KR20140143583A

KR20140143583A - 삼백초 추출물과 그 유효성분인 쿼세틴을 함유하는 신경변성질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품, 그리고 삼백초 추출물 추출 방법

Info

Publication number: KR20140143583A
Application number: KR1020130065302A
Authority: KR
Inventors: 최동국; 김병욱; 박영일
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2014-12-17
Also published as: KR101545495B1

Abstract

본 발명은 삼백초 추출물과 그 유효성분인 쿼세틴을 함유하는 신경변성질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품, 그리고 삼백초 추출물 추출 방법에 관한 것으로, 신경교세포에 의해 야기되는 신경염증에 있어서 삼백초 추출물과 그 유효성분인 쿼세틴이, 활성화된 신경소교세포의 전염증 매개인자를 억제함으로써 신경염증 및 신경세포사 억제에 효능을 가질 수 있도록 하는 신경변성질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품과, 그러한 삼백초 추출물을 추출하는 추출 방법에 관한 것이다.

Description

삼백초 추출물과 그 유효성분인 쿼세틴을 함유하는 신경변성질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품, 그리고 삼백초 추출물 추출 방법 {Pharmaceutical Composition and Functional Food for Preventing or Treating Neurodegenerative Disease by Saururus Chinesis Extracts and Quercetin as Effective Component, and Extracting Method of Saururus Chinesis Extracts}

본 발명은 삼백초 추출물과 그 유효성분인 쿼세틴을 함유하는 신경변성질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품과, 그리고 삼백초 추출물 추출 방법에 관한 것으로, 신경교세포에 의해 야기되는 신경염증에 있어서 삼백초 추출물과 그 유효성분인 쿼세틴이, 활성화된 신경소교세포의 전염증 매개인자를 억제함으로써 신경염증 및 신경세포사 억제에 효능을 가질 수 있도록 하는 신경변성질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품과, 그러한 삼백초 추출물을 추출하는 추출 방법에 관한 것이다.

신경교세포는 중추신경계통 (CNS, Central Nervous System)에 존재하며 신경세포들의 일차적인 보호 및 회복에 관여한다. 그러나 활성화된 신경교세포는 신경염증 반응을 유도하고, 신경염증 반응은 다양한 신경변성질환의 원인으로 작용한다는 다수의 연구가 보고되고 있다. 신경교세포의 활성화에 기인하는 지속적인 신경염증은 여러 가지 신경변성질환에서의 두드러진 병리학적 특징이다 (Kim and Joh, 2006; Koning et al., 2007; Krause and Muller, 2010; Moller, 2010).

뇌 손상 또는 신경독소 등에 의해 활성화된 신경교세포는 아질산염 (NO), 활성산소종 (ROS), 염증효소인 Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS)와 Cyclooxygenase-2 (COX-2), 그리고 전염증성 사이토카인 (Cytokine)인 IL-1b, IL-6, TNF-a 등의 활성을 유도하며 (Graeber and Streit, 2010), 이러한 물질들은 다발성경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병과 같은 퇴행성 신경변성질환의 병리기전에 관여한다는 사실이 보고되어 있다 (Kim and Joh, 2006; Koning et al., 2007; Krause and Muller, 2010; Moller, 2010). 따라서 이러한 신경교세포 활성화의 억제에 따른 신경염증의 조절이 퇴행성 신경변성질환의 예방에 중요한 역할을 할 것이라는 사실을 유추할 수 있다.

한편 삼백초 [Saururus chinensis (Lour.) Baill; SC]의 신경염증 억제 효능에 관한 본질적인 기전연구는 아직 이루어진바 없다. 예를 들어 한국등록특허 제10-0358384호 '건강보조식품 및 그 제조방법'은, 삼백초를 원료로 하는 건강보조식품과 이를 제조하는 방법에 관해 개시하고 있으나, 신경 염증 억제 효능과 관련한 기술은 아니었다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 삼백초 추출물과 그 유효성분인 쿼세틴을 함유하는 신경변성질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품, 그리고 삼백초 추출물 추출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 삼백초 에탄올 용매 추출물을 함유하는 신경변성질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하며, 상기 에탄올 용매는 에탄올 100 중량부에 대해 물 1 내지 20 중량부 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜을 1 내지 20 중량부 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 이러한 조성물에 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제, 시럽제 또는 식용음료의 형태로서 제제학적으로 허용되는 부형제를 가하여 제형화된 조성물을 제공하며, 생약제제 또는 건강기능식품을 제공한다.

