CN110531014A - 液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法。针对现有技术中缺乏一种能够同时检测7种常见毒品、11种降压药物、11种降糖药物以及14种精神类药物的方法，本发明提供了一种方法，包括以下步骤：a、待测样品采用乙腈沉淀蛋白；b、采用高效液相色谱‑串联质谱法的多反应监测MRM模式针对所选药物进行检测，以化合物保留时间、两对或三对母离子/子离子对分段进行质谱筛查分析。本发明方法能在25min内一次性快速准确的完成常见降血压药物、降血糖药物、精神类药物及毒品等43种药物的筛查分析，检测效率高，方法灵敏度好，适宜推广使用。

Description

液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法。

背景技术

民用航空业飞速发展，飞行安全一直是民航服务的宗旨，是民航发展的前提。飞行员作为特殊职业群体，其身心健康直接影响飞行安全。随着航空人员数量的不断增加，航空卫生保障工作逐渐进入困境，航空人员自行就诊、用药情况时有发生，其中很多药物存在影响飞行活动的副反应，大大增加了发生飞行事故的概率。根据《民航空勤人员、空中交通管制员药品、毒品检测处理程序》(AP-67FS-003)规定，需要对民航空勤人员、空中交通管制员和飞行学生体检鉴定进行毒品、降血压药物、降血糖药物、精神类药物等专项检查。

文献“Mμlti-component plasma qμantitation of anti-hyperglycemicpharmaceμtical compoμndsμsing liqμid chromatography–tandem mass spectrometry”(Ming Wang等，Joμrnal of Chromatography B,856(2007)318–327)介绍了一种采用高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS/MS)测定二甲双胍等7种常用降血糖药物，其中所检测的降血糖药物较少，且不涉及降血压类、精神类药物以及毒品的检测。

文献“超高效液相色谱-串联质谱法同时检测人血浆中11种镇静催眠药浓度”，(安静等，医药导报，2016，35(9)：938-942)，采用萃取溶液(二氯甲烷∶正己烷∶乙酸乙酯＝5∶4∶1)进行萃取，前处理过程复杂，且检测目标物不涉及降压药物、降糖药物以及毒品等。

文献“超高效液相色谱-串联质谱法同时快速确证检测血浆和尿液中的42种精神药物及其代谢产物”，(张秀尧等，色谱，2010，28(1)：23-33)，其中42种精神药物包括抗抑郁药、抗癫痫药、解热镇痛药等，但不涉及降压药物、降糖药物以及毒品的检测。

2016年由中华人民共和国司法部司法鉴定管理局发布的司法鉴定技术规范《血液、尿液中238种毒(药)物的检测液相色谱-串联质谱法》(SF/Z JD0107005-2016)，其中介绍了一种同时检测阿片类、苯丙胺类、抗抑郁类、抗癫痫类等多种毒药物的检测方法，样品预处理采用易制毒试剂乙醚进行提取，乙醚不易购买，试验毒性更大，且需要较大的血液量(1ml)，检测药物种类无法达到AP-67FS-003的要求。

公开号为CN 104133006 A的专利公开了一种超高效液相色谱质谱联用法，能同时检测临床上常用的11种降糖药物、19种降压药物和1种降血脂药物，但由于被检药物中不涉及精神类药物和常见毒品，亦不能完全满足民航空勤人员安全用药监管的需要。

公开号为CN 107807178 A的专利公开了一种超高效液相色谱质谱联用法检测血液中毒品和抗精神疾病类药物的方法，该方法虽能对9种常见毒品、14种常见精神类药物进行检测，但未涉及降压药物及降糖药物，不能完全满足民航空勤人员安全用药监管的需要。

若按照公开号为CN 104133006 A和CN 107807178 A的专利对AP-67FS-003内规定药物进行筛查，则需体检人员完成2次抽血，进行2次不同的实验，才能完成所有药物筛查，所需生物样本量大，耗时长。

