서 동맥경화증, 퇴행성 뇌질환, 중풍, 파킨슨병, 헌팅턴병, 당뇨, 암, 알쯔하이머, 치매, 노화 등의 다양한 질환의 원인이 되고 있다.
산화적 스트레스의 원인물질은 자유 라디칼인 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)으로 O2 -(superoxide anion), H2O2(hydrogen peroxide) 및 ㆍOH(hydroxyl radical) 등과, 염증 반응과 관련된 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)인 NO(nitric oxide), NO2, ONOO-(peroxynitrite) 등이 있다. 특히 ONOO-는 생체 내에서 NO와 O2 -의 반응에 의해 생성되는 독성 세포손상(pathogenic cellular damage)와 기관 부전(organ dysfunction)의 주요인으로 알려져 있다. ONOO-는 단백질, 아미노산, DNA 등과 반응하여 세포 및 조직 손상을 야기할 뿐만 아니라 NO 신호화를 저해하여 다양한 만성질환 발생에 관여한다.
생체내에서 ROS와 RNS 등의 제거를 위하여 SOD (superoxide dismutase) 등의 효소 함유 식품이나 β-카로틴, 비타민 C와 E, 페놀성 화합물 등을 함유하는 식품의 섭취가 이루어져 왔으나 여전히 더 효과적인 대안의 개발이 요구되어 오고 있다.
최근에 다양한 질환의 원인이 되는 산화적 스트레스를 개선하기 위하여 천연물 유래의 활성성분에 대한 연구가 이루어지고 있는데, 등록특허 제10-0873222호에는 붉나무로부터 분리한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물을 활성성분으로 하는 동맥경화증, 치매, 암 등의 산화적 스트레스성 질환의 예방, 개선 및 치료에 유용한 조성물이 개시되어 있으나, 여전히 다양한 천연물에서 산화적 스트레스 개선 활성을 갖는 신규한 활성성분의 분리 및 개발이 요망되고 있다.
하수오는 다년생 덩굴성 초본으로 길이 5 ~ 10 cm, 지름 3 ~ 10 cm의 여뀌과(Polygonaceae)의 방추형 덩이뿌리로서, 간, 신을 보익하고 혈을 자양하며 풍을 제거하는 효능이 있다고 알려져 있으며 장기 복용 시 혈압강화효과를 나타내어 예로부터 민간요법에 많이 이용되어 왔으며, 심보호 효과, 신경보호 효과 등이 알려져 있고, 모발의 색소 침착을 유도하고 모발의 성장 효과 등이 보고된 바 있다.
하수오의 생리적 활성은 하수오 중에 함유된 안트라퀴논 화합물, 식물성 스테롤, 각종 배당체화합물에서 유래할 것으로 추측되어 왔다. 또한 하수오의 장기 섭취 시 간 손상 등의 부작용이 있어 통상 법제 과정을 거쳐서 섭취되고 있다. 그러나 법제 과정에 의하여 상기 활성성분의 변화로 인하여 법제 하수오의 효능도 많은 변화가 있다고만 알려져 있을 뿐, 이에 대한 연구는 드문 실정이다.
특히 법제 하수오로부터 유래되는 기능성 활성성분 특히 산화적 스트레스 개선 효능을 갖는 활성성분에 대해서는 보고된 바는 없다.
종래 기술에서의 요구에 부응하기 위해 지속적으로 연구한 결과, 본 발명자들은 법제 하수오의 추출물이 생체(신장 근위 세뇨관 세포)에서 활성산소종 (O2 -, H2O2 및 ㆍOH)과 활성질소종(NO, ONOO-)의 우수한 제거활성에 의해 산화적 스트레스 개선 효과를 나타낸다는 것을 확인하고 아울러 활성성분이 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀임을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 활성산소종 및 활성질소종의 소거활성을 갖는 법제 하수오 유래의 산화적 스트레스 개선용 조성물 및 이를 포함하는 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 법제 하수오로부터 활성산소종 및 활성질소종의 소거 활성을 갖는 산화적 스트레스 개선용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 법제 하수오 유래의 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및/또는 크리소파놀을 활성성분으로 포함하는 산화적 스트레스 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 법제 하수오 유래의 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀은 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 함유하는 추출물 또는 분획물, 또는 이들로부터 정제된 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 모두 포함하는 개념이다.
