CN109232500A - 一种从中华小苦荬中提取多种单体化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药提取、分离技术领域，具体涉及一种从中华小苦荬中提取多种单体化合物的方法，采用该方法能从中华小苦荬中提取分离得到13个化合物，其中其中化合物2（5，7，4'‑三羟基‑6，8‑二甲氧基黄酮），化合物5（蒲公英萜醇），化合物8（蒲公英甾醇），化合物11（蒲公英甾醇乙酸酯），化合物12（木犀草苷）,化合物13（棕榈酸）是首次从中华小苦荬中提取分离得到，本发明为进一步丰富中华小苦荬的化学成分研究资料，寻找新的具有较好活性的抗炎、抗氧化、抗肿瘤先导化合物以及为定量测定研究提供物质基础。

Description

一种从中华小苦荬中提取多种单体化合物的方法
技术领域
本发明涉及中药提取、分离技术领域，具体涉及一种从中华小苦荬中提取多种单体化合物的方法。
背景技术
中华小苦荬为菊科小苦荬属中华小苦荬Ixeriduim chinese (Thunb.)Tzvel.的全草，为多年生草本植物，高5-47厘米，花果期1-10月，中国大部分地区均有分布，每100克苦菜嫩幼苗含蛋白质2.8克，脂肪0.6克，粗纤维5.4克，糖类4.6克，胡萝卜素540微克，维生素B10.09毫克，维生素B20.11毫克，维生素PP0.6毫克，维生素C19毫克，维生素E2.93毫克，钾180毫克，钙66毫克，铁9.4毫克，锌0.86毫克，磷41毫克，还含有17种氨基酸，其中精氨酸、组氨酸、谷氨酸含量最高，占氨基酸总量的43％。
中华小苦荬中含有丰富的胡萝卜素、维生素C以及钾盐、钙盐等，对预防和治疗贫血病，维持人体正常的生理活动，促进生长发育和消暑保健有较好的作用。
中华小苦荬中含有蒲公英甾醇、胆碱等成分，对金黄色葡萄球菌耐药菌株、溶血性链球菌有较强的杀菌作用，对肺炎双球菌、脑膜炎球菌、白喉杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌等也有一定的杀伤作用，故对黄疸性肝炎、咽喉炎、细菌性痢疾、感冒发热及慢性气管炎、扁桃体炎等均有一定的疗效。中华小苦荬具有清热解毒、凉血消肿等功效，用于治疗肺痈、乳痈、痢疾肠炎及无名肿痛等多种疾病，是一种重要的民间药物，现代药理学研究表明中华小苦荬具有抗炎保肝、抗氧化和抗菌等生物活性，植物化学研究显示其主要含有二萜、黄酮、木脂素、鞣质和有机酸类化学成分。目前从中华小苦荬中分离出的化学成分大多数是已知的，为进一步丰富中华小苦荬的化学成分研究资料，寻找新的具有较好活性的抗炎、抗氧化、抗肿瘤先导化合物，对中华小苦荬中新化合物的开发和分离是亟待需要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种从中华小苦荬中提取多种单体化合物的方法，采用该方法能从中华小苦荬中提取分离得到 13个化合物，其中 化合物2、5、8、11～13为首次从中华小苦荬中分离得到，为进一步丰富中华小苦荬的化学成分研究资料，寻找新的具有较好活性的抗炎、抗氧化、抗肿瘤先导化合物以及为定量测定研究提供物质基础。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种从中华小苦荬中提取多种单体化合物的方法，包括以下步骤：
（1）取中华小苦荬药材粗粉，加10 重量倍、体积浓度为 95% 的乙醇渗漉提取 3 周，合并提取液，减压回收溶剂得醇提物；
（2）将得到的醇提物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取， 分别回收溶剂，得石油醚部位浸膏、氯仿部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏；
（3）氯仿部位浸膏经硅胶柱分离，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂进行梯度洗脱，得15个组分A～O；
（4）组分B经硅胶柱色谱，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂梯度洗脱，Sephadex LH-20柱色谱纯化，重结晶，得到化合物1、化合物3、化合物4和化合物5；
（5）组分G经硅胶柱色谱，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂梯度洗脱，Sephadex LH-20柱色谱纯化，用甲醇重结晶后得化合物7和化合物9；
（6）组分H经硅胶柱色谱，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂梯度洗脱，Sephadex LH-20柱色谱纯化，用甲醇反复重结晶得化合物10和化合物11；
（7）乙酸乙酯部位浸膏经硅胶柱分离，依次用氯仿:甲醇=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂进行梯度洗脱，得8个组分Ⅰ～Ⅷ；组分Ⅲ经硅胶柱色谱，甲醇-水梯度洗脱（甲醇:水=8:1），得化合物2、化合物8和化合物13；
（8）组分Ⅶ经硅胶柱色谱，甲醇-水梯度洗脱（甲醇:水=5:1），得化合物6和化合物12。
上述的从中华小苦荬中提取多种单体化合物的方法，从中华小苦荬中提取分离得到13个单体化合物，其中化合物1为槲皮素，化合物2为5，7，4' -三羟基-6，8-二甲氧基黄酮，化合物3为木犀草素，化合物4为β-谷甾醇，化合物5为蒲公英萜醇，化合物6为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，化合物7为β-胡萝卜苷，化合物8为蒲公英甾醇，化合物9为芹菜素，化合物10为豆甾醇，化合物11为蒲公英甾醇乙酸酯，化合物12为木犀草苷,化合物13为棕榈酸，其中化合物2、5、8、11～13是首次从中华小苦荬中提取分离得到。
