CN111812225A - 超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗焦虑和催眠药物浓度的方法 - Google Patents

超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗焦虑和催眠药物浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗焦虑和催眠药物的方法，可以一次性对11种抗焦虑和催眠药物进行检测，目标药物与代谢产物同时监测，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5分钟之内完成抗焦虑和催眠药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗焦虑和催眠药物的定量分析，为临床上血清中抗焦虑和催眠药物的治疗浓度监测提供简单快速的检测方法。

Description

超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗焦虑和催眠药物 浓度的方法
技术领域
本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗焦虑和催眠药物浓度的方法，具体药物为：硝西泮(Nitrazepam，NZP)、奥沙西泮(Oxazepam，OXP)、艾司唑仑(Estazolam，ESL)、替马西泮(Temazepam，TMP)、阿普唑仑(Alprazolam，APL)、溴西泮(Bromazepam，BZP)、劳拉西泮(Lorazepam，LZP)、咪达唑仑(Midazolam，MDZ)、佐匹克隆(Zopiclone，ZPC)、地西泮(Diazapam，DZP)和唑吡坦(Zolpidem，ZPM)。
背景技术
焦虑失眠症是一种常见的疾病，一般受生物和心理及社会三个方面影响。苯二氮卓类药物属于一种精神药品，具有镇静、催眠、抗焦虑、抗惊厥、使肌肉松弛等作用。苯二氮卓类药物是药物相关的苯二氮卓类受体激动剂，对中枢神经系统(CNS)产生抑制作用，适合于治疗睡眠不足、焦虑、肌肉张力增加或癫痫。
苯二氮卓类药物有地西泮(Diazapam，DZP)、硝西泮(Nitrazepam，NZP)、劳拉西泮(Lorazepam，LZP)、奥沙西泮(Oxazepam，OXP)、阿普唑仑(Alprazolam，APL)、替马西泮(Temazepam，TMP)、溴西泮(Bromazepam，BZP)等。
地西泮(7-氯-1-甲基-5-苯基-3H-1，4-苯二氮杂-2[1H]-酮)用于治疗苯胺类疾病，为长效苯二氮卓类药。奥沙西泮、替马西泮(3-羟基地西泮)是1,4-苯二氮卓衍生物，也是地西泮的主要活性代谢物，主要用作抗焦虑和催眠药物。劳拉西泮也是1,4-苯二氮卓衍生物，临床用于治疗与抑郁症状相关或不相关的焦虑，作为术前药物，也作为新生儿的抗惊厥药物。硝西泮具有抗癫痫催眠作用，催眠作用比地西泮强，劳拉西泮和奥沙西泮基本上和地西泮的效果差不多。阿普唑仑是我国最常用的苯二氮卓类药物之一，是一种安全的抗焦虑药，吸收迅速，生物利用度高。艾司唑仑是快速吸收和半衰期中等的苯二氮卓安定类催眠药物，是苯二氮
Figure BDA0002518375650000011
类药物的萃取药物，通常当做短期的失眠处方。咪达唑仑具有典型的苯二氮
Figure BDA0002518375650000021
类药理活性，具有催眠、镇静、抗惊厥、肌肉松弛、遗忘和轴解等作用。在临床实践中，通过静脉和肌肉注射来治疗全身性癫痫发作、难治性癫痫持续状态和肌肉痉挛。咪达唑仑也被用于有意识的镇静和全身麻醉的诱导。
除苯二氮卓类药物外，唑吡坦(安必恩)是一种处方药，用于短期治疗失眠症(难以入睡或保持睡眠)和一些脑部疾病。它是一种短效非苯二氮卓类催眠药，其催眠作用类似于苯二氮类药物，但在分子上与经典的苯二氮类分子不同，属于咪唑吡啶类，唑吡坦在维持睡眠方面没有充分证明其有效性，然而在缩短入睡时间，延长睡眠时间方面是有效的。佐匹克隆为吡咯酮类镇静催眠药，可用于失眠症的治疗，特别是暂时性入睡困难和早醒的患者。
然而，这些抗焦虑和催眠药物有相似的不良或毒性作用，主要表现为头晕或睡眠时间延长，注意力集中能力下降。如果与其他抑制中枢神经系统的物质，特别是酒精，同服可能导致严重的甚至危及生命的呼吸抑制。除此之外，这些物质具有产生耐受性和依赖性的高潜力，这可能导致生理和心理上的戒断症状，导致误用和滥用。
因此，对于临床毒理学(CT)中的毒理学筛选、鉴定和量化，需要合适的分析程序。血清或血清中抗焦虑和催眠药物的检测对于依从性、监测和鉴别滥用具有重要的临床意义。测定血清或血清浓度有助于优化慢性给药、验证依从性和确定药代动力学的变化。
到目前为止，血清中苯并二氮杂卓、唑吡坦和唑匹克隆的通用筛选程序尚未公布，与此组单一物质或其中一些物质的组合(有些还包括代谢物)的定量方法不同。不同药物的血清分析已发表了大量的分析方法。然而，所有这些方法只涉及单一或少数苯二氮卓类的混合物。
目前针对抗焦虑和催眠药物体内浓度检测的专利有很多，比如中国专利申请(公布号：CN 109085265 A)公开了一种“液相色谱串联质谱法检测血清血浆中抗焦虑/催眠类药物的试剂盒及应用”，同时检测8种物质，样本量需要100μL，前处理需要35分钟以上，中国专利申请(公开号：CN 107991421 A)公开了“一种检测血液中地西泮含量的液相色谱分析方法”，地西泮灵敏度低，定量限在0.625μg/mL，样本量需要100μL，前处理繁琐，需要萃取，氮吹浓缩。此外，还有专利针对其中一种或几种此类药物进行检测，效率相对比较低，存在单个样品分析时间长、灵敏度低、线性范围不适宜、样品前处理复杂和存在基质效应干扰等不足。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗焦虑和催眠药物浓度的方法。
本发明的技术方案如下：
一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗焦虑和催眠药物浓度的方法，
