KR101158368B1

KR101158368B1 - 은어 단백질 및 펩타이드를 함유하는 항염증 활성용 조성물 및 추출방법

Info

Publication number: KR101158368B1
Application number: KR1020100032421A
Authority: KR
Inventors: 김재훈; 이주운; 최종일; 송범석; 윤요한; 성낙윤; 정필문; 전영하; 이승락
Original assignee: 봉화군
Priority date: 2010-04-08
Filing date: 2010-04-08
Publication date: 2012-06-22
Also published as: KR20110113080A

Abstract

본 발명은 은어 단백질 및 펩타이드를 함유하는 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 조성물 및 이들의 추출방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 염증반응인자로서의 산화질소(nitric oxide, NO) 및 사이토카인(종양괴사인자(TNF)-α, IL-6, IL-1β)와 프로스타글란딘 E2(prostaglandin, PGE2)의 생성을 억제하고, 사이토카인과 산화질소의 생성을 조절하는 단백질인 iNOS 및 염증 반응의 매개체인 사이클로옥시게나제2(cyclooxygenase, COX-2)등과 같은 단백질을 생성하는 mRNA의 생성을 억제하여 면역조절에 관여하는 대식세포(macrophage)의 기능을 조절하는 효과를 가지고 있다.
본 발명의 추출물인 은어 단백질 및 펩타이드는 염증면역반응에 의한 질환의 예방 및 치료에 유용한 조성물을 제공한다.

Description

은어 단백질 및 펩타이드를 함유하는 항염증 활성용 조성물 및 추출방법 {Composition for anti-inflammatory activity Containing sweetfish proteins and it's peptides and Method Thereof}

본 발명은 항염증 및 면역조절 활성을 나타내는 은어 단백질 및 펩타이드를 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 이는 염증반응인자로서의 사이토카인(종양괴사인자(Tumor necrosis factor(TNF)-α, Interleukin(IL)-6, IL-1β)의 생성 억제, 산화질소(nitric oxide, NO), 프로스타글란딘 E2(prostaglandin, PGE2)의 생성을 억제하고, 사이토카인과 산화질소의 생성을 조절하는 단백질인 iNOS (inducible nitric oxide synthase) 및 염증 반응의 매개체인 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2)등과 같은 단백질을 생성하는 mRNA의 생성을 억제하여 면역조절에 관여하는 대식세포 (macrophage)의 기능을 조절하는 효과를 가지고 있어 면역염증반응 질환의 예방 및 치료를 개선시키는데 유용한 의약품 또는 기능성 식품으로 제공하는데 있다.

은어(銀魚, sweet fish; 학명 Plecoglossus altivelis)는 바다빙어목 바다빙어과의 어류로 분류되며, 몸길이가 약 15cm로 어두운 청록색을 띤 회색으로 배쪽에 이를수록 그 빛깔이 연해진다. 9～10월 사이에 주로 산란하며, 물이 맑은 하천에 주로 서식하고 한국, 일본, 대만, 중국 등에 주로 분포한다. 은어는 회귀성 어류로서 육지와 가까운 바다에서 겨울을 보내고 이듬해 봄에 은어들이 태어난 하천으로 거슬러 올라와 일생을 보낸다. 은어의 수명은 보통 1년이고, 맛이 단백하고 비린내가 나지 않아 생선회, 구이, 조림, 튀김, 훈제 등으로 이용된다.

최근 어류로부터 정제된 다양한 기능성 펩타이드들이 개발되고 있는 추세이다. 그중 가장 대표적인 예로 정어리는 청어과의 바닷물고기로 아미노산이 풍부하며 식품으로 다양하게 이용되는 어류이다. 정어리펩타이드에는 발린(valine), 아르기닌(arginine), 아스파라긴산(aspartic acid), 글루타민산 (glutamic acid), 프롤린(proline), 라이신(lysine) 등 각종 아미노산이 풍부하다. 혈압조절과 관련된 보고를 보면 여러 펩타이드들 중 바릴타로신(valine-tyrosine) 펩타이드가 혈압을 낮추는 작용이 있는 것으로 보고 되어 있다. 정어리펩타이드는 인체 내에 혈압 조절에 도움을 주는 성분인 바릴티로신(Val-Tyr)이 함유된 원료로 일본에는 특정보건용식품으로 인정되어 판매되고 있다.

