CN108169381A - 一种降血脂类中成药和保健食品中非法添加药物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种具有降血脂功能的中成药和保健食品中非法添加6种降血脂药物的快速检测方法。样品用甲醇提取处理后，采用超高效液相色谱‑串联质谱法，色谱柱分离，甲酸水溶液和乙腈作流动相梯度洗脱，质谱ESI正离子、多反应监测模式测定，外标法定量。本方法线性关系良好，快速、简便、准确，可作为降血脂类保健食品中非法添加化学药物的定性定量检测方法，可以用于中成药及保健食品中非法添加药物的筛查。为控制保健品质量、打击保健品行业非法添加行为提供有效依据。
Description
技术领域
本发明涉及到食品药品安全领域，特别是食品药品安全检测领域，具体涉及一种同时快速检测具有降血脂功效的中成药和保健食品中非法添加6种降血脂化学药物的超高效液相色谱-串联质谱方法。
背景技术
近年，我国人民生活质量显著提高，人们对自身的健康也越来越关注，开始讲究“治未病”和“养生保健”，从而促成了保健品市场利益空间迅速增大，无数商家竞相掘金。但是，随之而来的食品药品安全问题不断增多，一些不法分子为获取高额利益在中成药和保健食品中非法添加化学药物，使其功效显著。此类非法添加随意性大，剂量不明确，标签上又未作说明，往往导致消费者长期、超量服用因而引起毒性反应，严重的甚至危及生命。
目前，国内外对于保健食品与中成药中非法添加化学药的研究很多，但研究降血脂类非法添加的相对较少。而近年发病率逐渐上升的高血脂症等心脑血管疾病，已成为严重危害我国人民健康的“隐形杀手”，降血脂保健食品市场也呈飞速上升的趋势。已见报道的检测方法有薄层色谱法和高效液相色谱法，但存在选择性差、定性能力弱和灵敏度低的问题；也有液相色谱-质谱联用法，但检测成分少、检测时间较长。
国家食品药品监督管理局曾于2010年颁布《辅助降血脂类保健食品违法添加药物的检测方法》，但方法中仅含3种药物成分，且检测时间很长（接近40min），灵敏度较低。因此研究降血脂类保健食品中的非法添加物，对促进质量监督，保障食品安全和人民健康是十分有必要的。
发明内容
本发明选取了6种可能用于降血脂功能产品中非法添加的临床常用的降血脂化学药，分别为：烟酸、普伐他汀钠、氟伐他汀钠、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀，采用超高效液相色谱-串联质谱法，以多反应监测（MRM）模式，建立了在4min内定性、定量检测6种降血脂药物成分的分析方法，并进行了方法验证，证明方法准确、可靠。该发明大大提高了检测效率、缩短了检测时间，可为降血脂类保健食品与中成药的安全监控提供技术依据。
本发明是采用如下技术方案实现的：
1、对照品溶液制备：分别精密称取烟酸、普伐他汀钠、氟伐他汀钠、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀对照品适量，加甲醇溶解并稀释定容，摇匀，作为各对照品的标准储备液。各取对照品的标准储备液适量，用甲醇稀释并配制成所需浓度的混合对照品溶液，使用时进一步稀释。
2、供试品溶液制备：各取供试样品内容物适量，粉碎、混匀。分别精密称取一次日常服用量的样品，置于50mL容量瓶中，用甲醇超声提取15-30min，料液比为1:5-1:10g/mL。冷却至室温后，用甲醇稀释定容，摇匀，上清液经0.22µm微孔滤膜过滤后，作为供试品储备溶液。使用时精密量取供试品储备液适量，用初始流动相逐步稀释至使其中供试品质量浓度与对照品溶液质量浓度相近的溶液，作为供试品使用溶液。
3、色谱条件：色谱柱：超高效液相C18色谱柱；流动相：含0.05-0.1%甲酸的水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱：0～2.5min，50%B，2.5～3.0min，60%B，3.0～3.5min，100%B，3.5～4.0min，50%B，流速0.15-0.25mL/min；色谱柱温度：25-35℃；进样量0.5-5µL。
4、质谱条件：电喷雾离子源ESI正离子模式扫描；毛细管电压2.5-2.9kV；脱溶剂气温度450-650℃；脱溶剂气流量750-950L/h；锥孔气流速度45-55L/h；碰撞气体为氩气；子离子扫描及MRM模式同时监测。