目前，还未有一种准确、有效的方法可用于同时检测AP-67FS-003中规定的降血糖、降血压、精神类药物和常见毒品，亟待开发。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有技术中缺乏一种能够同时检测7种常见毒品、11种降压药物、11种降糖药物以及14种精神类药物的方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法。该方法包括以下步骤：

a、采集待测抗凝血液，第一次离心，取上清液采用乙腈沉淀蛋白，涡旋混合，第二次离心，转移有机层至另一离心管中，干燥后残渣用初始比例流动相溶解，涡旋混合，第三次离心，取上清液；

b、采用高效液相色谱-串联质谱法的多反应监测MRM模式对步骤a得到的上清液针对所选药物进行检测，以化合物保留时间、两对或三对母离子/子离子对分段进行质谱筛查分析。

其中，上述液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法中，步骤a所述的采血管为肝素钠采血管。

其中，上述液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法中，步骤a所述的初始比例流动相由甲醇与缓冲溶液按体积比5:95混合而成，所述缓冲溶液为5mmol/L甲酸铵加0.1％甲酸。

其中，上述液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法中，步骤a中所述离心条件为：第一次离心为4000rmp离心15min，第二次和第三次离心为13000rmp离心5min。

其中，上述液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法中，步骤a所述干燥为在60℃水浴中采用氮气吹干。

其中，上述液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法中，步骤a中沉淀蛋白时上清液与乙腈的体积比为1:2。

其中，上述液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法中，步骤b所述的药物包括：7种毒品为吗啡、单乙酰吗啡、可待因、苯丙胺、甲基苯丙胺、3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺或氯胺酮中的一种；11种降压药物为氨氯地平、厄贝沙坦、硝苯地平、拉贝洛尔、尼卡地平、拉西地平、尼群地平、非洛地平、福辛普利、缬沙坦或氯沙坦中的一种；11种降糖药物为二甲双胍、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、瑞格列奈、那格列奈、格列喹酮或格列美脲中的一种；14种精神类药物为阿米替林、马普替林、米安色林、氟西汀、西酞普兰、帕罗西汀、氟伏沙明、舍曲林、文拉法辛、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、地西泮或氯丙嗪中的至少一种。

其中，上述液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法中，步骤b所述检测时的液相色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱RRHD50*2.1mm*1.8μm；流动相由甲醇与缓冲溶液按体积比5:95混合而成，所述缓冲溶液为5mmol/L甲酸铵加0.1％甲酸；流速：0.2ml/min；柱温与室温20℃±5℃；进样量：5μl。

其中，上述液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法中，步骤b筛查检测时的质谱条件为：离子源：ESI+；扫描方式：多反应监测MRM；液氮气体流速：13L/min；毛细管电压：4000V；干燥气温度：350℃；雾化气压力：60psi。

其中，上述液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法中，所述的分段筛选分析的具体分段方式为：

第一组0-7min：二甲双胍、吗啡；

第二组7-11.5min：可待因、苯丙胺、甲基苯丙胺、单乙酰吗啡、3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺、氯胺酮；

第三组11.5-19.5min：西他列汀、罗格列酮、拉贝洛尔、文法拉辛、西酞普兰、米安色林、吡格列酮、尼卡地平、氯硝西泮、帕罗西汀、艾司唑仑、马普替林、阿普唑仑、阿米替林、缬沙坦、氟伏沙明、氨氯地平、氟西汀、硝苯地平、氯沙坦、格列吡嗪、格列齐特、氯丙嗪、舍曲林、地西泮-D5、地西泮、厄贝沙坦；

第四组19.5-30：尼群地平、格列本脲、格列美脲、那格列奈、瑞格列奈、非洛地平、格列喹酮、拉西地平、福辛普利。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过高效液相色谱串联质谱法对上述43种药物进行检测，对保留时间，两对母/子离子对等参数确证后，将7种常见毒品、11种降压药物、11种降糖药物以及14种精神类药物按照保留时间相近或化学性质相似进行分组，在不同的时间段进行检测，能在25min内一次性快速准确的完成常见降血压药物、降血糖药物、精神类药物及毒品等43种药物的筛查分析，满足实际检测的时效性要求。同时，本发明方法大大提高了检测的灵敏度，同时节约了样品的处理时间、检测时间，高效准确的通过一次实验即可完成4大类共43种药物的筛查分析，所检药物基本涵盖《民航空勤人员、空中交通管制员药品、毒品检测处理程序》(AP-67FS-003)中规定的所有毒药物，满足民航空勤人员安全用药监管的需要，具有重要的现实意义。

