CN114509507A - 一种同时测定黄精赞育胶囊中多种指标的定量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物制剂领域，涉及一种同时测定黄精赞育胶囊中多种指标的定量方法，具体涉及一种高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)同时测定黄精赞育胶囊中多种指标的含量，包括以下内容：分别制备供试品溶液和对照品溶液，采用HPLC法进行梯度洗脱，同时测定淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’‑四羟基二苯乙烯‑2‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、蛇床子素的含量。本发明的方法简单、灵敏、准确度高，解决了目前黄精赞育胶囊中仅控制1种成分的含量不能较全面的反映黄精赞育胶囊质量的问题，以对黄精赞育胶囊的质量进行多指标的控制，为科学评价和有效控制黄精赞育胶囊的质量提供更科学的依据。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种同时测定黄精赞育胶囊中多种指标的定量方法，具体涉及一种HPLC法同时测定黄精赞育胶囊中多种指标的含量。
背景技术
世界卫生组织(World Health Organization，WHO)规定，夫妇有规律性生活1年以上，未采用任何避孕措施，由于男方因素造成女方无法自然受孕的，称为男性不育(MaleInfertility)。WHO预测，在21世纪，不育症将成为仅次于肿瘤和心脑血管疾病的第三大疾病。在全球15％-20％的不育发病率中，少弱精子症占比四分之三。
黄精赞育胶囊是国医大师王琦院士基于“肾虚夹湿热瘀毒虫”的核心病机理论研制而出的我国第一个专门治疗男性不育的国家新药，系由何首乌(制)、黄精(酒制)、枸杞子、菟丝子、五味子、熟地黄、肉苁蓉、淫羊藿、紫河车、续断、党参、当归、丹参、蒲公英、败酱草、蛇床子、蜂房(炒)、水蛭、牡蛎、车前子(盐炒)组成的复方制剂，具有补肾填精，清热利湿等功效，用于肾虚精亏夹湿热型弱精子症、少精子症引起的男性不育，症见腰膝酸软，阴囊潮湿等，精液检查见精子稀少，活动力差。该药物属中药复方制剂，仅测定2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量，难以有效控制其质量。因此，为了保证黄精赞育胶囊产品质量的稳定均一，建立同时测定多种指标的检测方法至关重要。
因此，申请人对该药物进行了多成分含量测定的研究，以提升其质量控制水平，为科学评价和有效控制黄精赞育胶囊的质量提供更科学的依据。
发明内容
本发明的目的是提供了一种同时测定黄精赞育胶囊中多种指标的定量方法，解决目前黄精赞育胶囊中仅控制1种成分的含量不能较全面的反映黄精赞育胶囊质量的问题，为科学评价和有效控制黄精赞育胶囊的质量提供更科学的依据。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种同时测定黄精赞育胶囊中多种指标的定量方法，其特征在于，采用HPLC法同时测定黄精赞育胶囊中淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和蛇床子素的含量。
进一步地，具体包括如下步骤：
(1)液相色谱工作条件：液相色谱仪工作条件，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：甲醇-水；梯度洗脱；流速：0.9-1.1mL/min；柱温：25-40℃；检测波长：245-335nm；
(2)供试品溶液制备方法的考察：对供试品溶液制备过程中溶剂类型、溶剂体积，提取时间和次数进行考察。提取溶剂，甲醇的浓度为60-90％；提取体积为供试品含量的10-50倍量；超声提取时间为0.50-1.00h，超声提取次数为1-5次。
(3)对照品溶液的制备：称取淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素，以甲醇为溶剂，配制成混合对照品溶液，摇匀，冷藏保存备用；
(4)供试品溶液的制备：称取同批次胶囊内容物，放入具塞锥形瓶中，加入甲醇，超声提取，滤过，合并滤液并定容，取样过滤，取续滤液作为供试品溶液；
(5)测定法与系统适用性试验：分别吸取淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱；在此色谱条件下，分离度和理论塔板数以淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素峰计算。
在上述方法的步骤(1)中，优选地，液相色谱仪工作条件：流动相：A相甲醇-B相水；梯度洗脱为：0-5min，35％A相；5-35min，35％-58％A相；35-100min，58％-76％A相；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：254nm和320nm。
在上述方法的步骤(2)中，优选地，甲醇的体积浓度为75％。超声提取时间为0.75h，超声提取次数为3次。
在上述方法的步骤(3)中，优选地，混合对照品溶液中淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素的浓度分别为0.0240mg/mL，0.0130mg/mL，0.0084mg/mL，0.1900mg/mL、0.0600mg/mL。
