CN108459089A - 一种采用hplc-dad-ms测定郁金次生代谢产物的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种采用HPLC‑DAD‑MS测定郁金次生代谢产物的方法。本申请通过采用HPLC‑DAD‑MS分析手段，建立郁金指纹图谱分析方法，并通过模式识别技术，分析郁金次生代谢产物，结合紫外、多级质谱数据，对生物标志物进行鉴定。

Description

一种采用HPLC-DAD-MS测定郁金次生代谢产物的方法

技术领域：本申请涉及一种采用HPLC-DAD-MS测定郁金次生代谢产物的方法，属于中药分析测定领域。

背景技术：

郁金临床常用于治疗肝胆系统疾病，通过初步研究，我们得出如下结论：郁金水提物表现为性寒，郁金醇提物均表现为性温；郁金提取物的寒温与其姜黄素含量有一定正相关性。

发明内容：

为了分析郁金性寒的有效成分群，需要采用HPLC-MS指纹图谱技术，分析郁金的次生代谢产物、提取物及含药血清图谱间，阐明其体内作用的物质基础。

本申请采用HPLC-DAD-MS分析手段，建立郁金指纹图谱分析方法，并通过模式识别技术，比较郁金次生代谢产物的差异，结合紫外、多级质谱数据，对生物标志物进行鉴定。

一种采用HPLC-DAD-MS测定郁金次生代谢产物的方法，其特征在于，

(1)取郁金饮片粉碎、过20目筛，精称0.5g粉末，置于具塞三角瓶中，精密加入50mL甲醇，称重后置于超声波提取器中，冰水超声提取40min，取出称重后用甲醇补重，进样前过0.45μm微孔滤膜，

(2)取处理好的样品，上样，其中HPLC-DAD-MS测定的条件为：

固定相：Kromasil C18 5uL 250×4.6mm(E48163)，柱温35℃，流动相：A相：0.1％甲酸水，B相：乙腈，梯度设置：0-20min，10-60％B；20-45min，60-100％B；45-50min，100％B，流速：1.0ml/min，进样量：10μL，DAD检测器的设置：200-400nm(监测波长265nm)，

质谱检测器的设置：

附图说明：

附图1姜黄、郁金HPLC-DAD(265nm)色谱指纹图谱匹配图 (a)姜黄典型色谱图 (b)郁金典型色谱图 (c) 姜黄、郁金色谱匹配图a.Not identified b.Bisdemethoxycurcuminc.Demethoxycurcumin d.Curcumin e.Not identufied f.Ar-turmerone g.Zingiberene，β-bisabolene orβ-curcumene h.α，β-turmerone or bisacumol

附图2姜黄、郁金质谱总离子流图(TIC)(A：姜黄，B：郁金)

附图3PCA主成份分析得分图(scores plot)

附图4PCA主成份分析载荷图(Loading Plot)

附图5姜黄、郁金主要次生差异代谢产物相对含量比较

附图6(a)姜黄素标品一级质谱图

附图6(b)姜黄素标品分子离子峰(m/z 369)的二级质谱图

附图7生物标志物2的一级质谱图(出峰时间：UV.22.5min，MS：23min)

附图8生物标志物2的紫外全波长扫描图(出峰时间：UV.22.5min，MS：23min)

附图9生物标志物2的二级质谱图(出峰时间：UV.22.5min，MS：23min)

附图10生物标志物3的一级质谱图(出峰时间：UV.23.0min，MS：23.5min)

附图11生物标志物3的紫外全波长扫描图(出峰时间：UV.23.0min，MS：23.5min)

附图12生物标志物3的二级质谱图(出峰时间：UV.23.0min，MS：23.5min)

附图13生物标志物4的一级质谱图(出峰时间：UV.23.6min，MS：24.1min)

附图14生物标志物4的紫外全波长扫描图(出峰时间：UV.23.6min，MS：24.1min)