5、定性和定量检测：质谱在正离子、MRM模式下，用1µg/mL的混合标准溶液手动调谐结合自动调谐，逐一选择并确定适合各化合物的准离子峰及母离子，采用子离子扫描方式进行二级质谱分析，对子离子进行优化选择，找出满足化合物碎裂规律的子离子，确定定量与定性离子，同时优化毛细管电压和锥孔电压、碰撞能量等质谱参数，使离子强度最大、分离度最佳。最后确定测定6种化学药物的定性和定量离子对，共12个离子检测通道。各化合物采集的总离子流见图1，定量离子对的MRM离子流见图2。当定量检测时，采用外标法绘制各标准品的标准工作曲线。其中标准曲线的横坐标为标准溶液浓度，纵坐标为标准溶液的质谱响应峰面积。
本发明的有益技术效果是：建立了具有降血脂功能的中成药和保健食品中非法添加烟酸、普伐他汀钠、氟伐他汀钠、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀6种降血脂化学药物成分的UPLC-MS/MS测定方法，具有快速、准确、灵敏度高和专属性强等优点，可为药品监管及规范保健品市场提供技术支撑。
附图说明
图1为6种降血脂化学药物总离子流图；
图2为6种降血脂化学药物定量离子对的MRM离子流图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例中所采用的实验用品如下：
（1）材料与试剂：实验用对照品：洛伐他汀、美伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀钠、氟伐他汀钠、烟酸，购于中国食品药品检定研究院；样品处理所用甲醇为分析纯，实验用水为超纯水，其它试剂均为质谱纯级别。实验所用样品为购自本市药店所售的声称具有降血脂功能的保健食品。
（2）仪器与设备：ACQUITY UPLC Xevo TQD液相色谱-串联四级杆质谱联用仪，电喷雾离子源（ESI），Waters Masslynx 4.1数据处理系统，美国沃特世公司；Millipore超纯水仪，美国密理搏公司；KQ-300DA型数控型超声波提取仪，上海波龙电子有限公司；SartoriusBP211D型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司。
实施例1：实验方法的考察验证
（1）色谱-质谱条件：色谱柱：Waters Acquity BEH-C18（2.1mm×50mm，1.7µm）；
流动相：含0.05%甲酸的水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱：0～2.5min，50%B，2.5～3.0min，60%B，3.0～3.5min，100%B，3.5～4.0min，50%B，流速0.15mL/min；色谱柱温度：25℃；进样量5µL。质谱条件：电喷雾离子源ESI正离子模式扫描；毛细管电压2.5kV；脱溶剂气温度450℃；脱溶剂气流量750L/h；锥孔气流速度45L/h；碰撞气体为氩气；子离子扫描及MRM模式同时监测；
流动相：含0.75%甲酸的水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱：0～2.5min，50%B，2.5～3.0min，60%B，3.0～3.5min，100%B，3.5～4.0min，50%B，流速0.25mL/min；色谱柱温度：35℃；进样量0.5µL。质谱条件：电喷雾离子源ESI正离子模式扫描；毛细管电压2.9kV；脱溶剂气温度650℃；脱溶剂气流量950L/h；锥孔气流速度55L/h；碰撞气体为氩气；子离子扫描及MRM模式同时监测；
流动相：含0.1%甲酸的水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱：0～2.5min，50%B，2.5～3.0min，60%B，3.0～3.5min，100%B，3.5～4.0min，50%B，流速0.2mL/min；色谱柱温度：30℃；进样量1µL；质谱条件：电喷雾离子源ESI正离子模式扫描；毛细管电压2.68kV；脱溶剂气温度500℃；脱溶剂气流量850L/h；锥孔气流速度50L/h；碰撞气体为氩气；子离子扫描及MRM模式同时监测。
（2）质谱特征的确定
各物质的色谱保留时间、分子离子与定性定量离子及其采集参数见表1。
表1 降血脂化学药物的质谱采集参数
表中：a-定量离子，b-定性离子。
