CN114152687A - 一种包含莲子的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包含莲子的中药复方的检测方法，其包括如下步骤：取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中该中药复方由黄芩、麦门冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参组成，该对照品为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和黄芩苷，该检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液或缓冲盐水溶液，根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或成分及其含量信息。本发明对包含莲子的中药复方的化学成分进行了全面系统地解析，为质量控制和药效物质基础的深入研究提供了理论依据。

Description

一种包含莲子的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用
技术领域
本申请涉及中药质量鉴定技术领域，特别是涉及一种包含莲子的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用。
背景技术
随着我国中药制剂的快速发展，中药制剂的质量管理问题也受到了人们的广泛关注，其质量的优劣会直接影响到医疗质量和患者生命安危。中药(包括单味中药和中药复方)指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。
与指标成分含量测定的质量分析方法相比，指纹图谱能够比较全面地反映中药化学成分的种类和数量，在中药复方制剂有效成分尚未完全阐明的现状下，可实现对中药内在质量的综合评价和对其整理物质的有效控制，是目前中药标准汤剂及其制剂质量控制的有效手段之一。中药指纹图谱的检测方法有色谱法、光谱法、波谱法等。色谱法主要包括薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳、液质联用等，其中高效液相色谱法具有高效、快速、灵敏、重现性好的特点，与紫外检测器(UV)、二极管阵列检测器(DAD)、蒸发光散射检测器(ELSD)和质谱检测器(MS)等对种检测器联用，可用于中药中对多种复杂成分的分析检测。
中药特征图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药制剂及中间体质量的真实性、优良性和稳定性。在目前中药及其制剂的有效成分尚未能完全阐明的情况下，相较于指标成分含量测定，特征图谱能更好的从整体性客观反映中药制剂的质量，是目前中药及其制剂质量有效控制的主流手段之一。
目前，尚未见文献报道对包含莲子的中药复方的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种包含肉桂的中药复方成分检测方法及其指纹图谱构建方法。该检测方法测得的图谱能较全面的反映上述中药复方中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量，从而对其质量能够进行有效地监控，提高包含肉桂的中药复方的质量从而保证疗效。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
根据本发明的一个方面，提供了一种包含莲子的中药复方的检测方法，其包括如下步骤：
取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中该中药复方由黄芩、麦门冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参组成，该对照品为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和黄芩苷，
该检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，5％A；12～13min，5％～18％A；13～18min，18％～20％A；18～28min，20％A；28～29min，20％～26％A；29～40min，26％A；40～55min，26％～32％A；55～60min，32％～40％A；60～75min，40％～45％A；75～78min，45％～80％A；78～80min，80％A，流速为0.6～1.5mL/min，柱温为20～40℃，检测波长为200～350nm；
根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息。
进一步地，该信息为根据所记录的该中药复方供试品溶液的色谱图和该对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算该中药复方中以下成分中一种或多种的含量：毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和黄芩苷。
进一步地，该中药复方供试品溶液的制备方法包括：称取适量的中药复方粉末，加适量的水溶解，以酸调节PH至1.0至2.5，70～85℃保温20～40分钟后离心，取离心后的上清液加第一溶剂振摇提取，水浴蒸干，残渣加第二溶剂溶解并定容，摇匀，过滤，取续滤液得到该中药复方供试品溶液。
进一步地，该水与该中药复方粉末的重量比为50～100。
进一步地，该酸为盐酸或盐酸与水任一比例混合的溶剂。
进一步地，该第一溶剂为乙酸乙酯、正丁醇和/或两者任一比例混合的溶剂。
进一步地，该第二溶剂为水、甲醇和/或两者任一比例混合的溶剂。
进一步地，该对照品溶液的制备方法包括：称取适量的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和黄芩苷；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为20～200μg/ml的该对照品溶液。
进一步地，该流速为0.8～1.2mL/min，该柱温为25～35℃，该检测波长为250～300nm。