在上述方法的步骤(4)中，优选地，称取胶囊内容物的量为0.93g。
在上述方法的步骤(5)中，优选地，淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素对照品溶液和供试品溶液的吸取量为10μL。在此色谱条件下，各组分分离完全，各组分峰的分离度均大于1.5，理论塔板数以2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计均高于5000。
与现有技术相比，本发明的有益效果：建立了一种同时测定黄精赞育胶囊中多种指标的定量方法，所采用的质量控制方法科学合理，准确度高，重现性好，能较全面有效地控制黄精赞育胶囊制剂的质量，为科学评价和有效控制其质量提供更科学的依据。
为了研究一种同时测定黄精赞育胶囊中多种指标的定量方法，申请人对此进行了大量的实验以筛选最佳方案，具体如下：
本发明人采用高效液相色谱法建立了黄精赞育胶囊中淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素含量的同时测定方法，并进行了方法学验证：线性关系考察结果表明5个成分在各自范围内线性关系良好；精密度试验结果表明日内、日间精密度良好；重复性试验结果表明重复性良好；.稳定性试验表明供试品溶液在60h内保持稳定；加样回收率试验结果表明淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素的平均加样回收率分别为97.68％，95.52％，100.06％，96.78％，97.62％。
附图说明
图1混合对照品溶液在254nm的色谱图(a.淫羊藿苷；b.大黄素；c.五味子甲素)；
图2混合对照品溶液在320nm的色谱图(d.2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；e.蛇床子素)；
图3供试品溶液在254nm的色谱图(a.淫羊藿苷；b.大黄素；c.五味子甲素)；
图4供试品溶液在320nm的色谱图(d.2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；e.蛇床子素)；
图5空白、供试品溶液、混合对照品溶液在253nm的色谱图(a.淫羊藿苷；b.大黄素；c.五味子甲素)；
图6空白、供试品溶液、混合对照品溶液在320nm的色谱图(d.2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；e.蛇床子素)
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步详细的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。任何对发明内容实施方案进行非本质的改进、调整或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1.HPLC法同时测定黄精赞育胶囊中多种指标含量
1.仪器与试药
高效液相色谱仪：岛津LC-20AT高效液相色谱仪(配备SPD-M20A二极管阵列检测器，SIL-20A自动进样器，SIL-20A柱温箱)；KQ-500DE数控超声波清洗器；真空泵。
试剂试药：淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素对照品均购自上海诗丹德生物技术有限公司；色谱甲醇(北京迪科马科技有限公司)；液相用水为屈臣氏蒸馏水；黄精赞育胶囊(上海新亚药业邗江有限公司)。
2.液相色谱仪工作条件：色谱柱：Agilent C18(250*4.6，5μm)色谱柱；流动相：A相甲醇-B相水；流速：1.0mL/min；梯度洗脱为：0-5min，35％A相；5-35min，35％-58％A相；35-100min，58％-76％A相；柱温：35℃；检测波长：254nm和320nm。
3.供试品溶液制备方法的考察
3.1供试品处理方法
3.1.1提取溶剂考察：精密称取同批次胶囊内容物0.93g，平行4份，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入等体积75％甲醇、50％甲醇、100％甲醇、50％乙醇适量，超声提取，滤过，合并滤液并定容，取样过滤，取续滤液作为供试品溶液，结果显示：75％甲醇提取较50％甲醇、100％甲醇、50％乙醇提取多指标成分含量最大，故定75％甲醇作为最优提取溶剂。
3.1.2提取溶剂体积考察：精密称取同批次胶囊内容物0.93g，平行3份，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入75％甲醇5ml/0.31g、10ml/0.31g、15ml/0.31g，超声提取，滤过，合并滤液并定容，取样过滤，取续滤液作为供试品溶液，结果显示：提取溶剂用量对各指标成分的提取含量影响无显著性差异，故定5ml/0.31g 75％甲醇作为最优提取溶剂体积。
3.1.3提取时间考察：精密称取同批次胶囊内容物0.93g，平行3份，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入75％甲醇5mL/0.31g即15mL，分别超声提取30min、45min、60min，滤过，合并滤液并定容，取样过滤，取续滤液作为供试品溶液，结果显示：提取时间对各指标成分的提取含量影响无显著性差异，继续考察提取次数的影响。