염증반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개 물질 분비, 체액침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등 외적 증상이 나타난다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부 물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성질환, 만성 염증)이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 산화질소(nitric oxide; NO)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제 (nitric oxide synthase; NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin; PGs)의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제(NOS)나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 시클로옥시게나제(COX) 는 염증을 차단하는데 있어서 주된 표적이 되고 있다.

최근의 연구 결과에 따르면, 니트릭옥사이드 신타제(nitric oxide synthase; NOS)는 몇 가지 종류가 존재하는데 뇌에 존재하는 bNOS (brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는데 반하여, 각종 사이토카인(cytokines)이나 외부 자극물질로 인해 유도되는 iNOS(inducible NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와 관련 있다는 연구가 있다.

또한, 시클로옥시게나제도 2종류의 이소형태가 존재하는데, 시클로옥시게나제-1(cyclooxygenase-1, COX-1)은 세포내에 항상 존재하여 세포보호 작용에 필요한 프로스타글란딘(PGs)을 합성하는 작용을 나타내는 것에 반하여, COX-2는 염증반응 시 세포내에서 급격히 증가되어 염증 반응을 일으키는 데 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. NO와 프로시타글란딘(PGs)의 정도를 향상시키는 iNOS 및 COX-2를 포함하는 전사 염증 인자는 다양한 경화(sclerosis), 파킨슨병(parkinson's disease), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease) 및 결장암(colon cancer)을 포함하는 만성 질환의 병인에 관련한다.

종양괴사인자(Tumor necrosis factor; TNF-α)와 같은 다 기능성 사이토카인(cytokine)은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변 과정에서 그 발현 정도가 증가되며, 특히 암촉진 과정에서 일어나는 피부염증에 중요한 역할을 한다. TNF-α가 인간의 염증성 피부질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고되고 있다. 여러 염증질환과 알러지 현상에 TNF-α에 대한 항체를 처리하였을 때 증상이 완화되었고, TNF-α는 호중성 백혈구를 활성화시켜 과산화수소 생성을 증가시킴으로써 내인성 암촉진제로서의 기능도 하고 있다. 따라서, 발암촉진 단계와 밀접한 관계가 있는 염증단계에 중추적 역할을 하고 있는 사이토카인인 TNF-α의 발현을 저해시키거나 COX-2 활성저해에 기인하는 프로스타글란딘 PGE2의 생성 억제를 통해 초기염증성 분자(proinflammatory molecule)의 증가를 수반하는 병변 과정을 조절할 수 있을 가능성이 높다.

한편, 대식세포(macrophage)는 혈액의 단핵세포(백혈구)에서 유래한 것으로 특수한 조직세포의 한 종류이다. 대식세포는 세포 파편을 제거하거나 병원성 미생물을 죽이고 림프구 세포로 모아져서 항원작용을 한다. 그러므로 대식세포의 활성은 효과적인 내적 면역체계에서 중요한 역할을 수행하게 된다. 신체가 병원성 자극이나 손상을 받게 되면 대식세포는 다양한 전염증성 사이토카인(종양괴사인자(TNF)-α, 인터류킨(IL)-1, -2), 세포사이의 신호 전달을 담당하는 케모카인 (chemokines), 염증성 분자, 산화질소(NO), 활성산소종(ROS) 및 PGE2를 방출하고, 또한 당단백질 (공동자극분자인 CD80 및 CD86, 부착분자)의 표면 수준을 상향조절 한다.

그러나 이러한 대식세포들의 이점들은 숙주의 면역성 반응의 크기에 의존한다. 염증 매개물질에서 유래한 대식세포는 혈액 내에서 양이 많아져 패혈증(septic shock)이나 류머티즘성 관절염, 동맥경화증과 같은 염증성 질병과 관련된 손상을 막을 수 있다. 그렇기 때문에 어떠한 병이 심한 상태에서 회복이 되느냐 하는 것은 대식세포 기능 조절에 달려있다.