또한 본 발명이 제공하는 조성물은 그 유효성분으로서 쿼세틴 (Quercetin, QCT)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

한편 본 발명은 삼백초 에탄올 추출물 추출 방법을 제공하며, (A) 삼백초 조각을 채취하여 건조하고 분쇄하는 단계; (B) 분쇄한 삼백초 조각을 에탄올을 포함하는 극성용매와 혼합하는 단계; 및 (C) 분쇄한 삼백초 조각과 극성용매와의 혼합물로부터 삼백초 에탄올 추출물을 추출한 후 여과하고 진공 농축 및 동결 건조하는 단계;를 포함한다.

이때, 상기 (A) 단계는, (A1) 삼백초 조각을 채취하여 채취한 삼백초 조각을 15℃ 내지 20℃의 온도 조건을 유지하면서 3일 내지 5일간 건조하는 단계; 및 (A2) 건조한 삼백초 조각을 입도가 0.1 mm 내지 5 mm를 갖도록 분쇄하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 이때, 상기 (B) 단계의 극성용매는 에탄올 100 중량부에 대해 물 1 내지 20 중량부 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜을 1 내지 20 중량부 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 한다.

그리고 이때, 상기 (C) 단계는, (C1) 추출 온도를 15℃ 내지 25℃로 유지하면서 초음파분쇄기를 이용하여 삼백초 에탄올 추출물을 추출하는 단계; (C2) 추출한 삼백초 에탄올 추출물을 50℃ 내지 60℃에서 진공 농축하고 동결 건조하는 단계; 및 (C3) 동결 건조한 삼백초 에탄올 추출물을 용기에 주입한 후 40℃ 내지 50℃에서 감압 농축하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 삼백초 추출물과 그 유효성분인 쿼세틴을 함유하는 신경변성질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품, 그리고 삼백초 추출물 추출 방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1A 및 도 1B는 본 발명에 따른 삼백초 추출물에 관한 세포독성검사 및 아질산염 저해 효능을 나타낸 그래프.
도 2A 및 도 2B는 본 발명에 따른 삼백초 추출물의 활성산소 억제 효능을 나타낸 그래프.
도 3A 내지 도 3D는 본 발명에 따른 삼백초 추출물의 염증 생성 관여 효소에 대한 유전자 및 단백질의 저해 효능을 나타낸 그래프.
도 4A 및 도 4B는 본 발명에 따른 삼백초 추출물의 전염증성 매개체인 TNF-α, IL-6 유전자에 대한 저해 효능을 나타낸 그래프.
도 5A 내지 도 5C는 본 발명에 따른 삼백초 추출물의 NF-κB 활성에 따른 저해 효능을 나타낸 그래프.
도 6A 내지 도 6E는 본 발명에 따른 삼백초 추출물의 활성성분인 쿼세틴의 염증 억제 효능을 나타낸 그래프.

본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 할 것이다.

또한, 본 발명에 관련된 공지 기능 및 그 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는, 그 구체적인 설명을 생략하였음에 유의해야 할 것이다.

본 발명자들은 Lipopolysaccharide (LPS)에 의하여 유도된 염증 관련 인자들의 생산물, 유전자 및 단백질의 발현에 관련한 기전연구를 수행하였으며, 분자 생화학적 실험 분석법을 바탕으로 삼백초 (Saururus chinensis Baill; SC) 추출물의 효능 분석을 수행하였다.

구체적으로, 비정상적인 전염증성 사이토카인의 생성은 염증성 손상을 초래하는 것으로 보고된바 있으며 (Feldmann et al.,1998; Dinarello, 1999; De Nardin, 2001), 신경염증 또한 신경교세포의 활성화로 인해 그 수준이 증가하여 반응한다고 보고된 바에 따라 (Boka et al., 1994; Hunot et al., 1999), 사이토카인의 생성 및 신경교세포의 활성을 억제하는 효능이 신경염증 반응 억제를 위한 주요 분석 대상 효능이 된다.

본 발명자들은 삼백초 추출물의 대표적인 활성성분인 쿼세틴 (Quercetin, QCT)의 아질산염 억제 효능을 유전자 및 단백질 단계의 억제 정도에 따라 각종 염증매개 마커들을 이용하여 확인하였으며, 이를 통해 삼백초 추출물이 염증 억제 효능을 나타내게 하는 대표적인 물질은 쿼세틴이라는 사실을 확인하였다.

이에 본 발명은, 우수한 신경변성질환 예방 또는 치료 효능을 나타내는 삼백초 추출물과 그 유효성분인 쿼세틴을 함유하는 조성물과, 삼백초 추출물 추출 방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 삼백초 추출물에 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제, 시럽제 또는 식용음료의 형태로서 제제학적으로 허용되는 부형제를 가하여 제형화된 조성물과, 삼백초 추출물을 포함하는 생약제제, 건강기능식품 또는 음료를 제공한다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 삼백초 추출물 추출 방법에 관해 상세히 설명한다.

먼저 삼백초로부터 삼백초 조각을 채취하였다.