법제 하수오 추출물은 다양한 추출법을 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올, 메탄올 및 이소프로판올 등의 유기 극성용매를 이용하여 추출할 수 있고, 가장 바람직하게는 메탄올을 이용하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
법제 하수오 분획물은 상기 법제 하수오 추출물을 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥센(hexane), 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 디클로로메탄으로 이루어진 군으로 부터 선택되는 하나 이상의 유기용매와 물을 이용하여 분획하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 유기용매로 헥센, 클로로포롬 및 메탄올을 이용하여 분획할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는 본 발명의 산화적 스트레스 개선용 조성물의 활성성분인 법제 하수오 유래의 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀은 법제 하수오 분말을 메탄올로 추출한 후, 추출물을 물에 현탁한 후 헥센(hexane), 클로로포름 및 메탄올 로 분획한 후, 메탄올 분획물을 메탄올, 클로로포름, 헥센, 부탄올, 및 아세토니트릴로 순차적으로 분획한 후, 다시 각각의 분획물을 물과 메탄올의 농도구배 분획, 메탄올과 클로로포름의 농도구배 분획, 메탄올과 헥센의 농도구배 분획, 메탄올과 부탄올의 농도구배 분획 및 물과 아세토니트릴의 농도구배 분획을 순차적으로 하여 분획물을 얻는다. 활성성분인 4 종의 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀의 분리, 정제는 통상의 정제방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 정제 순환고압액체크로마토그래피(Prep-recycling High Press Liquid Chromatograph, RHPLC), 역상크로마토그래피, 실리카 겔 프래시 CC 크로마토그래피 또는 세파덱스 LH-20 크로마토그래피를 이용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 핵자기공명기 등의 분광학적 기기분석법를 이용하여 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀의 구조를 하기와 같이 동정하였다 (제조예 1, 2 참조):
본 발명의 법제 하수오 추출물/분획물은 활성산소종 및 활성질소종의 소거 활성을 가져서 (시험예 1 ~ 4 참조) 산화적 스트레스 개선 효과를 나타내며, 산화적 스트레스 관련 질환 개선용, 항산화, 항당뇨, 항비만, 항고혈압 건강기능성 식품 조성물로써 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 산화적 스트레스 개선용 조성물은 건강식품 분야에서 공지의 방법의 의해 건강기능식품 조성물로 제제화될 수 있고, 법제 하수오 추출물 분말 자체 또는 건강기능식품으로 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합하여 건강식품으로 통상으로 허용되는 제제, 예를 들면 환, 과립, 타블렛, 액상음료, 시럽, 연질캡슐 등으로 제제화될 수 있으며, 건강기능식품으로 섭취할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 본 발명은
ⅰ) 법제 하수오 분말을 제공하는 단계;
ⅱ) 법제 하수오 분말에 20 ~ 30 부피배의 메탄올, 에탄올, 클로로포롬 및 이소프로판올로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유기용매로 추출하는 단계;
ⅲ) 유기용매 추출물을 물에 현탁한 후, 헥센, 클로로포름 및 메탄올로 분획한 후, 메탄올 분획물을 메탄올, 클로로포름, 헥센, 부탄올, 및 아세토니트릴로 순차적으로 분획한 후, 다시 각각의 분획물을 물과 메탄올의 농도구배 분획, 메탄올과 클로로포름의 농도구배 분획, 메탄올과 헥센의 농도구배 분획, 메탄올과 부탄올의 농도구배 분획 및 물과 아세토니트릴의 농도구배 분획을 순차적으로 하여 분획물을 얻는 단계; 및
ⅳ) 결과의 분획물로부터 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 산화적 스트레스 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.
필요에 따라서, 본 발명의 산화적 스트레스 개선용 조성물의 제조방법은, 단계 ⅳ) 후에, 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
단계 ⅰ): 법제 하수오 분말 제공
법제 하수오 분말은 건조된 법제 하수오를 분쇄기로 분쇄하여, 약 80 메쉬 체로 걸러 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
하수오의 법제화는 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는 하수오를 95 ~ 100℃에서 30 ~ 60 분간 증자한 후 자연 건조하거나 45 ~ 55℃로 유지된 열풍건조기에 넣고 2 ~ 3일 건조하여 법제 하수오를 제조할 수도 있고, 또는 건조 하수오를 생막걸리에 하루 정도 침지시킨 후 이를 다시 건조하고 다시 검정콩물에 하루 정도 침지시킨 후 건조하여 법제 하수오를 제조할 수도 있다.