所述抗焦虑和催眠药物分别为：硝西泮(NZP)、奥沙西泮(OXP)、艾司唑仑(ESL)、替马西泮(TMP)、阿普唑仑(Alprazolam，APL)、溴西泮(BZP)、劳拉西泮(LZP)、咪达唑仑(MDZ)、佐匹克隆(ZPC)、地西泮(DZP)和唑吡坦(ZPM)；
上述抗焦虑和催眠药物对应的同位素内标物分别为：硝西泮-d5(NZP-d5)、奥沙西泮-13C6(OXP-13C6)、艾司唑仑-d5(ESL-d5)、替马西泮-d5(TMP-d5)、阿普唑仑-d5(APL-d5)、溴西泮-d4(BZP-d4)、劳拉西泮-d4(LZP-d4)、咪达唑仑-d7(MDZ-d7)、佐匹克隆-d8(ZPC-d8)、地西泮-d5(DZP-d5)和唑吡坦-d8(ZPM-d8)；
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述抗焦虑和催眠药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清中抗焦虑和催眠药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.01％～0.1％乙酸-0.05～0.5mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A和流动相B的初始比例为80～100:20～0；所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至35:65；在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由35:65匀速渐变至2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至初始比例；每个样品采集时间为5.0分钟。
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为2.5kV(ESI+)；源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了乙酸和乙酸铵，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血清中抗焦虑和催眠药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5分钟之内完成抗焦虑和催眠药物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.01％～0.05％乙酸-0.05～0.1mM乙酸铵水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.05％乙酸-0.1mM乙酸铵水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.01％～0.1％乙酸-0.05～0.5mM乙酸铵水溶液和乙腈作为流动相，色谱柱型号：ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，5.0分钟之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用硝西泮-d5(NZP-d5)、奥沙西泮-13C6(OXP-13C6)、艾司唑仑-d5(ESL-d5)、替马西泮-d5(TMP-d5)、阿普唑仑-d5(APL-d5)、溴西泮-d4(BZP-d4)、劳拉西泮-d4(LZP-d4)、咪达唑仑-d7(MDZ-d7)、佐匹克隆-d8(ZPC-d8)、地西泮-d5(DZP-d5)和唑吡坦-d8(ZPM-d8)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中抗焦虑和催眠药物时的重现性、准确度均较好。
在一种优选方案中，流动相A和流动相B的初始比例为85～95:15～5。进一步优选地，流动相A和流动相B的初始比例为90:10。
在一种方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.3mL/min。
进一步地，柱温为35～45℃，优选为45℃。
更进一步地，进样体积为0.2～5μL，优选为1μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗焦虑和催眠药物时，具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：0.05％乙酸-0.1mM乙酸铵水溶液；
流动相B：乙腈；
色谱柱型号：ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)；
流动相A和流动相B的初始比例为90:10；采用梯度洗脱的方式，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由99:10匀速渐变至35:65；在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由35:65匀速渐变至2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至90：10；每个样品采集时间为5.0分钟。梯度洗脱方式具体见表1；流速为0.3mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL；
表1 流动相梯度洗脱参数
时间(min) 流速(mL/min) ％A ％B
0.0 0.3 90 10
1.0 0.3 35 65
3.0 0.3 2 98
5.0 0.3 90 10
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为2.5kV(ESI+)；源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h，质谱源参数如表2所示；同时监测了各目标物及其对应同位素内标；各目标待测物的质谱采集参数见表3。