3.1.4提取次数考察：精密称取同批次胶囊内容物0.93g，平行2份，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入75％甲醇5mL/0.31g即15mL，分别超声提取30min、45min，滤过，分别提取5次，取样过滤，取续滤液作为供试品溶液，结果显示：提取时间45min提取次数3次时各指标成分的提取含量最高，故定提取时间为45min,提取次数为3次为最优提取时间和提取次数。
4.对照品溶液的制备：精密称取淫羊藿苷1.20mg、大黄素0.65mg、五味子甲素0.42mg、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷9.50mg、蛇床子素3.0mg，以75％甲醇定容，配制成上述5个成分质量浓度分别为：0.024,0.013,0.0084,0.19,0.06mg/mL的混合对照品储备液，摇匀，冰箱保存备用；
5.供试品溶液的制备：精密称取同批次胶囊内容物0.93g，置于具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇5mL/0.31g即15mL，超声提取45min，滤过，提取三次，合并滤液定容至50mL，取样滤过，取续滤液作为供试品溶液；
6.测定法与系统适用性试验：分别取淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素对照品溶液和供试品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱；在此色谱条件下，各组分分离完全，各组分峰的分离度均大于1.5，理论塔板数以2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计均高于5000。
7.线性关系考察
分别精密称取淫羊藿苷1.20mg，大黄素0.65mg，五味子甲素0.42mg，2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷9.50mg，蛇床子素3.0mg，以75％甲醇定容，配制成上述5个成分质量浓度分别为：0.024,0.013,0.0084,0.19,0.06mg/ml的混合对照品储备液，摇匀，冰箱保存备用。精密量取上述混合对照品储备液7mL,以75％甲醇定容至10mL，稀释成上述5个成分质量浓度分别为：0.01680,0.00910,0.00588,0.13300,0.04200mg/ml的混合对照品溶液，分别精密吸取淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素对照品混合溶液1,2,5,10,15,20μL，注入液相色谱仪，记录峰面积(其中淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素记录254nm下峰面积，2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素记录320nm下峰面积)。以对照品进样量(X，ng)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1，表明5个成分在各自范围内均呈良好的线性关系。
表1五种成分线性回归方程和线性范围
8.精密度试验
精密吸取同一供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，计算淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、二苯乙烯苷、蛇床子素峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.108％、1.931％、0.997％、0.868％、0.162％，实验结果表明日内精密度良好。按上述色谱条件连续6天进样，测定6次，记录色谱图，计算各成分峰面积的RSD分别为1.173％、2.379％、1.216％、2.779％、0.241％，实验结果表明日间精密度良好。
9.重复性试验
取同一批黄精赞育胶囊6份混匀，精密称定，按上述供试品制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别进样测定，记录色谱图，计算淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、二苯乙烯苷、蛇床子素峰面积的RSD分别为1.792％、1.968％、2.283％、2.574％、2.530％，实验结果表明重复性良好。
10.稳定性试验
精密称取一批次黄精赞育胶囊0.93g，按供试品制备方法制备供试品溶液，分别于0h，3h，6h，9h，12h，24h，36h，48h，60h，72h，96h，120h，144h，168h，按上述色谱条件进样测定，记录色谱图，分别计算各成分在24h、36h、48h、60h、72h、96h、120h、144h、168h内峰面积的RSD。结果见表2，表明供试品溶液在48h内保持稳定。
表2稳定性试验
11.加样回收率试验
