CN109632981A

CN109632981A - 一种液质联用检测2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物的方法

Info

Publication number: CN109632981A
Application number: CN201811364284.7A
Authority: CN
Inventors: 胡研; 黄勤琴; 陈伊杰; 蒋竞; 赵初芒
Original assignee: Changzhou Hequan Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Changzhou Hequan Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2019-04-16

Abstract

本发明公开一种液质联用检测2,2,6,6‑四甲基哌啶氮氧化物的方法，包括：步骤1)配制供试品溶液和对照品储备液；步骤2)取供试品溶液和一定浓度梯度的对照品储备液分别进样，用高效液相色谱‑质谱仪进行检测，记录色谱图；步骤3)对照品储备液的各质量浓度及色谱图峰面积进行线性回归分析，得回归方程和相关系数，制作出标准曲线；利用供试品溶液的色谱图中2,2,6,6‑四甲基哌啶氮氧化物的峰面积，按外标法计算获得2,2,6,6‑四甲基哌啶氮氧化物的含量。本发明提供的方法是本领域首次开发出的2,2,6,6‑四甲基哌啶氮氧化物的检测方法，该方法检测结果准确，灵敏度高，稳定性好，检测限低，完全满足本领域对基因毒性杂质的检测要求。

Description

一种液质联用检测2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物的方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种采用液质联用技术检测药品中2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物含量的方法。

背景技术

2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物，化学名2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy(TEMPO)，是一种典型的哌啶类氮氧自由基，在化学、生物学、食品工业、农业等领域都有较为广泛的应用，主要作为催化剂合成药品以及医药中间体。在有机合成中，2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物能催化过氧化氢、氧气和次氯酸钠等绿色氧化剂在温和条件下将伯醇和仲醇定量氧化为醛和酮，该反应具有高选择性，将伯醇氧化为醛，不再氧化至羧酸，将仲醇氧化为酮，同时2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物自身被还原为2,2,6,6-四甲基哌啶基-1-醇。其结构式如下：

但是，基于结构毒性相关性理论，2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物属于潜在的基因毒性杂质，根据国际药品协调会议(ICH)关于基因毒性杂质的指导原则要求，基因毒性杂质严重威胁人类健康，一般使用被定义为毒理学关注阈值(TTC)的方法来评估基因毒性杂质在原料药中的可接受限度，而一个1.5μg/day的TTC值，即相当于每天摄入1.5μg的基因毒性杂质，被认为对于大多数药品来说是可以接受的风险(一生中致癌风险小于十万分之一)。按照这个阈值，可以根据预期的每日摄入量计算出原料药中可接受的基因毒性杂质水平。因此如果某种可能含有2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物的药品的日剂量为200mg，那么其TTC水平为7.5ppm,如果日剂量更高，那么TTC水平更低，因此需要建立一种快速、高效且高灵敏度的方法测定药品中2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物残留。目前尚未见文献报道该化合物的相关检测方法，由于2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物只有很弱的紫外吸收，采用高效液相-紫外检测器，由于条件缺陷，检测结果不准确，灵敏度低，在定量检测方面具有很大的局限性。而2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物越来越多的应用于有机合成中，鉴于此，急需建立一种操作简单，结果准确，灵敏度高，可用于药品及医药中间体中基因毒性杂质2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物残留含量的测定方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，克服现有技术的缺陷，提供一种具有操作简单、精密度好、回收率高、检测限低的特点的测定2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物含量的液质联用方法，可用于药品中基因毒性杂质2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物残留的质量控制。

为解决上述技术问题，本发明提供一种液质联用检测2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物的方法，用高效液相色谱-质谱仪进行检测，采用外标法定量法分析，具体包括以下步骤：

步骤1)配制供试品溶液和对照品储备液：以乙腈、水、抗坏血酸钠的混合液为溶剂，对待测样品进行溶解和定容，获得供试品溶液；以乙腈、水、抗坏血酸钠的混合液为溶剂，对2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物标准品进行溶解和定容，配制得到一定浓度梯度的对照品储备液；

步骤2)取供试品溶液和一定浓度梯度的对照品储备液分别进样，用高效液相色谱-质谱仪进行检测，记录色谱图；其中，

色谱条件为：色谱柱为Waters Xbridge Phenyl 150×4.6mm,3.5μm；流动相A为含体积分数0.05％～0.2％甲酸的水溶液；流动相B为含体积分数0.05％～0.2％甲酸的乙腈溶液；采用梯度洗脱程序：0～6分钟，流动相A从体积分数90％降至10％，流动相B从体积分数10％升至90％；6～8分钟，流动相A保持为10％，流动相B保持为90％；8～8.1分钟，流动相A从10％升至90％，流动相B从90％降至10％；8.1～10分钟，流动相A保持为90％，流动相B保持为10％；柱温为20～45℃；流速为0.2～1.2mL/min；进样量为0.2～10μL；