13个单体化合物结构的测定过程如下：
化合物1 黄色针状结晶（甲醇），m.p.315～316℃。与三氯化铝反应生成黄色产物，紫外光下观察为黄绿色荧光，推测所得的物质为黄酮类化合物。1H-NMR（DMSO-d 6，400 MHz）δ:12.48（1H，s，5-OH），7.66（1H，d，J = 11.8 Hz，H-2′）,7.53（1H，d，J = 7.8 Hz，H-6′），6.88(1H，d，J = 7.8 Hz，H-5′)，6.41（1H，d，J = 1.8 Hz， H-8），6.17(1H，d，J = 1.8 Hz，H-6)，谱中δ:8.08（1H，s），8.44（1H，s），8.67（1H，s），9.91（1H，s），12.18（1H，S）分别为3′-OH、3-OH、4′-OH、7-OH、5-OH的信号。13 C-NMR（100Hz，DMSO-d 6）δ:145.5（C-2），136.1（C-3），176.2（C-4），158.2（C-5），98.5（C-6）,164.3（C-7），93.6（C-8），159.8（C-9）103.4（C-10）122.3（C-1′），115.7（C-2′），146.9（C-3′），148.1（C-4′），115.3（C-5′），120.4（C-6′）。以上数据与文献（陶鑫，潘多，许枬，等．酸模叶蓼化学成分的研究[J]中成药，2018，4（40）:866-870.）中报道基本一致，鉴定化合物1为槲皮素。
化合物2 黄色针晶（丙酮）；mp. 262～264℃；盐酸-镁粉反应呈阳性。ESI-MS m/z331［M + H］+；1H-NMR（DMSO-d 6，500 MHz）δ：12. 79 (1H，s，5-OH)，10. 41 ( 2 H，brs，7，4'-OH )，7. 88（2H，d，J = 8. 9 Hz，H-2'，6'），6. 83（2H，d，J =8. 9 Hz，H-3'，5'），6. 76（1H，s，H-3），3. 82（3H，s，OCH3），3. 76（3H，s，OCH3）。基以上数据与文献（韩庆通，肖凯，蔡云，等．念珠根黄芩中的黄酮类化合物[J]中国中药杂志,2017,9(42):1699-1703.）中的基本一致,确定化合物 2为5，7，4' -三羟基-6，8-二甲氧基黄酮。
化合物3 淡黄色粉末，m.p.328 ～ 329°C。盐酸-镁粉反应阳性，Molish反应阴性。1H-NMR（DMSO-d 6，500MHz）δ: 6.58（1H，s，3-H），12.94（1H，s，5-OH），6.10（1H，d，J = 2.0Hz，H-6），6.36（1H，d，J = 2.1 Hz，H-8），6.85（1H，d，J = 8.2 Hz，H-5′），7.36（1H，dd，J =8.9，2.2 Hz，H-6′），7.38（1H，d，J = 2.2 Hz，H-2′）。13C-NMR（DMSO-d 6）δ：164.1（C-2），102.8（C-3），181.7（C-4），116.9（C-5），99.9（C-6），167.0（C-7），94.7（C-8），157.9（C-9），103.2（C-10），121.2（C-1′），113.2（C-2′），146.2（C-3′），151.3（C-4′），116.4（C-5′），119.4（C-6′）。以上数据与文献（黄慧彬，江林，刘杰，等．活血丹的化学成分研究[J]中药材，2017,4(40):844-847.）中公开的基本一致，鉴定化合物3为木犀草素。
化合物4 白色粉末（氯仿），Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应呈阴性。与 β-谷甾醇对照品薄层色谱鉴定，用3种不同极性的溶剂系统展开，结果二者Rf值及显色行为一致，并且与对照品混合后熔点不降低，故化合物4鉴定为 β-谷甾醇。
化合物5 无色针晶（石油醚-氯仿-甲醇），mp 224 ～ 225 ℃。 EI-MS m/z：426[M]+，408[M-H2O]+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.59（1H，dd，J = 8.0，3.0 Hz，H-15），3.28（1H，dd，J = 11.0，4.0 Hz，H-3），2.09（1H，dt，J = 13.0，3.5 Hz，H-16b），1.95（1H，dd，J =15.0，3.0 Hz，H-16a），1.11（3H，s，H-26），0.99（3H，s，H-23），0.97（3H，s，H-28），0.93（3H，s，H-25），0.92（3H，s，H-27），0.91（3H，s，H-30），0.95（3H，s，H-28），0.85（3H，s，H-24）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：38.2（C-1），28.3（C-2），80.1（C-3），37.9（C-4），55.8（C-5），18.5（C-6），41.1（C-7），40.0（C-8），48.7（C-9），38.2（C-10），17.7（C-11），32.9（C-12），35.4（C-13），157.8（C-14），117.4（C-15），37.2（C-16），35.5（C-17），48.1（C-18），36.6（C-19），29.1（C-20），33.5（C-21），35.3（C-22），28.3（C-23），15.6（C-24），15.5（C-25），26.2（C-26），21.6（C-27），30.2（C-28），33.5（C-29），30.2（C-30）。以上数据与文献（舒佳为，石宽，杨光忠．飞扬草化学成分的研究[J]华中师范大学学报 自然科学版,2018,1(52):48-52.）报道一致，故鉴定化合物 5 为蒲公英萜醇。