附图15生物标志物4的二级质谱图(出峰时间：UV.23.6min，MS：24.1min)

附图16生物标志物5的一级质谱图(出峰时间：UV.24.8min，MS：25.3min)

附图17生物标志物5的紫外全波长扫描图(出峰时间：UV.24.8min，MS：25.3min)

附图18生物标志物5的二级质谱图(出峰时间：UV.24.8min，MS：25.3min)

附图19生物标志物8的一级质谱图(出峰时间：UV.33.4min，MS：33.9min)

附图20生物标志物8的紫外全波长扫描图(出峰时间：UV.33.4min，MS：33.9min)

附图21生物标志物8的二级质谱图(出峰时间：UV.33.4min，MS：33.9min)

附图22生物标志物9的一级质谱图(出峰时间：UV.35.2min，MS：35.6min)

附图23生物标志物9的紫外全波长扫描图(出峰时间：UV.35.2min，MS：35.6min)

附图24生物标志物9的二级质谱图(出峰时间：UV.35.2min，MS：35.6min)

附图25生物标志物10的一级质谱图(出峰时间：UV.37.0min，MS：37.4min)

附图26生物标志物10的紫外全波长扫描图(出峰时间：UV.37.0min，MS：37.4min)

附图27生物标志物10的二级质谱图(出峰时间：UV.37.0min，MS：37.4min)

具体实施方式：

具体实验如下：

一、材料与仪器

仪器：Agilent 1200 HPLC系统，高压二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、Chemstations化学工作站等(美国Agilent公司)，串联二极管阵列检测器(DAD detector)和安捷伦离子阱质谱检测器(Agilent LC-MSD-Trap-SL ion trap mass spectrometer)。台式高速离心机(美国Labnet)，Sartorious BT 25S型 1/100000电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)，KQ-500DE型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)，水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。

试剂：甲醇、乙腈为Fisher色谱纯，甲酸(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)，水为Milli-Q water system(Millipore，Bedfo-rd，MA，USA)过滤后的纯水。

数据处理软件：6300Series Ion Trap LC/MS Software 6.1，SIMCA-P+12.0(Umetrics，Sweden)，Microsoft Excel2003(Microsoft Corporation)，色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会)，SPSS11.5软件包(SPSSInc，美国)。

二、实验方法

1.郁金样品的采集与前处理

姜科植物姜黄(Curcuma.Longa L)样品采自四川省成都市，样品经鉴定为姜科植物姜黄，块根即中药材郁金。

2.提取方法考察

为保证样品制备的过程中成分的稳定性，采用冰水超声提取的办法，根据色谱出峰情况(数量、强度)，考察超声时间20、30、40、50、60min。提取溶剂：采用甲醇作为提取溶剂，根据色谱图出峰情况考察甲醇用量8、10、20、50、100倍。

3.HPLC-DAD-MS色谱条件的优化及方法学考察

固定相的考察：实验中考察了三种色谱柱分别为Diamonsil C18 5uL 250×4.6mm(DiKma Ser.no.：8038655)，Kromasil C18 5uL 250×4.6mm(E48163)，AgelaTechnologies Venusil MP-C18 (250×4.60mm，5μm，SN：4625051005)。

流动相考察：甲醇-水，乙腈-水以及不同浓度的甲酸。DAD检测信号的确定：考察不同(200-400) 检测波长，根据峰的数量和分离情况确定最佳检测波长。方法学考察：从样品色谱图中均匀选取响应较高的色谱峰，进行方法学考察，包括精密度，重现性。

4.数据处理

4.1原始图谱的前处理

根据优化后的色谱条件，确定DAD检测信号在265nm分离情况较好，且获得的化学信息较多。经 Chemstations化学工作站积分后(自动积分，最小峰面积设为10)，选取主要色谱峰为标准点，进行峰的对齐和匹配，把匹配结果保存为Excel文件。