구체적으로, 삼백초의 줄기, 뿌리, 잎 등 부위에서 무작위적으로 삼백초 조각을 채취하되 100 개체 이상의 삼백초로부터 5kg 이상의 삼백초 조각을 채취하여 확보하였다.

그 다음, 채취한 삼백초 조각을 15℃ 내지 20℃의 온도 조건을 유지하면서 3일 내지 5일간 건조하였다.

다음으로, 건조한 삼백초 조각을 분쇄하였다.

건조한 삼백초 조각은 고른 입자를 가지도록 분쇄되었으며 입도가 0.1 mm 내지 5 mm 사이에 분포되도록 하였다.

다음으로, 분쇄된 삼백초를 에탄올을 포함하는 극성용매와 혼합하였다.

이때 혼합하는 극성용매는 100% 에탄올이거나, 에탄올 100 중량부에 대해 물 1 내지 20 중량부 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜을 1 내지 20 중량부 혼합한 혼합용매일 수 있다.

또한 혼합하는 극성용매의 중량은 분쇄된 삼백초 중량의 0.2배 내지 2배인 것이 바람직한데, 구체적으로는 분쇄한 삼백초 1kg에 대하여 에탄올 95%, 물 5%로 이루어진 혼합 극성용매를 1L 혼합하였다.

다음으로, 삼백초 혼합물로부터 삼백초 에탄올 추출물을 추출한 후 여과하고 진공 농축 및 동결 건조함으로써 본 발명에 따른 삼백초 에탄올 추출물을 수득한다.

이때, 추출 방법으로는 냉침 추출법, 온침 추출법 또는 열 추출법 등을 사용할 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄기 또는 분획기를 이용할 수 있고, 구체적으로는 초음파분쇄기(BRANSON Ultrasonic’s Corporation, CT, USA)를 이용하여 추출 온도를 15℃ 내지 25℃로 유지하면서 2시간 간격으로 15분간 15회 상쇄하였다.

또한 구체적으로 여과는 0.22μM 필름 여과기를 이용하였으며 진공 농축은 50℃ 내지 60℃에서 회전식 증발기를 이용하여 수행하였고 동결 건조를 통해 분말 형태의 삼백초 에탄올 추출물을 14.4g 수득하였다.

그리고, 실험 시료 등으로서의 사용을 위해 수득한 삼백초 에탄올 추출물을 튜브에 넣고 40℃ 내지 50℃에서 감압 농축하여 저온 보관하였으며, 용량이 20 mg ± 0.5 mg인 튜브를 15개 이상 확보하여 임의의 튜브에 대한 실험을 수행하였고, 평균값을 실험 결과로서 채택하였다.

한편, 삼백초 에탄올 추출물 내에 쿼세틴이 포함되어 있는지를 확인하기 위하여, 쿼세틴 (QCT) (Sigma Chemical Co, USA)을 구입하여 HPLC (Waters, Ontario, Canada) 분석을 통하여 확인하였다.

실험 예

시약

Saururus Chinensis (SC), Lipopolysaccharide (LPS), Tween-20, Bovine Serum Albumin (BSA), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). (Sigma Chemical Co, USA) 6-well, 12well, 96wel tissue culture plate 100mm culture plate. (NUNC Inc, IL, USA)

실험에 사용한 시약은 세포 배양 시 배지로 DMEM을 사용하였으며, 5% FBS와 항생제 100 units/㎖ penicillin/streptomycin (Gibco, BRL)을 사용하였다. 또한 antibodies NF-κB p65, COX-2 (Santa Cruz, CA), iNOS, IκB-α, phosphor(p)-IκB-α and β-actin (Cell signaling, Co, USA)을 이용하였다.

세포배양 및 세포독성검사 ( MTT assay )

Murine BV-2 microglial cells은 경북대학교 약리학 교실로부터 입수하였으며, 불활성화 상태의 5% FBS와 100 units/㎖ penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM에서 습도가 유지되는 5% CO₂, 95% O₂ incubator를 이용하여 배양하였다.

모든 실험에서 세포의 수는 5 X 10⁵cell/㎖이었으며, 삼백초 추출물은 배지에 희석하여 농도별(1㎍/㎖, 5㎍/㎖, 10㎍/㎖)로 1시간 전 처리하였고, LPS는 배지에 희석하여 100ng/㎖을 사용하였다.

