CN112595801A - 含有机体指印待测样品中降血脂药物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有机体指印待测样品中降血脂药物的检测方法，包括：采用液相色谱‑质谱联用法对待测样品进行测定，根据测定结果中的液相色谱峰保留时间和质谱的子离子和母离子离子强度的比值，确定待测样品中所含降血脂药物；所述降血脂药物包括阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、苯扎贝特、环丙贝特、氯贝特、非诺贝特、依替米贝、吉非罗齐和烟酸，该方法对常见降血脂药物具有较低的检测限，能够实现同时检测多种常见的降血脂药物。

Description

含有机体指印待测样品中降血脂药物的检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及一种含有机体指印待测样品的降血脂药物的检测方法。

背景技术

案件现场常见的体液斑痕有血液斑、唾液斑、汗液斑、精斑等，通过分析体液斑痕中的一些生活特征成分能够获得遗留者的相关信息。指印是犯罪现场最常见到的汗液斑形式，目前对其进行的分析多局限于形态学鉴定和DNA检验。指印中含有多种内源性和外源性物质，其中蕴含着遗留者的生物特征、社会习性等相关信息。通过检验指印中的生活特征成分，可对指纹遗留者进行刻画，从而为侦查提供线索。这种技术在无法通过指印进行个体识别时有更加重要的意义。

高血脂(hyperlipoidemia)通常指血浆中甘油三醇和(或)总胆固醇升高，也包括低密度脂蛋白胆固醇升高和高密度脂蛋白胆固醇降低。它是导致动脉粥样硬化的主要因素，也可引起心脑血管疾病。高血脂患者在我国人数多分布广，且需要长期服药，因此可以将是否患有高血脂疾病作为刻画特征，通过检验指印中的降血脂药物，获得指印供体的相关信息。已有大量文献报道了各类降血脂药物的作用机理、代谢规律和相互影响，但在检验指印中降血脂药物的研究鲜有报道。研究并建立指印中常见降血脂药物的检验方法，充分挖掘物证的潜在信息以对嫌疑人进行特征刻画，可以为侦查提供线索，具有重要的实际应用意义。

目前，降血脂药物的检验方法主要有光谱法、免疫法、质谱法、色谱法等，但由于指印通常样本量较少，含有机体指印样品中的降血脂药物含量很低，现有的该类方法均不能达到良好的检测效果。要准确检测到指印中的降血脂药物，要准确检测到指印中的降血脂药物，就需要建立检测限较低的检测方法，并且能对样本中的常见降血脂药进行同时检测，以减少样本用量，这也是本领域技技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种含有机体指印待测样品中降血脂药物的检测方法，具有较低的检测限，能够同时检测多种常见的降血脂药物。

本发明提供一种含有机体指印待测样品中降血脂药物检测方法，包括：

采用液相色谱-质谱联用法对待测样品进行测定，根据测定结果中的液相色谱峰保留时间和质谱的子离子和母离子离子强度的比值(离子对丰度比)，确定待测样品中所含降血脂药物；其中，降血脂药物包括阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、苯扎贝特、环丙贝特、氯贝特、非诺贝特、依替米贝、吉非罗齐和烟酸。

本发明提供的检测方法，利用液相色谱-质谱联用法，对上述13种常见降血脂药物均具有较低的检测限和定量限，能够实现对上述13种常见降血脂药物的准确定性和定量检测，既能测定待测样品中是否含有降血脂药物，也能测定待测样品中所含降血脂药物的具体种类，还能进一步确定待测样品中所含某一种或某几种降血脂药物的含量，具有重要的实用意义。

本发明中，含有机体指印待测样品可以包括含有机体指印的渗透性客体。渗透性客体是指能够使机体体液汗斑渗入至该客体的客体，本发明中，所述的渗透性客体可以包括各种具有上述渗透性特征的各种客体，例如可以包括具有上述渗透性特征的纸张，具体可以包括牛皮纸信封、报纸、货币以及纸巾等。