进一步地，该检测的进样量为10μl。
进一步地，该中药复方供试品溶液和该对照品溶液在该检测之前用0.22μm或0.45μm微孔滤膜过滤。
进一步地，该黄芩苷对应的色谱峰的理论塔板数大于10000。
进一步地，该色谱柱的柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm。
进一步地，该色谱柱为Agilent5TC-C18(2)色谱柱、WatersSymmetry C18色谱柱或AgilentSBC18色谱柱。
进一步地，该色谱柱为Agilent5TC-C18(2)色谱柱。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
进一步地，该酸水溶液为0.1％～0.4％的酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.1％～0.4％的磷酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.3％的磷酸水溶液。
进一步地，该中药复方中黄芩、麦门冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参的重量比为1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5。
进一步地，该中药复方中黄芩、麦门冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参的重量比为2:2:2:2:2:3:3:3:3。
进一步地，该麦门冬为去心的麦门冬。
进一步地，该甘草为炙甘草。
进一步地，该莲子为去心的莲子。
进一步地，该黄芪为蜜炙黄芪。
进一步地，该茯苓为白茯苓。
进一步地，该对照品溶液为毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度为20μg/ml、甘草苷浓度为40μg/ml、黄芩苷浓度为200μg/ml的混合溶液。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含莲子的中药复方的指纹图谱构建方法，其包括以下步骤：
供试品溶液的制备：称取适量的中药复方粉末，加适量的水溶解，以酸调节PH至1.0至2.5，70～85℃保温20～40分钟后离心，取离心后的上清液加第一溶剂振摇提取，水浴蒸干，残渣加第二溶剂溶解并定容，摇匀，过滤，取续滤液得到该中药复方供试品溶液，其中该中药复方由黄芩、麦门冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参组成；
对照品溶液的制备：称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和黄芩苷，加10％～100％甲醇制成含各成分浓度为20～200μg/ml的该对照品溶液；
根据高效液相检测该供试品溶液和该对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱；
高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，5％A；12～13min，5％～18％A；13～18min，18％～20％A；18～28min，20％A；28～29min，20％～26％A；29～40min，26％A；40～55min，26％～32％A；55～60min，32％～40％A；60～75min，40％～45％A；75～78min，45％～80％A；78～80min，80％A，流速为0.6～1.5mL/min，柱温为20～40℃，检测波长为200～350nm。
进一步地，该高效液相检测的该流速为0.8～1.2mL/min，该柱温为25～35℃，该检测波长为250～300nm。
进一步地，该黄芩苷对应的色谱峰的理论塔板数大于10000。
进一步地，在该检测波长为280nm时，该指纹图谱包括1-10号峰，其中，4号峰为黄芩苷作为参照峰、2号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、3号峰为甘草苷，其保留时间分别为37.5～38.5min、23.5～24.5min、25.0～26.0min。
进一步地，该中药复方中黄芩、麦门冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参的重量比为1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5。
进一步地，该中药复方中黄芩、麦门冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参的重量比为2:2:2:2:2:3:3:3:3。
进一步地，该麦门冬为去心的麦门冬。
进一步地，该甘草为炙甘草。
进一步地，该莲子为去心的莲子。
进一步地，该黄芪为蜜炙黄芪。
进一步地，该对照品溶液为毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度为20μg/ml、甘草苷浓度为40μg/ml、黄芩苷浓度为200μg/ml的混合溶液。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
进一步地，该酸水溶液为0.1％～0.4％的酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.1％～0.4％的磷酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.3％的磷酸水溶液。
进一步地，该色谱柱为Agilent5TC-C18(2)色谱柱、WatersSymmetry C18色谱柱或AgilentSBC18色谱柱。
进一步地，该色谱柱为Agilent5TC-C18(2)色谱柱。
进一步地，在该检测波长为280nm时，1号峰为九味药材共有峰；2号峰来自黄芪药材；3号峰来自甘草药材；4号峰来自黄芩药材；5号峰来自黄芩药材；6号峰来自黄芩药材；7号峰来自黄芩药材；8号峰来自黄芩药材；9号峰来自黄芩药材；10号峰来自黄芩药材。