化合物6 : 黄色粉末（甲醇）。盐酸-镁粉反应为阳性，Molish 反应为阳性，提示该化合物为黄酮苷类化合物。1H-NMRδ: 6. 81（1H，s，H-3），6. 43 ( 1H，d，J = 2. 1 Hz，H-6) ，6. 84 ( 1H，d，J = 2. 1 Hz，H-8 ) ，7. 92（2H，d，J = 8. 0 Hz，H-2'，6'），6. 91 (2H，d，J = 8. 7Hz，H-3'，5'），12.5（1H，s，5-OH）；13C-NMRδ: 161. 2（C-2），102.8（C-3），181.9（C-4），163. 3（C-5），100. 2（C-6），159. 5（C-7），91. 9（ C-8），160. 8（C-9），105. 1（C-10），121. 4（C-1'），129. 3（ C-2'），115. 8（C-3'），156. 9（C-4'），117. 1（C-5'），129. 1（C-6'）。糖区碳信号δ: 99. 8（C-1″）、72. 9（C-2″） 、77. 1（C-3″） 、69. 4（C-4″）、76. 7（C-5″）、61. 2（C-6″）提示该糖是葡萄糖，以上数据与文献（吴七十三，王青虎，那音台．蒙药光叶山苦荬化学成分研究[J]中药材，2017,12(35):1945-1949.）报道一致，故鉴定化合物6为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。
化合物7 白色粉末，m.p.290 ～ 292°C。Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应呈阳性，经酸水解，用PC检出含有葡萄糖，说明该化合物为甾体苷类化合物。硅胶薄层色谱检识，3种不同极性的溶剂系统展开，结果二者Rf值及显色行为一致，并且与对照品混合后熔点不降低，故化合物7鉴定为 β-胡萝卜苷。
化合物8 无色粉末，硫酸香草醛显红色，mp190～193℃，ESI - MS（m / z）：426[M]+。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ：4.69（1H，brs，H-30a），4.56（1H，brs，H-30b），3.18（1H，dd，J =11 Hz，5.4 Hz，H-3），1.68（3H，s，H-30），1.01（3H，s，H-26），0.95（3H，s，H-27），0.94（3H，s，H-23），0.83（3H，s，H-25），0.78（3H，s，H-28），0.76（3H，s，H-24）。13C-NMR（75 MHz，CDCl3）δ:37.8（C-1），28.5（C-2），76.9（C-3），39.2（C- 4），55.6（C-5） ，17.8（C-6），35.8（C-7），41.2（C- 8），51.4（C-9），36.7（C-10），21.7（C-11），25.6（C-12），38.7（C-13），42.5（C-14），28.3（C-15），38.2（C-16) ，35.6( C-17），47.8（C-18) ，39.7（C-19) ，154.2（C-20) ，26.5（C-21) ，41.8（C-22) ，28.2（C-23），15.8（C-24），16.6（C- 25），16.9（C-26），16.2（C-27），21.2（C-28），109.4（C-29），26.8（C- 30）。以上数据与文献（杨锦强，杨念云，吴啟南．佩兰的化学成分[J]中国药业,2017,21(26):4-6.）报道一致，故鉴定化合物8 为蒲公英甾醇。
化合物9 浅黄色粉末( 丙酮)，盐酸-镁粉反应呈阳性。1H-NMR（DMSO-d 6，400 MHz）δ: 12. 99 ( 1H，s，5-OH），10. 81 ( 1H，brs，7-OH），10. 46 ( 1H，brs，4'-OH），7. 93 (2H，d，J = 8. 7 Hz，H-2'，6') ，6. 95（2H，d，J = 8. 7 Hz，H-3'，5'），6. 8（1H，s，H-3），6.51 ( 1H，d，J = 2. 0 Hz，H-8 ) ，6. 20（1H，d，J = 2. 0 Hz，H-6）。13C-NMR ( DMSO-d 6，100MHz ) δ：165.4 ( C-2 ) ，104.9 ( C-3 ) ，182.9 ( C-4 ) ，162.6（C-5），99.87（C-6），164. 10 ( C-7) ，96.1 ( C-8 ) ，157.8（C-9），104.8（C-10），121. 76（C-1'），128.4（C-2'，6'），117. 9（C-3'，5'），163. 5（C-4'）。以上数据与文献（李彦，周宝萍，张皖晋，等．东北茶藨子化学成分研究[J]中草药，2018，4：772-779.）报道基本一致，鉴定化合物9为芹菜素。
化合物10 无色针状结晶，熔点145～146 °C。醋酐-浓硫酸反应阳性 ，香草醛-浓硫酸反应显色为紫红色，提示该化合物可能为甾体化合物。与豆甾醇对照品共薄层色谱鉴定，用3种不同极性的溶剂系统展开，结果二者Rf值及显色行为一致，并且与对照品混合后熔点不降低，故鉴定该化合物10为豆甾醇。
