CN115201389B - 九味补血口服液中药制剂的指纹图谱建立方法及指纹图谱 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药质量控制技术领域，涉及一种九味补血口服液中药制剂的指纹图谱建立方法及指纹图谱。筛选色谱条件：流动相A乙腈，流动相B为甲酸溶液；梯度洗脱；制备对照品溶液、供试品溶液、阴性样溶液；取上述溶液按色谱条件注入高效液相色谱仪进行测定，得到指纹图谱。本研究利用HPLC‑ELSD建立九味补血口服液特征图谱检测方法，共标定出25个特征峰，指认了人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd，黄芪甲苷，甘草苷，柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素9个特征性成分，方法具有良好的灵敏度、重复性、稳定性，将更能有效控制九味补血口服液质量，保证各批次间药品质量稳定、均匀、有效、可控，确保疗效和用药安全。
Description
技术领域
本发明属于中药质量控制技术领域，涉及一种九味补血口服液中药制剂的指纹图谱建立方法及指纹图谱。
背景技术
九味补血口服液是广西白云山盈康药业有限公司独家生产的纯中药制剂，2022年获认定为广西第一批民族成药制剂，该制剂国家药品标准编号为YBZ00362007-2015Z，标准处方为人参75g、黄芪100g、绞股蓝100g、五味子100g、当归75g、白术50g、陈皮30g、山楂50g、甘草30g，具有益气补血、健脾益胃的功效。制剂处方源于壮族民间常用广西特色草药绞股蓝、陈皮配以常用中药人参、黄芪、当归、五味子、白术、山楂、甘草治疗失眠、头晕、乏力、气短自汗、食欲不振等症的经验方，是广西壮族民间医生传统和习用的益气补血、失眠健忘的经验良方，方中的人参、黄芪作为君药，绞股蓝、陈皮、白术、当归为臣药，山楂为佐药，甘草为使药，以上诸药合用，共奏益气补血、健脾益胃之功，用于气血两虚所致之失眠，健忘，心悸旺忡，头晕目眩，神疲乏力，短气自汗，纳呆食少等症，补气、补血、抗疲劳、促睡眠效果显著。九味补血口服液质量控制方面的报道已有针对方中人参、黄芪、绞股蓝、五味子等开展了薄层色谱鉴别研究，以及五味子醇甲、黄芪甲苷的含量测定，现有的专利及文献报道均难以系统反应及评价该制剂的质量。指纹图谱作为一种系统的质量评价模式，能科学系统地反映中药复方制剂的复杂性和整体性。因此，为了能更全面反映产品质量信息，更好地控制产品质量，我们研究和建立了九味补血口服液的指纹图谱质量控制方法，该方法的灵敏性、精密度、稳定性等均符合现代中药检测技术要求，确保各批次间药品质量稳定、均匀、有效、可控。
发明内容
本发明的目的在于提供一种九味补血口服液中药制剂的指纹图谱建立方法及指纹图谱，以提升九味补血口服液的质量控制水平。
为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案和步骤实现：
一种九味补血口服液中药制剂的指纹图谱建立方法，所述方法采用HPLC-ELSD指纹图谱检测法，具体步骤如下：
1)筛选色谱条件：流动相A乙腈，流动相B为甲酸溶液；梯度洗脱，流速：1.0mL/min；进样量15μL；
2)制备对照品溶液；
3)制备供试品溶液；
4)制备阴性样溶液；
5)精密度检测试验；
6)重复性检测试验；
7)检测供试品溶液稳定性；
8)测定：取步骤3)得到的供试品溶液、步骤4)得到的阴性溶液及步骤2)得到的对照品溶液按步骤1)色谱条件注入高效液相色谱仪进行测定，得到指纹图谱。
所述步骤1)中，
色谱条件为，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，规格为250×4.6mm，5μm；流动相A乙腈，流动相B为甲酸溶液；梯度洗脱，0-15min，18％-19％B；15-25min，19％-23％B；25-30min，23％B；30-34min，23％-25％B；34-54min，25％-30％B；54-59min，30％B；59-71min，30％-32％B；71-80min，32％-34％B；80-90min，34％-35％B；90-93min，35％-37％B；93-96min，37％-42％B；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量15μL；漂移管温度为45℃，载气压力为3.6bar。
所述步骤2)中，
对照品溶液的制备方法为：精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、黄芪甲苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷、川陈皮素对照品，分别置于10mL量瓶中，加入甲醇充分溶解后定容，制成质量浓度1-2mg/mL的各对照品贮备溶液；精密量取各对照品贮备溶液，用甲醇稀释制成质量浓度为100μg/ml的对照品溶液。