현재까지의 항염증 약물의 사용으로 인한 염증의 감소는 흔히 상당한 기간 동안 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제(아스피린 등)의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급하다고 할 수 있다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 최근에는 민간에서 사용되는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.

본 발명은 천연물로부터 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 발명자들은 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 천연물을 연구하던 중, 은어 단백질 및/은어 펩타이드를 함유하는 추출물이 대식세포에서 면역반응을 조절하며 항염증 활성을 나타내어 염증질환을 치료하는데 효과적임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 은어 단백질 및 펩타이드를 함유하는 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 은어 단백질 및 펩타이드를 함유하는 추출물의 cytokines(종양괴사인자(TNF-α), 인터류킨-6, 인터류킨-1β) 발현억제, 프로스타글란딘 E2(PGE2) 및 산화질소(NO)의 발현 및 억제활성을 제공하는 것으로서 이들과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 의약품 또는 건강기능성 식품의 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 은어 단백질 및 펩타이드 추출물은 다양한 전염증성 사이토카인의 활성화, 생성 및 발현을 억제하여 항염증 활성을 나타내므로 염증질환, 염증반응과 관련된 동맥경화 및 이로 인한 순환기 질환의 예방 및 치료용도의 의약품 또는 식품첨가제로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 각각의 추출 용매로 은어로부터 추출된 단백질을 정량한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 함유하는 항염증 활성용 조성물을 나타낸다.

본 발명은 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 함유하는 면역조절용 조성물을 나타낸다.

본 발명은 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 함유하는 항염증 활성 및 면역조절용 조성물을 나타낸다.

상기에서 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드는 조성물 전체 중량 대비 0.01중량％ 내지 20중량％ 함유될 수 있다.

상기에서 은어 단백질은 인산완충용액 또는 생리식염수를 사용하여 추출하여 현탁액을 여과한 후 얻어진 액상물을 동결 건조하여 은어 단백질을 얻을 수 있다.

상기에서 은어 펩타이드는 효소가 함유된 인산완충용액 또는 효소가 함유된 생리식염수를 사용하여 추출하여, 현탁액을 여과한 후 얻어진 액상물을 동결 건조하여 은어 펩타이드를 얻을 수 있다.

상기에서 인산완충용액은 인산나트륨, 인산리튬, 인산칼륨, 인산루비듐 또는 인산세슘(cesium phosphate) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합용매를 사용할 수 있다.

상기에서 은어 펩타이드를 얻을 때 효소는 펩신, 트립신, 알파키모트립신, 파파인, 알칼레이즈, 뉴트라제 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 효소를 사용할 수 있다.

상기 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 함유하는 조성물은 관절염, 패혈증, 염증의 염증성 질환, 자가면역질환의 예방 및/또는 면역조절의 치료 효과를 갖는다.

상기 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 함유하는 조성물은 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 활성화된 대식세포에서 염증발생 인자의 활성화, 발현 및 생성을 억제하는 효과를 갖는다.

상기 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 함유하는 조성물은 산화질소(NO)의 생성을 저해하는 효과를 갖는다.

상기 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 함유하는 조성물은 IL-6, IL-1β 또는 TNF-α에서 선택되는 전염증성 사이토카인의 생성을 저해하는 효과를 갖는다.

상기 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 함유하는 조성물은 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 저해하는 효과를 갖는다.

상기 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 함유하는 조성물은 염증성 질환의 예방 및 개선용 또는 면역조절용 약제학적 조성물로 사용할 수 있다.

은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 함유하는 조성물은 염증성 질환의 예방 및 개선용 또는 면역조절용 건강기능성식품 조성물로 사용할 수 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명자는 은어 단백질 및 펩타이드를 함유하는 추출물을 선택하여, 이의 면역 활성과 항염증 효능을 확인하고 그 사용방법을 개발함으로써, 이들과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 다양한 의약품 또는 건강기능성 식품의 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 은어 단백질 및 펩타이드를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 사용된 은어는 경상북도 봉화군에서 양식한 은어를 구입하여 사용하였다.