（3）方法专属性考察
取阴性样品（经检测不含违法添加成分的降血脂类保健食品）适量，按供试品溶液制备方法处理后，依发明中色谱条件进样、质谱条件采集图谱，得到样品的MRM离子流色谱图，12个定性定量离子通道中均未见有干扰6种目标物成分的色谱峰。结果表明，阴性样品对所测6种目标物均无干扰，方法专属性良好。
（4）进样精密度试验
取混合对照品溶液，按步骤（1）所述色谱-质谱条件进样测定，每一组分别连续测定6次，计算烟酸、普伐他汀钠、氟伐他汀钠、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀定量离子对质谱峰面积的RSD，均在7%以内，表明方法的精密度良好。
（5）方法检测限（LOD）和定量限（LOQ）试验
取阴性样品适量，置50mL容量瓶中，按1.0mg/g的添加量加入混合对照品溶液，按供试品溶液方法制备并经逐步稀释后进样，以信噪比为3时计算各化学药的检测限，信噪比为10时计算各化学药的定量限。结果表明方法检测限均在39µg/kg以下，说明方法具有较高的灵敏度，能满足非法添加的检测要求。
实施例2：样品的测定
（1）对照品溶液制备
分别精密称取洛伐他汀（批号：LK10O58，含量98.0%，中国食品药品检定研究院）、美伐他汀（批号：2-NYL-167-1，含量98.0%，中国食品药品检定研究院）、辛伐他汀（批号：11-SCC-167-1，含量98.0%，中国食品药品检定研究院）、普伐他汀钠（批号：8-XJZ-27-1，含量98.0%，中国食品药品检定研究院）、氟伐他汀钠（批号：7-ABY-122-1，含量98.0%，中国食品药品检定研究院）、烟酸（批号：LF80N66，含量99.5%，中国食品药品检定研究院）1-5mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度定容，摇匀，作为各标准品的标准储备液。根据初步分析的质谱响应结果，取各标准品的标准储备液适量，用甲醇稀释并配制成所需浓度的混合对照品溶液并进一步稀释使用。
6个对照品的总离子流如图1所示，定量离子对的MRM离子流如图2所示。
（2）降血脂保健食品供试溶液制备
将具有降血脂功效的保健食品每个品种取10至20粒油状样品内容物，混匀；或取10至20片（丸或袋）固体样品，置研钵中碾磨均匀呈粉末状。分别精密称取一次日常服用量的样品，置于50mL容量瓶中，加甲醇超声提取15min，料液比为1:5g/mL。冷却至室温后，用甲醇稀释定容，摇匀，上清液经0.22µm微孔滤膜过滤后，作为供试品储备溶液。使用时精密量取供试品储备液适量，用初始流动相逐步稀释至使待测物质量浓度与对照品溶液质量浓度相近的溶液，作为供试品使用溶液。在样品处理过程中，大部分基质较简单，前处理时只采用甲醇超声提取过滤后即上样分析。但个别样品（如苦瓜洋参软胶囊和苍芎胶囊）基质比较复杂，会产生一定的基质效应，质谱检测器的离子源容易被污染，则先将样品过固相萃取柱（如：WAX固相萃取柱）净化处理后再作为供试品使用溶液上机分析。
（3）色谱-质谱条件：色谱柱：Waters Acquity BEH-C18（2.1mm×50mm，1.7µm）；流动相：含0.1%甲酸的水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱：0～2.5min，50%B，2.5～3.0min，60%B，3.0～3.5min，100%B，3.5～4.0min，50%B，流速0.2mL/min；色谱柱温度：30℃；进样量1µL；质谱条件：电喷雾离子源ESI正离子模式扫描；毛细管电压2.68kV；脱溶剂气温度500℃；脱溶剂气流量850L/h；锥孔气流速度50L/h；碰撞气体为氩气；子离子扫描及MRM模式同时监测。
（4）线性关系考察
取稀释后的不同浓度的混合对照品溶液进样测定，以各组分定量离子对的峰面积（Y）对质量浓度（X）绘制标准曲线，得回归方程和相关系数（R2），结果表明，6种化学药物的线性关系在线性范围内良好，R2均在0.9955以上。具体数据见表2。
（5）加样回收率试验
精密称取未检出6种化学药的阴性样品1次服用量，共9份，分为3组，制备成供试溶液，分别进行0.5、1.0、1.5mg/g 3个添加浓度的回收率试验，结果见表2。结果表明，6种化学药的加样回收率中各质量浓度的平均回收率均在87.5~116.5%，符合测定要求。