表2 质谱源参数
Figure BDA0002518375650000051
表3 抗焦虑和催眠药物检测质谱参数
Figure BDA0002518375650000061
本发明提及的血清为人或动物血清。
所述经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；所述蛋白质沉淀剂为甲醇与异丙醇混合溶液；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比为1:1～5。在不影响本发明效果的情况下，例如，蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比1:4。
在一种优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比1:4)，振荡3～5min，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
在一种更优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比1:4)，振荡5min，在14000r/min，4℃离心5min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样，进样量1μL。
在一种方案中，含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
以甲醇配制如下同位素内标母液：硝西泮-d5(NZP-d5)0.1mg/mL、奥沙西泮-13C6(OXP-13C6)1mg/mL、艾司唑仑-d5(ESL-d5)0.1mg/mL、替马西泮-d5(TMP-d5)1mg/mL、阿普唑仑-d5(APL-d5)0.01mg/mL、溴西泮-d4(BZP-d4)0.1mg/mL、劳拉西泮-d4(LZP-d4)0.1mg/mL、咪达唑仑-d7(MDZ-d7)0.1mg/mL、佐匹克隆-d8(ZPC-d8)0.1mg/mL、地西泮-d5(DZP-d5)0.1mg/mL和唑吡坦-d8(ZPM-d8)1mg/mL。
分别移取各同位素内标母液：硝西泮-d5(NZP-d5)5μL、奥沙西泮-13C6(OXP-13C6)1μL、艾司唑仑-d5(ESL-d5)5μL、替马西泮-d5(TMP-d5)1μL、阿普唑仑-d5(APL-d5)50μL、溴西泮-d4(BZP-d4)5μL、劳拉西泮-d4(LZP-d4)2μL、咪达唑仑-d7(MDZ-d7)1μL、佐匹克隆-d8(ZPC-d8)5μL、地西泮-d5(DZP-d5)20μL和唑吡坦-d8(ZPM-d8)2μL，再加入至903μL甲醇中得到1mL混合内标溶液。
取200uL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
在一种优选方案中，蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比为1:1～5；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比为1:4。
在一种优选方案中，含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
分别以甲醇配制上述抗焦虑和催眠药物的同位素内标母液，再加入至903μL甲醇中，混匀得到1mL混合内标溶液，取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比为1:4)中，即得含内标的蛋白沉淀剂，浓度参下表4。
表4 含内标的蛋白沉淀剂配制
Figure BDA0002518375650000071
Figure BDA0002518375650000081
在一种方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
将上述抗焦虑和催眠药物配制成如下浓度的标准品母液：硝西泮(NZP)1mg/mL、奥沙西泮(OXP)1mg/mL、艾司唑仑(ESL)1mg/mL、替马西泮(TMP)1mg/mL、阿普唑仑(APL)0.1mg/mL、溴西泮(BZP)1mg/mL、劳拉西泮(LZP)1mg/mL、咪达唑仑(MDZ)1mg/mL、佐匹克隆(ZPC)5mg/mL、地西泮(DZP)1mg/mL和唑吡坦(ZPM)0.1mg/mL。
分别移取各标准品母液：硝西泮(NZP)20μL、奥沙西泮(OXP)50μL、艾司唑仑(ESL)20μL、替马西泮(TMP)40μL、阿普唑仑(APL)50μL、溴西泮(BZP)20μL、劳拉西泮(LZP)10μL、咪达唑仑(MDZ)5μL、佐匹克隆(ZPC)4μL、地西泮(DZP)100μL和唑吡坦(ZPM)100μL，再加入至581μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液。
将上述混合标准储备溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
阿普唑仑(APL)和咪达唑仑(MDZ)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL。
劳拉西泮(LZP)和唑吡坦(ZPM)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL。
硝西泮(NZP)、艾司唑仑(ESL)、溴西泮(BZP)和佐匹克隆(ZPC)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。
替马西泮(TMP)的七个浓度点为依次为：4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL。
奥沙西泮(OXP)的七个浓度点为依次为：5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL、2500ng/mL。