또한, 본 발명에 따른 상기 추출물은 증류수, 인산완충용액, 생리식염수의 용매를 사용하여 단백질을 추출하고, 인산 완충용액으로는 인산나트륨(sodium phosphate), 인산리튬(lithium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 인산루비듐(rubidium phosphate) 및 인산세슘(cesium phosphate)으로 이루어진 그룹중 1종 이상을 사용하여 제조되며, 특히 인산완충 용액은 인산나트륨인 것을 특징으로 하는 단백질을 추출하는 방법을 사용하며, 펩신, 트립신, 알파키모트립신, 파파인, 알칼레이즈, 뉴트라제 등의 효소중에서 1종 혹은 혼합으로 사용하여 가수분해하여 추출한 펩타이드 추출물을 포함한다.

본 발명의 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 함유하는 조성물에서 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드는 조성물 총 중량에 대하여 0.01～20중량％로 포함한다. 본 발명의 은어 단백질 및 펩타이드의 추출물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기에서 본 발명의 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 함유하는 조성물에서 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 제외한 담체, 부형제 및/또는 희석제 등의 성분 함량은 조성물 총 중량에 대하여 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 제외한 성분을 사용할 수 있다. 일예로 본 발명의 조성물에서 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 0.01～20중량％를 사용하는 경우 은어 단백질 및/또는 은어 펩타이드를 제외한 담체, 부형제 및/또는 희석제 등의 성분 함량은 80중량％～99.99중량％를 사용할 수 있다.

본 발명의 은어 단백질 및 펩타이드의 추출물을 포함하는 조성물은 염증질환의 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 20 중량％를 로 첨가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100㎖를 기본으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.1 내지 1g의 비율로 첨가할 수 있다. 본 발명의 건강 음료 조성물은 제시된 비율의 범위내에서 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 은어 단백질 및 펩타이드 추출물은 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6), 산화질소(nitric oxide, NO), 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 발현 및 생성을 유의적으로 억제시키는 항염증효과를 확인함으로써, 효과적이고 안전한 염증 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통해 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

<실시예 1～실시예 7> 은어 단백질 제조

경상북도 봉화군에서 양식한 은어를 구입하여, 냉동 동결건조하여 수분을 제거하고, 분쇄기를 사용하여 분쇄하였다. 분쇄된 은어 100g에 1L의 증류수(실시예 1)와 생리식염수(실시예 2) 및 각각의 인산 나트륨(실시예 3), 인산 리튬(실시예 4), 인산 칼륨(실시예 5), 인산 루비듐(실시예 6), 인산 세슘(실시예 7)으로 만들어진 인산 인산완충용액(pH 7.4) 용액을 가하여 12시간 동안 4℃ 냉장 상태에 보관하면서 마그네틱바를 사용하여 계속해서 교반하면서 단백질을 추출하엿다. 다음으로 원심분리기를 이용하여 단백질 추출액을 10,000rpm으로 30 분간 원심분리하여 지질 및 불용성 부분을 제거 하였다. 이용액을 0.45μM 및 0.22μM의 크기를 가진 필터로 순차적으로 여과하고 동결건조 하여 은어 단백질로 실험에 사용하였다. 각각의 추출 용매로 추출된 단백질에 10mL의 증류수를 가하고 단백질을 정량한 결과 중 인산 나트륨(실시예 3)을 이용한 인산 완충용액이 추출 효율이 가장 좋았기 때문에 인산 나트륨을 이용하는 인산 완충용액을 사용하여 단백질 및 펩타이드 정제에 이용 하였다(도 1 참조).

실시예에 따른 은어 단백질 추출용매

은어 단백질 및 펩타이드 추출용매
증류수 (실시예 1)
생리 식염수 (실시예 2)
인산 완충용액	인산 나트륨 (실시예 3)
	인산 리튬 (실시예 4)
	인산 칼륨 (실시예 5)
	인산 루비듐 (실시예 6)
	인산 세슘 (실시예 7)