4.2数据的多元统计分析

色谱图谱经前处理后得到的Excel文件中，第一列为样品名(观测对象，observation)，第一行为色谱峰/化合物(即检测变量，variables)的保留时间(或峰的编号)，对应之处为色谱定量数据。这样每个样品的特征就由同一行中的众多定量数据所决定，而各个样品之间或者各组样品之间差异的程度取决于上述定量数据。把上述数据导入SIMCA-P+12.0(Umetrics，Sweden)进行分析。分析采用无监督模式识别(主成份分析PCA)或有监督模式识别(偏最小二乘法-判别分析PLS-DA)通过得分图(Scores Plot)直观的表示组间的代谢差异；通过载荷图(Loading Plot)和VIP值初步筛选生物标志物，在载荷图中化合物投影点距离原点越远表明该化合物对分类的贡献越大，其VIP值也越大(一般选择VIP＞1的变量)，最后通过t-test对上述差异变量进行统计检验，最终确定有显著性差异的变量，即为差异生物标志物。

4.3生物标志物的鉴定

由未知化合物的质谱和紫外去推导出对应化合物的结构是十分困难的，由于不同仪器离子化的方法不同，同类仪器制造商不同，以及源内裂解和CID(碰撞诱导解离)的条件不同，导致化合物在不同仪器平台得到的质谱数据不尽相同，因此液质没有统一的质谱数据库。本实验中对相关化合物的鉴定主要依据质谱数据(一级质谱和二级质谱)和化合物的紫外光谱数据并结合相关文献对生物标志物类型及平面结构进行初步鉴定。

三、结果与讨论

1.样品处理

取郁金饮片粉碎、过20目筛。精称0.5g粉末，置于具塞三角瓶中，精密加入50mL甲醇，称重后置于超声波提取器中，冰水超声提取40min，取出称重后用甲醇补重，进样前过0.45μm微孔滤膜。

2.HPLC-DAD-MS色谱条件及质谱条件的确定

固定相：Kromasil C18 5uL 250×4.6mm(E48163)，柱温35℃。流动相：A相：0.1％甲酸水，B相：乙腈。梯度设置：0-20min，10-60％B；20-45min，60-100％B；45-50min，100％B。流速：1.0ml/min。进样量：10μL。DAD检测器的设置：200-400nm(监测波长265nm)。

质谱检测器的设置：

从图1可以看出检测波长在265nm时，指纹图谱中各峰分离情况较好，郁金其指纹图谱整体上基本一致。a.Not identified b.Bisdemethoxycurcuminc.Demethoxycurcumin d.Curcumin e.Not identufied f.Ar-turmerone g.Zingiberene，β-bisabolene or β-curcumene h.α，β-turmerone or bisacumol

3.数据处理

在检测波长265nm条件下，经Chemstations化学工作站积分后(自动积分，最小峰面积设为10)，选取主要色谱峰为标准点，进行峰的对齐和匹配(如图1)，结果存为Excel文件。把上述数据导入 SIMCA-P+12.0(Umetrics，Sweden)进行分析。采用主成份分析(PCA)，通过得分图(Scores Plot)直观的观察姜黄、郁金样品分布情况，为进一步确定造成差异的主要次生代谢产物(生物标志物)，可以通过载荷图(Loading Plot)初步筛选生物标志物，在载荷图中化合物投影点距离原点越远表明该化合物对分类的贡献越大，结果如图3、4所示。

由图3主成分得分图可以清楚的看出，姜黄、郁金样品分别聚为2类，且组内样品点集中，说明姜黄、郁金二者次生代谢产物存在较大差异。从图6可以筛选出造成差异的主要化合物，并采用t检验进一步对差异代谢产物进行比较，确定了10个生物标志物(表3.和图5)，并鉴定了其中7个。(关于生物标志物的结构鉴定详见“4.生物标志物结构鉴定”)。从鉴定出的生物标志物可以看到，姜黄素类化合物和萜类化合物在姜黄和郁金中均有显著差异，姜黄中姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素、 Dihydrocurcumin、Ar-turmerone，α，β-turmerone(bisacumol)，Zingiberene(β-bisabolene，β-curcumene)在姜黄中的含量均高于郁金。