化合物11 无色粉末，mp 213～ 215℃，硫酸香草醛显红色；ESI-MS（m / z）：468[M]+。1H-NMR( 300 MHz，CDCl3)δ: 4.69（1H，brs，H-29a），4.52（1H，brs，H-29b），4.45（1H，dd，J = 5.5 Hz，11 Hz，H-3），2.12( 3H，s，COCH3) ，1.11（3H，s，H-30），1.05（3H，s，H-26），0.94（3H，s，H-27），0.86（3H，s，H-23），0.83（3H，s，H-25），0.82（3H，s，H-28），0.81（3H，s，H-24）。13C-NMR（75 MHz，DMSO-d 6）δ: 39.3（C-1），27.9（C-2），80.1（C-3），37.5（C-4），54.6（C-5），19.1（C-6），33.2（C-7），40.9（C -8），50.1（C-9），38.2（C-10），21.6（C-11） ，24.8（C-12），39.1（C-13），41.1（C-14），27.3（C-15），38.7（C-16），37.1（C-17），50.2（C-18），40.1（C-19），152.3（C-20），25.8（C-21），38.3（C-22），28.2（C-23），17.3（C-24），16.1（C-25）， 16.4（C-26），14.9（C-27），20.1（C-28），107.7（C-29），25.1（C-30），171.2（COCH3），21.4（COCH3）。以上数据与文献（柏玲，齐艳明，张文治．还阳参化学成分研究[J]齐齐哈尔大学学报,2012,2(28):22-24.）报道一致，故鉴定化合物 11 为蒲公英甾醇乙酸酯。
化合物12 黄绿色粉末（甲醇），mp（EtOH）：236～238℃，分子式 C12H20O11，盐酸-镁粉反应显红色提示为黄酮类化合物。锆盐-枸椽酸反应，加酸后黄色减退，提示结构中有 5-OH 但无 3-OH。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d 6）δ:12.88（1H，s，5-OH），7.39（1H，dd，J = 8.4，2.2Hz，H-6′），7.42（2H，d，J = 2.2 Hz，H-2′），7.10（1H，d，J = 8.4 Hz， H-5′），6.82（1H，d，J =2.1 Hz，H-8），6.75（1H，s，H-3），6.51（1H，d，J = 2.1 Hz，H-6），5.09（1H，d，J = 7.5 Hz，Glc-H-1″）；13C-NMR （125 MHz，DMSO-d 6）δ: 164.6 （C-2），103.9 （C-3），179.8 （C-4），157.1（C-5），100.3（C-6）， 163.5（C-7），96.7（C-8），161.2（C-9），105.3（C-10），120.4（C-1′），113.5（C-2′），149.7 （C-3′），146.5 （C-4′），116.8（C-5′），121.2（C-6′），99.8（Glc-C-1″），73.1 （Glc-C-2″），76.3（Glc-C-3″），70.2（Glc-C-4″），77.1（Glc-C-5″），61.6（Glc-C-6″）。以上数据与文献（李慧，杨宝，黄芬，等．半边旗化学成分研究[J]中草药，2018，1（49）：95-99．）报道基本一致，故鉴定化合物 12 为木犀草苷。
化合物13白色针晶（石油醚-丙酮）。ESI-MS（m / z）：279［M+Na］+，相对分子质量258。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：0.91（3 H， t，16-H），2.37（2H，t，J ＝ 7.7 Hz，H-2），1.63（2H，m，H-3），1.25～1.36（24H，-CH2）1.18 ～ 1.29（24H，m，H-4 ～ H-15），0.94（3H，t，J＝6.4 Hz，H-16）。13C-NMR（150MHz，CDCl3）δ：180.2（C-1），33.2（C-2），31.4（C-3），29.2～30.1（C-4～C-13），32.4（C-14），22.5（C-15），14.3（C-16），13.8（C-18）。以上数据与文献（聂映，姚卫峰．女贞子的化学成分研究[J]南京中医药大学学报,2014,5(30):475-477.）报道一致，故鉴定化合物13 为棕榈酸。
本发明的有益效果为：
本发明从中华小苦荬中提取多种单体化合物的方法采用多种色谱方法进行分离纯化，结合波谱技术与化学方法进行结构鉴定，该方法操作方法简便快速，
工艺方法环保，采用本发明从中华小苦荬中提取多种单体化合物的方法能从中华小苦荬中提取分离得到 13个化合物，其中 化合物2（5，7，4' -三羟基-6，8-二甲氧基黄酮）、化合物5（蒲公英萜醇）、化合物8（蒲公英甾醇）、化合物11（蒲公英甾醇乙酸酯）、化合物12（木犀草苷）和化合物13（棕榈酸）为首次从中华小苦荬中分离得到，为进一步丰富中华小苦荬的化学成分研究资料，寻找新的具有较好活性的抗炎、抗氧化、抗肿瘤先导化合物以及为定量测定研究提供物质基础。
具体实施方式
实施例1
1、仪器和材料
Waters Autospec Premier 776质谱仪（瑞士Waters公司）；Bruker Avance Ⅲ800MHz、Drx-600MHz、Drx-500MHz、AV-400MHz核磁共振仪（瑞士Waters公司）；TD电子分析天平（德国赛多利斯公司）；AutopolIV自动记录旋光仪；XT4-100Ａ显微熔点测定仪（北京科仪电光仪器厂）；Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）。
葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20（美国GE 公司），薄层色谱硅胶GF254、柱层析硅胶（青岛海洋化工厂）。试验试剂均为分析纯，为（国药集团化学试剂有限公司），豆甾醇对照品（批号：83-48-7；上海广锐生物科技有限公司），β-谷甾醇（批号：83-46-5；上海广锐生物科技有限公司），β-胡萝卜苷（批号：474-58-8；上海广锐生物科技有限公司）
中华小苦荬购自广西玉林药材市场，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为菊科植物中华小苦荬Ixeriduim chinese (Thunb.)Tzvel．的干燥全草，标本（SKM20161009）存于广西中医药大学壮瑶药协同创新中心。
2、提取和分离