<실시예 8～실시예 13> 은어 펩타이드 제조

분쇄된 은어 100g에 각각의 효소가 첨가된 1L의 인산 나트륨 완충용액(실시예 3)을 가하여 36℃에서 12시간 동안 쉐이킹 인큐베이터에서 250rpm 으로 교반하면서 보관하여 단백질이 분해된 펩타이드를 얻었다(효소, pH 및 완충용액의 조성은 표 1에 나타내었다). 교반 후 10분간 100℃로 가열하여 효소를 불활성화하여 가수분해 반응을 종결하였다. 다음으로 원심분리기를 이용하여 펩타이드 추출액을 10,000rpm으로 30분간 원심분리하여 지질 및 불용성 부분을 제거하였다. 이 용액을 0.45μM 및 0.22μM의 크기를 가진 필터로 순차적으로 여과하였고, 동결건조 하여 은어 펩타이드 추출물로 실험에 사용하였다

은어 펩타이드 제조시 효소 및 완충용액

효소	완충용액	pH
Pepsin (실시예 8)	50mM Glycine-HCl	2.0
Trypsin (실시예 9)	50mM Sodium phosphate	8.0
α-Chymotrypsin (실시예 10)	50mM Sodium phosphate	8.0
Papain (실시예 11)	50mM Sodium phosphate	6.0
Alcalase (실시예 12)	50mM Sodium phosphate	7.0
Neutrase (실시예 13)	50mM Sodium phosphate	8.0

<실시예 14> 단백질 및 펩타이드 추출물의 세포 생존률 실험

본 실시예에서는 실시예 3와 실시예 8내지 13에서 수득한 은어 단백질 및 펩타이드의 염증억제 반응이 세포독성에서 기인한 비특이적 반응에서 유도되는지를 확인하기 위해 세포생존율에 미치는 효과를 측정하였다.

본 실시예에 사용된 RAW 264.7 세포주는 마우스의 대식세포에서 유래한 세포주이다. 이 세포의 배양중에 시료를 처리하고 세포에서 세포 증식(cell proliferation)을 측정하여 판단하였다. RAW 264.7의 세포 증식(cell proliferation) 측정은 다음과 같이 행하였다.

RAW 264.7을 96공 평판배양기에 각 웰 당 3×10⁴ 농도의 세포와 세포배양 배지 100㎕를 넣고 12시간 동안 세포를 부착시킨 후 은어 단백질(실시예 7) 및 효소 분해된 펩타이드(실시예 8～12)를 각각 200㎍/ml의 농도로 시료를 처리하여 24시간동안 배양하였다. 24시간 배양 후 배지를 제거하고, 각 웰 당 MTT 용액(2.5mg/ml) 30㎕를 넣은 후 1시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide)을 100㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고, 마이크로플레이트 판독기에서 595nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 1에 의해 세포생존율(％)을 측정하였다.

[수학식 1]

세포생존율(％) = [St / Bt]×100

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 595 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 595 nm 흡광도

단백질 및 펩타이드별 세포독성

시료명		농도(㎍/ml)	Cell proliferation (％)
Normal		-	100
은어 단백질 (실시예 3)		200	103.7
은어 펩타이드	pepsin (실시예 8)	200	110.0
	trypsin (실시예 9)	200	107.5
	α-chymotrypsin (실시예 10)	200	109.2
	Papain (실시예 11)	200	105.3
	Alcalase (실시예 12)	200	103.2
	Neutrase (실시예 13)	200	107.4

상기 표 3에서 확인할 수 있듯이 200㎍/ml의 농도에서 실시예 3, 실시예 8 내지 실시예 13에서 수득한 은어 단백질 및 은어 펩타이드 추출물은 각각 103.7％, 110.0％, 107.5％, 109.2％, 105.3％, 103.2％, 107.4％로 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 관하여 세포독성을 유도하지 않는 것으로 확인되었다.

<실시예 15> 은어 단백질 및 펩타이드 추출물의 LPS 처리에 의해 유도된 산화질소(NO)의 생성억제 활성 실험

본 실시예에서는 실시예 3와 실시예 8내지 13에서 수득한 은어 단백질 및 펩타이드 추출물을 가지고 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포로부터 생성되는 산화질소 억제효과를 측정하였다.