地西泮(DZP)的七个浓度点为依次为：10/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL、5000ng/mL。
本发明提及的空白血清基质为不含抗焦虑和催眠目标药物的空白血清。
在一种优选方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
分别上述抗焦虑和催眠药物的标准品母液，再加入至581μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液，浓度参下表5。
表5 混合标准品储备溶液
Figure BDA0002518375650000091
本发明将混合标准品储备液以空白血清基质(不含抗焦虑和催眠目标药物的空白血清)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取10μL混合标准品储备液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点。标曲配制的七个浓度点如表6所示。
表6 标曲配制
Figure BDA0002518375650000092
每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比1:4)，振荡5min，在14000r/min，4℃离心5min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样，进样量1μL。
本发明还包括制备质控品，所述质控品为含有抗焦虑和催眠药物的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。其中，
QC(L)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至5000倍。
QC(M)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至500倍。
QC(H)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至50倍。
优选地，空白血清基质为不含抗焦虑和催眠目标药物的空白血清。
在一种优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准储备溶液以不含抗焦虑和催眠目标药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体如表7所示。
表7 抗焦虑和催眠药物质控品对应浓度(浓度单位：ng/mL)
编号 组分 QC(L) QC(M) QC(H)
1 NZP 4 40 400
2 OXP 10 100 1000
3 ESL 4 40 400
4 TMP 8 80 800
5 APL 1 10 100
6 BZP 4 40 400
7 LZP 2 20 200
8 MDZ 1 10 100
9 ZPC 4 40 400
10 DZP 20 200 2000
11 ZPM 2 20 200
QC(L)中包含：硝西泮4mg/mL、奥沙西泮10mg/mL、艾司唑仑4mg/mL、替马西泮8mg/mL、阿普唑仑1mg/mL、溴西泮4mg/mL、劳拉西泮2mg/mL、咪达唑仑1mg/mL、佐匹克隆4mg/mL、地西泮20mg/mL和唑吡坦2mg/mL；
QC(M)中包含：硝西泮40mg/mL、奥沙西泮100mg/mL、艾司唑仑40mg/mL、替马西泮80mg/mL、阿普唑仑10mg/mL、溴西泮40mg/mL、劳拉西泮20mg/mL、咪达唑仑10mg/mL、佐匹克隆40mg/mL、地西泮200mg/mL和唑吡坦20mg/mL；
QC(H)中包含：硝西泮400mg/mL、奥沙西泮1000mg/mL、艾司唑仑400mg/mL、替马西泮800mg/mL、阿普唑仑100mg/mL、溴西泮400mg/mL、劳拉西泮200mg/mL、咪达唑仑100mg/mL、佐匹克隆400mg/mL、地西泮2000mg/mL和唑吡坦200mg/mL。
采用本发明的试剂盒检测血清中抗焦虑和催眠药物时，样本量仅需要50uL，前处理10分钟左右可完成，可同时针对11种物质进行检测，通量更高。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供的超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗焦虑和催眠药物，可以一次性对11种抗焦虑和催眠药物进行检测，目标药物与代谢产物同时监测，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5分钟之内完成抗焦虑和催眠药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗焦虑和催眠药物的定量分析，为临床上血清中抗焦虑和催眠药物的治疗浓度监测提供简单快速的检测方法。
附图说明
图1为抗焦虑和催眠药物标准品的选择离子流色谱图；
图2为血清样本中抗焦虑和催眠药物的选择离子流色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
一、实验材料与仪器
1.材料
样本来自于武汉亚洲心脏病医院2019年11月份门诊收集的血清样本。
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级乙酸(Fisher，美国)；MS级乙酸铵(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；色谱柱ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)。
(3)标准品：标准品及其对应的内标物，见表8。
表8 标准品和内标
序号 中文名称 厂家
1 硝西泮 Sigma
2 硝西泮-d5 甄准生物
3 地西泮 Sigma
4 地西泮-d5 Sigma