하수오는 3년 이상인 것을 사용하는 것이 바람직하며 3년 이하의 경우 생리활성물질 함량이 적으며, 수확량(무게)가 적은 단점이 있고, 하수오 뿌리 부분을 사용하는 것이 좋다.
단계 ⅱ): 유기용매 추출
법제 하수오 분말에 20 ~ 30 부피배의 메탄올, 에탄올, 클로로포롬 및 이소프로판올로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유기용매로 추출한다.
추출은 통상의 방식에 따라 행할 수 있으며, 바람직하게는 추출은 12시간 동안 3회 혹은 50℃에서 5시간 동안 2회 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단계 ⅲ): 분획
분획은 통상의 방식에 따라 단계 ⅱ)의 유기용매 추출물을 유기용매의 극성에 따라 물에 현탁하여 헥센, 클로로포름 및 메탄올로 분획한 후, 메탄올 분획물을 메탄올, 클로로포름, 헥센, 부탄올, 및 아세토니트릴로 순차적으로 분획한 후, 다시 각각의 분획물을 물과 메탄올의 농도구배 분획, 메탄올과 클로로포름의 농도구배 분획, 메탄올과 엑센의 농도구배 분획, 메탄올과 부탄올의 농도구배 분획 및 물과 아세토니트릴의 농도구배 분획을 순차적으로 하여 분획한다.
이온크로마토그래피법 컬럼을 이용하여 순차적으로 분획하여 분획물을 얻는다.
단계 ⅳ): 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀 분리
단계 ⅲ)으로부터의 분획물에서 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 분리한다.
분리는 통상의 방식으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 정제 순환고압액체크로마토그래피(Prep-recycling High Press Liquid Chromatograph, RHPLC), 역상크로마토그래피, 실리카 겔 프래시 CC 크로마토그래피 또는 세파덱스 LH-20 크로마토그래피를 이용하여 분리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
필요에 따라서, 단계 ⅲ) 및 ⅳ)를 대체하여, 단계 ⅱ)로부터의 유기용매 추출물을 역상 크로마토그래피법을 이용하여 극성별 유기용매 조성물을 순차적으로 통과하여 분획물을 제조하여 고압액체크로마토그래(HPLC)로 확인하여 이로부터 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 분리할 수 있다.
단계 ⅴ): 추가 정제
단계 ⅳ) 후에, 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
정제는 통상의 방법으로 행할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법의 일례가 도 1에 도시되어 있으며, 본 발명에 따라 제조되고 동정된 법제 하수오 유래의 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀의 구조식은 도 3에 나타내었다.
본 발명에 따라 제조된 법제 하수오 유래 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및/또는 크리소파놀을 함유하는 조성물은 생체내 활성산소종 및 활성질소종의 소거 활성을 가져서 (시험예 1 ~ 4 참조) 우수한 산화적 스트레스 개선용 조성물이다.
본 발명에 따른 법제 하수오 유래의 테트라하이드록시스틸벤 2-O--D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및/또는 크리소파놀을 유효성분으로 함유하는 산화적 스트레스 개선용 조성물은 생체내 세포에서 활성산소종 및 활성질소종의 소거 활성이 탁월하다.
또한 본 발명에 따른 산화적 스트레스 개선용 조성물은 산화적 스트레스로 인한 질환인 알쯔하이머, 치매, 노화, 비만, 당뇨, 고지혈증, 고혈압의 증상 개선용 건강기능성 식품으로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 법제 하수오 유래 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및/또는 크리소파놀을 함유하는 산화적 스트레스 개선용 조성물의 제조하는 공정의 일례이다.
도 2는 법제 하수오 추출물의 HPLC 크로마토그램이다. 왼쪽부터 2,3,5,4' -테트라하이드록시스틸벤2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀 순이다.