中华小苦荬药材粗粉13.8 kg，加10 倍量 95% 乙醇渗漉提取 3 周，合并提取液，减压回收溶剂得醇提物，将得到的醇提物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别回收溶剂，得石油醚部位浸膏（105.7 g）、氯仿部位浸膏（78.5 g）、乙酸乙酯部位浸膏（102.3 g）。氯仿部位70 g经硅胶柱分离，以氯仿：丙酮梯度洗脱（100：0→80：1→60：1→50：1→30：1→15：1→10：1→8：1→5：1→1：1→0：1），得15个组分A-O。组分B经硅胶柱色谱，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂梯度洗脱；Sephadex LH-20柱色谱纯化，重结晶，得到化合物1（17 mg）、化合物3（14.4 mg）、化合物4（9.2 mg）、化合物5（16.3 mg）。组分G经硅胶柱色谱，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂梯度洗脱， Sephadex LH-20柱色谱纯化，甲醇重结晶得7（6.7 mg）、化合物9（7.1 mg）。组分H经硅胶柱色谱，氯仿：丙酮洗脱（即依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂梯度洗脱），Sephadex LH-20柱色谱纯化，甲醇反复重结晶得10（16.6mg）、化合物11（9.6 mg）。乙酸乙酯部位100 g经硅胶柱分离，以氯仿：甲醇梯度洗脱（100：0→80：1→60：1→50：1→30：1→15：1→10：1→8：1→5：1→1：1→0：1），得8个组分Ⅰ～Ⅷ；组分Ⅲ经硅胶柱色谱，甲醇-水梯度洗脱（甲醇:水=8:1），得化合物2（6.5mg）、化合物8（10.3mg）、化合物13（12.9mg）。组分Ⅶ经硅胶柱色谱，甲醇-水梯度洗脱（甲醇:水=5:1），得化合物6（9.7mg）、化合物12（11.8mg）。
3、结构鉴定
化合物1 黄色针状结晶（甲醇），m.p.315～316℃。与三氯化铝反应生成黄色产物，紫外光下观察为黄绿色荧光，推测所得的物质为黄酮类化合物。1H-NMR（DMSO-d 6，400 MHz）δ:12.48（1H，s，5-OH），7.66（1H，d，J = 11.8 Hz，H-2′）,7.53（1H，d，J = 7.8 Hz，H-6′），6.88(1H，d，J = 7.8 Hz，H-5′)，6.41（1H，d，J = 1.8 Hz， H-8），6.17(1H，d，J = 1.8 Hz，H-6)，谱中δ:8.08（1H，s），8.44（1H，s），8.67（1H，s），9.91（1H，s），12.18（1H，S）分别为3′-OH、3-OH、4′-OH、7-OH、5-OH的信号。13 C-NMR（100Hz，DMSO-d 6）δ:145.5（C-2），136.1（C-3），176.2（C-4），158.2（C-5），98.5（C-6）,164.3（C-7），93.6（C-8），159.8（C-9）103.4（C-10）122.3（C-1′），115.7（C-2′），146.9（C-3′），148.1（C-4′），115.3（C-5′），120.4（C-6′）。以上数据与文献（陶鑫，潘多，许枬，等．酸模叶蓼化学成分的研究[J]中成药，2018，4（40）:866-870.）中报道基本一致，鉴定化合物1为槲皮素。
化合物2 黄色针晶（丙酮）；mp. 262～264℃；盐酸-镁粉反应呈阳性。ESI-MS m/z331［M + H］+；1H-NMR（DMSO-d 6，500 MHz）δ：12. 79 (1H，s，5-OH)，10. 41 ( 2 H，brs，7，4'-OH )，7. 88（2H，d，J = 8. 9 Hz，H-2'，6'），6. 83（2H，d，J =8. 9 Hz，H-3'，5'），6. 76（1H，s，H-3），3. 82（3H，s，OCH3），3. 76（3H，s，OCH3）。基以上数据与文献（韩庆通，肖凯，蔡云，等．念珠根黄芩中的黄酮类化合物[J]中国中药杂志,2017,9(42):1699-1703.）中的基本一致,确定化合物 2为5，7，4' -三羟基-6，8-二甲氧基黄酮。
化合物3 淡黄色粉末，m.p.328 ～ 329°C。盐酸-镁粉反应阳性，Molish反应阴性。1H-NMR（DMSO-d 6，500MHz）δ: 6.58（1H，s，3-H），12.94（1H，s，5-OH），6.10（1H，d，J = 2.0Hz，H-6），6.36（1H，d，J = 2.1 Hz，H-8），6.85（1H，d，J = 8.2 Hz，H-5′），7.36（1H，dd，J =8.9，2.2 Hz，H-6′），7.38（1H，d，J = 2.2 Hz，H-2′）。13C-NMR（DMSO-d 6）δ：164.1（C-2），102.8（C-3），181.7（C-4），116.9（C-5），99.9（C-6），167.0（C-7），94.7（C-8），157.9（C-9），103.2（C-10），121.2（C-1′），113.2（C-2′），146.2（C-3′），151.3（C-4′），116.4（C-5′），119.4（C-6′）。以上数据与文献（黄慧彬，江林，刘杰，等．活血丹的化学成分研究[J]中药材，2017,4(40):844-847.）中公开的基本一致，鉴定化合物3为木犀草素。
化合物4 白色粉末（氯仿），Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应呈阴性。与 β-谷甾醇对照品薄层色谱鉴定，用3种不同极性的溶剂系统展开，结果二者Rf值及显色行为一致，并且与对照品混合后熔点不降低，故化合物4鉴定为 β-谷甾醇。