上述13种降血脂药物均是常见的降血脂药物，均可商购获得，但本发明不以此为限，也可以包括其他降血脂类药物。

具体地，上述每一种降血脂药物均有特定的色谱峰保留时间和质谱的母离子/子离子对(即目标物分子离子(母离子)峰和母离子在质谱中进一步裂解生成的碎片离子(子离子)峰，子离子可能会有多个，一般可选择信号最好、稳定性最高的一个或两个具有代表性的子离子作为上述定性子离子，可以将根据待测样品测得的液相色谱峰保留时间和质谱的离子对丰度比与降血脂药物标准样品的液相色谱峰保留时间和质谱的离子对丰度比进行比对，以确定待测样品中是否含有上述降血脂药物或者含有哪一种降血脂药物。其中，降血脂药物标准样品的色谱峰保留时间和质谱的离子对丰度比可以采用本领域常规手段获得，一般可以自行测定上述各降血脂药物标准样品的色谱峰保留时间和质谱的离子对丰度比，并最好采用同一仪器以及相同操作条件对标准样品和待测样品进行测定，以尽可能地减少误差。

例如，在本发明的一优选实施方式中，上述检测方法还包括：采用上述液相色谱-质谱联用法对降血脂药物标准样品进行测定，获得包括各降血脂药物标准样品的液相色谱峰保留时间和质谱的离子对丰度比的标准样品测定结果；将待测样品测定结果中的液相色谱峰保留时间和质谱的离子对丰度比与所述标准样品测定结果进行比对，确定待测样品中所含降血脂药物。其中，可以依次测定上述各降血脂药物标准样品的液相色谱峰保留时间和质谱的离子对丰度比，也可以将上述各降血脂药物标准样品进行混合，对得到的混合样品进行测定，获得包括各降血脂药物标准样品的液相色谱峰保留时间和质谱的离子对丰度比的标准样品测定结果。

具体地，将待测样品的测定结果与标准样品测定结果进行比对，若待测样品的测定结果中存在某一液相色谱峰的保留时间与标准样品测定结果中的某一降血脂药物标准样品的液相色谱峰保留时间基本一致，且出现与根据该降血脂药物标准样品测定得到的离子对丰度比基本相同的离子对丰度比，则确定待测样品中存在该降血脂药物。考虑到操作过程中所存在的误差等因素，一般待测样品的某一液相色谱峰保留时间与某一降血脂药物标准样品的液相色谱峰保留时间的相对误差在2.5％内，待测样品的离子对离子对丰度比与该降血脂药物标准样品的度比相对误差满足表1规定的范围，即可确定待测样品中含有该降血脂药物。

表1

举例来说，若待测样品的测定结果中存在某一液相色谱峰保留时间T₁，测得阿伐托他汀标准样品的液相色谱峰保留时间T₂，T₂与T₁的相对误差在±2.5％内，同时，待测样品的测定结果中出现根据阿伐托他汀标准样品测定的母离子/子离子对(扣除背景后)，且其离子对丰度比满足表1规定，则确定待测样品中存在阿伐托他汀；若待测样品的测定结果中存在液相色谱峰保留时间T₁、T₃，测得阿伐托他汀标准样品的液相色谱峰保留时间T₂、测得氟伐他汀标准样品的液相色谱保留时间T₄，T₂与T₁的相对误差在±2.5％内，T₃与T₄的差值在相对误差在±2.5％内，则确定待测样品中存在阿伐托他汀和氟伐他汀。

在本发明的一实施方式中，上述包括各降血脂药物标准样品的液相色谱峰保留时间和质谱的母离子/子离子对的标准样品测定结果如表1所示，具体实施时，可将待测样品测定结果中的液相色谱峰保留时间和质谱的母离子/子离子对与表2所示的标准样品测定结果进行比对，以确定待测样品中所含降血脂药物种类。举例来说，若待测样品的测定结果中，存在液相色谱峰保留时间为6.47±0.16min，且其离子对丰度比满足表1规定的范围，则可确定待测样品中存在阿托伐他汀。

表2

本发明还可用于对上述降血脂药物的定量分析，在本发明的一实施方式中，上述检测方法还包括：记录根据待测样品的液相色谱峰面积，按外标法以峰面积计算确定待测样品中所含降血脂药物的含量。