进一步地，该指纹图谱在检测波长280nm下，包括10个共有指纹峰，以黄芩苷4号色谱峰为参比峰，其他9个共有峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.28±0.02、2号色谱峰0.63±0.02、3号色谱峰0.67±0.01、5号色谱峰1.13±0.02、6号色谱峰1.22±0.02、7号色谱峰1.31±0.02、8号色谱峰1.80±0.04、9号色谱峰1.96±0.04、10号色谱峰2.03±0.04。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含对照品组合物的标准指纹图谱，该对照品组合物包含毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和黄芩苷，该标准指纹图谱为高效液相色谱图谱，在检测波长280nm下，该标准指纹图谱中呈现10个色谱峰，与参比峰黄芩苷的峰保留时间相比，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和甘草苷的色谱峰的相对保留时间分别为：0.63±0.02、0.67±0.01。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含对照品组合物的标准指纹图谱，该对照品组合物包含毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和黄芩苷，该标准指纹图谱为高效液相色谱图谱，其色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，5％A；12～13min，5％～18％A；13～18min，18％～20％A；18～28min，20％A；28～29min，20％～26％A；29～40min，26％A；40～55min，26％～32％A；55～60min，32％～40％A；60～75min，40％～45％A；75～78min，45％～80％A；78～80min，80％A，流速为0.6～1.5mL/min，柱温为20～40℃，检测波长为200～350nm。
进一步地，建立该标准指纹图谱后，按上述检测方法构建包含莲子的中药复方的指纹图谱，然后将其与该标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。
进一步地，建立该标准指纹图谱后，将上述构建方法所构建的指纹图谱与该标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。
根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述检测方法或根据上述构建方法或根据上述标准指纹图谱在包含莲子的中药复方的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含莲子的中药复方物质基准的质量监控方法，其包括以下步骤：
(1)按上述构建方法建立包含莲子的中药复方基准物质的标准特征图谱；
(2)取待检的包含莲子的中药复方供试品，按照上述构建方法得到特征图谱；
(3)供试品特征图谱中，应分别呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰，并应出现10个共有峰，以1、2、3、4(S)、5、6、7、8、9、10号峰为标记，
(4)以黄芩苷对照品相应的峰为S峰，计算所得图谱的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.28(峰1)、0.63(峰2)、0.67(峰3)、1.13(峰5)、1.22(峰6)、1.31(峰7)、1.80(峰8)、1.96(峰9)、2.03(峰10)。
(5)将所得的特征图谱导入国家药典委员会推荐使用的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，进行匹配分析，相似度应大于0.90；
(6)同时满足(3)～(5)项所述即为合格产品，不符合即为不合格产品。
本发明的方法对包含莲子的中药复方的质量进行有效监控，提高该中药复方的质量从而保证疗效。
更具体地，相对于现有技术，本发明具有以下优势和效果：
(1)本发明通过富集有效成分的办法解决了包含莲子的中药复方特征图谱峰少、协调性差的情况；
(2)本发明方法各指标峰性能参数优异；
(3)本发明在研究包含莲子的中药复方特征图谱过程中，确认了10个共有特征峰，对其相对保留时间进行研究，并确定了各特征峰的相对保留时间，为包含莲子的中药复方质量监控提供宏观可控的检测方法，保证药物的疗效，使包含莲子的中药复方能得到更加合理的监控；
(4)本发明不仅对特征图谱的相对保留时间进行监控，也对特征图谱的相似度进行监控，使评价指标更全面；
(5)本发明方法稳定性好、精密度高、重现性好。为完整、客观评价包含莲子的中药复方的质量提供了一种新的方法和手段。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本申请要求保护的范围。
图1为空白溶剂HPLC色谱图。
图2为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷与黄芩苷混合对照HPLC色谱图。
图3为缺黄芩阴性对照HPLC色谱图。
图4为缺甘草阴性对照HPLC色谱图。
图5为缺黄芪阴性对照HPLC色谱图。
图6为缺地骨皮阴性对照HPLC色谱图。
图7为缺人参阴性对照HPLC色谱图。
图8为缺车前子阴性对照HPLC色谱图。
图9为缺莲子阴性对照HPLC色谱图。
图10为缺麦冬阴性对照HPLC色谱图。
图11为缺茯苓阴性对照HPLC色谱图。
图12为供试品HPLC色谱图。
图13为多批匹配HPLC色谱图。
图14为多批基准物质所得共有模式。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例一
1、仪器和试剂
Waters2695色谱系统，包括四元梯度输液泵(Alliance2695型)、120位高性能自动进样器、原装进口色谱柱温箱、Waters2996型DAD二极管阵列检测器、Empower3色谱管理系统；