5 奥沙西泮 Sigma
6 奥沙西泮-13C6 甄准生物
7 艾司唑仑 Sigma
8 艾司唑仑-d5 Sigma
9 替马西泮 甄准生物
10 替马西泮-d5 甄准生物
11 唑吡坦 国家标准物质网
12 唑吡坦-d8 Sigma
13 阿普唑仑 中检所
14 阿普唑仑-d5 Sigma
15 溴西泮 Sigma
16 溴西泮-d4 甄准生物
17 劳拉西泮 Cerilliant
18 劳拉西泮-d4 Sigma
19 咪达唑仑 Cerilliant
20 咪达唑仑-d7 甄准生物
21 佐匹克隆 TRC
22 佐匹克隆-d8 甄准生物
(4)质控品：含有抗焦虑和催眠药物质的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，如表7所示。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.05％乙酸-0.1mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈。色谱柱型号：ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.3mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为2.5kV(ESI+)；源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h，质谱源参数如表2所示；同时监测了各目标物及其对应同位素内标；各目标待测物的质谱采集参数见表3。
三、实验过程
(1)标准品配制：
将上述抗焦虑和催眠药物配制成如下浓度的标准品母液：硝西泮(NZP)1mg/mL、奥沙西泮(OXP)1mg/mL、艾司唑仑(ESL)1mg/mL、替马西泮(TMP)1mg/mL、阿普唑仑(APL)0.1mg/mL、溴西泮(BZP)1mg/mL、劳拉西泮(LZP)1mg/mL、咪达唑仑(MDZ)1mg/mL、佐匹克隆(ZPC)5mg/mL、地西泮(DZP)1mg/mL和唑吡坦(ZPM)0.1mg/mL；
分别移取各标准品母液：硝西泮(NZP)20μL、奥沙西泮(OXP)50μL、艾司唑仑(ESL)20μL、替马西泮(TMP)40μL、阿普唑仑(APL)50μL、溴西泮(BZP)20μL、劳拉西泮(LZP)10μL、咪达唑仑(MDZ)5μL、佐匹克隆(ZPC)4μL、地西泮(DZP)100μL和唑吡坦(ZPM)100μL，再加入至581μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液。详见表5。
将上述混合标准储备溶液以空白血清基质(不含抗焦虑和催眠目标药物的空白血清)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，详见表6，所述校准品溶液的七个浓度点为：
阿普唑仑(APL)和咪达唑仑(MDZ)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL。
劳拉西泮(LZP)和唑吡坦(ZPM)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL。
硝西泮(NZP)、艾司唑仑(ESL)、溴西泮(BZP)和佐匹克隆(ZPC)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。
替马西泮(TMP)的七个浓度点为依次为：4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL。
奥沙西泮(OXP)的七个浓度点为依次为：5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL、2500ng/mL。
地西泮(DZP)的七个浓度点为依次为：10/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL、5000ng/mL。
(2)含内标的蛋白沉淀剂配制
以甲醇配制如下同位素内标母液：硝西泮-d5(NZP-d5)0.1mg/mL、奥沙西泮-13C6(OXP-13C6)1mg/mL、艾司唑仑-d5(ESL-d5)0.1mg/mL、替马西泮-d5(TMP-d5)1mg/mL、阿普唑仑-d5(APL-d5)0.01mg/mL、溴西泮-d4(BZP-d4)0.1mg/mL、劳拉西泮-d4(LZP-d4)0.1mg/mL、咪达唑仑-d7(MDZ-d7)0.1mg/mL、佐匹克隆-d8(ZPC-d8)0.1mg/mL、地西泮-d5(DZP-d5)0.1mg/mL和唑吡坦-d8(ZPM-d8)1mg/mL。
分别移取各同位素内标母液：硝西泮-d5(NZP-d5)5μL、奥沙西泮-13C6(OXP-13C6)1μL、艾司唑仑-d5(ESL-d5)5μL、替马西泮-d5(TMP-d5)1μL、阿普唑仑-d5(APL-d5)50μL、溴西泮-d4(BZP-d4)5μL、劳拉西泮-d4(LZP-d4)2μL、咪达唑仑-d7(MDZ-d7)1μL、佐匹克隆-d8(ZPC-d8)5μL、地西泮-d5(DZP-d5)20μL和唑吡坦-d8(ZPM-d8)2μL，再加入至903μL甲醇中得到1mL混合内标溶液。
取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂，详见表4。
(3)质控品配制：
取上述混合标准储备溶液以不含抗焦虑和催眠目标药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，详见表7。
QC(L)中包含：硝西泮4mg/mL、奥沙西泮10mg/mL、艾司唑仑4mg/mL、替马西泮8mg/mL、阿普唑仑1mg/mL、溴西泮4mg/mL、劳拉西泮2mg/mL、咪达唑仑1mg/mL、佐匹克隆4mg/mL、地西泮20mg/mL和唑吡坦2mg/mL；