각 시료들의 산화질소 억제효과는 48-웰 플래이트에서 대식세포 RAW264.7 (1×10⁶ cells/well)에 10％ FBS(fetal bovine serum), 페니실린(100 unit/ml), 스트렙토마이신 설페이트(100㎕/ml)가 포함된 RPMI (roswell park memorial institute) 1640 배지에서 37℃, 5％ 이산화탄소의 환경에서 배양하였으며, 각각의 은어 단백질 및 펩타이드 추출물(200㎍/ml)을 30분간 전처리한 후, LPS(1㎍/ml)를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양된 세포 배지 100㎕를 그리에스 시약(5％(v/v), 인산 및 0.1％(w/v) 나프틸에틸렌디아민-염산에 용해된 동량의 1％(w/v) 설파닐아미드) 100㎕에 혼합한 후, 실온에서 10분 동안 배양하였으며, 그 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 595nm에서 흡광도를 측정하였다. 신선한 배지는 모든 실험에서 무처리군으로 사용하였다. 시료에서의 산화질소의 양은 배지에서 준비된 소듐 니트라이트(sodium nitrite) 표준 곡선으로부터 계산되었다.

단백질 및 펩타이드별 산화질소 농도

시료명		농도(㎍/ml)	산화질소(μM)
Normal		-	6.6
LPS		-	31.5
LPS + 단백질 (실시예 3)		200	18.3
LPS + 펩타이드	pepsin (실시예 8)	200	14.7
	trypsin (실시예 9)	200	10.2
	α-chymotrypsin (실시예 10)	200	7.6
	Papain (실시예 11)	200	9.8
	Alcalase (실시예 12)	200	10.4
	Neutrase (실시예 13)	200	8.5

실험결과, LPS를 단독으로 처리한 그룹에서는 31.5μM의 높은 산화 질소의 생성이 관찰되었으나 은어 단백질 및 은어 펩타이드 추출물을 함께 처리한 그룹은 각각 18.3μM, 14.7μM, 10.2μM, 7.6μM, 9.8μM, 10.4μM, 8.5μM으로써, LPS에 의한 산화질소(nitric oxide, NO)의 발현 및 생성을 유의적으로 억제시키는 것을 알 수 있었다(표 4 참조),

<실시예 16> 은어 단백질 및 펩타이드 추출물의 LPS 처리에 의해 유도된 전염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6의 분비억제 활성

본 실시예에서는 실시예 3, 실시예 8 내지 실시예 13에서 수득한 은어 단백질 및 펩타이드 추출물을 가지고 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포로부터 생성되는 전염증성 사이토카인의 분비에 미치는 영향을 측정하였다. TNF-α 및 IL-6는 정상적인 방어응답과 셉틱 쇽, 류머티즘성 관절염, 자가면역질병과 같은 악성 염증성면역질환과 연결된 다양한 생물학적 활성을 가지는 전염증성 사이토카인으로 알려져 있다.

은어 단백질 및 펩타이드 추출물(200㎍/ml)을 RAW264.7(1×10⁶ cells/well) 세포에 30분간 전처리한 후, LPS(1㎍/ml)를 24시간 처리하고 얻어낸 상층액으로 부터 RAW264.7 세포에서 생성되는 전염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6의 생성량에 관하여 추출물들의 억제효과를 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법(Endogen, Cambridge, MA)으로 측정하였다.

전염증성 사이토카인의 분비에 미치는 영향

시료명		농도 (㎍/ml)	TNF-α (pg/ml)	IL-6 (pg/ml)
Normal		-	839.8	115.9
LPS		-	5974.1	6346.1
LPS + 단백질 (실시예 3)		200	4646.8	4862.9
LPS + 펩타이드	pepsin (실시예 8)	200	4093.5	4525.8
	trypsin (실시예 9)	200	2350.6	2350.6
	α-chymotrypsin (실시예 10)	200	2553.8	2553.7
	Papain (실시예 11)	200	2695.3	2832.1
	Alcalase (실시예 12)	200	2897.2	2993.5
	Neutrase (실시예 13)	200	3125.7	3225.8

표 5에서 알 수 있듯이, 실시예 3, 실시예 8 내지 실시예 13에서 수득한 은어 단백질 및 펩타이드 추출물들은 마우스 대식세포주인 RAW264.7세포에서 LPS로 유도되는 전염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 우수한 억제 효과를 나타내는 것을 관찰할 수 있었다(표 5 참조).