附图说明

图1所示为空白图谱与QC图谱对比图；

图2所示为20180809QC样品色谱图；

图3所示为20180809_0809A01地西泮阳性样品色谱图；

图4所示为20180912QC样品色谱图；

图5所示为20180912_S02硝苯地平阳性样品色谱图。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

实施例1采血管筛选试验

针对同浓度同色谱条件下，分别采用氟化钠、肝素钠两种抗凝管采集空白血，通过空白添加(100ng/ml)进行对比试验，结果显示以肝素钠作为抗凝剂，检测结果响应更高。氟化钠采集血样中3种毒品、7种降糖药物、7种降压药物不能被有效检测。试验结果如表1-4所示。

表1采血管筛选对比试验结果统计表-毒品类

表2采血管筛选对比试验结果统计表-降糖药物

表3采血管筛选对比试验结果统计表-降压药物

表4采血管筛选对比试验结果统计表-精神类药物

实施例2预处理方法筛选试验

相同色谱条件相同浓度下，分别采用2倍体积的乙腈沉淀蛋白和有机溶剂萃取处理样品，方法如下。

a：取各物质适量，60℃氮气吹干，残渣加入空白血1ml，加入乙酸乙酯3ml，涡旋混匀1min，5000r/min离心5min，取上清液氮气吹干，残渣加入50μl复溶剂复溶，涡旋1min，13000r/min离心5min，进样检测。

b：取各物质适量，60℃氮气吹干，残渣加入空白血1ml，加入乙腈3ml，涡旋混匀1min，5000r/min离心5min，取上清液氮气吹干，残渣加入50μl复溶剂复溶，涡旋1min，13000r/min离心5min，进样检测。

c:取各物质适量，60℃氮气吹干，残渣加入空白血1ml，混匀，加入pH9.18硼砂缓冲溶液2ml，乙醚3.5ml，涡旋混匀1min，5000r/min离心5min，取上清液60℃氮气吹干，残渣加入200μl复溶剂复溶，即得。(此法选自SF/Z JD0107005-2016)

d：取空白血100μl，加入各物质适量，混匀，加入甲醇200μl，涡旋混匀1min，13000r/min离心5min，取上清液60℃氮气吹干，残渣加入100μl复溶剂复溶。

结果显示：乙酸乙酯、乙醚处理均无法将43种物质同时检测，且采用乙酸乙酯、乙醚所需血量较大(1ml)；采用方法b，所需血量大、浓缩倍数高，易造成仪器系统污染，干扰检测；采用2倍体积乙腈和2倍体积甲醇沉淀处理后，各物质均能测得，对比之下，2倍乙腈峰面积响应更高，检测效果更好。试验结果如表5-8所示。

表5预处理方法筛选对比试验结果统计表-毒品类

表6预处理方法筛选对比试验结果统计表-降糖类药物

表7预处理方法筛选对比试验结果统计表-降压类药物

表8预处理方法筛选对比试验结果统计表-精神类

本发明采用乙腈沉淀蛋白，乙腈是常用的有机溶剂，其机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出，乙腈沉淀后上清液清亮。而现有技术中有公开采用三氯乙酸沉淀蛋白，三氯乙酸与蛋白质结合形成不溶性盐而析出，需要适当比例的三氯乙酸才能保证蛋白质沉淀完全，沉淀蛋白效果不好控制。

实施例3流动相筛选试验

对液相色谱检测条件进行如下筛选实验，实验例采用含0.1％甲酸的5mM甲酸铵水溶液-甲醇(95:5)为流动相，对比例采用下述A-F的液相条件，以梯度洗脱方式对43种物质进行检测。