도 3은 법제 하수오 추출물 및 분획물에서 분리 및 정제되어 구조가 동정된 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀의 화학구조식을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 4종 활성성분을 포함하는 법제 하수오 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 4 종 활성성분을 포함하는 법제 하수오 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 4 종 활성성분을 포함하는 법제 하수오 추출물의 하이드록실 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 법제 하수오 추출물의 HPLC 크로마토그램이다. 왼쪽부터 2,3,5,4' -테트라하이드록시스틸벤2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀 순이다.
도 3은 법제 하수오 추출물 및 분획물에서 분리 및 정제되어 구조가 동정된 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀의 화학구조식을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 4종 활성성분을 포함하는 법제 하수오 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 4 종 활성성분을 포함하는 법제 하수오 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 4 종 활성성분을 포함하는 법제 하수오 추출물의 하이드록실 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.
실 시 예
제조예 1: 법제 하수오 추출물 제조
스트레인서 추출기에 3년산 법제 하수오 건조 분말 (지리산하수오 영농조합법인) 10 kg과 메탄올 20 L를 첨가하여 320 rpm에서 12시간 추출하는 과정을 3회 반복하고 0.45 μm 여과 필터로 여과하여 모은 후 여과액을 감압농축기(EYELA, Tokyo, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 50 ℃에서 감압 농축하여 법제 하수오 추출물 380 g을 얻었다.
제조예 2: 법제 하수오 유래의 활성물질 제조 및 구조 동정
제조예 1에서 제조된 법제 하수오 추출물 건조물 100 g을 정제수에 현탁한 후, 도 1에 도시된 바와 같이, 분핵깔대기를 이용하여 헥센 분획물, 클로로포롬 분획물 및 메탄올 분획물로 분획한 후, 메탄올 분획물을 다시 분획물 A(메탄올), B(클로로포롬), C(핵센), D(부탄올), E(아세토니트릴)로 순차적으로 분획한 후, 다시 분획물 A1(물 : 메탄올 = 100 : 0) ~ A9(물 : 메탄올 = 0 : 100), B1(메탄올 : 클로로포롬 = 100 : 0) ~ B7(메탄올 : 클로로포롬 = 0 : 100), C1(메탄올 : 헥센 = 100 : 0) ~ C7(메탄올 : 헥센 = 0 : 100), D1(메탄올 : 부탄올 = 100 : 0) ~ D5(메탄올 : 부탄올 = 0 : 100), E1(물 : 아세토니트릴 = 100 : 0) ~ E4(물 : 아세토니트릴 = 0 : 100)로 농도구배 분획을 하였다 (도 1).
A1 ~ E4 분획물을 정제 순환 고압액체크로마토그래피를 이용하여 2,3,5,4' -테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 분리하여 정제하였다: 분석 칼럼은 Lichrophore 100 RP C18 column(4.6×250 mm, 5 μm, Merck & Co., Kenilworth, NJ, USA)을 사용하였고, 이동상 용매는 1.0% 글라시알 아세트산(solution A)와 100% 아세토니트릴(solution B)로 분석하였고, 이동상 조건은 solution B 기준으로 각각 20, 10, 10 및 10분 동안 10%, 20%, 25% 및 35%로 유지시켰다. 분획물 시료는 20 μL를 주입하였고 이동상의 속도는 30℃에서 1 mL/min로 유지하였고 생리활성물질은 diode array UV detector(Agilent 1200 series, Agilent Co.)의 흡광도 280 nm에서 정량하였다.
HPLC 분석 결과, 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드 (화합물 1), 레인 (화합물 2), 에모딘 (화합물 3) 및 크리소파놀 (화합물 4)이 확인되었으며 (도 2), 정량된 각각의 성분의 함량을 환산하여 표 1에 나타냈다.
| 화합물 | 함량 (mg/kg) |
| 2,3,5,4' -테트라하이드록시스틸벤 2-0-β-D-글루코사이드 (1) | 121.11±3.6 |
| 레인 (2) | 0.08±0.00 |
| 에모딘 (3) | 2.28±0.02 |
| 크리소파놀 (4) | 0.73±0.01 |
시험예: 법제 하수오 유래 조성물의 산화적 스트레스 개선효과 시험
상기 제조예 1에서 제조된 본 발명에 따른 4종 활성성분을 포함하는 법제 하수오 추출물을 농축하여 분말을 제조하고 메탄올에 각각 10, 25 및 50 μg/mL 농도로 용해시켜 하기 시험예들의 법제 하수오 유래 조성물 시료로 사용하였다.