化合物5 无色针晶（石油醚-氯仿-甲醇），mp 224 ～ 225 ℃。 EI-MS m/z：426[M]+，408[M-H2O]+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.59（1H，dd，J = 8.0，3.0 Hz，H-15），3.28（1H，dd，J = 11.0，4.0 Hz，H-3），2.09（1H，dt，J = 13.0，3.5 Hz，H-16b），1.95（1H，dd，J =15.0，3.0 Hz，H-16a），1.11（3H，s，H-26），0.99（3H，s，H-23），0.97（3H，s，H-28），0.93（3H，s，H-25），0.92（3H，s，H-27），0.91（3H，s，H-30），0.95（3H，s，H-28），0.85（3H，s，H-24）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：38.2（C-1），28.3（C-2），80.1（C-3），37.9（C-4），55.8（C-5），18.5（C-6），41.1（C-7），40.0（C-8），48.7（C-9），38.2（C-10），17.7（C-11），32.9（C-12），35.4（C-13），157.8（C-14），117.4（C-15），37.2（C-16），35.5（C-17），48.1（C-18），36.6（C-19），29.1（C-20），33.5（C-21），35.3（C-22），28.3（C-23），15.6（C-24），15.5（C-25），26.2（C-26），21.6（C-27），30.2（C-28），33.5（C-29），30.2（C-30）。以上数据与文献（舒佳为，石宽，杨光忠．飞扬草化学成分的研究[J]华中师范大学学报 自然科学版,2018,1(52):48-52.）报道一致，故鉴定化合物 5 为蒲公英萜醇。
化合物6 : 黄色粉末（甲醇）。盐酸-镁粉反应为阳性，Molish 反应为阳性，提示该化合物为黄酮苷类化合物。1H-NMRδ: 6. 81（1H，s，H-3），6. 43 ( 1H，d，J = 2. 1 Hz，H-6) ，6. 84 ( 1H，d，J = 2. 1 Hz，H-8 ) ，7. 92（2H，d，J = 8. 0 Hz，H-2'，6'），6. 91 (2H，d，J = 8. 7Hz，H-3'，5'），12.5（1H，s，5-OH）；13C-NMRδ: 161. 2（C-2），102.8（C-3），181.9（C-4），163. 3（C-5），100. 2（C-6），159. 5（C-7），91. 9（ C-8），160. 8（C-9），105. 1（C-10），121. 4（C-1'），129. 3（ C-2'），115. 8（C-3'），156. 9（C-4'），117. 1（C-5'），129. 1（C-6'）。糖区碳信号δ: 99. 8（C-1″）、72. 9（C-2″） 、77. 1（C-3″） 、69. 4（C-4″）、76. 7（C-5″）、61. 2（C-6″）提示该糖是葡萄糖，以上数据与文献（吴七十三，王青虎，那音台．蒙药光叶山苦荬化学成分研究[J]中药材，2017,12(35):1945-1949.）报道一致，故鉴定化合物6为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。
化合物7 白色粉末，m.p.290 ～ 292°C。Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应呈阳性，经酸水解，用PC检出含有葡萄糖，说明该化合物为甾体苷类化合物。硅胶薄层色谱检识，3种不同极性的溶剂系统展开，结果二者Rf值及显色行为一致，并且与对照品混合后熔点不降低，故化合物7鉴定为 β-胡萝卜苷。
化合物8 无色粉末，硫酸香草醛显红色，mp190～193℃，ESI - MS（m / z）：426[M]+。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ：4.69（1H，brs，H-30a），4.56（1H，brs，H-30b），3.18（1H，dd，J =11 Hz，5.4 Hz，H-3），1.68（3H，s，H-30），1.01（3H，s，H-26），0.95（3H，s，H-27），0.94（3H，s，H-23），0.83（3H，s，H-25），0.78（3H，s，H-28），0.76（3H，s，H-24）。13C-NMR（75 MHz，CDCl3）δ:37.8（C-1），28.5（C-2），76.9（C-3），39.2（C- 4），55.6（C-5） ，17.8（C-6），35.8（C-7），41.2（C- 8），51.4（C-9），36.7（C-10），21.7（C-11），25.6（C-12），38.7（C-13），42.5（C-14），28.3（C-15），38.2（C-16) ，35.6( C-17），47.8（C-18) ，39.7（C-19) ，154.2（C-20) ，26.5（C-21) ，41.8（C-22) ，28.2（C-23），15.8（C-24），16.6（C- 25），16.9（C-26），16.2（C-27），21.2（C-28），109.4（C-29），26.8（C- 30）。以上数据与文献（杨锦强，杨念云，吴啟南．佩兰的化学成分[J]中国药业,2017,21(26):4-6.）报道一致，故鉴定化合物8 为蒲公英甾醇。
