CN110749690B - 一种血浆样品中度他雄胺含量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血浆样品中度他雄胺含量的检测方法，所述检测方法为采用二维液相串联质谱法测定血浆样品中度他雄胺含量。其中血浆样品前处理采用液液萃取法，萃取剂为甲基叔丁基醚。有机相为甲醇：乙腈=1:1，水相为5mM乙酸铵水溶液。首先液相“1”对磷脂类化合物与度他雄胺及其同位素内标化合物进行有效分离，然后由液相“2”将度他雄胺及其同位素内标化合物切入分析柱，并在分析柱上对度他雄胺及其同位素内标化合物进行进一步分离纯化并载入质谱检测，与此同时液相“1”加大流速和有机相比例冲洗预柱。通过有效分离磷脂类化合物与度他雄胺及其同位素内标化合物，从而避免了磷脂类化合物对度他雄胺及其同位素内标响应的抑制。本方法的检测限可以达到12.5pg/ml，灵敏度高，血浆用量少，检测快速。

Description

一种血浆样品中度他雄胺含量的检测方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种用于生物基质样品中度他雄胺含量的检测方法。
背景技术
度他雄胺是葛兰素史克（GSK）公司研制，2003年6月获FDA批准在美国上市的一种I型和II型两种同工形式甾体类5a-还原酶抑制剂，能够抑制睾酮转化成5α-二氢睾酮，是一种新型的治疗良性前列腺增生的药物，可减少急性尿潴留和减少良性前列腺增生手术治疗。
文献1（Drug research (2018), 68(4), 238-240）公开了一种测量血浆中度他雄胺的检测方法，采用一维液相，血浆用量多达1ml。文献2（Talanta (2015), 131, 728-735）公开了一种测量血浆中度他雄胺的检测方法，采用一维液相，提取方法为固相萃取法，样品采集时间长达18min。由于一维液相不能有效的将磷脂类化合物排除废液，导致磷脂类化合物残留在系统中，抑制度他雄胺响应，降低了度他雄胺的灵敏度，从而所需血浆用量较大，或样品采集时间较长，前处理复杂等缺点。
发明内容
为解决上述血浆用量较大、样品采集时间长、前处理复杂等问题，本发明提供了一种快速、灵敏、便捷的检测血浆样品中度他雄胺含量的生物检测方法。
本发明提供了一种血浆样品中度他雄胺含量的检测方法，所述的检测方法为二维液相串联质谱法；其中，所述二维液相由液相“1”和液相“2”组成；所述二维液相串联质谱法包括液相“1”、液相“2”、预柱、分析柱和质谱；所述的分析方法包括如下步骤：
1）流路1状态下，液相“1”与预柱连通；液相“2” 与分析柱和质谱连通；液相“1”将分析物载入预柱并对分析物和磷酯类化合物等生物基质进行粗步分离（流路1见图1）；
2）流路2状态下，液相“1”不与预柱连通；液相“2”与预柱、分析柱和质谱连通；液相“2”将分析物切入分析柱（流路2见图2）；
3）流路1状态下，液相“1”与预柱连通；液相“2”与分析柱和质谱连通；液相“2”对分析物进一步分离纯化并载入质谱进行检测；
所述分析物为包含度他雄胺和内标的样品；
所述液相“1”的流动相是由水相1和有机相1组成；所述液相“2”的流动相是由水相2和有机相2组成；
所述水相1和水相2各自独立选自乙酸铵水溶液、甲酸铵水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液、水和氨水溶液中一种，优选乙酸铵水溶液、或甲酸铵水溶液；
其中，乙酸铵水溶液选自1-50mM乙酸铵水溶液，优选3-20mM乙酸铵水溶液，进一步优选5-10mM乙酸铵水溶液；
其中，甲酸铵水溶液选自1-50mM甲酸铵水溶液，优选3-20mM甲酸铵水溶液，进一步优选5-10mM甲酸铵水溶液；
所述有机相1和有机相2各自独立地选自甲醇、乙腈、甲醇乙腈混合溶液中一种，优选甲醇乙腈混合溶液；
其中，甲醇乙腈混合溶液选自甲醇：乙腈=1:9—9:1（体积比），优选2:8—8:2（体积比），进一步优选4:6—6:4（体积比）；
