CN113030352B - 一种厄贝沙坦中nmba含量的测定分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种厄贝沙坦中N‑亚硝基‑N‑甲基‑4‑氨基丁酸(以下简称NMBA)含量的测定分析方法，该方法直接用高效液相色谱‑质谱联用仪测定厄贝沙坦中NMBA的含量。该分析方法与现有技术相比具有专一性好,重现性好，灵敏度极高，适合做痕量分析等特点。

Description

一种厄贝沙坦中NMBA含量的测定分析方法
技术领域
本发明涉及用高效液相色谱-质谱联用仪直接测定出厄贝沙坦中N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(以下简称NMBA)的含量。此方法能较好的控制厄贝沙坦痕量NMBA含量，为患者的健康安全用药提供保障，属于医药技术领域。
技术背景
厄贝沙坦，化学名2-丁基-3-[4-[2-(1H-四唑-5-基)苯基]苄基]-1，3-二氮杂螺-[4,4]壬-1-烯-4-酮。
厄贝沙坦是一种治疗原发性高血压，合并高血压的2型糖尿病肾病的药物。在厄贝沙坦工艺中，残留溶剂N-甲基吡咯烷酮(以下简称NMP)与亚硝酸盐可能形成杂质NMBA。根据ICH M7指导原则，NMBA归为第一类基因毒性物质，TD50＝0.982mg/kg/day。转换成PDE为0.98μg/day，基于厄贝沙坦的日剂量300mg/day，计算出NMBA限度值为3.2ppm。然而，根据美国FDA的最新要求，厄贝沙坦中NMBA杂质含量被特定地降低10倍至0.32ppm。NMBA结构如下：
准确定量地测定厄贝沙坦中痕量的NMBA含量极具挑战性。很难采用气相、液相色谱等对其进行痕量直接测定。
目前，测定厄贝沙坦中NMBA含量的方法只有采用经典的色谱法,其专一性、灵敏度、方法精密度和重复性都存在很大的缺陷，不能提供可靠的痕量分析结果。为了克服原方法的缺陷，本发明采用高效液相色谱-质谱联用仪直接测定厄贝沙坦中NMBA的含量。该分析方法具有操作简单、专一性好、灵敏极高、重现性好等特点。
发明内容
如上所述，直接准确定量测定痕量NMBA存在各种缺陷。最直接提高灵敏度的手段为增大进样体积和/或增加API浓度。但是，厄贝沙坦仅能溶解在非极性溶剂中，而NMBA极性大，在反相柱上保留必须用高比例水相流动相，因为稀释剂和流动相存在较大的极性差异，增大进样体积易造成了显著的“强溶剂效应”使峰展宽裂分，反而降低了灵敏度。另外，己有方法中厄贝沙坦的浓度已接近上限，无再增加的空间。为了在原HPLC-MS方法基础上，增加对NMBA的检测灵敏度，我们利用厄贝沙坦高脂溶性，以及NMBA在碱性水溶液中高溶解性的理化特征，增加了样品预处理技术环节。先将厄贝沙坦以较高的浓度溶解于非极性溶剂，例如乙酸乙酯，二氯甲烷等，再用较少量的碱性水溶液将NMBA以羧酸负离子状态萃取至水相，该过程中，在水相中能高效地富集厄贝沙坦中的NMBA，而水相中几乎不含厄贝沙坦。另外，由于样品稀释剂为纯水相，与高比例水相流动相不会产生“强溶剂效应”，还可以增大进样体积而不会发生峰展宽与裂分现象。样品富集预处理结合增大进样量可极大的提高了方法的灵敏性。
通过试验发现厄贝沙坦在乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂中有非常好的溶解性。本发明将用乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂作为样品的稀释剂。
本发明涉及一种厄贝沙坦中NMBA含量的测定分析方法，该方法为直接用高效液相色谱-质谱联用仪测定厄贝沙坦中NMBA的含量。
上述样品配制中用乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂将样品溶解，选用碳酸氢钠溶液萃取。
上述采用高效液相色谱-质谱联用仪，正离子选择离子模式。
该方法包括以下几个步骤：
(1)取厄贝沙坦粉末或制剂粉末，以乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂作为稀释液溶解样品，加入碳酸氢钠萃取。
(2)采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.02％-0.5％七氟丁酸水溶液和乙腈，进行梯度洗脱。
(3)梯度为0-10min，流动相B比例为5％-12％，7-15min，流动相B比例为95％。
(4)设置流动相流速为0.3-1.5mL/min，柱温控制在25℃-50℃之间。
(5)取步骤(1)的样品溶液2-50μL，进样，记录质谱总离子流图。
(6)采用质谱检测器，离子模式选择正离子，取(1)的萃取后的水层清液进样，记录NMBA质谱离子流图。
本发明采用的技术方案如下：
样品前处理：
稀释液：采用分析级的乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂。
NMBA标准溶液：用稀释液精密配制15.0ng/mL的NMBA溶液。
样品溶液：精密称取100.0mg样品于20mL的顶空瓶中，加入约15mL的乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂溶解完全后，精确加入2.0mL的碳酸氢钠溶液进行萃取，进样。
本发明使用色谱柱为：十八烷基硅烷键合硅胶填料。流速：0.3-1.5mL/min。柱温：25℃-50℃。流动相A：0.02％-0.5％七氟丁酸水溶液；流动相B：乙腈。
梯度如下：
时间 流动相A 流动相B
0min 92％ 8％
6.5min 92％ 8％
6.6min 5％ 95％
13.0min 5％ 95％
13.1min 92％ 8％
23.0min 92％ 8％
质谱条件：
附图说明：
附图1：根据本发明实施例1得到的NMBA质谱棒图；
附图2：根据本发明实施例1得到的NMBA标准品质谱总离子流图；
附图3：根据本发明实施例2得到的厄贝沙坦样品质谱总离子流图；
附图4：根据本发明实施例3得到的厄贝沙坦样品加样回收率质谱总离子流图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合本发明的具体实施例作进一步说明，但其不限制于本发明。