表3姜黄、郁金差异次生代谢产物比较

The content was calculated by peak area/sample weight；^*tentativelyidentyfied；^**with t-test P＜0.05

4.生物标志物结构鉴定

4.1姜黄素类成分质谱裂解规律研究

姜黄素类成分具有共同的母核结构：1，7-二苯基-1，6-庚二烯-3，5-二酮。姜黄素类成分之间的差异往往由于苯基上取代基的差异所导致。根据相关文献由于结构相似，姜黄素类成分具有共同的质谱裂解规律，这就为结构鉴定提供了方便。但是由于液质仪器的不同以及质谱条件的差异，有必要在本实验质谱平台对姜黄素的裂解规律进行研究，因此首先对姜黄素(curcumin)标品进行质谱分析，验证其质谱裂解规律。实验的色谱条件和质谱条件同样品测定的条件(详见结果与讨论部分，“2.HPLC-DAD-MSn色谱条件及质谱条件的确定”项下)。

在正离子检测模式下，从姜黄素的一级质可以清楚的看到分子离子峰[M+H]+m/z369。从分子离子峰的二级质谱中可以找到m/z175，177，219，245，259，285，299，351八种主要碎片离子，八种主要碎片离子的主要裂解途径如下所示，依据该裂解规律可以对姜黄素类成分进行鉴定。

4.2生物标志物结构鉴定

标志物2：出峰时间紫外22.5min(见图1所示b峰)，质谱：23min。根据质谱紫外数据和相关文献 [3-6]确定该化合物为：双去甲氧基姜黄素Bisdemethoxycurcumin。

在质谱中显示的准分子离子峰[M+H]+为m/z309。紫外吸收峰为250nm，425nm，分子离子m/z309的二级质谱图主要为m/z147(根据裂解途径6，C3-C4键断裂并失去一个1-芳香基-3-羟基-1，3-丁二烯中性分子)， 189(根据裂解途径7，发生H转移并失去一个芳香基乙烯中性分子)、225(根据裂解途径3，发生重排反应并失去一个1-羟基-3-羰基环丁烯中性分子)碎片离子峰，该化合物为双去甲氧基姜黄素。

标志物3：紫外23.0min(见图1所示c峰)，质谱：23.5min。根据质谱紫外数据和相关文献[3-6]确定该化合物为：去甲氧基姜黄素Demethoxycurcumin。

在质谱中显示的准分子离子峰[M+H]+为m/z339，[M+Na]+为m/z360。紫外吸收峰为250nm，425nm，分子离子m/z338的二级质谱图主要为m/z177(根据裂解途径6，C3-C4键断裂并失去一个1-芳香基-3-羟基-1，3- 丁二烯中性分子)、255(根据裂解途径3，发生重排反应并失去一个1-羟基-3-羰基环丁烯中性分子)碎片离子峰，该化合物为去甲氧基姜黄素。

标志物4：出峰时间紫外23.6min(见图1所示d峰)，质谱24.1min。根据质谱紫外数据和相关文献 [3-6]确定该化合物为：姜黄素Curcumin。

在质谱中显示的准分子离子峰[M+H]+为m/z369，丰度最高的碎片离子[M-OCH3]+是m/z338。紫外吸收峰为265nm，425nm，分子离子m/z369的二级质谱图中有m/z175、177、219、245、259、285、299、351 碎片离子峰，与文献基本一致。且与对照品姜黄素色谱保留时间一致，因此该化合物为姜黄素。