质谱条件为：电离源为电喷雾(ESI)电离源，采用正离子扫描模式；

步骤3)将一定浓度梯度的对照品储备液的各浓度数据及色谱图峰面积进行线性回归分析，得回归方程和相关系数，制作出标准曲线；利用供试品溶液的色谱图中2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物的峰面积，按外标法计算获得2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物的含量。

具体的，所述步骤1)中，乙腈和水的体积比为(1～10):1，抗坏血酸钠的摩尔浓度为1～5mmol/L。

优选地，所述步骤1)中，乙腈和水的体积比为3:1，抗坏血酸钠的摩尔浓度为3mmol/L。

优选地，所述步骤1)中，所述供试品溶液的药品浓度为10mg/mL。

优选地，所述步骤1)中，所述对照品储备液的浓度分别为0.02μg/mL，0.1μg/mL，0.5μg/mL，0.8μg/mL，1.0μg/mL，1.2μg/mL，1.5μg/mL和2μg/mL。

优选地，所述步骤2)中，色谱条件的流动相A为含有体积分数0.1％的甲酸的水溶液，流动相B为含有体积分数0.1％的甲酸的水溶液。

具体的，所述高效液相色谱-质谱仪为Agilent 6525B高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱仪。

优选地，所述色谱条件中，流速为1.0mL/min，柱温为40℃，进样量为1μL。

具体的，所述质谱条件中，离子源温度为280～320℃；干燥气流量为8～13L/min；干燥气温度为200℃；雾化器压力为35psi；毛细管电压为3000V；锥孔电压为70～150V；定量离子m/z:158.0。

优选地，所述质谱条件中，离子源温度为300℃，干燥气流量为12L/min,，锥孔电压为70V。

具体的，所述步骤3)中，回归方程为y＝158628.64x+2515.88，相关系数R为0.9996。

本发明提供的液质联用检测2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物的方法，是本领域首次开发出的2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物的检测方法，能够用于有效检测药品中2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物含量。

本发明提供的液质联用法，样品处理过程操作简单，检测结果准确，灵敏度高，稳定性好，可检测到药品中含有的2ppm的2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物。根据前述ICH对基因毒性杂质限度的指导原则以及欧洲药典、美国药典中列出的基因毒性杂质的一般允许限制范围，本发明提供的方法完全达到了上述检测指标，因此可用于基因毒性杂质2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物残留的质量控制。

附图说明

图1是实施例专属性实验中空白溶液的色谱图。

图2是实施例专属性实验中样品的色谱图。

图3是实施例专属性实验中对照品储备液的色谱图。

图4是实施例专属性实验中样品加标溶液的色谱图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

1.仪器和试剂

仪器：

高效液相色谱-质谱仪：Agilent 6525B高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱仪百万分之一分析天平：Mettler Toledo XSE205DU

试剂：

水：Millipore超纯水

乙腈：Merck色谱纯

甲酸：J&K色谱纯

抗坏血酸钠：Damas-beta分析纯

2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物：Aldrich，含量98％

2.高效液相色谱-质谱联用检测条件

高效液相色谱条件：

色谱柱：Waters Xbridge Phenyl(150×4.6mm,3.5μm)；

流动相A：含体积分数0.1％甲酸的水溶液；

流动相B：含体积分数0.1％甲酸的乙腈溶液；

流速：1.0mL/min；

柱温：40℃；

进样体积：1μL；

梯度洗脱程序：

Time(min)	A％	B％
			0.01	90	10
6.00	10	90
			8.00	10	90
8.10	90	10
			10.0	90	10

质谱条件：

电离源：电喷雾(ESI)电离源，正离子扫描模式

离子源温度：300℃

干燥气流量：12L/min

干燥气温度：200℃

雾化器压力:35psi

毛细管电压：3000V

锥孔电压：70V

定量离子m/z:158.0

3.实验部分

3.1溶液配制

3.1.1空白溶液配制：量取250mL水和750mL乙腈，加入0.6g抗坏血酸钠，超声混匀，作为空白溶液。

3.1.1供试品溶液配制：取药品50mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，用空白溶液溶解并定容，摇匀，作为供试品溶液。

3.1.2对照品储备液：取100mg 2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物标准品至100mL容量瓶中，用空白溶液溶解，定容至刻度，摇匀，作为2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物储备液(1mg/mL).