具体实施时，可以按照如下过程绘制上述各降血脂药物的峰面积-浓度标准曲线：可以配制含有不同浓度某一降血脂药物标准样品的检测液，采用液相色谱-质谱联用法依次对该些不同浓度的检测液进行测定，获得各检测液对应的液相色谱峰面积，拟合生成该降血脂药物的液相色谱峰面积与浓度的标准曲线。当确定待测样品中含有某一降血脂药物后，获得待测样品测定结果中该降血脂药物的液相色谱峰面积y，在该降血脂药物的峰面积与浓度的标准曲线中，液相色谱峰面积y对应的浓度即为采用待测样品配制而成的待检测液中该降血脂药物的浓度，进而可以换算得出待测样品中某一降血脂药物的浓度。

在本发明的一实施方式中，该检测方法还包括：将待测样品依次用进行溶解和固液分离处理，得到上清液，以上清液作为液相色谱-质谱联用法测定的待检测液，通过该预处理方法，能够更为充分提取出渗透性客体中所含有的降血脂药物，即，使待测样品中的降血脂药物尽可能地进入上清液中，提高检测过程的准确度。

其中，上述对待测样品进行溶解所用溶剂包括甲醇和乙腈中的至少一种，例如可以是甲醇或甲醇与乙腈的混合液。在一优选的实施方式中，采用甲醇对含有基体指印的样品进行溶解，利于提高检测方法的灵敏度，同时省去样品进行测试前的吹干、复溶等步骤，利于更好的避免对样品的污染。

具体实施时，进行溶解和固液分离处理的过程可以包括：可以将采集有指印的滤纸剪碎置于装有0.5ml甲醇的2ml离心管中，将离心管依次涡旋混合1min、超声振荡3min、离心5min(12000r/min)，得到上清液，以上清液作为液相色谱-质谱联用法测定的待检测液。该溶解和固液分离处理简便、快速，易于操作。

根据本发明的研究，采用液相色谱-质谱联用法进行测定时，流动相可以包括甲醇和含有0.1％甲酸的水溶液，在0-1.5min内，甲醇与含有0.1％甲酸的水溶液的体积比为5：95；在1.5-6min内，甲醇与含有0.1％甲酸的水溶液的体积比为35:65；在6-8.1min内，甲醇与含有0.1％甲酸的水溶液的体积比为95:5；剩余时间内，甲醇与含有0.1％甲酸的水溶液的体积比为5：95。该剩余时间一般为8.1-11min。通过该梯度洗脱，能更好的将待测样品中可能含有的降血脂药物有效分离。

其中，流动相的流速为0.3-0.6mL/min。

在本发明的一实施方式中，采用液相色谱-质谱联用法进行测定时，可以采用C₁₈色谱柱，例如可以是内径为3mm、长度100mm、填料粒径为1.7μm的C₁₈色谱柱，其柱温可以为35-45℃。

根据本发明的研究，质谱分析过程可以采用s-MRM-IDA-EPI(scheduled multiplereaction monitoring-information dependent acquisition-enhanced production)模式，该模式在s-MRM分析的基础上基于预定义的IDA标准自动触发MS或MS扫描，其动态背景扣除(DBS)功能，可自动扣除背景离子，因此在进行s-MRM定量分析的同时可获得有效的子离子信息，利用子离子和谱库的比对情况，对化合物进行筛查，利于提高检测的灵敏度。

根据本发明的研究，所述质谱分析过程所用离子源可以为电喷雾离子源(ESI源)，扫描方式为正离子模式和负离子模式，正离子源喷雾电压为5500V(ESI⁺)，负离子源电压为-4500V(ESI^-)，离子源温度(TEM)可以为500-550℃；雾化气(GS1)为55psi，气帘气(CUR)为35psi，辅助气(GS2)为50psi，碰撞气(CAD)为7psi；正离子模式下化合物的射入电压(EP)为10V，碰撞室射出电压(CXP)为17V，负离子模式下化合物的射入电压为-10V，碰撞室射出电压(CXP)为-15V，碰撞电压(CE)和去簇电压(DP)检测前优化至最佳灵敏度(本发明检测条件下最大响应)，各降血脂药物对应的最佳碰撞电压和去簇电压见表2。