SC의 세포 독성 검사는 MTT assay를 이용하여 확인하였으며, MTT assay는 NO assay를 수행한 후, microplate에 있는 세포에 0.5 mg/㎖ 농도의 MTT를 30㎕ 투입하고, incubator에서 2시간 반응시켜 DMSO 100㎕로 formazan crystals을 녹이며, 파장이 540 nm인 Vmax microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

Assay of NO

Assay of NO는 NO(nitric oxide)의 생산량을 정량적으로 측정하는 방법으로 microplate(96well) assay 방법이다. microplate에 세포를 5 x 10⁴cell/well seeding 한 후, LPS와 삼백초 추출물을 농도 차를 두어 첨가하고, 24h incubator에서 반응시키며, 상층액을 각각 50㎕ 씩 Griess reagent (1% sulfanilamide/0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H3PO4)와 반응시킨 후, 파장이 550nm인 Vmax 96-well microplate spectrophotometer를 이용하여 측정하였다.

Isolation of total RNA and RT - PCR

Microglia BV-2 cell line의 모든 RNA 동정은 Trizol reagent (invitrogen, CA, USA)를 이용하여 제조회사가 제시한 사용법에 따라 분리하였다. microglia BV-2 cell line에 TRizol reagent 1㎖를 투입하며 chloroform 200㎕을 투입한 후 교반하고 실온에서 5분 동안 반응시키며 원심분리(4℃, 10,000rpm, 10분)한다.

그리고 상층액 500㎕를 새로운 튜브에 옮긴다. 동일한 양의 isopropanol 500㎕을 투입하며 실온에서 10분간 반응시키고 원심분리 (4℃, 14,000rpm, 15분)한다. 상층액을 제거하고 75% EtOH을 이용하여 2회 세척하며 pellet을 건조하고 DEPC-water를 이용하여 녹인다.

DNaseⅠ(Roche AC, USA)을 1:10으로 희석하여 2㎕ 투입하며 25℃에서 15분간 반응시킨다. 22㎕의 시료에 78㎕의 DEPC-water를 투입하여 전체 100㎕를 제조한다. TRizol reagent 100㎕를 투입하며 교반하고 chloroform 25㎕를 투입한 후 교반한다.

상온에서 5분 반응시키며 원심분리 (4℃, 14000rpm, 15분)한다. 상층액 약 140㎕를 새로운 튜브에 덜어내고 isopropanol 10분 반응시키며 원심분리 (4℃, 14000rpm, 15분)한다. 상층액을 제거하고 75% EtOH을 이용하여 2회 세척하며 pellet을 건조하고, DEPC-water를 이용하여 녹인다.

RT (reverse transcription) PCR은 시료 농도가 1㎍/㎕이 되게 하며 SuperScript Ⅲ (invitrogen CA, USA)의 cDNA 합성법에 따라 cDNA를 합성하고, 각 PCR 반응은 cDNA 1㎕ (0.5㎍/㎕)를 사용하여 수행하였다.

반응 조성은 2 X dyemix DNA polymerase (enzynomics CA)를 사용했으며, template 1㎕, 2 X dyemix 10㎕, primer-F 1㎕, primer-R 1㎕, 증류수 7㎕를 반응조건 95℃ 2분, 95℃ 30초 - 58℃ 1분 - 72℃ 1분 25회 반복, 72℃ 5분, 4℃ 보관으로 하여 총 20㎕를 반응시켰다. 사용한 primer들과 그 염기서열, genebank accession number 및 실험조건들은 아래의 [표 1]에 명시하였다.

Western blot analysis

Microglia BV-2 cell에서 단백질의 동정은 세포를 1 X PBS로 두 번 세척한 후, lysis buffer [1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% NaN3]를 이용하였다.

단백질의 정량은 DC protein assay (bio-rad CA)의 bradford 방법을 사용하였으며, 동일한 양의 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기영동하고, 0.45㎛ polyvinylidene fluoride (PVDF: Millipore)를 사용하여 겔에서 membrane에 이동시켰다.

항체의 사용은 1차 항체로 anti-β-actin (1:2000; Cell Signaling), anti-iNOS, anti-IκB-α, anti-phospho-IκB-α (1:1000; Cell Signaling), anti-p65 (1:1000; Santa Cruz), anti-COX-2 (1:1000; Santa Cruz)으로 희석하여 4℃에서 O/N(over-night)하고 2차 항체로 Horseradish peroxidase (HRP)를 가지고 있는 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후, ECL kit(pierce, CA)로 반응시키며, LAS-3000 (Fuji Co, Japan)를 사용하여 결과를 확인하였다.

Double - immunofluorescence labeling assay

Microglia BV-2 cell에서 NF-κB p65의 이동을 측정하기 위하여 (1×10⁵cells/well in 12-wellplate) 커버슬립 위에서 24시간 배양하였다. 물질을 1시간 전 처리한 후, LPS 처리 30분 경과 후에 상층액을 제거하며 메탄올 250㎕를 첨가하여 -20℃에서 20분간 고정하였다.

PBS (in 0.02% Tween)로 세척한 후 1μM Hoechst로 세포핵을 염색하였다. 안티바디를 침투시키기 위하여 1% Triton으로 10분간 처리하여 세포막을 뚫어주었다.