3.2方法学考察

3.2.1专属性试验

取空白溶液，样品，对照品储备液和样品加标溶液，分别进样采集色谱图，结果见图1-图4。试验结果表明，空白溶液无干扰，样品中其他峰对2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物色谱峰无干扰，方法专属性较好。

3.2.2精密度试验

将对照品储备液稀释至1μg/mL，在2的高效液相色谱-质谱联用检测条件下，连续进样6次，进样体积1μL，注入色谱仪，记录保留时间和峰面积，并对结果进行评价，结果见表1。

表1系统精密度试验结果

结果显示，保留时间RSD％为0.08％，峰面积RSD％为0.84％，说明该方法系统精密度很好，完全符合药品分析测试要求。

3.2.3线性与范围试验

精密移取适量的2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物对照品储备液，用空白溶液稀释至浓度为0.02μg/mL,0.1μg/mL,0.5μg/mL,0.8μg/mL,1.0μg/mL，1.2μg/mL,1.5μg/mL和2μg/mL。分别将上述溶液注入高效液相色谱-质谱仪，进样体积1μL，以质量浓度及峰面积进行线性回归，得到回归方程为y＝158628.64x+2515.88，相关系数R为0.9996，结果见表2。

表2 2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物线性与范围试验结果

结果表明，在0.02μg/mL-2.0μg/mL的范围内，2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物的线性良好，R＝0.9996。

3.2.4检出限与定量限试验

调节仪器灵敏度，取2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物储备液适量逐步稀释进样，进样体积1μL，使主峰高为基线噪音的2-3倍，记录色谱图，得2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物最小检测限为0.01μg/mL。

调节仪器灵敏度，取2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物储备液适量逐步稀释进样，进样体积1μL，使主峰高为基线噪音的10倍，记录色谱图，得2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物最小检测限为0.02μg/mL。

3.2.5回收率试验

回收率储备液：精密移取适量的2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物对照品储备液，用空白溶液稀释至浓度为0.5μg/mL(50％)，1.0μg/mL(100％)，1.5μg/mL(150％)的回收率储备液。

供试品溶液：精密称取药品50mg，置于5mL容量瓶中，加空白溶剂溶解定容，摇匀。

回收率溶液：精密称取药品50mg，置于5mL容量瓶中，分别用50％、100％、150％回收率储备液溶解，定容，摇匀，平行三份。

取上述储备液，供试品溶液和回收率溶液，注入高效液相色谱-质谱仪，进样体积1μL，按照外标法计算回收率溶液中各峰的浓度，试验结果见表3。

表3加标回收率试验结果

3.2.6溶液稳定性试验

取回收率溶液(100％)于室温条件下放置24小时，考察其溶液稳定性。按照2的高效液相色谱-质谱条件，分别于0，12，17，20，24小时注入色谱仪，进样体积1μL，记录色谱图，结果见表4。

表4回收率溶液稳定性试验

时间(小时)	0	12	17	20	24	平均值	RSD％
								加标溶液峰面积	112506	103688	102704	99131	97807	103167	5.58％

结果表明，回收率溶液室温条件下放置24小时，溶液稳定性良好。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种液质联用检测2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，乙腈和水的体积比为(1～10):1，抗坏血酸钠的摩尔浓度为1～5mmol/L。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，乙腈和水的体积比为3:1，抗坏血酸钠的摩尔浓度为3mmol/L。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述供试品溶液的药品浓度为10mg/mL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述对照品储备液的浓度分别为0.02μg/mL，0.1μg/mL，0.5μg/mL，0.8μg/mL，1.0μg/mL，1.2μg/mL，1.5μg/mL和2μg/mL。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，色谱条件的流动相A为含有体积分数0.1％的甲酸的水溶液，流动相B为含有体积分数0.1％的甲酸的水溶液。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱-质谱仪为Agilent 6525B高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱仪。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱条件中，流速为1.0mL/min，柱温为40℃，进样量为1μL。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱条件中，离子源温度为280～320℃；干燥气流量为8～13L/min；干燥气温度为200℃；雾化器压力为35psi；毛细管电压为3000V；锥孔电压为70～150V；定量离子m/z:158.0。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述质谱条件中，离子源温度为300℃，干燥气流量为12L/min,，锥孔电压为70V。