本发明的实施方案，至少具有如下有益效果：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种降血脂药物的检测方法，具有较低的检测限，能同时检测包括阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、苯扎贝特、环丙贝特、氯贝特、非诺贝特、依替米贝、吉非罗齐和烟酸的13种常见的降血脂药物，该13种降血脂药物的检测限均可达到0.050ng/patch。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1建立指印中降血脂药物的检测方法

如无特别说明，以下试验中，采用液相色谱-质谱联用法进行测定时的条件如下：

色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY

BEH C18(3.0×100mm Column，1.7μm)，柱温：40℃，流动相为甲醇(B相)和含0.1％甲酸的水溶液(A相)，流速0.4mL/min，各时间段内的梯度洗脱条件见表3。

表3

时间/min	B相体积浓度/％(余量为A相)
		0.00	5.0
1.00	5.0
		1.50	35.0
6.00	95.0
		8.00	95.0
8.10	5.0
		11.0	5.0

质谱条件

离子源：电喷雾离子源，扫描方式：正离子模式和负离子模式，正离子源喷雾电压：5500V，负离子源电压：-4500V，离子源温度：550℃，雾化气：55psi，气帘气：35psi，辅助气：50psi，碰撞气：7psi；正离子模式下，化合物的射入电压：10V，碰撞室射出电压：17V；负离子模式下，化合物的射入电压：-10V，碰撞室射出电压-15V。

扫描方式：s-MRM-IDA-EPI。

采用甲醇为溶剂，配制如下8种浓度的母液：为2.0μgL^-1、5.0μgL^-1、10.0μgL^-1、20.0μgL^-1、50.0μgL^-1、100.0μgL^-1、200.0μgL^-1、500.0μgL^-1、1000.0μgL^-1以及2000.0μgL^-1；采用该8种母液配制各标准样品检测液。

(1)线性试验

各取25μL上述浓度分别为8种的母液，分别配制8组同时含有上述表2中的13种降血脂药物的混合标准检测液，每组混合标准检测液中，各降血脂药物的浓度相同；该8组混合标准检测液中各降血脂药物的浓度分别为：0.050ng/patch、0.125ng/patch、0.250ng/patch、0.500ng/patch、1.250ng/patch、2.500ng/patch、5.000ng/patch、12.500ng/patch、25.000ng/patch以及50.000ng/patch。

依次采用液相色谱-质谱联用法对上述8组混合标准待测液测定，进样量为5μL，获得不同浓度各降血脂药物标准样品对应的液相色谱峰面积，以浓度为横坐标、液相色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制各降血脂药物标准样品对应的峰面积-浓度标准曲线，其方程式如表4所示，在0.050-50.000ng/patch的范围内，各降血脂药物标准样品对应的液相色谱峰面积与浓度呈线性关系，线性相关系数r²值均大于0.99。

表4

(2)检测限和定量限测定试验

按照上述(1)的操作步骤，配制并测定多组含有不同浓度各降血脂药物的混合标准检测液，测量其检测限和定量限，经测定，各药物检测限均达到了0.050ng/patch(S/N>3)，定量限达到0.450ng/patch(S/N>10)。

(3)精密度和准确度试验

配制浓度分别为0.250ng/patch、2.500ng/patch和25.000ng/patch的3种混合标准检测液，依次采用液相色谱-质谱联用法进行测定，测得上述表2中的13种降血脂药物的日内精密度、日内精密度、日间精密度见表5；其中：

按照如下过程分别测定每一降血脂药物各浓度混合标准检测液的日内精密度和日内准确度：在1天内重复测定6次，得到6个测定值(即根据外标法计算得到混合标准检测液中各降血脂药物的浓度)，计算该6个测定值的相对标准偏差，即为日内精密度(Intra-day RSD)；6个测定值的平均值与实际值(即上述配制浓度)的比值为日内准确度(Intra-day RSD)；

按照如下分别测定各浓度混合标准检测液的日间精密度：每一天测一次，共测3次，获得3个测定值，计算该3个测定值的相对标准偏差，即为日间精密度(Inter-day RSD)。