所述步骤3)中，
供试品溶液的制备方法为：精密量取九味补血口服液10ml，用水饱和正丁醇进行萃取3次，每次20ml，合并正丁醇萃取液，减压蒸干，加入甲醇复溶，转移并定容至5ml，摇匀，滤过，取续滤液即得。
所述步骤4)中，
阴性样品溶液的制备方法为：分别配置缺人参、缺黄芪、缺绞股蓝、缺五味子、缺当归、缺陈皮、缺白术、缺山楂、缺甘草9个阴性样品，按步骤3)供试品溶液的制备方法制备成阴性样品溶液。
所述步骤5)中，
精密度试验检测方法为：取步骤3)制备成的供试品溶液，以步骤1)中筛选的色谱条件进样，记录指纹图谱；以4号峰柚皮苷为参照峰S1，计算1-9号峰相对保留时间及相对峰面积，以22号峰人参皂苷Rd为参照峰S2，计算10-25号峰的相对保留时间及峰面积，以各峰的相对保留时间及峰面积的RSD作为参考指标。
所述步骤6)中，
重复性试验检测方法为：取步骤3)中供试品溶液，按步骤1)中筛选的色谱条件重复进样6次，记录指纹图谱；以4号峰柚皮苷为参照峰S1，计算1-9号峰相对保留时间及相对峰面积，以22号峰人参皂苷Rd为参照峰S2，计算10-25号峰的相对保留时间及峰面积，以各峰的相对保留时间及峰面积的RSD作为参考指标，计算相对保留时间的RSD、相对峰面积的RSD。
所述步骤7)中，
供试品溶液稳定性检测方法为：取步骤3)制备的供试品溶液在室温条件下放置0h、3h、6h、12h、24h、48h后，分别以步骤1)中筛选的色谱条件进样，记录指纹图谱；以4号峰柚皮苷为参照峰S1，计算1-9号峰相对保留时间及相对峰面积，以22号峰人参皂苷Rd为参照峰S2，计算10-25号峰的相对保留时间及峰面积，以各峰的相对保留时间及峰面积的RSD作为参考指标；计算相对保留时间的RSD、相对峰面积的RSD。
所述步骤8)得到的指纹图谱，供试品共标定出25个色谱峰，其中峰6、7、9、10、14、15、17、19、20、21、22共11个色谱峰来源于人参药材；峰8、11、12、13、16、24共6个色谱峰来源于忍冬藤药材；峰4、5、25来源于陈皮药材；峰18来源于黄芪药材；峰3来源于当归药材；峰2来源于甘草药材；峰23为绞股蓝和五味子的共有峰，峰1为五味子、绞股蓝、陈皮的共有峰；通过与对照品图谱对比，峰2为甘草苷，峰4、峰5、峰25分别为柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素，峰6、峰7、峰15、峰22分别为人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd，峰18为黄芪甲苷蜂。
本发明还提供一种上述的建立方法建立的指纹图谱。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本研究利用HPLC-ELSD首次建立九味补血口服液特征图谱检测方法，共标定出25个特征峰，指认了人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd，黄芪甲苷，甘草苷，柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素9个特征性成分，方法具有良好的灵敏度、重复性、稳定性，将更能有效控制九味补血口服液质量，保证各批次间药品质量稳定、均匀、有效、可控，确保疗效和用药安全。
附图说明
图1为人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd对照品色谱图；
图2为黄芪甲苷对照品色谱图；
图3为九味补血口服液供试品色谱图；
图4为缺人参阴性样品色谱图；
图5为缺黄芪阴性样品色谱图；
图6为缺绞股蓝阴性样品色谱图；
图7为缺五味子阴性样品色谱图；
图8为缺当归阴性样品色谱图；
图9为缺山楂阴性样品色谱图；
图10为缺白术阴性样品色谱图；
图11为缺甘草阴性样品色谱图；
图12为缺陈皮阴性样品色谱图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点和精神，下面通过实施例予以进一步阐释，但不构成对本发明的限制。
1.1仪器
Waters Alliance e2695色谱-Sedex 90LT-ELSD低温型蒸发光散射检测器(美国Waters公司)；MS105DU/A型十万分之一电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HWS-26型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；MS105DU十万分之一电子天平(梅特勒-托利多)。