表9实验例梯度洗脱比例

对比例：

A、1mM甲酸铵+0.1％甲酸：甲醇＝20:80，恒比例，0.3ml/min，此条件下，各物质集中于1-2min左右出峰，难以有效分离。

B、10mM甲酸铵+0.1％甲酸：甲醇＝20:80(首比例)，梯度洗脱，0.3ml/min。

表10对比例梯度洗脱比例

C、5mM甲酸铵+0.1％甲酸：甲醇＝20:80(首比例)，梯度洗脱，0.3ml/min。

表11对比例梯度洗脱比例

D、1mM甲酸铵+0.1％甲酸：甲醇＝20:80(首比例)，梯度洗脱，0.3ml/min。

表12对比例梯度洗脱比例

E、5mM甲酸铵+0.2％甲酸：甲醇＝20:80(首比例)，梯度洗脱，0.3ml/min。

表13对比例梯度洗脱比例

F、5mM甲酸铵+0.1％甲酸：甲醇＝20:80(首比例)，梯度洗脱，0.3ml/min。

表14对比例梯度洗脱比例

以各物质的保留时间为依据判断，结果显示方法A-F条件下43种物质保留时间密集，且部分物质无法检测；在且仅在本发明的色谱条件下，各物质均能被测得，且保留时间分布均匀，各色谱峰互不干扰，峰型良好。各条件下物质保留时间见表15-18。

表15色谱方法筛选对比试验结果统计表---毒品类

表16色谱方法筛选对比试验结果统计表---降糖类

表17色谱方法筛选对比试验结果统计表---降压类

表18色谱方法筛选对比试验结果统计表---精神类

实施例4质谱条件筛选

本发明优化的质谱条件如下表19所示。

表19 43种毒药物的定性分析参数

本发明以化合物的两对/三对母离子/子离子对进行筛查，结合其保留时间及相对离子丰度比计算进行确认，增加检测的特异性及结果准确性，减少假阳性结果。

此7种常见毒品、11种降压药物、11种降糖药物以及14种精神类药物在该色谱条件下将按照不同的化学性质依次洗脱，呈现出不同的保留时间，根据其保留时间，依次均匀的分为若干组，使得每个时间段内采集的离子个数减少，以保证各物质质谱参数中合适的Dwell(驻留时间)，以提高方法的灵敏度。

实施例5检测结果的判定试验

对本发明检测结果的判断方法为：结合保留时间及两对母离子/子离子对的相对丰度比判断，具体判断过程为：

进行样品测定时，如果空白样品中未出现本发明检测的43种药物的色谱峰及离子对，而空白添加样品及被检样品中出现相应的色谱峰及离子对，说明空白无干扰；检出的色谱峰保留时间与空白检材添加对照品的色谱峰保留时间比较，相对误差小于2％(吗啡小于3％)，并且样品质谱图中所选择的离子对均出现，而且所选择的离子对相对丰度比与添加对照品的离子对相对丰度比之相对误差不超过表20规定的范围，则可判定样品中存在这种化合物。

表20相对离子对丰度比的最大允许相对误差(％)

如果空白添加样品经提取测定后，质谱图中出现相应的色谱峰及离子对，而被检样品中未出现附录中毒药物的相应色谱峰及离子对，可认为被检样品中不含附录中的毒药物，阴性结果可靠。如果空白添加样品经提取测定后，质谱图中未出现相应的色谱峰，阴性结果不可靠，应重新检验。

参考GB/T 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》和司法鉴定技术规范《血液、尿液中238种毒(药)物的检测液相色谱-串联质谱法》(SF/Z JD0107005-2016)及《中国药典2015版》，结合本方法的预期用途，即用于检测一种物质或一组物质在所关注的浓度水平上是否存在，归属于定性方法。对本发明液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法进行方法确认，方法如下：

(1)选择性

选择人空白血浆样品，确定内源性物质是否对目标化合物存在干扰以及43种目标化合物之间是否存在相互干扰。

(2)检出限

按照S/N≥2判定，n＝3。

(3)保留时间精密度

测定多个样品中各物质的保留时间精密度。

(4)样品处理后稳定性

在方法检出限、5倍检出限、10倍检出限三个浓度水平制备空白添加样品，按照本方法进行检测，分别在样品处理后12h、24h再次进样，对比样品初次进样结果，研究在4℃下处理后样品中目标化合物的稳定性。