标志物5：紫外24.8min，质谱：25.3min。根据质谱紫外数据和相关文献[3-6]确定该化合物为：双氢姜黄素Dihvdrocurcumin。

在质谱中显示的准分子离子峰[M+H]+为m/z371。紫外吸收峰为215nm，375nm，分子离子m/z371的二级质谱图主要为m/z177(根据裂解途径6，C3-C4键断裂并失去一个1-芳香基-3-羟基-1，3-丁二烯中性分子)、 245(根据裂解途径4，发生重排反应并失去一个芳香基和氢原子)，该化合物初步确定为Dihydrocurcumin。

标志物8：出峰时间紫外33.4min(见图1所示f峰)，质谱33.9min。根据质谱紫外数据和相关文献确定该化合物为：芳姜黄酮Ar-turmerone。

在质谱中显示的准分子离子峰[M+H]+为m/z217，[M+Na]+是m/z239。紫外吸收峰为238nm，分子离子 m/z217的二级质谱图中有m/z119碎片离子峰，与文献基本一致，因此该化合物为Ar-turmerone。

标志物9：出峰时间紫外35.2min(见图1所示g峰)，质谱：35.6min。根据质谱紫外数据和相关文献确定该化合物可能为：萜类化合物姜烯Zingiberene，没药烯β-Bisabolene，姜黄烯β-curcumene.

质谱中显示的准分子离子峰[M+H]+为m/z205。紫外吸收峰为276，225nm，从分子量和紫外吸收图初步可以推断为倍半萜类化合物，与相关文献对照[7]，此峰可能为多化合物的混合峰，可能结构化合物为 Zingiberene，β-Bisabolene，β-curcumene。

标志物10：出峰时间紫外37.0min(见图1所示h峰)，质谱：37.4min。根据质谱紫外数据和相关文献确定该化合物为：可能结构为姜黄酮α，β-turmerone、姜黄醇bisacumol.

在质谱中显示的准分子离子峰[M+H]+为m/z219，[M+Na]+是m/z241。紫外吸收峰为238nm，分子离子 m/z219的二级质谱图中有m/z83、121碎片离子峰。可能结构为α，β-turmerone、bisacumol。

四、小结

本节建立了高效液相串联DAD检测器和离子阱质谱检测器的分析方法，对姜黄、郁金样品进行了分析。在检测波长265nm下，建立了姜黄、郁金指纹图谱，并采用主成份分析(PCA)对测定结果进行处理，从二维主成份得分图(Scores Polt)可以看到姜黄、郁金样品分别聚为两类，说明二者存在显著差异，主成份载荷图(Loading Plot)为我们提供了造成这种差异的生物标志物群，经过进一步t检验确定了其中 10种主要差异代谢产物，通过质谱和紫外数据对其中7种进行了鉴定，并进行了相对含量的比较，姜黄中姜黄素cuncumin，去甲氧基姜黄素Demethoxycurcumin，双去甲氧基姜黄素bisdemethoxycurcumin，双氢姜黄素Dihydrocurcumin，芳姜黄酮Ar-turmerone，姜黄酮α，β-turmerone(或姜黄醇bisacumol)，姜烯Zingiberene(或没药烯β-Bisabolene、姜黄烯β-curcumene)的含量均高于郁金。

Claims (1)

1.一种采用HPLC-DAD-MS测定郁金次生代谢产物的方法，其特征在于，

(1)取郁金饮片粉碎、过20目筛，精称0.5g粉末，置于具塞三角瓶中，精密加入50mL甲醇，称重后置于超声波提取器中，冰水超声提取40min，取出称重后用甲醇补重，进样前过0.45μm微孔滤膜，

(2)取处理好的样品，上样，其中HPLC-DAD-MS测定的条件为：

固定相：Kromasil C18 5uL 250×4.6mm(E48163)，柱温35℃，流动相：A相：0.1％甲酸水，B相：乙腈，梯度设置：0-20min，10-60％B；20-45min，60-100％B；45-50min，100％B，流速：1.0ml/min，进样量：10μL，DAD检测器的设置：200-400nm(监测波长265nm)，

质谱检测器的设置：