1.2材料
人参皂苷Rg1(批号：110703-202034)、人参皂苷Re(批号：110754-202129)、人参皂苷Rb1(批号：110704-202028)、黄芪甲苷(批号：110781-202118)均购自中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rd(批号：5826)、橙皮苷(批号：5836)、柚皮苷(批号：10668)、甘草苷(批号：9654)、川陈皮素(批号：6082)均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。
九味补血口服液(广西白云山盈康药业有限公司，批号：211220、211221、211222、211223、211224、211225，规格：10mL/支)；人参阴性九味补血口服液、黄芪阴性九味补血口服液、陈皮阴性九味补血口服液、白术阴性九味补血口服液、当归阴性九味补血口服液、五味子阴性九味补血口服液、绞股蓝阴性九味补血口服液、山楂阴性九味补血口服液、甘草阴性九味补血口服液(均由广西白云山盈康药业有限公司生产，规格：10mL/支)；乙腈、甲酸为色谱纯(美国sigma-aldrich公司)，甲醇、正丁醇为分析纯(天津大茂公司)，乙酸乙酯为分析纯(广东光华公司)，水为超纯化水。
一种九味补血口服液中药制剂的指纹图谱建立方法及指纹图谱，所述方法采用HPLC-ELSD指纹图谱检测法，具体步骤如下：
2.1色谱条件
采用Waters Sunfire C18(250×4.6mm，5μm)为色谱柱；流动相：乙腈(A)－0.05％甲酸(B)；梯度洗脱(0-15min，18％-19％B；15-25min，19％-23％B；25-30min，23％B；30-34min，23％-25％B；34-54min，25％-30％B；54-59min，30％B；59-71min，30％-32％B；71-80min，32％-34％B；80-90min，34％-35％B；90-93min，35％-37％B；93-96min，37％-42％B)；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量15μL；漂移管温度为45℃，载气压力为3.6bar。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备
精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、黄芪甲苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷、川陈皮素对照品适量，分别置于10mL量瓶中，加入甲醇充分溶解后(必要时超声溶解)定容，制成适宜质量浓度(12mg/mL)的各对照品贮备溶液。精密量取各对照品贮备溶液适量，用甲醇稀释制成质量浓度为100μg/ml的对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备
精密量取九味补血口服液10ml，用水饱和正丁醇进行萃取3次，每次20ml，合并正丁醇萃取液，减压蒸干，加入甲醇复溶，转移并定容至5ml，摇匀，滤过，取续滤液即得。
2.2.3阴性样品溶液的制备
按处方分别配置缺人参、缺黄芪、缺绞股蓝、缺五味子、缺当归、缺陈皮、缺白术、缺山楂、缺甘草等9个阴性样品，依“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。
2.3 HPLC指纹图谱的建立及方法学验证
2.3.1精密度试验
取批号为211222的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录指纹图谱。以4号峰(柚皮苷)为参照峰S1，计算1-9号峰相对保留时间及相对峰面积(对数)，以22号峰(人参皂苷Rd)为参照峰S2，计算10-25号峰的相对保留时间及峰面积(对数)，以各峰的相对保留时间及峰面积(对数)的RSD作为参考指标。结果相对保留时间的RSD为0.0％-0.1％(n＝6)，相对峰面积的RSD为0.0％-0.3％(n＝6)，表明仪器精密度良好。
2.3.2重复性考察
取批号为211222样品，精密量取6份，按“2.2.2”项下方法制备溶液，以“2.1”项下色谱条件进样，记录指纹图谱。以4号峰(柚皮苷)为参照峰S1，计算1-9号峰相对保留时间及相对峰面积(对数)，以22号峰(人参皂苷Rd)为参照峰S2，计算10-25号峰的相对保留时间及峰面积(对数)，以各峰的相对保留时间及峰面积(对数)的RSD作为参考指标。结果相对保留时间的RSD为0.0％-0.6％(n＝6)，相对峰面积的RSD为0.0％-0.8％(n＝6)，表明方法重复性良好。
