CN111337593A - 四种基源郁金饮片中共有止痛成分的检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了四种基源郁金饮片中共有止痛成分的检测方法及应用，取莪术烯醇标准品，配制成对照品溶液；取待测温郁金、桂郁金、绿丝郁金或黄丝郁金饮片粉末样品，用水提取，水提液作为供试品溶液；对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定并计算郁金中莪术烯醇的含量。本发明创造性的以郁金中的共有止痛成分莪术烯醇为对照品，提供了一种新的郁金质控标准，通过本发明的检测方法可以确定四种基源郁金水提液中共有止痛成分莪术烯醇的含量，进一步为临床用药提供指导。

Description

四种基源郁金饮片中共有止痛成分的检测方法及应用
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及四种基源郁金饮片中共有止痛成分的检测方法及应用。
背景技术
郁金为姜科植物温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling、姜黄Curcuma longa L.、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val.的干燥块根。前两种郁金常称作“温郁金”和“黄丝郁金”，后两种则习惯称作“桂郁金”或“绿丝郁金”。郁金药用历史悠久，具有活血化瘀、清心解郁、行气止痛、利胆退黄及保护肝脏、促进胆汁分泌和排泄、降血脂，抑制中枢神经，影响消化系统及抗肿瘤等功效；临床用于治疗经闭痛经、胸腹胀痛、黄胆尿赤、热病神昏、癫痫发狂以及肝炎、胆囊炎、心血管病、慢性胃炎、精神分裂症、肿瘤等疾病，其中临床多用于止痛，但由于四种基源郁金的生长地区、习性的不同，四者的外观性状及所含有化学成分方面差异较大。
2015年版《中国药典》一部郁金项下仅收载了薄层色谱法（TLC）鉴别（以温郁金对照药材）、水分和总灰分的检查。郭昊等人以吉马酮作为郁金药材质量评价标准，选择吉马酮作为定量指标成分，采用红外色谱法进行定量分析；专利CN105548026A公开了一种快速的郁金药材质控检测方法，将近红外在线分析技术引入到药材郁金中，实现对各质控指标(莪术二酮、莪术醇、吉马酮、水分含量)的快速测定，但这些指标并不适用于四种基源郁金，尤其当郁金作为止痛中药临床用药时，这些标准亦不能用来提供指导。
虽然不同基源郁金在外观性状和化学成分方面差异较大，但古今临床用药并未对四种基源郁金进行区分，普遍将不同品种的郁金作为通用药材，因此寻找四种基源郁金共有药效成分并将其作为薄层、含量测定指标用于进一步补充完善药典标准，对于有效控制郁金药材和饮片质量具有极为重要的意义。
发明内容
针对现有技术中郁金化学成分方面差异较大，缺乏作为止痛药时的质控标准的问题，本发明提供了四种基源郁金饮片中共有止痛成分的检测方法及应用，创造性的以共有止痛成分莪术烯醇为对照品，提供了一种新的郁金质控标准，进一步为临床用药提供指导。
本发明通过以下技术方案实现：
四种基源郁金饮片中共有止痛成分的检测方法，包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取莪术烯醇标准品，配制成对照品溶液；
（2）供试品溶液的制备：取待测郁金饮片粉末样品，用水提取，水提液作为供试品溶液；
（3）测定：取对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定并计算郁金中莪术烯醇的含量。
优选地，所述的郁金为温郁金、桂郁金、绿丝郁金和黄丝郁金中的一种。
优选地，步骤（1）所述的对照品溶液为0.0238 mg·mL-1的莪术烯醇甲醇溶液。
优选地，步骤（2）中所述的水提液的提取方法为：称取郁金饮片粉末1.0 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加水25 mL，称重后密塞，浸泡1 h，加热回流1 h，冷却后取下圆底烧瓶，再称定重量，加水补足失重，过滤，滤液转移到离心管中，在12000 r·min-1离心10min，取上清液，过0.45 µm微孔滤膜，得水提液。
优选地，步骤（3）中所述的检测条件为：色谱柱，Thermo scientific syncronisC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30℃，流动相：0.1%磷酸-乙腈（52:48），流速：1.0mL·min-1，检测波长：210 nm，进样量：10μL。
本发明中，所述的郁金饮片中共有止痛成分的检测方法在评价郁金质量或指导临床用药上的应用。
有益效果
（1）本发明创造性的以四种基源郁金中的共有止痛成分莪术烯醇为对照品，提供了一种新的郁金质控标准；
（2）通过本发明的检测方法可以确定四种基源郁金水提液中共有止痛成分莪术烯醇的含量，进一步为临床用药提供指导。
附图说明
图1为莪术烯醇对照品HPLC谱图。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1
（1）对照品溶液的制备：精密称取莪术烯醇标准品5.95 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为莪术烯醇对照品储备液，浓度为0.595 mg·mL-1，精密吸取莪术烯醇对照品储备液1 mL，置25 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容，摇匀，作为莪术烯醇对照品溶液，浓度为0.0238 mg·mL-1；