(5)样品处理前稳定性

在方法检出限、5倍检出限、10倍检出限三个浓度水平制备空白添加样品，分别考察冷藏(4℃24h)、冷冻(-80℃7day)样品的稳定性。

具体的判定过程为：

1、试剂和仪器：

试剂：除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

乙腈(LC/MS)；甲醇(LC/MS)；甲酸(LC/MS)；甲酸铵(LC/MS)。

对照品：盐酸二甲双胍、马来酸氟伏沙明、盐酸米安色林、盐酸马普替林、盐酸拉贝洛尔、瑞格列奈、拉西地平、非洛地平、盐酸罗格列酮、那格列奈、尼群地平、盐酸尼卡地平、盐酸阿米替林、盐酸氟西汀、盐酸氯丙嗪、苯磺酸氨氯地平、盐酸帕罗西汀、硝苯地平、格列吡嗪、格列喹酮、格列齐特、格列本脲、缬沙坦、格列美脲、福辛普利钠、磷酸西他列汀、盐酸吡格列酮、厄贝沙坦、氯沙坦、氢溴酸西酞普兰、盐酸文法拉辛、盐酸氯胺酮、阿普唑仑、地西泮、氯硝西泮、舍曲林对照品，纯度≥97％(中国食品药品检定研究院)；吗啡、单乙酰吗啡、可待因、苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA对照品溶液，浓度1mg/ml(Cerilliant进口标准物质)。

仪器：超高效液相色谱三重串联四级杆质谱联用仪(安捷伦1260-6420)，移液器(德国brand 1000μl、200μl、100μl、10μl、2.5μl)，超低温冰箱(法国froilaboBMEVO51586)，赛多利斯半微量天平(Qμintix35-1cn)，药品冷藏冷冻箱(海尔HYCD-205)，超纯水机(优普μLμP-II-10型)，台式高速冷冻离心机(湘仪TGL-16M)，恒温水浴氮吹仪(杭州奥盛WD-12)，旋涡混合器(其林贝尔XW-80A)，西门子冰箱(KG23D166EW)等。

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plμs C18HD 2.1*50mm 1.8μm。

2、标液配制：

分别精密称取各种药物对照品各10mg，分别置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得1mg/mL的对照品储备溶液，置于-18℃冷冻保存，保存期为1年。分别取上述储备液0.1mL,用甲醇稀释至10mL，得上述各种药物10.0μg/mL的对照品工作溶液。

3、样品预处理：

取待测抗凝血液离心4000rmp*15min，取上清液100μL置于1.5mL尖底离心管中，用200μL乙腈沉淀蛋白，涡旋混合1min,离心13000rmp*5min，转移有机层至另一离心管中，于60℃水浴中氮气吹干，残渣用100μL初始比例流动相溶解，涡旋混合1min,离心13000rmp*5min，取上清液供检。

4、方法学考察

检出限：取空白血浆若干份，每份100μl，加入内标地西泮-D5溶液1μg/ml*10μl，再分别添加43种目标物的混标溶液，制备成质量浓度为1ng/ml的质控样品(以吗啡为例)，n＝3，按照“样品预处理”方法处理后进样检测，根据S/N≥2判定，确定该方法中43种药物的检出限，如表21所示。

结果表明本发明方法满足GB/T 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》和司法鉴定技术规范《血液、尿液中238种毒(药)物的检测液相色谱-串联质谱法》(SF/Z JD0107005-2016)及《中国药典2015版》的相关要求。

本发明建立了一种液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法，并对该方法进行了确认，包括专属性、准确度、精密度、稳定性、检出限等研究，本方法检出限均低于药物有效血药浓度，满足实际检测需求。具体的检出限如下表21-22所示。