2.3.3稳定性考察
取批号为211222的供试品溶液，在室温下放置0h、3h、6h、12h、24h、48h后，按“2.1”项下色谱条件进样，记录指纹图谱。以4号峰(柚皮苷)为参照峰S1，计算1-9号峰相对保留时间及相对峰面积(对数)，以22号峰(人参皂苷Rd)为参照峰S2，计算10-25号峰的相对保留时间及峰面积(对数)，以各峰的相对保留时间及峰面积(对数)的RSD作为参考指标。结果相对保留时间的RSD为0.0％-0.4％(n＝6)，相对峰面积的RSD为0.0％-0.9％(n＝6)，表明供试品溶液在48小时内稳定。
2.3.4色谱峰归属研究
取批号为211222的供试品溶液、阴性溶液及对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件各进样15μl，记录色谱图。供试品共标定出25个色谱峰，其中峰6、7、9、10、14、15、17、19、20、21、22共11个色谱峰来源于人参药材；峰8、11、12、13、16、24共6个色谱峰来源于忍冬藤药材；峰4、5、25来源于陈皮药材；峰18来源于黄芪药材；峰3来源于当归药材；峰2来源于甘草药材；峰23为绞股蓝和五味子的共有峰，峰1为五味子、绞股蓝、陈皮的共有峰。处方中9味药材除白术、山楂均能找到对应的特征峰。通过与对照品图谱对比，峰2为甘草苷，峰4、峰5、峰25分别为柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素，峰6、峰7、峰15、峰22分别为人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd，峰18为黄芪甲苷，参将图1-12。
3样品的测定
按“2.1”项下的色谱条件，对6批样品进行特征图谱测定，6批样品均能检出25个特征峰，表明样品具备较好的一致性，25个特征峰的峰面积常用对数相对比值RSD％≦10％，表明批间一致性较好，生产工艺相对稳定。结果如下表1-表2所示：
表1不同批号九味补血口服液相对保留时间考察结果(n＝6)
表2不同批号九味补血口服液峰面积常用对数相对比值考察结果(n＝6)
4检测方法总结
4.1样品制备考察时选择中等极性的正丁醇及乙酸乙酯作为萃取剂，结果发现正丁醇作为萃取剂时，特征性物质保留更强，且样品萃取三次后，各峰面积增幅不大，因此选取正丁醇为萃取剂，萃取三次较为适宜。
4.2实验对比了样品氨处理前后的色谱峰变化，发现氨处理会导致较多的色谱峰丢失，但对人参皂苷成分几乎不影响，且黄芪甲苷色谱峰峰面积显著提高，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、黄芪甲苷5个色谱峰分离度>1.5，表明该色谱条件及氨处理的样品制备方法可同时作为测定人参皂苷与黄芪甲苷含量检测方法。
4.3本实验的人参、黄芪、绞股蓝中含有大量皂苷类活性成分，紫外检测波长均有末端吸收，容易被各种溶剂与吸收峰干扰，基线干扰大，且黄芪甲苷在紫外检测下响应值小，因此以蒸发光散射检测器进行检测。
本研究利用HPLC-ELSD建立九味补血口服液特征图谱检测方法，共标定出25个特征峰，指认了人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd，黄芪甲苷，甘草苷，柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素9个特征性成分，方法具有良好的灵敏度、重复性、稳定性，将更能有效控制九味补血口服液质量，保证各批次间药品质量稳定、均匀、有效、可控，确保疗效和用药安全。
Claims (7)
1.一种九味补血口服液中药制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述方法采用HPLC-ELSD指纹图谱检测法，具体步骤如下：
1）筛选色谱条件：流动相A乙腈，流动相B为甲酸溶液；梯度洗脱，流速：1.0 mL/min；进样量15 μL；
2）制备对照品溶液；
3）制备供试品溶液；
4）制备阴性样溶液；
5）精密度检测试验；
6）重复性检测试验；
7）检测供试品溶液稳定性；
8）测定：取步骤3）得到的供试品溶液、步骤4）得到的阴性溶液及步骤2）得到的对照品溶液按步骤1)色谱条件注入高效液相色谱仪进行测定，得到指纹图谱；
所述步骤1）中，