电子分析天平：SHIMADZΜ(岛津)AΜW120D、Sartoriμs(赛得利斯)BSA124S
超声清洗机：KQ-500DB型昆山市超声仪器有限公司
色谱柱：Agilent5TC-C18(2)柱(柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)
2、基准物质制备
按处方比例称取包含莲子的中药复方各味饮片，按处方加水，浸泡30分钟，武火加热至沸腾，调至文火保持微沸30分钟，收集煎液，趁热滤过，滤液置旋转蒸发仪中浓缩，浓缩至约100ml(相对密度为1.03～1.06)。取出，浸膏置不锈钢盘中，冷冻干燥，取出，粉碎，过三号筛，混匀，即得。
3、供试品溶液制备
取包含莲子的中药复方物质基准粉末约0.6g，精密称定，置50ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水定容至刻度，摇匀，以盐酸调节PH至1.5，80℃恒温静置30分钟后以5000r/min离心10分钟，取上清液加正丁醇：乙酸乙酯＝1:1预混溶液振摇提取两次，每次50ml，合并有机相，蒸干，残渣加50％甲醇溶解，并定容至25ml，滤过，取续滤液，即得。
4、对照品溶液制备
取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、甘草苷对照品、黄芩苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.02mg、甘草苷0.04mg、黄芩苷0.2mg的混合溶液，即得。
5、色谱条件
色谱柱：AgilentSB-C18柱(柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)
流动相：乙腈-0.1％磷酸
柱温：25℃
波长：280nm
流速：1.2ml/min
进样量：10μl
梯度洗脱如下表1所示：
表1流动相梯度洗脱表
Figure BDA0003347717020000091
Figure BDA0003347717020000101
理论塔板数按黄芩苷峰计算不低于10000。
6、试验结果
在供试品特征图谱中，分别呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰，并出现10个共有峰，按中药色谱特征图谱相似度评价系统计算，供试品特征图谱与对照特征图谱经相似度不高于0.90。各峰的相对保留时间为0.28(峰1)、0.63(峰2)、0.67(峰3)、1.13(峰5)、1.22(峰6)、1.31(峰7)、1.80(峰8)、1.96(峰9)、2.03(峰10)。
实施例二
1、仪器和试剂
高效液相色谱仪安捷伦1100色谱系统，包括G1322A型脱气机、G1311A型四元泵、G1313A型自动进样器、G1315B型DAD二极管阵列检测器、G1316A型柱温箱、Empower3色谱管理系统；
电子分析天平：SHIMADZΜ(岛津)AΜW120D、Sartoriμs(赛得利斯)BSA124S；
超声清洗机：KQ-500DB型昆山市超声仪器有限公司；
色谱柱：WatersSymmetryC18柱(柱长25cm，内径4.6mm，粒径5μm)；
2、基准物质制备
按处方比例称取包含莲子的中药复方各味饮片，按处方加水，浸泡30分钟，武火加热至沸腾，调至文火保持微沸30分钟，收集煎液，趁热滤过，滤液置旋转蒸发仪中浓缩，浓缩至约100ml(相对密度为1.03～1.06)。取出，浸膏置不锈钢盘中，冷冻干燥，取出，粉碎，过三号筛，混匀，即得。
3、供试品溶液制备
取包含莲子的中药复方物质基准粉末约0.6g，精密称定，置50ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水定容至刻度，摇匀，以10％盐酸调节PH至2.0，80℃恒温静置30分钟后以5000r/min离心10分钟，取上清液加正丁醇：乙酸乙酯＝1:3预混溶液振摇提取两次，每次50ml，合并有机相，蒸干，残渣加50％甲醇溶解，并定容至25ml，滤过，取续滤液，即得。
4、对照品溶液制备
取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、甘草苷对照品、黄芩苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.02mg、甘草苷0.04mg、黄芩苷0.2mg的混合溶液，即得。
5、色谱条件
色谱柱：WatersSymmetryC18柱(柱长25cm，内径4.6mm，粒径5μm)
流动相：乙腈-0.4％磷酸
柱温：35℃
波长：280nm
流速：0.8ml/min
进样量：10μl
梯度洗脱如下表2所示：
表2流动相梯度洗脱表
Figure BDA0003347717020000111
Figure BDA0003347717020000121
理论塔板数按黄芩苷峰计算不低于10000。
6、试验结果
在供试品特征图谱中，分别呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰，并出现10个共有峰，按中药色谱特征图谱相似度评价系统计算，供试品特征图谱与对照特征图谱经相似度不高于0.90。各峰的相对保留时间为0.28(峰1)、0.63(峰2)、0.67(峰3)、1.13(峰5)、1.22(峰6)、1.31(峰7)、1.80(峰8)、1.96(峰9)、2.03(峰10)。
实施例三：流动相种类的选择
在其它条件与实施例一或实施例二相同的情况下，对特征图谱流动相系统进行选择，对比乙腈-0.3％磷酸、乙腈-0.3％甲酸、乙腈-0.3％醋酸进行筛选，结果乙腈-0.3％磷酸、乙腈-0.3％甲酸均能符合检测要求，但以乙腈-0.3％磷酸为流动相时，峰分布较均匀，各主要峰分离效果最好，最终确定乙腈0.3％磷酸为最佳流动相种类，可选流动相酸种类为乙腈-0.3％甲酸、乙腈-0.3％醋酸。
实施例四：流动相磷酸比例的选择