<실시예 17> 은어 단백질 및 펩타이드 추출물의 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 생성 저해 활성

본 실시예에서는 실시예 3, 실시예 8 내지 실시예 13에서 수득한 은어 단백질 및 펩타이드 추출물을 가지고 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW 264.7 세포로부터 생성되는 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 분비에 미치는 영향을 측정하였다.

프로스타글란딘 E2(PGE2)은 많은 다른 악성 및 만성 염증질환에서 잘 알려진 전염증성 중재자로 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성에 있어 은어 단백질 및 펩타이드 추출물의 저해활성을 측정한 결과, LPS를 단독으로 처리한 그룹에서는 1193.5 pg/ml의 높은 프로스타글란딘 E2의 생성이 관찰되었으나 은어 단백질 및 펩타이드 추출물을 함께 처리한 그룹은 각각 836.7pg/ml, 608.6pg/ml, 360.9pg/ml, 450.1pg/ml, 554.8pg/ml, 542.9pg/ml, 601.4pg/ml로 프로스타글란딘 E2의 생성을 유의적으로 억제시키는 것을 알 수 있었다(표 6 참조).

프로스타글란딘 E2의 생성 억제 효과

시료명		농도(㎍/ml)	PGE2(pg/ml)
Normal		-	192.1
LPS		-	1193.5
LPS + 단백질 (실시예 3)		200	836.7
LPS + 펩타이드	pepsin (실시예 8)	200	608.6
	trypsin (실시예 9)	200	360.9
	α-chymotrypsin (실시예 10)	200	450.1
	Papain (실시예 11)	200	554.8
	Alcalas (실시예 12)	200	542.9
	Neutrase (실시예 13)	200	601.4

프로스타글란딘 E2(PGE2)의 억제활성 측정은 48-웰 플래이트에서 대식세포 RAW264.7(1×10⁶ cells/ml)에 10％ FBS, 페니실린(100 unit/ml), 스트렙토마이신 설페이트(100㎍/ml)가 포함된 RPMI 배지에서 37℃, 5％ 이산화탄소의 환경에서 배양하였으며, 각각의 추출물(200㎍/ml)을 30 분간 전처리한 후, LPS(1㎍/ml)를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양된 세포 상층액 100㎕를 PGE2 측정키트(Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 측정하였다.

<실시예 18> RT-PCR을 이용한 세포내 mRNA 발현 측정

본 실시예에서는 실시예 3, 실시예 8 내지 실시예 13에서 수득한 은어 단백질 및 펩타이드 추출물을 가지고 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포로부터 생성되는 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β), iNOS, COX-2의 mRNA 발현 억제 정도를 측정하였다.

RAW 264.7 세포 배양 중에 시료를 처리하고 세포내에서 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β), iNOS, COX-2의 단백질을 합성하는 mRNA의 발현을 측정하여 판단하였다. RAW 264.7 세포의 mRNA 측정은 다음과 같이 행하였다.

RAW 264.7 세포를 6공 평판배양기에 각 웰당 2×10⁶ 농도로 분주하고 12시간 동안 세포를 부착시킨 후 각각의 은어 단백질 및 펩타이드 추출물(200㎍/ml)을 30 분간 전처리한 후, LPS(1㎍/ml)를 처리하여 6시간 배양하였다. 6시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포에서 mRNA extraction kit를 사용하여 총 mRNA를 추출하였고, PCR을 통해서 cDNA로 변환 시켜준 후, cytokines(TNF-α, IL-6, IL-1β), iNOS, COX-2의 프라이머와 함께 RT-PCR을 수행하고 이를 1.2％의 아가로스(agarose)젤에 로딩하여 밴드의 인텐시티(intensity)를 측정하여 세포내 cytokines(TNF-α, IL-6, IL-1β), iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 측정하였다(표 7). 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β) 및 iNOS, COX-2의 mRNA 발현은 무처리군(normal) 밴드 대한 처리구의 밴드로 수학식 2에 의해 밴드의 Intensity를 측정하였다(표 7).