表21 43种毒药物的LC/MS/MS定性分析参数--检出限1

表22 43种毒药物的LC/MS/MS定性分析参数--检出限2

专属性：取空白血浆100μl，按照“样品预处理”方法处理后进样检测；空白图谱与QC图谱对比说明，未发现内源性物质对目标化合物有干扰，如图1所示。

保留时间精密度：取100μl含肝素钠抗凝剂的空白血浆若干份，分别添加43种化合物的对照品工作液适量，使之配成10倍检出限、5倍检出限、检出限三个浓度点生物样品，每个浓度点各2份，按照“样品预处理”方法处理后进样检测，得到日内精密度。

10倍检出限：含质量浓度为10ng/ml的吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA、氯胺酮、二甲双胍、罗格列酮、吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、瑞格列奈、那格列奈、格列美脲、厄贝沙坦、硝苯地平、尼卡地平、阿米替林、马普替林、米安色林、氟西汀、西酞普兰、帕罗西汀、氟伏沙明、舍曲林、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、地西泮、氯丙嗪；50ng/ml单乙酰吗啡、可待因、西他列汀、拉贝洛尔、拉西地平、尼群地平、文法拉辛；100ng/ml氨氯地平、非洛地平、福辛普利、氯沙坦；200ng/ml格列喹酮、缬沙坦的生物样品。

5倍检出限：含质量浓度为5ng/ml的吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA、氯胺酮、二甲双胍、罗格列酮、吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、瑞格列奈、那格列奈、格列美脲、厄贝沙坦、硝苯地平、尼卡地平、阿米替林、马普替林、米安色林、氟西汀、西酞普兰、帕罗西汀、氟伏沙明、舍曲林、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、地西泮、氯丙嗪；25ng/ml单乙酰吗啡、可待因、西他列汀、拉贝洛尔、拉西地平、尼群地平、文法拉辛；50ng/ml氨氯地平、非洛地平、福辛普利、氯沙坦；100ng/ml格列喹酮、缬沙坦的生物样品。

1倍检出限：含质量浓度为1ng/ml的吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA、氯胺酮、二甲双胍、罗格列酮、吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、瑞格列奈、那格列奈、格列美脲、厄贝沙坦、硝苯地平、尼卡地平、阿米替林、马普替林、米安色林、氟西汀、西酞普兰、帕罗西汀、氟伏沙明、舍曲林、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、地西泮、氯丙嗪；5ng/ml单乙酰吗啡、可待因、西他列汀、拉贝洛尔、拉西地平、尼群地平、文法拉辛；10ng/ml氨氯地平、非洛地平、福辛普利、氯沙坦；20ng/ml格列喹酮、缬沙坦的生物样品。

结果：对3个浓度条件下，每个浓度2个样品，每个样品测定2次(n＝12)，计算各物质保留时间的相对标准偏差(RSD％)。结果显示，除吗啡保留时间RSD％＜3％，其余物质保留时间RSD％＜2％，且各物质均阳性检出，定性良好，详见表23。

表23 43种毒药物方法确认--精密度结果

样品处理后稳定性：取100μl含肝素钠抗凝剂的空白血浆若干份，分别添加43种化合物的对照品工作液适量，使之配成10倍检出限、5倍检出限、检出限三个浓度点生物样品，每个浓度点平行制备2份，按照“样品预处理”方法处理后进样检测，在样品处理后12h、24h再次进样，对比样品初次进样结果，研究在4℃下处理后样品中目标化合物的稳定性。

分别统计0、12、24小时各物质的阳性检出率及保留时间，计算0小时与12h、24h检测结果中各物质的保留时间RSD％。结果发现，经本方法前处理后，于进样室4℃条件下放置12h、24h后，所有物质均能测得。除吗啡保留时间RSD％＜3％，其余物质保留时间RSD％均＜2％，定性良好。

样品处理前稳定性：取100μl含肝素钠抗凝剂的空白血浆若干份，分别添加43种化合物的对照品工作液适量，使之配成10倍检出限、5倍检出限、检出限三个浓度点生物样品，每个浓度点平行制备4份，2份于冷藏(4℃，24h)，2份于冷冻(-80℃，7day)放置后，按照“样品预处理”方法处理后进样检测，对比样品初次进样结果，研究在冷藏(4℃，24h)、冷冻(-80℃，7day)后样品中目标化合物的稳定性。