在其它条件与实施例一或实施例二相同的情况下，对特征图谱流动相磷酸比例进行选择，对比乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.2％磷酸、乙腈-0.3％磷酸、乙腈-0.4％磷酸进行筛选，结果乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.2％磷酸、乙腈-0.3％磷酸、乙腈-0.4％磷酸均能符合检测要求，但以乙腈-0.3％磷酸溶液为流动相时，峰分布较均匀，各主要峰分离效果较好，最终确定最佳流动相酸比例为乙腈-0.3％磷酸，可选流动相酸比例为乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.2％磷酸、乙腈-0.4％磷酸。
实施例五：检测波长的选择
在其它条件与实施例一或实施例二相同的情况下，采用PDA检测器对样品进行200～400nm范围内全波长扫描，结合主要成分的紫外光谱信息，对250nm、280nm、300nm波长下的色谱图进行比较，结果表明，检测波长为280nm时，峰信息最丰富，且整个色谱图的峰分布协调性最佳，故选用280nm为包含莲子的中药复方特征图谱的检测波长。
实施例六：洗脱梯度的优化
在其它条件与实施例一或实施例二相同的情况下，对特征图谱的梯度进行优化，对比如下梯度(如表3、表4和表5所示)：
表3包含莲子的中药复方特征图谱梯度1
Figure BDA0003347717020000131
表4包含莲子的中药复方特征图谱梯度2
Figure BDA0003347717020000132
Figure BDA0003347717020000141
表5包含莲子的中药复方特征图谱梯度3
Figure BDA0003347717020000142
结果表明，在包含莲子的中药复方特征图谱梯度3洗脱条件下，色谱峰分离度、峰宽等性能参数最佳基线平稳，且在该梯度下色谱峰的信息量较大、分析时间适中。
实施例七：柱温的选择
在其它条件与实施例一或实施例二相同的情况下，对特征图谱柱温进行选择，对比25℃、30℃、35℃进行筛选，结果柱温为25℃、30℃、35℃时均能满足检测要求，但柱温为30℃时，峰分布较均匀，各主要峰分离效果最好，最终确定30℃为最佳柱温，可选柱温为25℃、35℃。
实施例八：流速的选择
在其它条件与实施例一或实施例二相同的情况下，对特征图谱流速进行选择，对比0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min进行筛选，结果流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时均能满足检测要求，但流速为1.0ml/min时，峰分布较均匀，各主要峰分离效果最好，最终确定1.0ml/min为最佳流速，可选流速为0.8ml/min、1.2ml/min。
实施例九：色谱柱的选择
在其它条件与实施例一或实施例二相同的情况下，对特征图谱色谱柱进行选择，分别对比Agilent 5TC-C18(2)、Waters Symmetry C18、Agilent SB C18进行筛选，结果所选用的色谱柱均能满足检测要求，但色谱柱为Agilent5TC-C18(2)时，峰分布较均匀，各主要峰分离效果较好，性能参数最佳，最终确定Agilent5TC-C18(2)为最佳色谱柱，可选色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱(柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)。
因此，最终确定较佳的色谱条件如下所示：
色谱柱：Agilent5TC-C18(2)柱(柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)
流动相：乙腈-0.3％磷酸
柱温：30℃
波长：280nm
流速：1.0ml/min
进样量：10μl
梯度洗脱程序见表6。
表6流动相梯度洗脱表
Figure BDA0003347717020000151
Figure BDA0003347717020000161
理论塔板数按黄芩苷峰计算不低于10000。
实施例十：供试品PH值的选择
在其它条件与实施例一或实施例二相同的情况下，对供试品PH值进行选择，对比PH＝1.0、PH＝1.5、PH＝2.0进行筛选，结果PH＝1或2时，峰分布较均匀，协调性最佳。
实施例十一：供试品提取溶剂的选择
在其它条件与实施例一或实施例二相同的情况下，对供试品提取溶剂进行选择，对比正丁醇：乙酸乙酯＝1:1、正丁醇：乙酸乙酯＝1:3预混溶液进行筛选，当提取溶剂为正丁醇：乙酸乙酯＝1:1预混溶液时供试品各色谱峰分布均匀，总峰面积大，且色谱峰的各性能参数最佳，最终确定提取溶剂为正丁醇：乙酸乙酯＝1:1预混溶液，可选溶剂为正丁醇：乙酸乙酯＝1:3预混溶液。
实施例十二：溶解溶剂的选择
在其它条件与实施例一或实施例二相同的情况下，对供试品溶解溶剂进行选择，对比水、50％甲醇、甲醇进行筛选，结果当溶解溶剂为50％甲醇时供试品各色谱峰对称性、分离度等性能参数最佳，最终确定溶解溶剂为50％甲醇，可选溶剂为甲醇。
实施例十三：方法学验证
1、供试品溶液的制备：精密称取包含莲子的中药复方物质基准0.6g，精密称定，置50ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，并加水定容至刻度，摇匀，以盐酸溶液调节PH至1～2，80℃恒温静置30分钟后以5000r/min离心10分钟，取上清液加正丁醇：乙酸乙酯＝1:1预混溶液振摇提取两次，每次50ml，合并有机相，蒸干，残渣加50％甲醇溶解，并定容至25ml，滤过，取续滤液，即得。
2、对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、甘草苷对照品、黄芩苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.02mg、甘草苷0.04mg、黄芩苷0.2mg的混合溶液，即得。
3、单味药材及阴性对照溶液的制备：精密称取包含莲子的中药复方单味药材及阴性对照物质基准0.6g，精密称定，置50ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，并加水定容至刻度，摇匀，以盐酸调节PH至1～2，80℃恒温静置30min后以5000r/min离心10分钟，取上清液加正丁醇：乙酸乙酯＝1:1预混溶液振摇提取两次，每次50ml，合并有机相，蒸干，残渣加50％甲醇溶解，并定容至25ml，滤过，取续滤液，即得。