（2）供试品溶液的制备：分别取10个批次的温郁金饮片粉末约1.0 g，精密称定，置100mL圆底烧瓶中，加水25 mL，称重后密塞，浸泡1 h，加热回流1 h，冷却后取下圆底烧瓶，再称定重量，加水补足失重，过滤，药液转移到离心管中，在12000 r·min-1离心10 min，取上清液，过0.45 µm微孔滤膜，即得10个批次的温郁金饮片供试品溶液；
（3）测定：分别精密吸取对照品溶液和10个批次温郁金饮片的供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定并计算温郁金中莪术烯醇的含量，10个批次的温郁金饮片中莪术烯醇的含量如表1所示，莪术烯醇标准品HPLC谱图如图1所示；
步骤（3）中所述的液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱，Thermo scientific syncronisC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30℃，流动相：0.1%磷酸-乙腈（52:48），流速：1.0mL·min-1，检测波长：210 nm，进样量：10 μL。
表1实施例1中10个批次的温郁金饮片水提液中莪术烯醇的含量
Figure 790197DEST_PATH_IMAGE001
。
实施例2
（1）对照品溶液的制备：精密称取莪术烯醇标准品5.95 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为莪术烯醇对照品储备液，浓度为0.595 mg·mL-1，精密吸取莪术烯醇对照品储备液1 mL，置25 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容，摇匀，作为莪术烯醇对照品溶液，浓度为0.0238 mg·mL-1；
（2）供试品溶液的制备：分别取10个批次的桂郁金饮片粉末约1.0 g，精密称定，置100mL圆底烧瓶中，加水25 mL，称重后密塞，浸泡1 h，加热回流1 h，冷却后取下圆底烧瓶，再称定重量，加水补足失重，过滤，药液转移到离心管中，在12000 r·min-1离心10 min，取上清液，过0.45 µm微孔滤膜，即得10个批次的桂郁金饮片供试品溶液；
（3）测定：分别精密吸取对照品溶液和10个批次桂郁金饮片的供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定并计算郁金中莪术烯醇的含量，10个批次的桂郁金饮片中莪术烯醇的含量如表2所示；
步骤（3）中所述的液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱，Thermo scientific syncronisC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30℃，流动相：0.1%磷酸-乙腈（52:48），流速：1.0mL·min-1，检测波长：210 nm，进样量：10 μL。
表2 实施例2中10个批次的桂郁金饮片水提液中莪术烯醇的含量
Figure 123089DEST_PATH_IMAGE002
。
实施例3
（1）对照品溶液的制备：精密称取莪术烯醇标准品5.95 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为莪术烯醇对照品储备液，浓度为0.595 mg·mL-1，精密吸取莪术烯醇对照品储备液1 mL，置25 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容，摇匀，作为莪术烯醇对照品溶液，浓度为0.0238 mg·mL-1；
（2）供试品溶液的制备：分别取10个批次的绿丝郁金饮片粉末约1.0 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加水25 mL，称重后密塞，浸泡1 h，加热回流1 h，冷却后取下圆底烧瓶，再称定重量，加水补足失重，过滤，药液转移到离心管中，在12000 r·min-1离心10 min，取上清液，过0.45 µm微孔滤膜，即得10个批次的绿丝郁金饮片供试品溶液；
（3）测定：分别精密吸取对照品溶液和10个批次绿丝郁金饮片的供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定并计算郁金中莪术烯醇的含量，10个批次的绿丝郁金饮片中莪术烯醇的含量如表3所示；
步骤（3）中所述的液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱，Thermo scientific syncronisC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30℃，流动相：0.1%磷酸-乙腈（52:48），流速：1.0mL·min-1，检测波长：210 nm，进样量：10 μL。
表3实施例3中10个批次的绿丝郁金饮片水提液中莪术烯醇的含量
Figure 203041DEST_PATH_IMAGE003
。
实施例4
（1）对照品溶液的制备：精密称取莪术烯醇标准品5.95 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为莪术烯醇对照品储备液，浓度为0.595 mg·mL-1，精密吸取莪术烯醇对照品储备液1 mL，置25 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容，摇匀，作为莪术烯醇对照品溶液，浓度为0.0238 mg·mL-1；
（2）供试品溶液的制备：分别取10个批次的黄丝郁金饮片粉末约1.0 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加水25 mL，称重后密塞，浸泡1 h，加热回流1 h，冷却后取下圆底烧瓶，再称定重量，加水补足失重，过滤，药液转移到离心管中，在12000 r·min-1离心10 min，取上清液，过0.45 µm微孔滤膜，即得10个批次的黄丝郁金饮片供试品溶液；