化合物9 浅黄色粉末( 丙酮)，盐酸-镁粉反应呈阳性。1H-NMR（DMSO-d 6，400 MHz）δ: 12. 99 ( 1H，s，5-OH），10. 81 ( 1H，brs，7-OH），10. 46 ( 1H，brs，4'-OH），7. 93 (2H，d，J = 8. 7 Hz，H-2'，6') ，6. 95（2H，d，J = 8. 7 Hz，H-3'，5'），6. 8（1H，s，H-3），6.51 ( 1H，d，J = 2. 0 Hz，H-8 ) ，6. 20（1H，d，J = 2. 0 Hz，H-6）。13C-NMR ( DMSO-d 6，100MHz ) δ：165.4 ( C-2 ) ，104.9 ( C-3 ) ，182.9 ( C-4 ) ，162.6（C-5），99.87（C-6），164. 10 ( C-7) ，96.1 ( C-8 ) ，157.8（C-9），104.8（C-10），121. 76（C-1'），128.4（C-2'，6'），117. 9（C-3'，5'），163. 5（C-4'）。以上数据与文献（李彦，周宝萍，张皖晋，等．东北茶藨子化学成分研究[J]中草药，2018，4：772-779.）报道基本一致，鉴定化合物9为芹菜素。
化合物10 无色针状结晶，熔点145～146 °C。醋酐-浓硫酸反应阳性 ，香草醛-浓硫酸反应显色为紫红色，提示该化合物可能为甾体化合物。与豆甾醇对照品共薄层色谱鉴定，用3种不同极性的溶剂系统展开，结果二者Rf值及显色行为一致，并且与对照品混合后熔点不降低，故鉴定该化合物10为豆甾醇。
化合物11 无色粉末，mp 213～ 215℃，硫酸香草醛显红色；ESI-MS（m / z）：468[M]+。1H-NMR( 300 MHz，CDCl3)δ: 4.69（1H，brs，H-29a），4.52（1H，brs，H-29b），4.45（1H，dd，J = 5.5 Hz，11 Hz，H-3），2.12( 3H，s，COCH3) ，1.11（3H，s，H-30），1.05（3H，s，H-26），0.94（3H，s，H-27），0.86（3H，s，H-23），0.83（3H，s，H-25），0.82（3H，s，H-28），0.81（3H，s，H-24）。13C-NMR（75 MHz，DMSO-d 6）δ: 39.3（C-1），27.9（C-2），80.1（C-3），37.5（C-4），54.6（C-5），19.1（C-6），33.2（C-7），40.9（C -8），50.1（C-9），38.2（C-10），21.6（C-11） ，24.8（C-12），39.1（C-13），41.1（C-14），27.3（C-15），38.7（C-16），37.1（C-17），50.2（C-18），40.1（C-19），152.3（C-20），25.8（C-21），38.3（C-22），28.2（C-23），17.3（C-24），16.1（C-25）， 16.4（C-26），14.9（C-27），20.1（C-28），107.7（C-29），25.1（C-30），171.2（COCH3），21.4（COCH3）。以上数据与文献（柏玲，齐艳明，张文治．还阳参化学成分研究[J]齐齐哈尔大学学报,2012,2(28):22-24.）报道一致，故鉴定化合物 11 为蒲公英甾醇乙酸酯。
化合物12 黄绿色粉末（甲醇），mp（EtOH）：236～238℃，分子式 C12H20O11，盐酸-镁粉反应显红色提示为黄酮类化合物。锆盐-枸椽酸反应，加酸后黄色减退，提示结构中有 5-OH 但无 3-OH。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d 6）δ:12.88（1H，s，5-OH），7.39（1H，dd，J = 8.4，2.2Hz，H-6′），7.42（2H，d，J = 2.2 Hz，H-2′），7.10（1H，d，J = 8.4 Hz， H-5′），6.82（1H，d，J =2.1 Hz，H-8），6.75（1H，s，H-3），6.51（1H，d，J = 2.1 Hz，H-6），5.09（1H，d，J = 7.5 Hz，Glc-H-1″）；13C-NMR （125 MHz，DMSO-d 6）δ: 164.6 （C-2），103.9 （C-3），179.8 （C-4），157.1（C-5），100.3（C-6）， 163.5（C-7），96.7（C-8），161.2（C-9），105.3（C-10），120.4（C-1′），113.5（C-2′），149.7 （C-3′），146.5 （C-4′），116.8（C-5′），121.2（C-6′），99.8（Glc-C-1″），73.1 （Glc-C-2″），76.3（Glc-C-3″），70.2（Glc-C-4″），77.1（Glc-C-5″），61.6（Glc-C-6″）。以上数据与文献（李慧，杨宝，黄芬，等．半边旗化学成分研究[J]中草药，2018，1（49）：95-99．）报道基本一致，故鉴定化合物 12 为木犀草苷。
化合物13白色针晶（石油醚-丙酮）。ESI-MS（m / z）：279［M+Na］+，相对分子质量258。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：0.91（3 H， t，16-H），2.37（2H，t，J ＝ 7.7 Hz，H-2），1.63（2H，m，H-3），1.25～1.36（24H，-CH2）1.18 ～ 1.29（24H，m，H-4 ～ H-15），0.94（3H，t，J＝6.4 Hz，H-16）。13C-NMR（150MHz，CDCl3）δ：180.2（C-1），33.2（C-2），31.4（C-3），29.2～30.1（C-4～C-13），32.4（C-14），22.5（C-15），14.3（C-16），13.8（C-18）。以上数据与文献（聂映，姚卫峰．女贞子的化学成分研究[J]南京中医药大学学报,2014,5(30):475-477.）报道一致，故鉴定化合物13 为棕榈酸。
四、小结
本实验对中华小苦荬的化学成分进行了系统研究，从中共分离13个单体化合物，通过理化性质和光谱数据分别鉴定为：槲皮素（1）、5，7，4' -三羟基-6，8-二甲氧基黄酮（2）、木犀草素（3）、β-谷甾醇（4）、蒲公英萜醇（5）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（6）、β-胡萝卜苷（7）、蒲公英甾醇（8）、芹菜素（9）、豆甾醇（10）、蒲公英甾醇乙酸酯（11）、木犀草苷（12）、棕榈酸（13）。其中，化合物2、5、8、11～13为首次从中华小苦荬中分离得到。