1차 항체로 1:200 희석한 monoclonal mouse anti-human NF-κB (p65) (Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA) 60분간 실온에서 처리하였다. 2차 항체로는 1:100 희석한 Alexa Fluor 568-labeled goat anti-mouse antibody (Invitrogen, CA)를 60분간 실온에서 처리하였다.

박제를 위하여 mounting solution으로 커버 글라스에 고정하였다. 박제 후 형광 염색된 cells을 관측하기 위하여 암실에서 형광 현미경을 이용하여 관측하고 결과를 확인하였다.

Statistical analysis

실험 결과의 재현성 확인을 위하여 아래의 실험 결과는 평균값 ± 표준편차로 표기하였으며, 각 실험은 3회 실시하였다. 실험 결과의 통계분석은 Graphpad Prism V5.01. software를 사용하여 Dunnett's method를 이용한 일원분산분석(One-way ANOVA)에 의하였다.

주요 약어 설명

iNOS : inducible nitric oxide synthase

COX-2 : cyclooxygenase-2

IL-6 : interleukin-6

TNF-α : tumor necrosis factor-alpha

GAPDH : glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase.

실험 결과

1. BV -2 microglia cells 에서 SC 및/또는 LPS 의 세포 독성 검사 및 아질산염의 방출량 측정 결과

LPS로 자극된 BV-2 microglia 세포에서 LPS 및 삼백초 추출물 (SC)이 세포 생존에 미치는 영향을 확인하였다.

세포 독성 검사를 위해서는 MTT assay를 이용하였으며, 도 1A에 도시한 바와 같이, MTT 측정 결과 LPS와 SC 각각을 단독으로, 또는 LPS와 SC를 같이 처리한 모든 실험군에서 대조군에 비하여 세포 생존율이 변하지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는 신경염증 유도 물질인 LPS와 삼백초 추출물이 세포 생존에는 영향을 주지 않음을 의미한다.

또한, 삼백초 추출물의 항염증 효능을 분석하기 위하여 동일한 신경염증 유발 인자인 LPS(100ng/㎖)로 자극한 mouse BV-2 microglia 세포에서 생산되는 아질산염(NO)에 대한 농도 의존적 저해 효능을 보이는지 확인하였다.

아질산염의 측정을 위해서는 Griess 시약을 이용한 NO assay를 사용하였으며, BV-2 세포에서 LPS에 의해서 유도되는 아질산염(NO)의 방출량을 100%로 하였고, 실험군으로 삼백초 추출물을 농도별 (1, 5, 10 ㎍/㎖)로 처리한 결과, 도 1B에 도시한 바와 같이, 각각 아질산염(NO)의 방출량이 LPS만 처리한 군에 비하여 농도 의존적으로 감소하는 사실을 확인하였다.

도 1A 및 도 1B는 LPS로 자극된 mouse BV-2 microglia 세포에서 삼백초 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향과 아질산염 저해 효능을 나타낸 것이다. BV-2 microglia 세포를 96well plate에 5 X 10⁴cell/well이 되도록 한 후, 24시간 배양 하고, 삼백초 추출물을 농도별로 1시간 전 처리하였다. 그리고 LPS(100ng/㎖)로 세포를 자극하였다. 24시간 후, 상층액을 덜어 Griess assay를 통하여 아질산염의 방출량을 측정하였다. 남은 상층액을 제거하고 MTT 시약을 투입하며, 생존한 세포들을 측정하여 결과를 백분율로 표시하였다. 표시한 실험 결과는 3회 반복한 실험 결과의 평균이다.

2. ESR 분광학기기를 이용한 삼백초 추출물의 활성산소 소거능 확인 결과

본 발명에 따른 SC의 활성산소 제거능을 확인하기 위하여, ESR 스펙트로미터를 이용하여 자유라디칼 소거능(free radical scavenging activity)을 측정하였다.

DPPH radical의 소거능 측정 결과, 도 2A에 도시한 바와 같이, 다양한 농도 (0.031, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5 1 and 2 mg/mL)의 SC 추출물이 각각 48.9%±0.6%, 53.2%±2.4%, 63.0%±3.1%, 77.8%±1.6%, 86.8%±2.2%, 88.9%±1.3% and 90.8%±0.9%의 소거능을 나타내었고 IC₅₀의 값은 0.039±0.004 mg/mL이었다.

또한, alkyl radical은 APPH는 알킬 라디칼 형으로 분해되며, 알킬 라디칼과 산소(O₂)의 반응으로 지질 과산화(lipid peroxidation)를 유도한다. APPH를 37℃에서 30분간 배양하면 4-PBON/자유 라디칼의 알킬 라디칼 스핀 생성물이 발생한다.

