JP2015189691A - Gpdh活性抑制剤 - Google Patents
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Abstract
Description
から抽出されたものである、前記[1]又は「2」のGPDH活性抑制剤。
本発明は、下記の抽出方法により、カキの果皮からポモル酸を抽出して使用した。
システム: Waters 600E Multisolvent delivery system
カラム: Aqua C18(250×10mm,粒子径5μm、製品名phenomenex)
カラム温度: 37℃
溶離液: 移動相A液が水であり、移動相B液がアセトニトリルである。
グラジエント条件: 0分(B:80%)→12.5分(100%)→30分(100%)→32.5分(80%)
流量: 4.44mL/分
検出: UV波長200nm
上記の方法で得られたポモル酸に対して、そのGPDH活性及び脂肪蓄積の抑制効果について測定した。当該測定では、細胞分子レベルで行われており、脂肪前駆細胞(3T3−L1)を使用した。脂肪前駆細胞(3T3−L1)は、休止期に入ると脂肪細胞へと分化する性質を持っているが、インスリン、デキサメタゾン(DEX)、3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX)などの薬剤で刺激することにより効率よく分化することが知られている。
脂肪前駆細胞(3T3−L1)は、下記の手順で培養した。
(1)液体窒素から凍結アンプル(細胞数0.5×106〜1.0×106)を取り出し、37℃の湯浴で、細胞が約半分程度融解するまで攪拌した。
(1)72時間後に古い培養液を取り除き、5mL程度のリン酸緩衝生理食塩水(以下、PBSと略し)を静かに加え、細胞層を洗浄した。
(1)72時間後に古い培養液を取り除き、5mL程度のPBSを静かに加え、細胞層を洗浄した。
培養した細胞を回収し、酵素を抽出した。下記の方法により、GPDH活性測定キット(プライマリーセル製)を用いてそれぞれの試験区のGPDH活性を測定した。
下記の式で示す反応において、GPDHが酵素として働き、還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)を酸化型のNADに変換する。そのため、還元型のNADHの減少を波長340nmの吸光度変化で測定することにより、GPDHの活性を測定することができる。
反応基質のバイアル1本に対して精製水4.2mLを加えて溶解し、その溶液を反応基質溶液とした。反応基質溶液は使用するまで氷上で保管しておいた。
酵素抽出試薬の袋の内容物を精製水200mLで溶解し、その溶液を酵素抽出液とする。反応基質溶液は使用するまで氷上で保管しておいた。
(1)6ウェルプレートで培養した細胞を、上記の方法で用意した。
(1)96ウェルプレートに検体20μLずつ入れ室温に戻した。
)を求めた。測定は、7分間行った。
検体1mL当りのGPDHが1分間に1μmoleのNADHを消費する活性を1Uとし、下記の式に基づいて、GPDH活性を求めた。
図2は、トリテルペン類の脂肪細胞GPDH活性抑制効果を示す。横軸は、測定対象を表し、左から右の順で、未処理、DMSOによる処理、1μg/mL、2.5μg/mL及び5μg/mLのポモル酸による処理、1μg/mL、2.5μg/mL及び5μg/mLのウルソール酸による処理、並びに5μg/mLのオレアノール酸による処理の細胞を示す。縦軸は、上記の数式に基づいて算出したGPDH活性値を示す。
(オイルレッドO染色法)
アゾ色素(ズダンIII等)は、無極性かつ脂溶性であるため、組織に触れると組織内脂質に溶け込み、結果として脂肪染色ができる。さらに、染色された脂肪球を抽出液で抽出し、色素量を定量することによって脂肪量を推測することができる。
(1)脂肪前駆細胞(3T3−L1)を脂肪細胞に分化誘導後、2.5μg/mLのポモル酸を添加した培地で3日間培養した。
さらに、ポモル酸の添加濃度による生細胞への細胞毒性の有無を測定した。当該測定は、MTT細胞増殖キット(Roche 品番11 465 007)により脂肪前駆細胞(3T3−L1)の生細胞数の変化を観測した。
MTT(3−(4,5−ジ−メチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)は、ミトコンドリアにある脱水素酵素により還元され、ホルマザン色素が生じる。色素量は代謝活性のある細胞数と相関するため、色素を可溶化して比色法(吸光度550〜600nm)で定量することにより、生細胞数を測定する。
果実の果皮から抽出されるポモル酸、オレアノール酸、及びウルソール酸を含むトリテルペノイド類は、下記のHPLCにより定量化可能である。
カラム温度: 37℃、
移動相: 0.1%酢酸含有80%アセトニトリル、
流速: 0.6mL/min、
検出: UV波長200nm。
[その他の実施例]
Claims (5)
- 前記式(I)又は式(II)で示す化合物は、カキ、リンゴ及びナシを含む果実から抽
出されたものである、請求項1又は2に記載のGPDH活性抑制剤。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載のGPDH活性抑制剤を含む、食品添加物。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のGPDH活性抑制剤を配合した、食品。
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