CN113702547A - 一种人血浆中米拉贝隆的定量分析方法 - Google Patents

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Abstract

一种人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，属于生物分析领域。本发明采用蛋白沉淀处理人血浆样本，以米拉贝隆‑d5为内标，采用高效液相色谱‑质谱联用（LC‑MS/MS）方法检测人血浆中米拉贝隆的含量。采用本发明的检测方法，灵敏度高、专属性强、稳定性高、回收率高，既能满足回收率的要求，又可以提高检测效率。此外，本检测方法的重现性好，分析时间短，能满足米拉贝隆在人血浆中浓度的检测要求，可用于米拉贝隆缓释片药代动力学研究和生物等效性研究。

Description

一种人血浆中米拉贝隆的定量分析方法
技术领域
本发明属于生物分析领域，具体涉及一种液质联用技术（LC-MS/MS）定量检测血浆中米拉贝隆的方法。
背景技术
米拉贝隆一种有效的选择性β3肾上腺素受体激动剂，临床适用于治疗膀胱过度活动症引起的尿急、尿频及急迫性尿失禁。在健康志愿者中口服给予米拉贝隆后，约3.5小时达到最大血浆浓度（Cmax）。在剂量25 mg时绝对生物利用度为29%，在剂量50 mg时增加至35%。高脂餐后给于50mg米拉贝隆，Cmax 和AUC分别降低45%和17%。与低脂肪餐同服时，米拉贝隆Cmax和AUC分别降低75%和51%。米拉贝隆经多种途径代谢，包括脱烷基化、氧化、（直接）葡萄糖醛酸化和酰胺水解。14C-米拉贝隆单剂量给药后血液中存在的主要形式为米拉贝隆。人血浆中存在两种主要代谢物，均为二相代谢的葡萄糖醛酸苷，分别占总暴露量的 16%和 11%。这些代谢物无药理学活性。
目前，国内尚未有报道过受试者体内米拉贝隆的定量检测技术以及在临床一期生物等效性试验的应用，国外文献报道的方法均为液液萃取或固相萃取技术，费时费力，操作麻烦，实用性较差。为加速我国仿制药的研究和发展，并解决我国目前药品短缺的局面，亟需建立一种高灵敏、高通量的米拉贝隆定量分析方法。
发明内容
本发明为了解决现有技术中操作麻烦、实用性较差的缺点或不足，采用了蛋白沉淀样本前处理的方案，从而实现了高灵敏、高通量地定量测定人血浆中米拉贝隆的目的。
本发明通过蛋白沉淀的样本处理方式从人血浆中提取米拉贝隆，将提取过的样本进行液质联用分析。采用本发明的检测方法，灵敏度高、专属性强、稳定性高、回收率高，既能满足回收率的要求，又可以提高检测效率。
本发明的技术方案如下：
一种人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，将待测人血浆样本通过蛋白沉淀法对待测样本处理后，采用含甲酸和甲酸铵的水作为流动相A，用含甲酸和甲酸铵的甲醇作为流动相B，进行LC-MS/MS分析测定。
流动相体系含有甲酸铵，尝试加入不同浓度的甲酸铵，在一种优选方案中，甲酸铵的浓度为5mmol/l，既保证分析物米拉贝隆的响应，又确保主峰周围没有杂质峰的干扰。
流动相体系中含有甲酸，尝试加入不同浓度甲酸，在保证杂质峰不影响主峰的前提下，进一步优选含甲酸的体积为流动相总体积的0.1%，使质谱离子化效率提高。
流动相有机相为甲醇体系，优化过程中发现若流动相采用乙腈在色谱柱上保留过弱，并且响应也有所降低，因而排除乙腈使用甲醇。流动相采用梯度洗脱，初始比例设置为25%流动相B，优化过程中将梯度直接提高至90%流动相B，米拉贝隆和血浆中的杂质共同洗脱出，干扰分析；因而将梯度提高至55%流动相B，使米拉贝隆优先洗脱出，再进一步提高到90%的流动相B，使血浆中杂质洗脱出，并且杂质峰与主峰分离度良好，不干扰米拉贝隆的分析。详细洗脱比例见下表1。
表1 洗脱比例
时间(min) 流速(ml/min) A相比例(%) B相比例(%)
0.0 0.3 75 25
0.5 0.3 75 25
1.5 0.3 45 55
2 0.3 45 55
2.2 0.3 10 90
2.7 0.3 10 90
2.8 0.3 75 25
3.5 0.3 75 25
本发明采用LC-MS/MS测定人血浆中米拉贝隆的浓度，采用Synergi Hydro-RP C18作为色谱柱。在不影响本发明效果的情况下，优选该色谱柱的长度为50mm，内径为2.0mm，填料粒径为4μm。本实验尝试使用C18柱、C8柱以及其它核壳柱，C18柱与C8柱保留行为相似，而峰形更优。核壳柱峰形较差，故排除。而C18柱尝试Synergi Hydro-RP C18和XDB-C18，Synergi Hydro-RP C18色谱柱峰形更佳，因而最终选择Synergi Hydro-RP C18色谱柱。