QC(M)中包含：硝西泮40mg/mL、奥沙西泮100mg/mL、艾司唑仑40mg/mL、替马西泮80mg/mL、阿普唑仑10mg/mL、溴西泮40mg/mL、劳拉西泮20mg/mL、咪达唑仑10mg/mL、佐匹克隆40mg/mL、地西泮200mg/mL和唑吡坦20mg/mL；
QC(H)中包含：硝西泮400mg/mL、奥沙西泮1000mg/mL、艾司唑仑400mg/mL、替马西泮800mg/mL、阿普唑仑100mg/mL、溴西泮400mg/mL、劳拉西泮200mg/mL、咪达唑仑100mg/mL、佐匹克隆400mg/mL、地西泮2000mg/mL和唑吡坦200mg/mL。
(4)样品处理
1)标准品前处理：每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比1:4)，振荡5min，在14000r/min，4℃离心5min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样，进样量1μL。
2)血清样品前处理：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比1:4)，振荡5min，在14000r/min，4℃离心5min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样，进样量1μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：抗焦虑和催眠药物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗焦虑和催眠药物标准品的选择离子流色谱图；图2为血清样本中抗焦虑和催眠药物的选择离子流色谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。抗焦虑和催眠药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表9。
表9 抗焦虑和催眠药物线性回归方程及线性相关系数
Figure BDA0002518375650000151
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品，以相同步骤重复处理测定5次，结果显示，抗焦虑和催眠药物的加标回收率在88.63％-111.62％之间，5次重复试验的RSD在1.34％-7.32％范围，统计结果见表10。
表10 抗焦虑和催眠药物添加回收率结果
Figure BDA0002518375650000152
Figure BDA0002518375650000161
4.精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度抗焦虑和催眠药物标准品，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定抗焦虑和催眠药物的浓度，批内精密度为1.87-8.00％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.64-11.53％，结果见表11。
表11 批内批间精密度测试结果(浓度单位：ng/mL)
Figure BDA0002518375650000162
Figure BDA0002518375650000171
Figure BDA0002518375650000181
五、讨论
本发明采用ID-UPLC-MS/MS方法测定了人体血清中的抗焦虑和催眠药物的浓度。同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。
以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗焦虑和催眠药物的加标回收率为88.63％-111.62％之间，5次重复试验的RSD为1.34％-7.32％，准确度良好。
方法的重现性结果表明，抗焦虑和催眠药物的批内精密度为1.87-8.00％，批间精密度为2.64-11.53％。且建立的血清样品前处理过程非常简单，蛋白沉淀一步到位，血清用量仅50μL。
总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，5.0分钟之内可完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清抗焦虑和催眠药物浓度的定量分析，为临床上抗焦虑和催眠药物浓度治疗监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗焦虑和催眠药物的方法，
所述抗焦虑和催眠药物分别为：硝西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、替马西泮、阿普唑仑、溴西泮、劳拉西泮、咪达唑仑、佐匹克隆、地西泮和唑吡坦；
上述抗焦虑和催眠药物对应的同位素内标物分别为：硝西泮-d5、奥沙西泮-13C6、艾司唑仑-d5、替马西泮-d5、阿普唑仑-d5、溴西泮-d4、劳拉西泮-d4、咪达唑仑-d7、佐匹克隆-d8、地西泮-d5和唑吡坦-d8；
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述抗焦虑和催眠药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清中抗焦虑和催眠药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.01％～0.1％乙酸-0.05～0.5mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：ACQUITY UPLC CSH