所述液相“1”的初始有机相1比例为45-60%（体积%），其中详细的梯度洗脱程序为：
Figure 207623DEST_PATH_IMAGE002
所述液相“2”的初始有机相2比例为65-80%（体积%），其中详细的洗脱程序为：
Figure 289543DEST_PATH_IMAGE004
所述液相“1”的流速为0.6-1.0ml/min；
所述液相“2”的流速为0.6-1.0ml/min；
所述分析柱选自十八烷基硅烷键合硅胶填充剂填充的色谱柱；
所述预柱选自十八烷基硅烷键合硅胶填充剂填充的保护柱；
所述二维液相串联质谱法中的柱温为35-45℃、进样盘温度为4-15℃。
所述血浆样品的前处理方法选自液液萃取法、蛋白沉淀法、固相萃取法；
所述液液萃取法为从含有内标溶液的血浆样品中提取度他雄胺及内标，得度他雄胺和内标混合提取液，再将度他雄胺和内标混合提取液吹干，加入复溶剂复溶后用二维液相串联色谱法进行分析检测；
所述萃取剂选自甲基叔丁基醚、正己烷、甲基叔丁基醚二氯甲烷混合溶剂、甲基叔丁基醚正己烷混合溶剂、甲基叔丁基醚二氯甲烷正己烷混合溶剂，优选甲基叔丁基醚、甲基叔丁基醚二氯甲烷混合溶剂、甲基叔丁基醚正己烷混合溶剂；
其中，甲基叔丁基醚二氯甲烷混合溶剂选自甲基叔丁基醚：二氯甲烷=10:0.5—10:3（体积比），优选10:1.5—10:2.5（体积比）；
其中，甲基叔丁基醚正己烷混合溶剂选自甲基叔丁基醚：正己烷=1:9—7:3（体积比），优选1:9—3:7（体积比）；
所述内标选自同位素内标、非同位素内标，优选同位素内标；
所述内标溶液的溶剂选自甲醇、乙腈，优选甲醇；
所述度他雄胺和内标混合提取液经冷冻吹干后，用复溶剂复溶；
所述复溶剂选自乙腈水溶液、甲醇水溶液、乙腈甲醇水溶液、乙腈甲酸水溶液、乙腈乙酸水溶液、甲醇甲酸水溶液、甲醇乙酸水溶液、甲醇乙腈甲酸水溶液、甲醇乙腈乙酸水溶液，优选乙腈水溶液
其中，乙腈水溶液选自20 -80%（体积%）乙腈水溶液，优选40 -60%（体积%）乙腈水溶液。
附图说明
图1表示的是流路1状态下，液相“2”经分析柱与质谱仪（MS）连通，液相“1”与预柱连通；
图2表示的是流路2状态下，液相“2”经预柱与分析柱以及质谱仪（MS）连通；
图3表示的是LLOQ 浓度水平的样品；
图4表示的是低浓度水平的样品；
图5表示的是中浓度水平的样品；
图6表示的是高浓度水平的样品。
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
1）1.000µg/ml的度他雄胺工作溶液的制备：精密称取2.00mg度他雄胺于西林瓶中，加入20.000ml甲醇溶解混匀，配制成浓度为100.00µg/ml的初始贮备液。移取1.000ml100.00µg/ml的初始贮备液于西林瓶中，加入9.000ml甲醇，配制成浓度为10.00µg/ml的度他雄胺二级贮备液。移取2.000ml 10.00µg/ml的度他雄胺二级贮备液于西林瓶中，加入18.000ml甲醇，配制成1.000µg/ml度他雄胺工作溶液（配制2份，一份用于配制标准曲线样品，另一份用于配制质控样品）。
2）20.00ng/ml度他雄胺-13C6工作溶液的配制：度他雄胺-13C6瓶装标示量为1mg，加入10.000ml甲醇，溶解混匀，配制成浓度为100.0µg/ml的初始贮备液。移取1.000ml100.00µg/ml的初始贮备液于西林瓶中，加入9.000ml甲醇，配制成浓度为10.00µg/ml的度他雄胺-13C6二级贮备液。移取0.500ml 10.00µg/ml的度他雄胺-13C6二级贮备液于西林瓶中，加入9.500ml甲醇，配制成浓度为0.500µg/ml的度他雄胺-13C6三级贮备液。移取0.800ml0.500µg/ml的度他雄胺-13C6三级贮备液于西林瓶中，加入19.200ml甲醇，配制成浓度为20.00ng/ml的度他雄胺-13C6工作溶。