4、该包含莲子的中药复方物质基准及各单味与阴性对照品物质基准的制备方式如下：按处方量称取饮片及提取溶剂，浸泡30min，武火加热至沸，文火保持微沸30分钟，趁热过滤，滤液浓缩至相对密度为1.03～1.06的浸膏，干燥，碾细，过三号筛，即得。
5、专属性试验
精密吸取“单味药材及阴性对照溶液的制备”项下的缺黄芩的阴性对照溶液、缺麦冬的阴性对照溶液、缺地骨皮的阴性对照溶液、缺车前子的阴性对照溶液、缺甘草的阴性对照溶液、缺莲子的阴性对照溶液、缺茯苓的阴性对照溶液、缺黄芪的阴性对照溶液、缺人参的阴性对照溶液、对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂各10μl，注入液相色谱仪，按照“最终确定较佳的色谱条件”项下的色谱条件检测，记录色谱图，结果见图1～12。
结果显示：2号峰(tR：23.984min)为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、3号峰(tR：25.625min)为甘草苷、4号峰(tR：38.138min)为黄芩苷。1号峰为九味药材共有峰；2号峰来自黄芪药材；3号峰来自甘草药材；4号峰来自黄芩药材；5号峰来自黄芩药材；6号峰来自黄芩药材；7号峰来自黄芩药材；8号峰来自黄芩药材；9号峰来自黄芩药材；10号峰来自黄芩药材。空白溶剂无干扰。
6、进样精密度
按照“最终确定较佳的色谱条件”项下的色谱条件检测，取同一供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图，计算相对保留时间与相似度。
结果表明：10个共有峰的相对保留时间小于0.1％。采用国家药典委员会推荐的“中药色谱特征图谱相似度评价系统”2012版软件进行数据处理，以包含莲子的中药复方物质基准(冻干粉)对照特征图谱为参照谱，相似度均在0.90以上。综合判断，该方法的进样精密度好，符合特征图谱的要求。
7、方法重复性
按照“最终确定较佳的色谱条件”项下的色谱条件检测，取同一批供试品，按“1、供试品溶液制备”的方法制备6份供试品，注入液相色谱仪，计算相对保留时间与相似。
结果表明：10个共有峰的相对保留时间RSD％均小于0.4％，采用国家药典委员会推荐的“中药色谱特征图谱相似度评价系统”2012版软件进行数据处理，以包含莲子的中药复方物质基准对照特征图谱为参照谱，相似度均在0.90以上。综合判断，该方法的重复性好，符合特征图谱的要求。
8、中间精密度(不同仪器)
按照“最终确定较佳的色谱条件”项下的色谱条件检测，取同一供试品溶液，分别在Agilent高效液相色谱仪和Waters高效液相色谱仪上进行试验，记录色谱图，计算相对保留时间及相似度。
结果表明：10个共有峰的相对保留时间相对评价偏差均小于2.5％，采用国家药典委员会推荐的“中药色谱特征图谱相似度评价系统”2012版软件进行数据处理，以包含莲子的中药复方物质基准对应实物(冻干粉)对照特征图谱为参照谱，相似度均在0.90以上。综合判断，方法的中间精密度(不同品牌液相色谱仪)好，符合特征图谱的要求。
9、中间精密度(不同人员)
按照“最终确定较佳的色谱条件”项下的色谱条件检测，取同一冻干粉样品，由甲、乙、丙三位不同实验人员按照相同方法制备供试品溶液两份，注入同一液相色谱仪，记录色谱图，计算相似度，结果见表7。
表7中间精密度(不同实验人员)相似度结果
Figure BDA0003347717020000181
Figure BDA0003347717020000191
结果表明：10个共有峰的相对保留时间RSD％均小于0.06％、采用国家药典委员会推荐的“中药色谱特征图谱相似度评价系统”2012版软件进行数据处理，以包含莲子的中药复方物质基准对照特征图谱为参照谱，相似度均在0.90以上。综合判断，该方法的中间精密度(不同实验人员)好，符合特征图谱的要求。
10、稳定性试验
按照“最终确定较佳的色谱条件”项下的色谱条件检测，取同一供试品液分别于配制后0、2、4、8、12、24、36、48、72、96小时，测定，记录色谱图，计算相似度，结果见表8。
表8稳定性相似度结果
时间(h) 相似度
对照特征图谱 1.000
0 0.979
2 0.979
4 0.979
8 0.979
12 0.979
24 0.979
36 0.979
48 0.979
72 0.979
96 0.979
结果表明：10个共有峰的相对保留时间RSD％均小于1％。采用国家药典委员会推荐的“中药色谱特征图谱相似度评价系统”2012版软件进行数据处理，以包含莲子的中药复方对应实物(冻干粉)对照特征图谱为参照谱，相似度均在0.90以上。说明供试品溶液在96小时内稳定，满足检测需要。
实施例十四：对照指纹图谱的建立及相对保留时间的确定
1、供试品的制备
采用“实施例十三：方法学验证”下方法制备20批包含莲子的中药复方基准物质，按“实施例十三：方法学验证”下方法制备供试品溶液，按照“最终确定较佳的色谱条件”项下的色谱条件检测。
2、参照峰的选择
黄芩苷化学结构确定、性质稳定，其在特征图谱中，出峰时间居中，分离度好，峰面积大，故选取4号峰(黄芩苷)为特征图谱参照峰。
3、共有峰的匹配与共有峰的相对保留时间计算
以4号峰(黄芩苷)的保留时间为参照，计算共有峰的相对保留时间。
采用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，对20批基准物质图谱进行匹配，结果见图13，表9。
由匹配图可知，所选10个特征峰为20批基准物质所共有，因此确定所选10个峰为共有色谱峰，并确定共有模式，结果见图14。
所测20批包含莲子的中药复方物质基准相对保留时间RSD％均小于1，故选用20批相对保留时间均值作为相对保留时间规定值，各特征峰的规定值为：0.28(峰1)、0.63(峰2)、0.67(峰3)、1.13(峰5)、1.22(峰6)、1.31(峰7)、1.80(峰8)、1.96(峰9)、2.03(峰10)。
表920批物质基准对应实物(冻干粉)特征图谱相似度
Figure BDA0003347717020000201