实施例2
一种从中华小苦荬中提取多种单体化合物的方法，包括以下步骤：
（1）取中华小苦荬药材粗粉，加10 重量倍、体积浓度为 95% 的乙醇渗漉提取 3 周，合并提取液，减压回收溶剂得醇提物；
（2）将得到的醇提物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取， 分别回收溶剂，得石油醚部位浸膏、氯仿部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏；
（3）氯仿部位浸膏经硅胶柱分离，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂进行梯度洗脱，得15个组分A～O；
（4）组分B经硅胶柱色谱，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂梯度洗脱，Sephadex LH-20柱色谱纯化，重结晶，得到化合物1、化合物3、化合物4和化合物5；
（5）组分G经硅胶柱色谱，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂梯度洗脱，Sephadex LH-20柱色谱纯化，用甲醇重结晶后得化合物7和化合物9；
（6）组分H经硅胶柱色谱，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂梯度洗脱，Sephadex LH-20柱色谱纯化，用甲醇反复重结晶得化合物10和化合物11；
（7）乙酸乙酯部位浸膏经硅胶柱分离，依次用氯仿:甲醇=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂进行梯度洗脱，得8个组分Ⅰ～Ⅷ；
组分Ⅲ经硅胶柱色谱，用甲醇:水=8:1的混合溶剂洗脱，得化合物2、化合物8和化合物13；
（8）组分Ⅶ经硅胶柱色谱，用甲醇:水==5:1的混合溶剂洗脱，得化合物6和化合物12。
上述的从中华小苦荬中提取多种单体化合物的方法，从中华小苦荬中提取分离得到13个单体化合物，其中化合物1为槲皮素，化合物2为5，7，4' -三羟基-6，8-二甲氧基黄酮，化合物3为木犀草素，化合物4为β-谷甾醇，化合物5为蒲公英萜醇，化合物6为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，化合物7为β-胡萝卜苷，化合物8为蒲公英甾醇，化合物9为芹菜素，化合物10为豆甾醇，化合物11为蒲公英甾醇乙酸酯，化合物12为木犀草苷,化合物13为棕榈酸，其中化合物2、5、8、11～13是首次从中华小苦荬中提取分离得到。

Claims (2)

1.一种从中华小苦荬中提取多种单体化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取中华小苦荬药材粗粉，加10 重量倍、体积浓度为 95% 的乙醇渗漉提取 3 周，合并提取液，减压回收溶剂得醇提物；
（2）将得到的醇提物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取， 分别回收溶剂，得石油醚部位浸膏、氯仿部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏；
（3）氯仿部位浸膏经硅胶柱分离，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂进行梯度洗脱，得15个组分A～O；
（4）组分B经硅胶柱色谱，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂梯度洗脱，Sephadex LH-20柱色谱纯化，重结晶，得到化合物1、化合物3、化合物4和化合物5；
（5）组分G经硅胶柱色谱，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂梯度洗脱，Sephadex LH-20柱色谱纯化，用甲醇重结晶后得化合物7和化合物9；
（6）组分H经硅胶柱色谱，依次用氯仿:丙酮=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂梯度洗脱，Sephadex LH-20柱色谱纯化，用甲醇反复重结晶得化合物10和化合物11；
（7）乙酸乙酯部位浸膏经硅胶柱分离，依次用氯仿:甲醇=100:0、80:1、60:1、50:1、30:1、15:1、10:1、8:1、5:1、1:1、0:1的混合溶剂进行梯度洗脱，得8个组分Ⅰ～Ⅷ；
组分Ⅲ经硅胶柱色谱，用甲醇:水=8:1的混合溶剂洗脱，得化合物2、化合物8和化合物13；
（8）组分Ⅶ经硅胶柱色谱，用甲醇:水==5:1的混合溶剂洗脱，得化合物6和化合物12。
2.根据权利要求1所述的从中华小苦荬中提取多种单体化合物的方法，其特征在于，从中华小苦荬中提取分离得到13个单体化合物，其中化合物1为槲皮素，化合物2为5，7，4' -三羟基-6，8-二甲氧基黄酮，化合物3为木犀草素，化合物4为β-谷甾醇，化合物5为蒲公英萜醇，化合物6为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，化合物7为β-胡萝卜苷，化合物8为蒲公英甾醇，化合物9为芹菜素，化合物10为豆甾醇，化合物11为蒲公英甾醇乙酸酯，化合物12为木犀草苷,化合物13为棕榈酸，其中化合物2、5、8、11～13是首次从中华小苦荬中提取分离得到。
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