도 2B에 도시한 바와 같이, 다양한 농도 (0.25, 0.5 and 1 mg/mL)의 SC 추출물이 각각 41.0%±1.3%, 56.0%±0.5%, and 62.1%±5.6%의 소거능을 나타내었고, IC₅₀ 값은 0.35±0.07 mg/mL이었다.

도 2A 및 도 2B는 삼백초 추출물의 활성산소 억제 효능을 나타낸 것이다. 도 2A는, DPPH 시약과 삼백초 농도별 시료를 1:1로 혼합하고 2분간 반응시킨 후 반응 시약을 capillary tube에 투입하고 ESR 기기를 사용하여 측정한 결과이다. 도 2B는, 멸균된 증류수와 삼백초 농도별 시료, AAPH, POBN을 1:1:1:1로 혼합하고 37℃ water bath에서 30분간 반응시킨 후 반응 시약을 capillary tube에 투입하고 ESR 기기를 사용하여 측정한 결과이다.

3. LPS 로 자극된 BV -2 신경교세포에서 SC 의 농도 의존적인 iNOS , COX -2의 유전자 및 단백질의 발현저해 작용 확인 결과

염증생성에 관여하는 효소인 iNOS 및 COX-2 (cyclooxygenase type 2)의 유전자 및 단백질의 발현 양상의 변화를 알아보기 위하여, 본 실험에서는 BV-2 cell에 LPS 및 삼백초 추출물을 농도별로 처리하고 시간별로 배양하였다.

6시간 후 RNA를 동정하여 RT-PCR을 시행하고 유전자의 발현 양상을 정량적인 방법을 통하여 분석하여 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현 양상의 변화를 확인하였다.

도 3A 및 도 3C에 도시한 바와 같이, LPS만 처리한 군에서의 발현량은 대조군에 비해 증가함을 확인하였고, 삼백초 추출물을 농도별 (1, 5, 10 ㎍/㎖)로 처리한 발현량은 LPS만 처리한 군에 비하여 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현량을 감소시키는 사실을 확인할 수 있었다.

또한, 18시간 후 Protein을 동정하여 Western blot을 시행하여 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현 양상을 확인하였다.

도 3B 및 도 3D에 도시한 바와 같이, LPS만 처리한 군에서의 발현량은 대조군에 비해 증가함을 확인하였고, 삼백초 추출물을 농도별 (1, 5, 10 ㎍/㎖)로 처리한 발현량은 LPS만 처리한 군에 비하여 농도 의존적으로 iNOS, COX-2 단백질의 발현량을 감소시키는 사실을 확인하였다. β-actin은 단백질 발현 분석의 대조군으로 사용하였다.

도 3A 내지 도 3D는 LPS로 자극된 BV-2 신경교세포에서 iNOS 및 COX-2의 유전자 및 단백질 단계에서의 삼백초 추출물 농도에 따른 저해 효능을 나타낸 것이다. 도 3A 및 도 3C는 6well plate에 세포를 1 X 10⁶cell/well로 배양하여 6시간 후, 세포 상층액을 제거하고, 세포에서 RNA를 동정하여, iNOS 및 COX-2 유전자를 RT-PCR을 사용하여 분석한 결과이다. 도 3B 및 도 3D는 6well plate에 세포를 1 X 10⁶cell/well로 배양하여 18시간 후, 세포에서 단백질을 동정하여 다클론성 항체인 iNOS 및 COX-2를 사용하여 western blot에 의해 분석한 결과이다. 실험 결과는 3회의 반복 실험에 의한 것이다.

4. LPS 로 자극된 mouse BV -2 microglia 세포에서 염증 매개 사이토카인의 생산 시 삼백초 추출물의 농도 의존적인 억제 효능 확인 결과

염증 매개 사이토카인인 TNF-α, IL-6 유전자의 발현 양상의 변화를 도출하기 위하여 본 실험에서는 BV-2 cell에 LPS 및 삼백초 추출물을 농도별로 처리하고 6시간 배양한 후, RNA를 동정하고 RT-PCR을 시행하여 유전자의 발현 양상을 정량적인 방법을 통하여 분석함으로써 두 가지 유전자에서 공통적인 발현 양상 변화를 확인할 수 있었다.

도 4A 및 도 4B에 도시한 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 대조군에서는 TNF-α, IL-6 유전자의 발현량이 거의 없음을 확인하였으며 LPS(100ng/㎖)를 처리한 실험군에서는 대조군에 비하여 TNF-α, IL-6 유전자의 발현량이 확연히 증가했고, 삼백초 추출물 처리 시, 농도 의존적으로 감소하는 발현 양상 변화 변화를 확인하였다. GAPDH는 유전자 정량 분석의 대조군으로 사용하였다.