分别统计各物质的阳性检出率及保留时间，与当日空白添加样品对比，研究冷藏、冷冻后各目标化合物的稳定性。结果发现，冷藏(4℃，24h)、冷冻(-80℃，7day)后各物质均能保持阳性检出，保留时间RSD％均＜2％，定性良好，详见表24。

表24 43种毒药物方法确认--稳定性结果

实施例6采用本发明方法检测血液中43种药物

收集14个体检人员的血液样本，按照本发明的方法对7种常见毒品、11种降压药物、11种降糖药物以及14种精神类药物进行未知样筛查检测。

具体的操作过程为：

1、试剂和仪器：

试剂：除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

乙腈(LC/MS)；甲醇(LC/MS)；甲酸(LC/MS)；甲酸铵(LC/MS)。

对照品：盐酸二甲双胍、马来酸氟伏沙明、盐酸米安色林、盐酸马普替林、盐酸拉贝洛尔、瑞格列奈、拉西地平、非洛地平、盐酸罗格列酮、那格列奈、尼群地平、盐酸尼卡地平、盐酸阿米替林、盐酸氟西汀、盐酸氯丙嗪、苯磺酸氨氯地平、盐酸帕罗西汀、硝苯地平、格列吡嗪、格列喹酮、格列齐特、格列本脲、缬沙坦、格列美脲、福辛普利钠、磷酸西他列汀、盐酸吡格列酮、厄贝沙坦、氯沙坦、氢溴酸西酞普兰、盐酸文法拉辛、盐酸氯胺酮、阿普唑仑、地西泮、氯硝西泮、舍曲林对照品，纯度≥97％(中国食品药品检定研究院)；吗啡、单乙酰吗啡、可待因、苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA对照品溶液，浓度1mg/ml(Cerilliant进口标准物质)。

仪器：超高效液相色谱三重串联四级杆质谱联用仪(安捷伦1260-6420)，移液器(德国brand 1000μl、200μl、100μl、10μl、2.5μl)，超低温冰箱(法国froilaboBMEVO51586)，赛多利斯半微量天平(Qμintix35-1cn)，药品冷藏冷冻箱(海尔HYCD-205)，超纯水机(优普μLμP-II-10型)，台式高速冷冻离心机(湘仪TGL-16M)，恒温水浴氮吹仪(杭州奥盛WD-12)，旋涡混合器(其林贝尔XW-80A)，西门子冰箱(KG23D166EW)等。

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plμs C18HD 2.1*50mm 1.8μm。

2、标液配制：

分别精密称取各种药物对照品各10mg，分别置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得1mg/mL的对照品储备溶液，置于-18℃冷冻保存，保存期为1年。分别取上述储备液0.1mL,用甲醇稀释至10mL，得上述各种药物10.0μg/mL的对照品工作溶液。

3、样品预处理：

取待测抗凝血液离心4000rmp*15min，取上清液100μL置于1.5mL尖底离心管中，用200μL乙腈沉淀蛋白，涡旋混合1min,离心13000rmp*5min，转移有机层至另一离心管中，于60℃水浴中氮气吹干，残渣用100μL初始比例流动相溶解，涡旋混合1min,离心13000rmp*5min，取上清液供检。

记录各物质保留时间与峰面积，用目标化合物质谱响应值最低的离子对峰面积与响应值最高的离子对峰面积相比作为相对离子丰度比，与当日QC样品中相对离子丰度比计算相对误差，按照本法所述判断标准进行判断。由表26-28所示，检测样品20180809_0809A01和20180912_S02分别检出地西泮与硝苯地平，计算其保留时间RSD％＜2％，相对离子丰度比之相对误差在±20％范围内，阳性结果可靠。