（3）测定：分别精密吸取对照品溶液和10个批次黄丝郁金饮片的供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定并计算郁金中莪术烯醇的含量，10个批次的黄丝郁金饮片中莪术烯醇的含量如表4所示；
步骤（3）中所述的液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱，Thermo scientific syncronisC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30℃，流动相：0.1%磷酸-乙腈（52:48），流速：1.0mL·min-1，检测波长：210 nm，进样量：10 μL。
表4实施例4中10个批次的黄丝郁金饮片水提液中莪术烯醇的含量
Figure 432028DEST_PATH_IMAGE004
。
基于止痛成分含量的四种基源郁金饮片的等量性分析：通过以上实施例分析，温郁金、桂郁金、绿丝郁金及黄丝郁金饮片中均含有莪术烯醇，但含量差异较大。温郁金水提液中莪术烯醇的含量在0.1061～0.7485mg·g-1之间，平均值为0.2708mg·g-1；桂郁金水提液中莪术烯醇的含量在0.0163～0.2923mg·g-1之间，平均值为0.0658mg·g-1；绿丝郁金水提液中莪术烯醇的含量在0.1386～0.4974 mg·g-1之间，平均值为0.3101mg·g-1；黄丝郁金水提液中莪术烯醇的含量在0.0176～0.1247mg·g-1之间，平均值为0.0573mg·g-1，本研究在测定郁金饮片水提液中莪术烯醇的含量时，采用传统的水煎煮法，与临床用药过程一致。莪术烯醇作为郁金饮片中的共有成分，具有止痛的作用，以其作为衡量指标可为郁金作为止痛中药使用时提供一定的指导。基于上述测定结果，当郁金作为止痛药物时，我们初步认为温郁金和绿丝郁金饮片在临床用药中可等量，而黄丝郁金和桂郁金的临床用药可等量，温郁金、绿丝郁金的用量可为黄丝郁金、桂郁金饮片的约1/5量。
药效验证
1.四种基源郁金止痛作用研究
（1）分别取温郁金、绿丝郁金、黄丝郁金、桂郁金各约500g，分别加入10倍量的水，浸泡1h，加热回流2次，每次1h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至200mL；按10g做为小鼠临床等效量计算标准，则为1.3g/kg。分别取四种基源郁金的水提液20mL加1%羧甲基纤维素钠稀释到100mL，相当于给药饮片量为0.5g/mL，即为灌胃用药。小鼠灌胃体积为20mL/kg。
（2）取健康小鼠60只，随机分为10组，模型对照组（等体积生理盐水)、阳性对照组（阿司匹林0.25g/kg）、温郁金水提液组（10g/kg)、桂郁金水提液组（10g/kg)、绿丝郁金水提液组（10g/kg)、黄丝郁金水提液组（10g/kg)。每日给药l次，连续7天。于第7天给药后30min，各鼠腹腔注射1%醋酸（20mL/kg），观察记录第一次扭体反应的时间（潜伏期）和15分钟内小鼠扭体反应次数。
研究发现，与模型对照组相比较，阳性对照(阿司匹林)组可以明显延长醋酸所致小鼠扭体反应的潜伏期，减少小鼠15min内扭体次数。绿丝郁金、温郁金可以延长醋酸所致小鼠扭体反应的潜伏期，减少小鼠15min内扭体次数，结果有显著性差异。黄丝郁金、桂郁金水提液镇痛作用相对较弱，进一步说明本专利方法可定量郁金中有效止痛成分，为临床用药提供指导。

Claims (6)

1.四种基源郁金饮片中共有止痛成分的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取莪术烯醇标准品，配制成对照品溶液；
（2）供试品溶液的制备：取待测郁金饮片粉末样品，用水提取，水提液作为供试品溶液；
（3）测定：取对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定并计算郁金中莪术烯醇的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的郁金为温郁金、桂郁金、绿丝郁金和黄丝郁金中的一种。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）所述的对照品溶液为0.0238mg·mL-1的莪术烯醇甲醇溶液。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述的水提液的提取方法为：称取郁金饮片粉末1.0 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加水25 mL，称重后密塞，浸泡1 h，加热回流1 h，冷却后取下圆底烧瓶，再称定重量，加水补足失重，过滤，滤液转移到离心管中，在12000 r·min-1离心10 min，取上清液，过0.45 µm微孔滤膜，得水提液。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述的检测条件为：色谱柱，Thermo scientific syncronis C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30℃，流动相：0.1%磷酸-乙腈（52:48），流速：1.0 mL·min-1，检测波长：210 nm，进样量：10μL。
6.权利要求1～5任一项所述的郁金饮片中共有止痛成分的检测方法在评价郁金质量或指导临床用药上的应用。
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