Figure BDA0003347717020000211
将20批包含莲子的中药复方基准物质所得色谱图导入中药色谱特征图谱相似度评价系统计算，供试品特征图谱与对照特征图谱经相似度计算，相似度均高于0.90。
经过对20批包含莲子的中药复方基准物质特征图谱进行分析，最终确定包含莲子的中药复方特征图谱质量标准如下：供试品特征图谱中，应分别呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰，并应出现10个共有峰，以1、2、3、4(S)、5、6、7、8、9、10号峰为标记，按中药色谱特征图谱相似度评价系统，供试品特征图谱与对照特征图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。与黄芩苷对照品相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.28(峰1)、0.63(峰2)、0.67(峰3)、1.13(峰5)、1.22(峰6)、1.31(峰7)、1.80(峰8)、1.96(峰9)、2.03(峰10)。
以上对本申请实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本申请的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本申请的思想，基于本申请的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本申请保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (7)

1.一种包含莲子的中药复方的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中所述中药复方由黄芩、麦门冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参组成，所述对照品为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和黄芩苷，
所述检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，5％A；12～13min，5％～18％A；13～18min，18％～20％A；18～28min，20％A；28～29min，20％～26％A；29～40min，26％A；40～55min，26％～32％A；55～60min，32％～40％A；60～75min，40％～45％A；75～78min，45％～80％A；78～80min，80％A，流速为0.6～1.5mL/min，柱温为20～40℃，检测波长为200～350nm；
根据检测结果，获得所述中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述信息为根据所记录的所述中药复方供试品溶液的色谱图和所述对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算所述中药复方中以下成分中一种或多种的含量：毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和黄芩苷；
优选地，所述中药复方供试品溶液的制备方法包括：称取适量的中药复方粉末，加适量的水溶解，以酸调节PH至1.0至2.5，70～85℃保温20～40分钟后离心，取离心后的上清液加第一溶剂振摇提取，水浴蒸干，残渣加第二溶剂溶解并定容，摇匀，过滤，取续滤液得到所述中药复方供试品溶液；
优选地，所述水与所述中药复方粉末的重量比为50～100；
优选地，所述酸为盐酸或盐酸与水任一比例混合的溶剂；
优选地，所述第一溶剂为乙酸乙酯、正丁醇和/或两者任一比例混合的溶剂；
优选地，所述第二溶剂为水、甲醇和/或两者任一比例混合的溶剂；
优选地，所述对照品溶液的制备方法包括：称取适量的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和黄芩苷；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为20～200μg/ml的所述对照品溶液；
更优选地，所述流速为0.8～1.2mL/min，所述柱温为25～35℃，所述检测波长为250～300nm；
更优选地，所述检测的进样量为10μl；
更优选地，所述中药复方供试品溶液和所述对照品溶液在所述检测之前用0.22μm或0.45μm微孔滤膜过滤；
特别优选地，所述黄芩苷对应的色谱峰的理论塔板数大于10000；
尤其优选地，所述色谱柱的柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；
又尤其优选地，所述色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)色谱柱、Waters Symmetry C18色谱柱或Agilent SB C18色谱柱；
最优选地，所述色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)色谱柱。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，
所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸；
更优选地，所述酸水溶液为0.1％～0.4％的酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.1％～0.4％的磷酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.3％的磷酸水溶液；
特别优选地，所述中药复方中黄芩、麦门冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参的重量比为1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5；