시험예 1: 법제 하수오 유래 조성물의 활성산소종 (라디칼) 소거 활성
본 발명에 따른 법제 하수오 유래 조성물의 산화적 스트레스 개선 효과를 활성산소종 (라디칼) 소거 활성 즉, DPPH, ABTS 및 하드록실 (ㆍOH) 라디칼 소거 활성을 측정하여 검정하였다.
<DPPH 라디칼 소거활성>
DPPH 라디칼 소거활성을 측정하여 산화적 스트레스 개선효과를 확인하였다. DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, sigma D9132, FW 393.4 C18H12N5O6)는 매우 안정한 라디칼로서 525nm에서 특정 흡광도를 나타내는 보라색 화합물이다.
에탄올로 1.5×10-4 M 농도가 되게 한 DPPH 용액 0.8 ㎖과 상기에서 준비된 법제 하수오 유래 조성물 시료 (10, 25 및 50 μg/mL 농도) 각각의 0.2 mL을 10 초간 보텍스(vortex)로 균일하게 혼합한 후, 실온에서 30분 방치한 후 분광광도계(Spectronic 2D, Thermo Electron Co., Marietta, OH, USA)를 이용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군은 시료 대신에 메탄올을 0.2 mL를 취하여 실험하였고 양성 대조군은 아스코르빅 애스드(L-ascorbic acid)를 사용하여 실험하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 아래와 같은 식으로 계산하여 백분율(%)로 표시했으며, 그 결과를 도 4에 나타냈다:
DPPH 라디칼 소거활성(%) =
[1-(음성 대조구 흡광도 ÷ 실험구 흡광도)] × 100
도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 법제 하수오 유래 조성물의 농도가 증가할수록 DPPH 라디칼 소거활성이 유의적으로 증가하였으며 50 μg/mL의 농도 시료에서 48.4% 까지의 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타냈다.
<ABTs 라디칼 소거활성>
ABTs 라디칼 소거활성을 측정하여 산화적 스트레스 개선효과를 확인하였다.
ABTs 라디칼(2,2`-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid 양이온) 소거활성은 2-아지노-비소의 색을 띤 라디칼의 감소 정도에 따라 검사하는 방법이다. 즉 이 방법은 시료와 표준물질 (trolox, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)의 값과 비교하여 소거활성을 측정하는 방법으로서, ABTs 양이온(ABTs+)이 소거되어 청록색으로 탈색되는데, 이때 ABTs 양이온(ABTs+)의 제거 정도를 흡광도를 측정함으로써 알 수 있고, 탈색반응이 1분 내에 종료되므로 짧은 시간에 측정이 가능하다.
구체적으로 7 mM ABTs 시약(sigma 1888) 5㎖과 2.45 mM K2S2O8 (FW 270.3, sigma 9392) 5 ㎖을 섞어 어두운 곳에 12 ~ 16시간 방치시켜 보관하여 ABTs 라디칼을 생성시킨 후, 732 nm에서 흡광도가 0.7±0.02가 되도록 메탄올로 희석하여 사용하였다.
상기와 같이 희석된 ABTs 용액 0.9 mL과 상기에서 준비된 법제 하수오 유래 조성물 시료 (10, 25 및 50 μg/mL 농도) 각각의 0.1 mL를 혼합하고 정확히 3분 후 분광광도계(Spectronic 2D)를 이용하여 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군은 시료 대신에 메탄올을 0.1 mL를 취하여 실험하였고 양성 대조군은 아스코르빅 애스드를 사용하여 실험하였다.
ABTs 라디칼 소거활성은 아래와 같은 식으로 계산하여 백분율(%)로 표시하였으며, 그 결과를 도 5에 나타냈다:
ABTs 라디칼 소거활성(%)
= [1-(음성 대조구 흡광도 ÷ 실험구 흡광도)] × 100
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 법제 하수오 유래 조성물의 농도가 증가할수록 ABTs 라디칼 소거활성이 유의적으로 증가하였으며 50 μg/mL의 농도 시료에서 57.9% 까지의 우수한 ABTs 라디칼 소거활성을 나타냈다.