[수학식 2]

mRNA intensity fold = 처리구 밴드 intensity/ 무처리구 밴드 intensity

세포내 mRNA 발현 측정 결과

시 료 명		Intensity fold (TNF-α)	Intensity fold (IL-6)	Intensity fold (IL-1β)	Intensity fold (COX-2)	Intensity fold (iNOS)
Normal		1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
LPS		1.5	4.2	5.4	3.2	2.1
LPS + 은어 단백질(실시예 3)		1.3	3.1	4.2	2.4	1.9
LPS + 펩타이드	pepsin(실시예 8)	1.3	3.0	3.8	2.1	1.7
	trypsin(실시예 9)	1.2	2.7	3.9	2.0	1.5
	α-chymotrypsin (실시예 10)	1.0	2.4	3.4	1.5	1.3
	Papain(실시예 11)	1.1	2.5	3.3	2.0	1.4
	Alcalase(실시예 12)	1.0	2.6	3.4	1.7	1.3
	Neutrase(실시예 13)	1.2	2.5	3.2	1.6	1.4

표 7에서 알 수 있듯이, 실시예 3, 실시예 8 내지 실시예 13에서 제조한 은어 단백질 및 펩타이드 추출물들은 마우스 대식세포주인 RAW264.7세포에서 LPS로 유도되는 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β)과 COX-2 및 iNOS등의 염증성 인자들의 mRNA의 생성이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명하였으나 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형실시가 가능할 것이며, 이러한 변형실시는 본원 발명의 보호범위에 속하는 것으로서 본원 발명의 보호범위는 특허청구범위에 기재된 바에 따라 해석되어야 할 것이다.

본 발명의 은어 단백질 및 펩타이드 추출물은 다양한 전염증성 사이토카인의 활성화, 생성 및 발현을 억제하여 항염증 활성을 나타내므로 염증질환, 염증반응과 관련된 동맥경화 및 이로 인한 순환기 질환의 예방 및 치료용도의 의약품 또는 식품첨가제로 유용하게 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다고 사료된다.

Claims

삭제
하기의 (1)단계 내지 (3)단계의 공정에 의해 제조되며, 세포독성이 없고, LPS(lipopolysaccharide) 처리에 의해 유도된 산화질소(NO)의 생성 억제, LPS 처리에 의해 유도된 IL-6 또는 TNF-α에서 선택되는 전염증성 사이토카인의 분비 억제, LPS 처리에 의해 유도된 프로스타글란딘 E2(PGE2) 생성 저해, LPS 처리에 의해 유도된 IL-6, IL-1β 또는 TNF-α의 전염증성 사이토카인의 mRNA 생성 억제 및 LPS 처리에 의해 유도된 COX-2과 i-NOS의 염증성 인자들의 생성 억제 효과를 지니는 은어 펩타이드를 조성물 총중량을 기준으로 0.01～20.0중량％ 함유하는 것을 특징으로 하는 항염증 활성용 조성물.
(1)뼈를 포함한 은어 전부위를 분쇄한 은어 100g에 펩신, 트립신, 알파키모트립신, 파파인, 알칼레이즈, 뉴트라제 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 효소가 첨가된 1L의 인산나트륨 완충용액을 가하여 36℃에서 12시간 동안 쉐이킹 인큐베이터(shaking incubator)에서 250rpm으로 교반하는 단계;
(2)상기의 교반 단계 후 10분간 100℃로 가열하여 효소를 불활성화 하는 단계;
(3)상기의 효소 불활성화 후 원심분리기를 이용하여 펩타이드 추출액을 10,000rpm으로 30분간 원심분리하여 지질 및 불용성 부분을 제거한 다음 0.45μM 및 0.22μM의 크기를 가진 필터로 순차적으로 여과하고, 동결건조하여 은어 펩타이드 추출물을 얻는 단계.
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제2항에 있어서,
조성물은 염증성 질환의 예방 및 개선용 약제학적 조성물임을 특징으로 하는 항염증 활성용 조성물.
제2항에 있어서,
조성물은 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능성식품 조성물임을 특징으로 하는 항염증 활성용 조성물.