表2 6种降血脂化学药的线性方程、相关系数及回收率
（6）样品测定结果
本次测定共收集降血脂类保健食品20批，取各样品按方法制备供试品使用溶液，依发明中色谱、质谱条件进样测定，根据定量监测离子对的色谱峰面积，采用外标法计算样品中各化学药成分的量。结果发现，20批降血脂类保健食品中共检出3批可能添加化学药物，分别检测出烟酸和洛伐他汀。
利用本发明中上述已建立的检测方法，进行方法学的验证和批量样品的检测。经验证，本检测方法快速、灵敏、专属性强，适用于对降血脂功能中成药或保健食品中的非法添加化学药物进行检测。
最后应说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖本发明的权利要求保护范围中。
Claims (7)
1.一种降血脂类中成药和保健食品中非法添加药物的检测方法，包括以下步骤：
（1）对照品溶液制备：分别精密称取烟酸、普伐他汀钠、氟伐他汀钠、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀对照品，加甲醇溶解并稀释定容，作为各对照品的标准储备液；取各对照品的标准储备液，用甲醇稀释并配制成所需浓度的混合对照品溶液，使用时进一步稀释；
（2）供试品溶液制备：取供试样品，粉碎、混匀，精密称取一次日常服用量，加甲醇超声提取，冷却至室温后，用甲醇稀释定容，摇匀，上清液经0.22µm微孔滤膜过滤后，作为供试品储备溶液；使用时精密量取供试品储备液，用初始流动相逐步稀释至使其中供试品质量浓度与对照品溶液质量浓度相近的溶液，作为供试品使用溶液；
（3）将混合对照品溶液和供试品使用溶液分别进样至超高效液相色谱-串联质谱联用仪，采用超高效液相色谱-串联质谱法，对供试品使用溶液进行定性和定量检测，色谱条件为：采用超高效液相C18色谱柱分离，柱温25-35℃，以0.05-0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）作流动相梯度洗脱，洗脱程序为：0～2.5min，50%B，2.5～3.0min，60%B，3.0～3.5min，100%B，3.5～4.0min，50%B，流速0.15-0.25mL/min；质谱条件为：电喷雾离子源ESI正离子模式扫描，毛细管电压2.5-2.9kV，脱溶剂气温度450-650℃，脱溶剂气流量750-950L/h，锥孔气流速度45-55L/h，碰撞气体为氩气，子离子扫描及MRM模式同时监测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中供试样品若为油状胶囊产品，则每个品种取10至20粒油状内容物，混匀后进行提取；若为片剂或丸剂，则取10至20份固体样品，研磨均匀呈粉末状后进行提取。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中提取时供试样品与甲醇的料液比为1:5-1:10g/mL。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中甲醇超声提取15-30min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中对于基质比较复杂、容易产生基质效应的样品，需将制成的供试品溶液过固相萃取柱净化处理。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中定量检测时，采用外标法绘制各标准品的标准工作曲线。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中色谱条件为：采用超高效液相C18色谱柱分离，柱温30℃，以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）作流动相梯度洗脱，洗脱程序为：0～2.5min，50%B，2.5～3.0min，60%B，3.0～3.5min，100%B，3.5～4.0min，50%B，流速0.2mL/min；质谱条件为：电喷雾离子源ESI正离子模式扫描，毛细管电压2.68kV，脱溶剂气温度500℃，脱溶剂气流量850L/h，锥孔气流速度50L/h，碰撞气体为氩气，子离子扫描及MRM模式同时监测。
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