<하이드록실 라디칼 소거 활성>
하이드록실(OH) 라디칼 소거활성 측정하여 산화적 스트레스 개선효과를 검정하였다.
구체적으로는 10 mM FeSO47H20-EDTA 0.2 ㎖, 10 mM 2-데옥시리보스 0.2 ㎖, 10 mM H2O2 0.2 ㎖, 상기에서 준비된 법제 하수오 유래 조성물 시료 (10, 25 및 50 μg/㎖농도) 각각의 1 ㎖를 혼합한 후 37 ℃에서 4시간 동안 반응시켜 혼합액을 만든 후, 이 혼합액에 1% 티오바르비투르산(thiobarbituric acid)/증류수와 2.8% 트리클로로아세트산 /증류수를 각각 1 ㎖를 가하여 100 ℃에서 20분간 가열하고 냉각시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 행하였다.
음성 대조군은 시료 대신에 메탄올을 사용하였고 양성 대조군은 아스코르빅 애스드를 사용하여 실험하였다. 하이드록실 라디칼 소거활성은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도의 차이를 백분율(%)로 나타내었으며, 그 결과를 도 6에 나타냈다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 법제 하수오 유래 조성물의 농도가 증가할수록 하이드록실 라디칼 소거활성이 유의적으로 증가하였으며, 특히 10 μg/mL의 낮은 농도 시료에서도 70% 이상의 우수한 하이드록실 라디칼 소거활성을 나타냈다.
따라서 본 발명에 따른 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 에모딘, 크리소파놀 및/또는 레인을 활성성분으로 함유하는 법제 하수오 유래 조성물은 활성산소종(라디칼) 소거 활성이 우수하여 산화적 스트레스 개선 효과를 가짐을 확인할 수 있다.
시험예 2~4: 법제 하수오 유래 조성물의 돼지 신장 세뇨관 세포 모델
(
LLC-PK
1
세포 모델)에서 산화적 스트레스 개선 효과
LLC-PK1 세포 모델을 사용하여 본 발명의 법제 하수오 유래 조성물의 산화적 스트레스 개선 효과를 분석하였다.
<LLC-PK1 세포 모델 시험>
신장 근위 세뇨관 세포는 자유 라디칼에 매우 민감한 세포로 특히 LLC-PK1, 돼지 신장 세뇨관 세포는 네프론에서 유도된 MDCK 다비 개 신장 상피 세포보다 산화적 스트레스에 더욱 민감한 세포이다. LLC-PK1 세포에 자유 라디칼 생성물질로 라디칼 생성을 유도하여 산화적 손상(스트레스)을 일으킨 후에 이에 대한 개선 효과를 살펴봄으로써 시료의 산화적 스트레스 개선 효과를 살펴볼 수 있다.
구체적으로는 LLC-PK1 세포가 컨플루언스(confluence) 상태가 되면 96-웰 배양 플레이트에 LLC-PK1 세포를 1×104 cells/mL로 분주하여 2시간 배양한 후 산화적 스트레스 유발물질인 250 μM 피로갈롤(pyrogallol), 500 μM 소디움 니트로프루시드(sodium nitroprusside; SNP) 및 1 mM 3-모르폴리노시드노니미드(morpholinosydnonimide; SIN-1)를 각각 처리하여 24시간 배양하였다. 그리고 나서 상기에서 준비된 법제 하수오 유래 조성물 시료 (10, 25 및 50 μg/mL 농도) 각각을 처리하여 다시 24시간 배양한 후, 5 mg/mL의 MTT 용액을 각 웰에 주입하여 37℃에서 4시간 동안 재배양한 후 생성된 포르마잔 (formazan) 결정을 빛을 차단한 상태에서 DMSO에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
시험예 2: 피로갈롤 유발 산화적 스트레스 개선 효과
피로갈롤(Pyrogallol)은 H2O2의 전구체로 수용액 상태일 때 빠른 자동 산화과정을 통해 활성산소종인 O2 -를 생성하고 이렇게 생성된 활성산소종은 동맥경화 및 혈관-관련 여러 질환의 병리적 매개 물질로 작용하게 된다.