3）标准曲线样品配制：
Figure 207296DEST_PATH_IMAGE006
按照上述表格配制度他雄胺标准曲线CAL1—CAL9）样品。
4）质控样品配制：
Figure 336926DEST_PATH_IMAGE008
按照上述表格配制度他雄胺质控（QC0—QC3）样品。
5）血浆样品前处理：取100ul标准曲线样品、质控样品、RB（H2O）、RB/IS、PB（空白基质）、PB/IS、CB（空白基质）于短玻璃中，在标准曲线样品、质控样品、RB/IS、PB/IS中加入50uL的内标工作溶液（20.00ng/ml,溶剂：甲醇），在RB、PB、CB中加入50uL的甲醇，混匀；加入200uL水，混匀；加入1.500mL甲基叔丁基醚，涡旋5min；将样品转移至离心机中3000rpm离心3min；将离心后的样品转移至冷肼冷冻，待水相冻结实后，将上清液倾倒至长玻璃管中，得度他雄胺和度他雄胺-13C6的混合提取液；将度他雄胺和度他雄胺-13C6的混合提取液转移至浓缩仪中40℃，氮气吹干；向浓缩后的样品管中加入50%乙腈水溶液200uL复溶，混匀；加入96孔板，待L-MS/MS检测。
6）流动相的配制：1M乙酸铵水溶液：称量约7.7g乙酸铵至试剂瓶中，量取100ml水于试剂瓶中，溶解，混合。
水相：量取995ml水、移取5ml的1M乙酸铵水溶液至试剂瓶中摇匀超声；
有机相：量取1000ml甲醇、1000ml乙腈于试剂瓶中摇匀超声；
洗针液R0、R3的配制：量取1300ml甲醇、1300ml乙腈、1300ml异丙醇至试剂瓶中混匀超声。
7）仪器设备与条件：仪器设备：质谱：AB Sciex API 6500+；溶液输送单元：Shimadzu LC-30AD（液相“2”）；Shimadzu LC-20AT（液相“1”）；脱气机：Shimadzu DGU-20A5R；柱温箱： Shimadzu CTO-30A；自动进样器： Shimadzu SIL-30ACMP；系统控制器：Shimadzu CBM-20A；数据采集软件及版本：Analyst，Version 1.6.3；数据处理软件及版本：Microsoft Office 2013、Watson LIMS Version 7.5。仪器条件：离子源：ESI；IS：5000.0V；CUR：40 psi；GS1：45psi；GS2：45 psi；TEM：500.0℃；CAD：10 psi；DP：60.0 V；EP：10.0 V；CXP：10.0 V；CE： 48.0 V；采集模式：ESI、正离子、MRM；色谱柱：Pursuit 3 C18/3um,3.0*50mm；保护柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18 /2.1*12.5mm,5um;4-pack；柱温：40°C；自动进样器温度：15°C；
质量数：
Figure 151298DEST_PATH_IMAGE010
液相“1”（LC-20AT）的洗脱梯度：
Figure 973760DEST_PATH_IMAGE012
备注：初始流速：0.6000mL/min；初始有机相比例：55%；Pump B Conc.3代表LC-20AT泵比例，Total Flow 3代表LC-20AT泵的总流速；
液相“2”（LC-30AD）的洗脱梯度：
Figure 178477DEST_PATH_IMAGE014
备注：初始流速：0.6000mL/min；初始有机相比例：70%；Pump B Conc.代表LC-30AD泵比例，Total Flow 1代表LC-30AD泵的总流速；
0-0.9min为流路1；0.9-1.2min为流路2；1.2-5min为流路1。
8）实验结果