도 4A 및 도 4B는 LPS로 자극된 BV-2 신경교세포에서 전염증성 매개체인 TNF-α, IL-6 유전자에 대한 삼백초 추출물의 농도의존적인 저해 효능을 나타낸 것이다. BV-2 신경교세포를 6well plate에 5 X 10⁵cell/㎖이 되도록 한 후, 24시간 배양하고, SC를 농도별로 1시간 전 처리하였다. 그리고 LPS(100ng/㎖)로 세포를 자극하였다. 6시간 후, 세포 상층액을 제거하고, 세포에서 RNA를 동정하여, TNF-α, IL-6 유전자를 RT-PCR에 의해 분석하였다. 실험 결과는 3회의 반복 실험에 의한 것이다.

5. LPS 로 자극된 BV -2 신경교세포에서 삼백초 추출물의 NF -κB의 억제를 매개로 한 농도 의존적인 효능 확인 결과

삼백초 추출물의 효능 분석을 위하여 본 실험에서는 LPS에 의한 염증 유도시 전염증성 사이토카인들을 발현시키는 전사인자인 NF-κB의 활성화를 확인하였는데, NF-κB를 구성하는 p65의 핵질에서 핵 안으로의 유입과, IκBα의 분해로 p-IκBα의 발현을 Western blot에 의해 확인하였다.

도 5A에 도시한 바와 같이, BV-2 cell에 LPS(100ng/㎖) 및 삼백초 추출물을 농도별로 처리하고 30분간 배양한 후, 면역형광법을 통하여 NF-κB를 구성하는 p65 단백질이 핵질에서 핵 안으로 유입되는 정도를 확인할 수 있었다. 아무것도 처리하지 않은 경우 단백질 p65가 핵질에 많이 내재됨을 확인할 수 있었고, LPS 처리 시 단백질 p65가 핵 안으로 많이 유입된 사실을 알 수 있었으며, 삼백초 추출물을 처리하면 단백질 p65의 핵 안으로의 유입을 방지하는 사실을 확인할 수 있었다.

도 5B 및 도 5C에 도시한 바와 같이, LPS 처리 시, IκBα는 분해되어 p-IκBα 양이 증가하는 것을 확인하였고, SC의 농도 의존적으로 단백질 p-IκBα 양이 감소함을 확인하였다. β-actin은 정량 확인의 대조 단백질이다.

도 5A 내지 도 5C는 LPS로 자극된 BV-2 신경교세포에서 NF-κB 활성에 따른 SC의 농도 의존적인 저해 효능을 나타낸 것이다. 도 5A는 BV-2 신경교세포를 12well plate에 1 X 10⁵cell/well이 되도록 한 후, 24시간 배양하고, 삼백초 추출물을 농도별로 1시간 전 처리하며, LPS(100ng/㎖)로 세포를 자극하고, 30분 후 상층액을 제거하여 면역형광법을 이용해 관측한 결과이다. 도 5B는 BV-2 microglia 세포를 6well plate에 1 X 10⁶cell/㎖이 되도록 한 후, 24시간 배양하고, 삼백초 추출물을 농도별로 1시간 전 처리하며, LPS(100ng/㎖)로 세포를 자극하고, 30분 후 세포 상층액을 제거한 후, 세포질에서 단백질을 동정하며, 단일클론항체인 NF-κB p65와 다클론 항체인IκBα, p-IκBα를 사용하여, Western blot에 의해 분석한 결과이다. 도 5C는 도 5B에 나타낸 실험 결과에 대한 정량적 분석 결과이다. 실험 결과는 3회의 반복 실험에 의한 것이다.

6. LPS 로 자극된 BV -2 신경교세포에서 삼백초 추출물의 활성성분인 쿼세틴( Quercetin, QCT)의 NO 생산 및 각종 염증 관련 바이오 마커의 발현 억제 효능 확인 결과

삼백초의 구성 성분은 몇 종의 페놀릭 화합물로 구성된다고 종래 보고된바 있다 (Chen et al., 2010). 이에 따라, 본 발명자들은 종래 알려진 화합물 중 신경교세포에서 보고되지 않은 쿼세틴(QCT)을 선별하여 실험한 삼백초 추출물에 쿼세틴을 포함하는지 여부를 HPLC 분석을 이용하여 확인하였으며, 그 결과를 도 6A에 도시하였다.

이미 쿼세틴은 강력한 항산화활성 (Choi et al., 2002)을 나타낸다는 사실과 함께 항염증 효능 (Kao et al., 2010)을 갖는 사실이 보고된바 있다. 본 발명자들은 쿼세틴 화합물을 이용하여 BV-2 신경교세포에서 세포독성검사를 진행하여 독성이 없는 사실을 확인하였으며 (도 6B), 다양한 농도(1, 5, 10μM)의 쿼세틴에서 농도 의존적으로 NO 방출량을 억제하는지 확인하였다 (도 6D). 또한 쿼세틴의 신경염증 억제 효능을 확인하기 위하여 각종 염증 관련 바이오 마커를 이용해 확인한 결과 농도의존적으로 저해하는 사실을 확인하였다 (도 6E).