상기에서 시험된 피로갈롤에 의해 산화적 스트레스가 유발된 LLC-PK1 세포 모델에서 본 발명의 법제 하수오 유래 조성물의 보호효과 즉 세포 생존율을 표 2에 나타냈다.
| 본 발명의 법제 하수오 조성물 처리농도 (μg/mL) | 세포 생존율(%) |
| 10 | 74.8±1.4 |
| 25 | 75.7±4.2 |
| 50 | 82.1±1.9 |
| 0 (대조군) | 69.4±3.2 |
| 정상군 | 100.0±2.8 |
표 2에 나타낸 바와 같이, 피로갈롤(Pyrogallol)만을 처리한 대조군은 유발된 O2 -에 의해 산화적 스트레스로 인하여 69.4%의 세포 생존율을 보인 반면에, 본 발명의 법제 하수오 조성물 시료를 처리한 경우는 농도가 증가할수록 세포 생존율이 증가하였고, 특히 50 μg/mL 농도 시료 처리의 경우는 80% 이상의 세포 생존율을 보였다. 따라서 본 발명의 법제 하수오 조성물은 활성산소종 O2 - 소거활성이 우수하여 산화적 스트레스로부터 세포 보호 효과가 뛰어난 것을 알 수 있다.
시험예 3: SNP 유발 산화적 스트레스 개선 효과
SNP는 니트로소디움 이온(nitrosodium ion)을 함유해 가시광선에 노출될 때 NO를 생성하는 화합물로 이에 의해 생성된 NO는 인체에서 중요한 생리적 조절인자로 작용하지만 고농도의 NO는 반응성 산화물질로 전환되어 세포에 병적인 손상을 유발한다. NO가 세포 생존에 미치는 영향은 농도와 세포 종류에 따라 다르게 나타나는 것으로 알려져 있으며, 일반적으로 고농도에서는 세포 생존율에 해로운 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
상기에서 시험된 SNP에 의해 산화적 스트레스가 유발된 LLC-PK1 세포 모델에서 본 발명의 법제 하수오 유래 조성물의 보호효과 즉 세포 생존율을 표 3에 나타냈다.
| 본 발명의 법제 하수오 조성물 처리농도 (μg/mL) | 세포 생존율(%) |
| 10 | 75.1±2.3 |
| 25 | 85.3±2.8 |
| 50 | 89.1±3.1 |
| 0 (대조군) | 68.3±2.2 |
| 정상군 | 100.0±1.8 |
표 3에 나타낸 바와 같이, SNP만을 처리한 대조군은 세포 생존율이 68.3%로 감소하였던바, 유발된 NO에 의한 산화적 스트레스로 인하여 세포가 손상되었음을 확인할 수 있고, 반면에 본 발명의 법제 하수오 조성물 시료를 처리한 경우는 농도가 증가할수록 세포 생존율이 증가하였고, 특히 25 μg/mL 이상의 농도 시료 처리군에서는 모두 85% 이상의 세포 생존율을 나타내었다. 따라서 본 발명의 법제 하수오 조성물은 활성질소종 NO 소거활성이 우수하여 산화적 스트레스로부터 세포 보호 효과가 뛰어난 것을 알 수 있다.
시험예 4: SIN-1 유발 산화적 스트레스 개선 효과
SIN-1은 NO와 O2 -를 생성하고 이들은 급속히 반응하여 ONOO-를 형성하며 이것은 강력한 세포독성 산화물(cytotoxic oxidants)로 분해되기 때문에 독성효과를 나타내게 된다.