曲线的r2=0.9987；曲线的平均Bias为2.44%，S.D.为1.86%；QC0的平均Bias为-6.40%，RSD为9.83%；QC1的平均Bias为7.33%，RSD为11.90%；QC2a的平均Bias为5.20%，RSD为5.46%；QC2b的平均Bias为2.00%，RSD为1.57%；QC3的平均Bias为2.50%，RSD为0.95%；无残留（各浓度水平的样品的图谱见图3-6）。
9）方法验证的相关结果
精密度、准确度、回收率情况：
Figure 377377DEST_PATH_IMAGE016
选择性情况：
Figure 46256DEST_PATH_IMAGE018
耐用性情况：
Figure 39620DEST_PATH_IMAGE020
稳定性情况：
Figure 934894DEST_PATH_IMAGE022
。
实施例2
1）流动相的配制：1M甲酸铵水溶液: 称量约7.7g甲酸铵至试剂瓶中，量取100ml水于试剂瓶中，溶解，混合。水相：量取995ml水、移取5ml的1M甲酸铵水溶液至试剂瓶中摇匀超声；
2）其余条件同“实施例1”；
3）实验结果：曲线的r2=0.9901；曲线的平均Bias为1.89%，S.D.为2.75%；QC0的平均Bias为7.32%，RSD为10.03%；QC1的平均Bias为2.34%，RSD为7.12%；QC2a的平均Bias为4.35%，RSD为8.19%；QC2b的平均Bias为5.78%，RSD为5.23%；QC3的平均Bias为3.12%，RSD为4.56%；无残留。
实施例3
1）流动相的配制
水相：量取990ml水、移取10ml的1M乙酸铵水溶液至试剂瓶中摇匀超声；
2）其余条件同“实施例1”；
3）实验结果：曲线的r2=0.9921；曲线的平均Bias为2.13%，S.D.为2.45%；QC0的平均Bias为3.15%，RSD为6.79%；QC1的平均Bias为4.67%，RSD为8.19%；QC2a的平均Bias为5.23%，RSD为9.17%；QC2b的平均Bias为8.19%，RSD为4.87%；QC3的平均Bias为5.12%，RSD为1.25%；无残留。
实施例4
1）流动相的配制
水相：量取990ml水、移取10ml的1M甲酸铵水溶液至试剂瓶中摇匀超声；
2）其余条件同“实施例1”；
3）实验结果：曲线的r2=0.9985；曲线的平均Bias为2.67%，S.D.为1.23%；QC0的平均Bias为2.85%，RSD为1.47%；QC1的平均Bias为2.98%，RSD为4.76%；QC2a的平均Bias为3.98%，RSD为5.47%；QC2b的平均Bias为3.76%，RSD为3.81%；QC3的平均Bias为4.53%，RSD为3.78%；无残留。
实施例5
1）流动相的配制
有机相：量取1200ml甲醇、800ml乙腈于试剂瓶中摇匀超声；
2）液相条件
液相“1”（LC-20AT）的洗脱梯度：
Figure 671906DEST_PATH_IMAGE024
备注：初始流速：0.6000mL/min；初始有机相比例：60%；Pump B Conc.3代表LC-20AT泵比例，Total Flow 3代表LC-20AT泵的总流速；
液相“2”（LC-30AD）的洗脱梯度：
Figure 195291DEST_PATH_IMAGE026
备注：初始流速：0.6000mL/min；初始有机相比例：75%；Pump B Conc.代表LC-30AD泵比例，Total Flow 1代表LC-30AD泵的总流速；
3）其余条件同“实施例1”
4）实验结果：曲线的r2=0.9972；曲线的平均Bias为3.07%，S.D.为2.24%；QC0的平均Bias为1.05%，RSD为1.67%；QC1的平均Bias为1.98%，RSD为5.03%；QC2a的平均Bias为3.83%，RSD为3.43%；QC2b的平均Bias为2.71%，RSD为2.89%；QC3的平均Bias为5.03%，RSD为2.79%；无残留。
实施例6
1）流动相的配制
有机相：量取800ml甲醇、1200ml乙腈于试剂瓶中摇匀超声；