도 6A 내지 도 6E는 LPS로 자극된 BV-2 신경교세포에서 삼백초 추출물의 활성성분인 쿼세틴의 염증 억제 효능을 나타낸 것이다. 도 6A는 삼백초 추출물 및 지표물질인 QCT에 대한 HPLC 분석 결과이다. BV-2 신경교세포를 96well plate에 5 X 10⁴cell/well이 되도록 한 후, 24시간 배양하고, 삼백초 추출물의 활성성분인 쿼세틴을 농도별로 1시간 전 처리하였으며 LPS(100ng/㎖)로 세포를 자극하였다. 도 6B는 24시간 후 상층액을 제거하고 MTT 시약을 이용하여 세포 독성검사를 진행한 결과이다. 도 6D는 덜어낸 상층액을 이용하여 Griess assay를 이용해서 아질산염의 방출량을 측정한 결과이다. 도 6C는 쿼세틴의 화학구조를 나타낸 것이다. 도 6E는 아질산염(NO)의 합성 유도 효소인 iNOS 및 염증매개 단백질인 COX-2 그리고 전염증성 사이토카인인 IL-6를 확인하기 위해, 6well plate에 세포를 1 X 10⁶cell/well로 하루 배양하고, QCT를 농도별로 1시간 전처리 후, LPS(100ng/㎖)로 세포를 자극한 결과이다. 각각의 실험에서 6시간 또는 18시간 후, 세포에서 유전자 및 단백질을 동정하여 RT-PCR과 western blot에 의해 분석하였다. 실험 결과는 3회의 반복 실험에 의한 것이며 각각 유사한 실험 결과를 나타내었다.

이상으로 본 발명의 기술적 사상을 예시하기 위한 바람직한 실시 예와 관련하여 설명하고 도시하였지만, 본 발명은 이와 같이 도시되고 설명된 그대로의 구성 및 작용에만 국한되는 것이 아니며, 기술적 사상의 범주를 일탈함이 없이 본 발명에 대해 다수의 변경 및 수정 가능함을 당업자들은 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 그러한 모든 적절한 변경 및 수정과 균등물들도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주하여야 할 것이다.

Claims

삼백초 에탄올 용매 추출물을 함유하는 신경변성질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 에탄올 용매는 에탄올 100 중량부에 대해 물 1 내지 20 중량부 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜을 1 내지 20 중량부 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항의 조성물에 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제, 시럽제 또는 식용음료의 형태로서 제제학적으로 허용되는 부형제를 가하여 제형화된 조성물.
제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 생약제제 또는 건강기능식품.
제1항 또는 제2항에 있어서 유효성분으로서 쿼세틴 (Quercetin, QCT)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
삼백초 에탄올 추출물 추출 방법에 있어서,
(A) 삼백초 조각을 채취하여 건조하고 분쇄하는 단계;
(B) 분쇄한 삼백초 조각을 에탄올을 포함하는 극성용매와 혼합하는 단계; 및
(C) 분쇄한 삼백초 조각과 극성용매와의 혼합물로부터 삼백초 에탄올 추출물을 추출한 후 여과하고 진공 농축 및 동결 건조하는 단계;를 포함하는 삼백초 에탄올 추출물 추출 방법.
제6항에 있어서,
상기 (A) 단계는,
(A1) 삼백초 조각을 채취하여 채취한 삼백초 조각을 15℃ 내지 20℃의 온도 조건을 유지하면서 3일 내지 5일간 건조하는 단계; 및
(A2) 건조한 삼백초 조각을 입도가 0.1 mm 내지 5 mm를 갖도록 분쇄하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 삼백초 에탄올 추출물 추출 방법.
제6항에 있어서,
상기 (B) 단계의 극성용매는 에탄올 100 중량부에 대해 물 1 내지 20 중량부 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜을 1 내지 20 중량부 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 하는 삼백초 에탄올 추출물 추출 방법.
제6항에 있어서,
상기 (C) 단계는,
(C1) 추출 온도를 15℃ 내지 25℃로 유지하면서 초음파분쇄기를 이용하여 삼백초 에탄올 추출물을 추출하는 단계;
(C2) 추출한 삼백초 에탄올 추출물을 50℃ 내지 60℃에서 진공 농축하고 동결 건조하는 단계; 및
(C3) 동결 건조한 삼백초 에탄올 추출물을 용기에 주입한 후 40℃ 내지 50℃에서 감압 농축하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 삼백초 에탄올 추출물 추출 방법.