상기에서 시험된 SIN-1에 의해(ONOO-에 의한) 산화적 스트레스가 유발된 LLC-PK1 세포 모델에서 본 발명의 법제 하수오 유래 조성물의 보호효과 즉 세포 생존율을 표 4에 나타냈다.
| 본 발명의 법제 하수오 조성물 처리농도 (μg/mL) | 세포 생존율(%) |
| 10 | 64.6±1.8 |
| 25 | 72.5±3.9 |
| 50 | 77.6±2.4 |
| 0 (대조군) | 60.4±3.5 |
| 정상군 | 100.0±2.2 |
표 4에 나타낸 바와 같이, SIN-1만을 처리한 대조군은 60.4%로 세포 생존율이 감소하였던바, 유발된 ONOO-에 의한 산화적 스트레스로 인하여 세포가 손상되었음을 확인할 수 있고, 반면에 본 발명의 법제 하수오 조성물 시료를 처리한 경우는 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하였고, 특히 25 및 50 μg/mL 농도 시료 처리군에서는 각각 72.5%와 77.6%의 세포 생존율을 나타냈다. 따라서 본 발명의 법제 하수오 조성물은 활성질소종 ONOO- 소거활성이 우수하여 산화적 스트레스로부터 세포 보호 효과가 뛰어난 것을 알 수 있다.
상기 시험 결과로부터 본 발명의 법제 하수오 조성물은 산화적 스트레스 개선 효과에 우수하다는 것을 확인할 수 있다.
Claims (11)
- 법제 하수오 유래의 하기 구조식으로 표시되는 테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 산화적 스트레스 개선용 조성물:
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 법제 하수오의 유기용매 추출물 또는 분획물인 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 활성성분은 법제 하수오 유래의 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드인 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 활성성분은 법제 하수오 유래의 레인인 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 활성성분은 법제 하수오 유래의 에모딘 또는 크리소파놀인 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 개선용 조성물.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 산화적 스트레스 개선용 조성물을 포함하여 이루어지는 건강기능성 식품.
- 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 산화적 스트레스 개선은 O2 -, H2O2 및 ㆍOH으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 활성산소종 소거활성에 의한 것인 산화적 스트레스 개선용 조성물.
- 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 산화적 스트레스 개선은 NO 및 ONOO- 의 활성질소종 소거활성에 의한 것인 산화적 스트레스 개선용 조성물.
- 제 6항에 있어서, 정제, 캅셀제, 분말제, 과립제, 액상제 및 환제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태로 가공된 것을 특징으로 하는 건강기능성 식품.
- ⅰ) 법제 하수오 분말을 제공하는 단계;
ⅱ) 법제 하수오 분말에 20 ~ 30 부피배의 메탄올, 에탄올, 클로로포롬 및 이소프로판올로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유기용매로 추출하는 단계;
ⅲ) 유기용매 추출물을 물에 현탁한 후, 헥센, 클로로포름 및 메탄올로 분획한 후, 메탄올 분획물을 메탄올, 클로로포름, 헥센, 부탄올, 및 아세토니트릴로 순차적으로 분획한 후, 다시 각각의 분획물을 물과 메탄올의 농도구배 분획, 메탄올과 클로로포름의 농도구배 분획, 메탄올과 헥센의 농도구배 분획, 메탄올과 부탄올의 농도구배 분획 및 물과 아세토니트릴의 농도구배 분획을 순차적으로 하여 분획물을 얻는 단계; 및
ⅳ) 결과의 분획물로부터 2,3,5,4'-테트라하이드록시스틸벤 2-O-β-D-글루코사이드, 레인, 에모딘 및 크리소파놀을 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 산화적 스트레스 개선용 조성물의 제조방법.
- 제 10항에 있어서, 단계 ⅳ)에서 분리는 정제 순환 고압액체크로마토그래피, 역상크로마토그래피, 실리카 겔 프래시 CC 크로마토그래피 및 세파덱스 LH-20 크로마토그래피로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 산화적 스트레스 개선용 조성물의 제조방법.
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|---|---|---|---|---|
| WO2020013581A1 (ko) * | 2018-07-09 | 2020-01-16 | 주식회사 엘지생활건강 | 탈모방지 또는 모발성장 촉진용 조성물 |
| KR102074314B1 (ko) * | 2018-10-22 | 2020-03-17 | 주식회사 엘지생활건강 | 탈모방지 또는 모발성장 촉진용 조성물 |
| CN112305211A (zh) * | 2019-07-29 | 2021-02-02 | 北京圆融科技有限公司 | 一种控制何首乌特异质肝毒性的方法 |
| CN114509507A (zh) * | 2020-11-16 | 2022-05-17 | 上海新亚药业邗江有限公司 | 一种同时测定黄精赞育胶囊中多种指标的定量方法 |
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2015
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