2）液相条件
液相“1”（LC-20AT）的洗脱梯度：
Figure 625136DEST_PATH_IMAGE028
备注：初始流速：0.6000mL/min；初始有机相比例：45%；Pump B Conc.3代表LC-20AT泵比例，Total Flow 3代表LC-20AT泵的总流速；
3）其余条件同“实施例1”
4）实验结果：曲线的r2=0.9987；曲线的平均Bias为2.07%，S.D.为2.57%；QC0的平均Bias为4.19%，RSD为2.34%；QC1的平均Bias为4.78%，RSD为5.67%；QC2a的平均Bias为3.92%，RSD为4.43%；QC2b的平均Bias为5.11%，RSD为4.09%；QC3的平均Bias为3.72%，RSD为4.56%；无残留。
实施例7
1）血浆样品前处理
取100ul标准曲线样品、质控样品、RB（H2O）、RB/IS、PB（空白基质）、PB/IS、CB（空白基质）于短玻璃中，在标准曲线样品、质控样品、RB/IS、PB/IS中加入50uL的内标工作溶液（20.00ng/ml,溶剂：甲醇），在RB、PB、CB中加入50uL的甲醇，混匀；加入200uL 5%氨水溶液，混匀；加入1.500mL甲基叔丁基醚，涡旋5min；将样品转移至离心机中3000rpm离心3min；将离心后的样品转移至冷肼冷冻，待水相冻结实后，将上清液倾倒至长玻璃管中，得度他雄胺和度他雄胺-13C6的混合提取液；将度他雄胺和度他雄胺-13C6的混合提取液转移至浓缩仪中40℃，氮气吹干；向浓缩后的样品管中加入50%甲醇水溶液200uL复溶，混匀；加入96孔板，待L-MS/MS检测；
2）其余条件同“实施例1”；
3）实验结果：曲线的r2=0.9975；曲线的平均Bias为4.15%，S.D.为3.23%；QC0的平均Bias为8.79%，RSD为1.24%；QC1的平均Bias为7.08%，RSD为3.71%；QC2a的平均Bias为5.94%，RSD为5.41%；QC2b的平均Bias为2.15%，RSD为1.81%；QC3的平均Bias为5.32%，RSD为4.15%；无残留。
实施例8
1）血浆样品前处理
取100ul标准曲线样品、质控样品、RB（H2O）、RB/IS、PB（空白基质）、PB/IS、CB（空白基质）于短玻璃中，在标准曲线样品、质控样品、RB/IS、PB/IS中加入50uL的内标工作溶液（20.00ng/ml，溶剂：甲醇），在RB、PB、CB中加入50uL的甲醇，混匀；加入200uL水，混匀；加入1.500mL甲基叔丁基醚：正己烷=2：8，涡旋5min；将样品转移至离心机中3000rpm离心3min；将离心后的样品转移至冷肼冷冻，待水相冻结实后，将上清液倾倒至长玻璃管中，得度他雄胺和度他雄胺-13C6的混合提取液；将度他雄胺和度他雄胺-13C6的混合提取液转移至浓缩仪中40℃，氮气吹干；向浓缩后的样品管中加入40%乙腈水溶液200uL复溶，混匀；加入96孔板，待L-MS/MS检测；
2）其余条件同“实施例1”；
3）实验结果：曲线的r2=0.9894；曲线的平均Bias为1.45%，S.D.为5.13%；QC0的平均Bias为2.15%，RSD为9.17%；QC1的平均Bias为2.87%，RSD为3.76%；QC2a的平均Bias为4.35%，RSD为5.18%；QC2b的平均Bias为4.76%，RSD为9.01%；QC3的平均Bias为5.63%，RSD为2.85%；无残留。
实施例9
1）血浆样品前处理
取100ul标准曲线样品、质控样品、RB（H2O）、RB/IS、PB（空白基质）、PB/IS、CB（空白基质）于短玻璃中，在标准曲线样品、质控样品、RB/IS、PB/IS中加入50uL的内标工作溶液（20.00ng/ml,溶剂：甲醇），在RB、PB、CB中加入50uL的甲醇，混匀；加入200uL水，混匀；加入1.500mL甲基叔丁基醚：二氯甲烷=10:2，涡旋5min；将样品转移至离心机中3000rpm离心3min；将离心后的样品转移至冷肼冷冻，待水相冻结实后，将上清液倾倒至长玻璃管中，得度他雄胺和度他雄胺-13C6的混合提取液；将度他雄胺和度他雄胺-13C6的混合提取液转移至浓缩仪中40℃，氮气吹干；向浓缩后的样品管中加入40%乙腈水溶液200uL复溶，混匀；加入96孔板，待L-MS/MS检测；