表5

从表4可以看到，日内精密度的RSD值不超过11.2％，日内准确度为86.7％-101.0％，日间精密度的RSD值不超过15.1％。

(3)回收率试验

将采集有空白指印(不含有降血脂药物的机体指印)的滤纸剪碎置于装有0.5ml甲醇的2ml离心管中，将离心管依次涡旋混合1min、超声振荡3min、离心5min(12000r/min)，得到空白指印样品上清液。

配制浓度分别为0.250ng/patch、2.500ng/patch和25.000ng/patch的含有上述表2中的13种降血脂药物的3种混合标准检测液，依次采用液相色谱-质谱联用法对上述3组混合标准检测液测定，进样量为5μL，得到峰面积测定值(C)。在上述空白指印样品上清液中添加合适浓度的上述母液配置相同浓度的3种空白指印样品混合加标待测液，依次采用液相色谱-质谱联用法对上述3组空白指印样品混合加标待测液进行测定，进样量为5μL，得到峰面积测定值(A)。

3组混合标准检测液的峰面积测定值(C)与相同浓度的空白指印样品混合加标待测液的测定值(A)的比值为其回收率，回收率＝C/A×100％。

经计算，回收率为79.9％-114.8％，13种降血脂药物的回收率计算结果见表6。

表6

实验例：

样品处理：

从某案发现场的纸巾上发现一枚指印，将纸巾携带指印的部位剪下，剪碎后置于装有0.5ml甲醇的2ml离心管中，将离心管依次涡旋混合1min、超声振荡3min、离心5min(12000r/min)，得到上清液。

测得采集到的指印中含有洛伐他丁和氯贝特，其含量分别为0.205ng/pacth和0.314ng/pacth。

该指印经DNA检验入库比对，未找到指印供体，可以根据指印中含有该2种降血脂药物判定该指印的遗留者为高血脂病患者，从而为侦查提供线索。

最后应说明的是：以上各实验例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实验例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实验例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实验例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种含有机体指印待测样品中降血脂药物的检测方法，其特征在于，包括：

采用液相色谱-质谱联用法对待测样品进行测定，根据测定结果中的液相色谱峰保留时间和质谱的子离子和母离子离子强度的比值，确定待测样品中所含降血脂药物；

所述降血脂药物包括阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、苯扎贝特、环丙贝特、氯贝特、非诺贝特、依替米贝、吉非罗齐和烟酸。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还包括：采用所述液相色谱-质谱联用法对所述降血脂药物的标准样品进行测定，获得包括各降血脂药物标准样品的液相色谱峰保留时间和质谱的子离子和母离子离子强度的比值的标准样品测定结果；将待测样品测定结果中的液相色谱峰保留时间和质谱的子离子和母离子离子强度的比值与所述标准样品测定结果进行比对，确定待测样品中所含降血脂药物。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，还包括：记录根据所述待测样品测定的液相色谱峰面积，按外标法以峰面积计算确定待测样品中所含降血脂药物的含量。

4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：将待测样品依次进行溶解和固液分离处理，得到上清液，以所述上清液作为所述液相色谱-质谱联用法测定的待检测液。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述溶解所用溶剂包括甲醇和乙腈中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用液相色谱-质谱联用法进行所述测定时，所述流动相包括甲醇和含有0.1％甲酸的水溶液，在0-1.5min内，甲醇与含有0.1％甲酸的水溶液的体积比为5：95；在1.5-6min内，甲醇与含有0.1％甲酸的水溶液的体积比为35:65；在6-8.1min内，甲醇与含有0.1％甲酸的水溶液的体积比为95:5；剩余时间内，甲醇与含有0.1％甲酸的水溶液的体积比为5：95。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述剩余时间为8.1-11min。

8.根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.3-0.6mL/min。

9.根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，采用液相色谱-质谱联用法进行测定时，所用色谱柱为C₁₈色谱柱，其柱温为35-45℃。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用液相色谱-质谱联用法进行所述测定时，所述质谱分析过程采用s-MRM-IDA-EPI模式，所述质谱分析过程所用离子源为电喷雾离子源，离子源温度为500-550℃。