将检测结果与体检人员自述情况、体检情况及检验科结果对比，结果一致，说明本发明的检测方法灵敏可靠。

检测结果如(表25-29，图2-5)所示。

表25 14名体检人员血液中43种毒药物检测结果统计表

表26 20180809_0809A01地西泮阳性样与检出限QC保留时间计算表

表27 20180809_0809A01地西泮阳性样与检出限QC相对离子丰度比计算表

表28 20180912_S02硝苯地平阳性样与检出限QC保留时间计算表

表29 20180912_S02硝苯地平阳性样与检出限QC相对离子丰度比计算表

由实施例的结果可看出：本发明方法能够一次性快速准确的完成常见降血压药物、降血糖药物、精神类药物及毒品等43种药物的筛查分析，检出结果稳定可靠，适宜推广使用。

Claims (10)

1.液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、采集待测抗凝血液，第一次离心，取上清液采用乙腈沉淀蛋白，涡旋混合，第二次离心，转移有机层至另一离心管中，干燥后残渣用初始比例流动相溶解，涡旋混合，第三次离心，取上清液；

b、采用高效液相色谱-串联质谱法的多反应监测MRM模式对步骤a得到的上清液针对所选药物进行检测，以化合物保留时间、两对或三对母离子/子离子对分段进行质谱筛查分析。

2.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法，其特征在于：步骤a所述的采血管为肝素钠采血管。

3.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法，其特征在于：步骤a所述的初始比例流动相由甲醇与缓冲溶液按体积比5:95混合而成，所述缓冲溶液为5mmol/L甲酸铵加0.1％甲酸。

4.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法，其特征在于：步骤a中所述离心条件为：第一次离心为4000rmp离心15min，第二次和第三次离心为13000rmp离心5min。

5.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法，其特征在于：步骤a所述干燥为在60℃水浴中采用氮气吹干。

6.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法，其特征在于：步骤a中沉淀蛋白时上清液与乙腈的体积比为1:2。

7.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法，其特征在于：步骤b所述的药物包括：7种毒品为吗啡、单乙酰吗啡、可待因、苯丙胺、甲基苯丙胺、3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺或氯胺酮中的一种；11种降压药物为氨氯地平、厄贝沙坦、硝苯地平、拉贝洛尔、尼卡地平、拉西地平、尼群地平、非洛地平、福辛普利、缬沙坦或氯沙坦中的一种；11种降糖药物为二甲双胍、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、瑞格列奈、那格列奈、格列喹酮或格列美脲中的一种；14种精神类药物为阿米替林、马普替林、米安色林、氟西汀、西酞普兰、帕罗西汀、氟伏沙明、舍曲林、文拉法辛、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、地西泮或氯丙嗪中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法，其特征在于：步骤b所述检测时的液相色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱RRHD50*2.1mm*1.8μm；流动相由甲醇与缓冲溶液按体积比5:95混合而成，所述缓冲溶液为5mmol/L甲酸铵加0.1％甲酸；流速：0.2ml/min；柱温与室温20℃±5℃；进样量：5μl。

9.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法，其特征在于：步骤b筛查检测时的质谱条件为：离子源：ESI+；扫描方式：多反应监测MRM；液氮气体流速：13L/min；毛细管电压：4000V；干燥气温度：350℃；雾化气压力：60psi。

10.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱检测血液中43种药物的方法，其特征在于：所述的分段筛选分析的具体分段方式为：

第一组0-7min：二甲双胍、吗啡；

第二组7-11.5min：可待因、苯丙胺、甲基苯丙胺、单乙酰吗啡、3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺、氯胺酮；

第三组11.5-19.5min：西他列汀、罗格列酮、拉贝洛尔、文法拉辛、西酞普兰、米安色林、吡格列酮、尼卡地平、氯硝西泮、帕罗西汀、艾司唑仑、马普替林、阿普唑仑、阿米替林、缬沙坦、氟伏沙明、氨氯地平、氟西汀、硝苯地平、氯沙坦、格列吡嗪、格列齐特、氯丙嗪、舍曲林、地西泮-D5、地西泮、厄贝沙坦；

第四组19.5-30：尼群地平、格列本脲、格列美脲、那格列奈、瑞格列奈、非洛地平、格列喹酮、拉西地平、福辛普利。