2）其余条件同“实施例1”；
3）实验结果：曲线的r2=0.9903；曲线的平均Bias为2.35%，S.D.为6.72%；QC0的平均Bias为5.73%，RSD为6.08%；QC1的平均Bias为3.56%，RSD为3.76%；QC2a的平均Bias为4.05%，RSD为4.32%；QC2b的平均Bias为5.84%，RSD为7.23%；QC3的平均Bias为7.01%，RSD为4.35%；无残留。

Claims (1)

1.一种血浆样品中度他雄胺含量的检测方法，其特征在于所述的检测方法为二维液相串联质谱法；所述二维液相由液相“1”和液相“2”组成；所述二维液相串联质谱法包括液相“1”、液相“2”、预柱、分析柱和质谱；液相“1”的溶液输送单元为LC-20AT，液相“2”的溶液输送单元为LC-30AD；所述的检测方法包括如下步骤：
1)流路1状态下，液相“1”与预柱连通；液相“2”与分析柱和质谱连通；液相“1”将分析物载入预柱；
2)流路2状态下，液相“1”不与预柱连通；液相“2”与预柱、分析柱和质谱连通；液相“2”将分析物切入分析柱；
3)流路1状态下，液相“2”对分析物进行分离纯化并载入质谱检测；
所述分析物为包含度他雄胺和内标的血浆样品；所述的分析柱为Pursuit 3 C18/3um,3.0*50mm；预柱为ZORBAX Eclipse Plus-C18/2.1*12.5mm,5um；
所述液相“1”是由水相1和有机相1组成；所述液相“2”是由水相2和有机相2组成；所述的水相1和水相2配制为量取995ml水、移取5ml的1M乙酸铵水溶液至试剂瓶中摇匀超声；所述的有机相1和有机相2配制为量取1000ml甲醇、1000ml乙腈于试剂瓶中摇匀超声；前处理的方法采用液液萃取法；所述液液萃取法为从含有内标溶液的血浆样品中提取度他雄胺及内标，得度他雄胺和内标混合提取液，再将度他雄胺和内标混合提取液吹干，加入复溶剂复溶后进行二维液相串联色谱法分析检测；萃取剂为甲基叔丁基醚；液相“1”的洗脱梯度为
时间 模块 事件 B％ 0.30 Pumps Pump B Conc.3 55 0.50 Pumps Pump B Conc.3 70 1.30 Pumps Pump B Conc.3 70 1.50 Pumps Pump B Conc.3 95 1.50 Pumps Total Flow 3 0.6 1.60 Pumps Total Flow 3 1.0 3.10 Pumps Pump B Conc.3 95 3.20 Pumps Pump B Conc.3 55 3.20 Pumps Total Flow 3 1.0 3.30 Pumps Total Flow 3 0.6 5.00 Controller Stop -
初始流速为0.6000mL/min；初始有机相比例为55％；Pump B Conc.3代表LC-20AT泵比例，Total Flow 3代表LC-20AT泵的总流速；液相“2”洗脱梯度为
Figure FDA0003468129260000011
Figure FDA0003468129260000021
初始流速为0.6000mL/min；初始有机相比例为70％；Pump B Conc.代表LC-30AD泵比例，Total Flow 1代表LC-30AD泵的总流速；0-0.9min为流路1：0.9-1.2min为流路2：1.2-5min为流路1。
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