色谱条件为，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，规格为250×4.6mm，5μm；流动相A乙腈，流动相B为甲酸溶液；梯度洗脱，0-15 min，18%-19%B；15-25 min，19%-23% B；25-30 min，23% B；30-34 min，23%-25% B；34-54 min，25%-30% B；54-59 min，30% B；59-71min，30%-32% B；71-80 min，32%-34% B；80-90 min，34%-35% B；90-93 min，35%-37% B；93-96 min，37%-42% B；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量15 μL；漂移管温度为45℃，载气压力为3.6bar；
所述步骤2）中，
对照品溶液的制备方法为：精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、黄芪甲苷、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷、川陈皮素对照品，分别置于10 mL量瓶中，加入甲醇充分溶解后定容，制成质量浓度1-2 mg/mL的各对照品贮备溶液；精密量取各对照品贮备溶液，用甲醇稀释制成质量浓度为100μg/ml的对照品溶液。
2.如权利要求1所述的九味补血口服液中药制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤3）中，
供试品溶液的制备方法为：精密量取九味补血口服液10ml，用水饱和正丁醇进行萃取3次，每次20ml，合并正丁醇萃取液，减压蒸干，加入甲醇复溶，转移并定容至5ml，摇匀，滤过，取续滤液即得。
3.如权利要求1所述的九味补血口服液中药制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤4）中，
阴性样品溶液的制备方法为：分别配置缺人参、缺黄芪、缺绞股蓝、缺五味子、缺当归、缺陈皮、缺白术、缺山楂、缺甘草9个阴性样品，按步骤3）供试品溶液的制备方法制备成阴性样品溶液。
4.如权利要求1所述的九味补血口服液中药制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤5）中，
精密度试验检测方法为：取步骤3）制备成的供试品溶液，以步骤1）中筛选的色谱条件进样，记录指纹图谱；以4号峰柚皮苷为参照峰S1，计算1-9号峰相对保留时间及相对峰面积，以22号峰人参皂苷Rd为参照峰S2，计算10-25号峰的相对保留时间及峰面积，以各峰的相对保留时间及峰面积的RSD作为参考指标。
5.如权利要求1所述的九味补血口服液中药制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤6）中，
重复性试验检测方法为：取步骤3）中供试品溶液，按步骤1）中筛选的色谱条件重复进样6次，记录指纹图谱；以4号峰柚皮苷为参照峰S1，计算1-9号峰相对保留时间及相对峰面积，以22号峰人参皂苷Rd为参照峰S2，计算10-25号峰的相对保留时间及峰面积，以各峰的相对保留时间及峰面积的RSD作为参考指标，计算相对保留时间的RSD、相对峰面积的RSD。
6.如权利要求1所述的九味补血口服液中药制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤7）中，
供试品溶液稳定性检测方法为：取步骤3）制备的供试品溶液在室温条件下放置0h、3h、6h、12h、24h、48h后，分别以步骤1）中筛选的色谱条件进样，记录指纹图谱；以4号峰柚皮苷为参照峰S1，计算1-9号峰相对保留时间及相对峰面积，以22号峰人参皂苷Rd为参照峰S2，计算10-25号峰的相对保留时间及峰面积，以各峰的相对保留时间及峰面积的RSD作为参考指标；计算相对保留时间的RSD、相对峰面积的RSD。
7.如权利要求1所述的九味补血口服液中药制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤8）得到的指纹图谱，供试品共标定出25个色谱峰，其中峰6、7、9、10、14、15、17、19、20、21、22共11个色谱峰来源于人参药材；峰8、11、12、13、16、24共6个色谱峰来源于忍冬藤药材；峰4、5、25来源于陈皮药材；峰18来源于黄芪药材；峰3来源于当归药材；峰2来源于甘草药材；峰23为绞股蓝和五味子的共有峰，峰1为五味子、绞股蓝、陈皮的共有峰；通过与对照品图谱对比，峰2为甘草苷，峰4、峰5、峰25分别为柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素，峰6、峰7、峰15、峰22分别为人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd，峰18为黄芪甲苷蜂。
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