尤其优选地，所述中药复方中黄芩、麦门冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参的重量比为2:2:2:2:2:3:3:3:3；
又尤其优选地，所述麦门冬为去心的麦门冬；
又尤其优选地，所述甘草为炙甘草；
又尤其优选地，所述莲子为去心的莲子；
又尤其优选地，所述黄芪为蜜炙黄芪；
又尤其优选地，所述茯苓为白茯苓；
最优选地，所述对照品溶液为毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度为20μg/ml、甘草苷浓度为40μg/ml、黄芩苷浓度为200μg/ml的混合溶液。
4.一种包含莲子的中药复方的指纹图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：称取适量的中药复方粉末，加适量的水溶解，以酸调节PH至1.0至2.5，70～85℃保温20～40分钟后离心，取离心后的上清液加第一溶剂振摇提取，水浴蒸干，残渣加第二溶剂溶解并定容，摇匀，过滤，取续滤液得到所述中药复方供试品溶液，其中所述中药复方由黄芩、麦门冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参组成；
对照品溶液的制备：称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和黄芩苷，加10％～100％甲醇制成含各成分浓度为20～200μg/ml的所述对照品溶液；
根据高效液相检测所述供试品溶液和所述对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱；
高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～12min，5％A；12～13min，5％～18％A；13～18min，18％～20％A；18～28min，20％A；28～29min，20％～26％A；29～40min，26％A；40～55min，26％～32％A；55～60min，32％～40％A；60～75min，40％～45％A；75～78min，45％～80％A；78～80min，80％A，流速为0.6～1.5mL/min，柱温为20～40℃，检测波长为200～350nm。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，
所述高效液相检测的所述流速为0.8～1.2mL/min，所述柱温为25～35℃，所述检测波长为250～300nm；
优选地，所述黄芩苷对应的色谱峰的理论塔板数大于10000；
更优选地，在所述检测波长为280nm时，所述指纹图谱包括1-10号峰，其中，4号峰为黄芩苷作为参照峰、2号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、3号峰为甘草苷，其保留时间分别为37.5～38.5min、23.5～24.5min、25.0～26.0min；
特别优选地，所述中药复方中黄芩、麦门冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参的重量比为1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5:1～5；
尤其优选地，所述中药复方中黄芩、麦门冬、地骨皮、车前子、甘草、莲子、茯苓、黄芪和人参的重量比为2:2:2:2:2:3:3:3:3；
又尤其优选地，所述麦门冬为去心的麦门冬；
又尤其优选地，所述甘草为炙甘草；
又尤其优选地，所述莲子为去心的莲子；
又尤其优选地，所述黄芪为蜜炙黄芪；
又尤其优选地，所述茯苓为白茯苓；
最优选地，所述对照品溶液为毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度为20μg/ml、甘草苷浓度为40μg/ml、黄芩苷浓度为200μg/ml的混合溶液。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，
所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸；
更优选地，所述酸水溶液为0.1％～0.4％的酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.1％～0.4％的磷酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.3％的磷酸水溶液；
又优选地，所述色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)色谱柱、Waters Symmetry C18色谱柱或Agilent SB C18色谱柱；
又优选地，所述色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)色谱柱；
特别优选地，在所述检测波长为280nm时，1号峰为九味药材共有峰；2号峰来自黄芪药材；3号峰来自甘草药材；4号峰来自黄芩药材；5号峰来自黄芩药材；6号峰来自黄芩药材；7号峰来自黄芩药材；8号峰来自黄芩药材；9号峰来自黄芩药材；10号峰来自黄芩药材；
最优选地，所述指纹图谱在检测波长280nm下，包括10个共有指纹峰，以黄芩苷4号色谱峰为参比峰，其他9个共有峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.28±0.02、2号色谱峰0.63±0.02、3号色谱峰0.67±0.01、5号色谱峰1.13±0.02、6号色谱峰1.22±0.02、7号色谱峰1.31±0.02、8号色谱峰1.80±0.04、9号色谱峰1.96±0.04、10号色谱峰2.03±0.04。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法或根据权利要求4至6中任一项所述的构建方法在包含莲子的中药复方的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。
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