实施例一
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
流动相A：0.02％-0.5％七氟丁酸水溶液
流动相B：乙腈
流速：0.3-1.5mL/min
柱温：25℃-50℃
梯度如下：
时间 流动相A 流动相B
0min 92％ 8％
6.5min 92％ 8％
6.6min 5％ 95％
13.0min 5％ 95％
13.1min 92％ 8％
23.0min 92％ 8％
质谱条件：
实验步骤：
1)稀释液：1-100mM碳酸氢钠水溶液(称取适量的碳酸氢钠，精密称定于容量瓶中，先加入超纯水定容，超声溶解。)
2)萃取空白溶液：移取15mL的乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂于25mL的顶空瓶，再精密移取2.0mL的稀释液，拧紧盖子，剧烈振摇萃取3分钟，静置待分层，移取水相作为萃取空白溶液。
3)标准储备溶液：称取30.0mg NMBA标准品，精密称定于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释到刻度，混匀；准确移取100μL到10mL容量瓶中，用乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂稀释到刻度，混匀；准确移取100μL到10mL容量瓶中，用乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂稀释到刻度，混匀。(NMBA浓度：300.0ng/mL)
4)标准溶液：准确移取100μL标准储备溶液到25mL顶空瓶中，加入约15mL的乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂，精密移取2.0mL的标准溶液，拧紧盖子，剧烈振摇萃取3分钟，静置待分层，取水相待进样。(NMBA浓度：15.0ng/mL)。记录质谱棒图，见典型图1。记录NMBA质谱总离子流图，见典型图2。
实施例二
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
流动相A：0.02％-0.5％七氟丁酸水溶液
流动相B：乙腈
流速：0.3-1.5mL/min
柱温：25℃-50℃
梯度如下：
时间 流动相A 流动相B
0min 92％ 8％
6.5min 92％ 8％
6.6min 5％ 95％
13.0min 5％ 95％
13.1min 92％ 8％
23.0min 92％ 8％
质谱条件：
实验步骤
1)稀释液：1-100mM碳酸氢钠水溶液(称取适量的碳酸氢钠，精密称定于容量瓶中，先加入超纯水定容，超声溶解。)
2)萃取空白溶液：移取15mL的乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂于25mL的顶空瓶，再精密移取2.0mL的稀释液，拧紧盖子，剧烈振摇萃取3分钟，静置待分层，移取水相作为萃取空白溶液。
3)供试品溶液：称取100.0mg厄贝沙坦供试品，精密称定于25mL顶空瓶，加入15mL乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂超声溶解，精密移取2.0mL的稀释液，拧紧盖子，剧烈振摇萃取3分钟，静置待分层，取水相即为供试品溶液。(供试品浓度：50.0mg/mL)记录NMBA质谱总离子流图，见典型图3。
实施例三
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
流动相A：0.02％-0.5％七氟丁酸水溶液
流动相B：乙腈
流速：0.3-1.5mL/min
柱温：25℃-50℃
梯度如下：
时间 流动相A 流动相B
0min 92％ 8％
6.5min 92％ 8％
6.6min 5％ 95％
13.0min 5％ 95％
13.1min 92％ 8％
23.0min 92％ 8％
质谱条件：
实验步骤
1)稀释液：1-100mM碳酸氢钠水溶液(称取适量的碳酸氢钠，精密称定于容量瓶中，先加入超纯水定容，超声溶解。)
2)萃取空白溶液：移取15mL的乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂于25mL的顶空瓶，再精密移取2.0mL的稀释液，拧紧盖子，剧烈振摇萃取3分钟，静置待分层，移取水相作为萃取空白溶液。
3)回收率溶液：称取100mg厄贝沙坦供试品，精密称定于25mL顶空瓶，准确加入100μL标准储备溶液，加入约15mL乙酸乙酯，二氯甲烷等非极性溶剂超声溶解，精密移取2.0mL的稀释液，拧紧盖子，剧烈振摇萃取3分钟，静置待分层，取水相即为回收率溶液。(供试品浓度：50.0mg/mL；NMBA浓度：15.0ng/mL)记录NMBA质谱总离子流图，见典型图4。

Claims (1)

1.一种厄贝沙坦中N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(NMBA)含量的测定分析方法，其特征在于直接用高效液相色谱-质谱联用仪测定厄贝沙坦中痕量的杂质NMBA的含量；
该方法包括以下几个步骤：
(1)取厄贝沙坦粉末或制剂粉末，以乙酸乙酯或二氯甲烷作为稀释液溶解样品，加入碳酸氢钠溶液萃取；
(2)采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为0.02％-0.5％七氟丁酸水溶液和乙腈，进行梯度洗脱；
(3)梯度为：
时间 流动相A 流动相B 0min 92％ 8％ 6.5min 92％ 8％ 6.6min 5％ 95％ 13.0min 5％ 95％ 13.1min 92％ 8％ 23.0min 92％ 8％
；
(4)设置流动相流速为0.3-1.5mL/min，柱温控制在25℃-50℃之间；
(5)取步骤(1)的样品溶液2-50μL，进样，记录质谱总离子流图；
(6)采用质谱检测器，离子模式选择正离子，取步骤(1)的萃取后的水层清液进样，记录NMBA质谱离子流图。
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