C18；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A和流动相B的初始比例为80～100:20～0；所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至35:65；在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由35:65匀速渐变至2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至初始比例；每个样品采集时间为5.0分钟；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为2.5kV(ESI+)；源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述流动相A和流动相B的初始比例为85～95:15～5；所述流动相A为0.01％～0.05％乙酸-0.05～0.1mM乙酸铵水溶液；流速为0.2～0.5mL/min；柱温为35～45℃；进样体积为0.2～5μL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述流动相A和流动相B的初始比例为90:10；所述流动相A为0.05％乙酸-0.1mM乙酸铵水溶液；所述流速为0.3mL/min；所述柱温为45℃；所述进样体积为1μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血清为人或动物血清。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；所述蛋白质沉淀剂为甲醇与异丙醇混合溶液；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比为1:1～5；更优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比1:4。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂，振荡3～5min，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样；所述蛋白沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比1:4。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
以甲醇配制如下同位素内标母液：硝西泮-d5 0.1mg/mL、奥沙西泮-13C6 1mg/mL、艾司唑仑-d5 0.1mg/mL、替马西泮-d5 1mg/mL、阿普唑仑-d5 0.01mg/mL、溴西泮-d40.1mg/mL、劳拉西泮-d4 0.1mg/mL、咪达唑仑-d7 0.1mg/mL、佐匹克隆-d8 0.1mg/mL、地西泮-d50.1mg/mL和唑吡坦-d8 1mg/mL；
分别移取各同位素内标母液：硝西泮-d5 5μL、奥沙西泮-13C6 1μL、艾司唑仑-d5 5μL、替马西泮-d5 1μL、阿普唑仑-d5 50μL、溴西泮-d4 5μL、劳拉西泮-d4 2μL、咪达唑仑-d7 1μL、佐匹克隆-d8 5μL、地西泮-d5 20μL和唑吡坦-d8 2μL，再加入至903μL甲醇中得到1mL混合内标溶液；
取200uL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述蛋白沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比为1:1～5；优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比为1:4。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述标准品按照如下方法制备：
将上述抗焦虑和催眠药物配制成如下浓度的标准品母液：硝西泮1mg/mL、奥沙西泮1mg/mL、艾司唑仑1mg/mL、替马西泮1mg/mL、阿普唑仑0.1mg/mL、溴西泮1mg/mL、劳拉西泮1mg/mL、咪达唑仑1mg/mL、佐匹克隆5mg/mL、地西泮1mg/mL和唑吡坦0.1mg/mL；
分别移取各标准品母液：硝西泮20μL、奥沙西泮50μL、艾司唑仑20μL、替马西泮40μL、阿普唑仑50μL、溴西泮20μL、劳拉西泮10μL、咪达唑仑5μL、佐匹克隆4μL、地西泮100μL和唑吡坦100μL，再加入至581μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液；
将上述混合标准储备溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
阿普唑仑和咪达唑仑的浓度相同，其七个浓度点为依次为：0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL；
劳拉西泮和唑吡坦的浓度相同，其七个浓度点为依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL；
硝西泮、艾司唑仑、溴西泮和佐匹克隆的浓度相同，其七个浓度点为依次为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；
替马西泮的七个浓度点为依次为：4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL；
奥沙西泮的七个浓度点为依次为：5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL、2500ng/mL；
地西泮的七个浓度点为依次为：10/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL、5000ng/mL。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，
所述空白血清基质为不含抗焦虑和催眠目标药物的空白血清。
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