取一批次样品12粒，混匀后精密称取6份，分别按样品含量：对照品量(1:1)比例大致加入一定量的淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素对照品溶液。按照上述供试品制备方法制备供试品溶液。精密吸取上述制备溶液10μL，按上述色谱条件进样测定，计算淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、二苯乙烯苷、蛇床子素的平均加样回收率分别为97.68％、95.52％、100.06％、96.78％、97.62％。
Claims (12)
1.一种同时测定黄精赞育胶囊中多种指标的定量方法，其特征在于，所采用的方法为HPLC法同时测定黄精赞育胶囊中多种指标的含量，包括以下步骤：液相色谱仪工作条件的确定，供试品溶液制备方法的考察，对照品和供试品溶液的制备，测定法与系统适用性试验。测定成分分别为淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和蛇床子素。
2.根据权利要求1所述的一种同时测定黄精赞育胶囊中多种指标的定量方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)液相色谱仪工作条件的确定；对液相色谱仪工作条件中的色谱柱，流动相，洗脱程序，流速，柱温和检测波长进行确定；
(2)供试品溶液制备方法的考察：对供试品溶液制备过程中溶剂类型、溶剂体积，提取时间和次数进行考察；
(3)对照品溶液的制备：称取测定成分，以甲醇为溶剂，配制成混合对照品溶液，摇匀，冷藏保存备用；
(4)供试品溶液的制备：称取同批次胶囊内容物，放入具塞锥形瓶中，加入甲醇，超声提取，滤过，合并滤液并定容，取样过滤，取续滤液作为供试品溶液；
(5)测定法与系统适用性试验：分别吸取等体积的对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱；分离度和理论塔板数以测定成分峰计算。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，液相色谱仪工作条件，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：甲醇-水；梯度洗脱；流速：0.9-1.1mL/min；柱温：25-40℃；检测波长：245-335nm。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，供试品溶液制备方法的考察：分别以多个浓度的甲醇和乙醇为提取溶剂，再分别以已确定浓度的甲醇溶剂的多个体积为提取溶剂体积，再分别以已确定甲醇溶剂体积的多个提取时间为超声提取时间，多个提取次数为提取次数，提取并配制成供试品溶液，对供试品溶液制备过程中溶剂类型、溶剂体积，提取时间和次数进行考察。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对照品溶液的制备：称取测定成分，淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素制成混合对照品溶液。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，供试品溶液的制备：称取同批次胶囊内容物的量为0.30-1.00g。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，测定法：吸取量为1-20μL；系统适用性试验：分离度和理论塔板数以测定成分峰计算。
8.根据权利要求2和3之一所述的方法，其特征在于，所述液相色谱仪工作条件，流动相：A相甲醇，B相水；梯度洗脱为：0-5min，35％A相；5-35min，35％-58％A相；35-100min，58％-76％A相；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：254nm和320nm。
9.根据权利要求2和4之一所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂，甲醇的浓度为60-90％；提取体积为供试品含量的10-50倍量；超声提取时间为0.50-1.00h，超声提取次数为1-5次。
10.根据权利要求2和5之一所述的方法，其特征在于，对照品溶液的制备：混合对照品溶液中淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素的浓度分别为0.0240mg/mL，0.0130mg/mL，0.0084mg/mL，0.1900mg/mL、0.0600mg/mL。
11.根据权利要求2和6之一所述的方法，其特征在于，供试品溶液的制备：称取同批次胶囊内容物的量为0.93g。
12.根据权利要求2和7之一所述的方法，其特征在于，测定法：吸取量为10μL；系统适用性试验：各组分分离完全，分离度以淫羊藿苷、大黄素、五味子甲素、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蛇床子素峰计算均不低于1.5，理论塔板数以2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于5000。
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