由于米拉贝隆在中性和碱性条件下的logP值较高，因此采用液液萃取的方法应控制pH值条件，另外用液液萃取条件，米拉贝隆的回收率不到50%，影响灵敏度与方法的重现性。而固相萃取的方法虽然能满足方法学要求，但是处理过程繁琐，成本高。因此本发明中样本处理方法采用蛋白沉淀的方法，以米拉贝隆-d5作为内标，在其他条件的配合下，回收率高达90%，专属性强，与米拉贝隆色谱保留行为完全一致，减小了基质效应对检测结果的影响，既能满足回收率的要求，又可以提高检测效率。
在一种优选方案中，待测样本加入内标和沉淀剂，涡旋、离心后取上清进行LC-MS/MS分析测定。
本发明对血浆样本经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：（1）标准工作溶液的配制：
称取米拉贝隆标准品，经过折算，加入一定体积的甲醇溶解，配制成浓度为2.00mg/ml的米拉贝隆储备液，至少配制两份标准品储备液，一份作为标准曲线储备液，一份作为质控储备液。以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，将所述米拉贝隆标准曲线储备液稀释成梯度为3.00~1600ng/ml标准曲线工作溶液；以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，将所述米拉贝隆质控储备液稀释成梯度为3.00~1200ng/ml质控工作溶液；称取米拉贝隆-d5内标标准品，加入一定体积的甲醇溶解混匀，配制成浓度为200μg/ml的内标储备液，以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，将内标储备液稀释成5.00ng/ml的内标工作溶液。所有储备液、工作液分装后-20℃保存备用；
取健康人空白血浆，分别加入所述米拉贝隆工作溶液，涡旋混匀，配制成浓度范围为0.150~80.0ng/ml的标准曲线样本以及浓度范围为0.150~60.0ng/ml的质控样本。
（2）样本处理：
吸取标准曲线样本、质控样本、待测样本50.0μl，加入50.0μl内标工作溶液混匀（空白样本加入50μl空白溶剂），加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋后离心10分钟，取100μl上清液，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀后进行LC-MS/MS测定。
（3）标准曲线制作
将经步骤（2）处理后的校正标样、质控样本进行LC-MS/MS分析测定，以米拉贝隆的峰面积与内标米拉贝隆-d5的峰面积比作为纵坐标，以人血浆中米拉贝隆浓度为横坐标制作标准曲线，并进行线性回归。
（4）定量分析
将经步骤（2）处理后的待测生物样本，按照步骤（3）所得的标准曲线方程计算，得到待测生物样本中米拉贝隆的浓度。
在一种优选方案中，步骤（1）提及的米拉贝隆工作液浓度为3.00ng/ml、6.00ng/ml、16.0ng/ml、40.0ng/ml、80.0ng/ml、320ng/ml、640ng/ml、1280ng/ml、1600ng/ml；所述米拉贝隆质控工作溶液浓度为：3.00ng/ml、9.00ng/ml、72.0ng/ml、360ng/ml、1200ng/ml。
在一种优选方案中，步骤（1）提及的米拉贝隆校正标样和质控样本为新鲜配制；所述校正标样的浓度为：0.150ng/ml、0.300ng/ml、0.800ng/ml、2.00ng/ml、4.00ng/ml、16.0ng/ml、32.0ng/ml、64.0ng/ml、80.0ng/ml；所述质控样本的浓度为：0.150ng/ml、0.450ng/ml、3.60ng/ml、18.0ng/ml、60.0ng/ml。
米拉贝隆标准曲线工作溶液和质控工作溶液的配制过程分别见表2和表3。
表2米拉贝隆标准曲线工作溶液的配制
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表3米拉贝隆质控工作溶液的配制
Figure DEST_PATH_IMAGE002
在190μl的空白血浆中加入10μl对应的工作溶液，混合均匀。配制体积可根据实际情况按比例适当调整。配制含米拉贝隆的校正标样的浓度为：0.150ng/ml、0.300ng/ml、0.800ng/ml、2.00ng/ml、4.00ng/ml、16.0ng/ml、32.0ng/ml、64.0ng/ml、80.0ng/ml；配制含米拉贝隆的质控样本的浓度为：0.150ng/ml、0.450ng/ml、3.60ng/ml、18.0ng/ml、60.0ng/ml。
米拉贝隆标准曲线样本和质控样本的配制过程分别见表4和表5所示。
表4米拉贝隆标准曲线样本的配制
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表5质控样本的配制
Figure DEST_PATH_IMAGE004
本发明在步骤（2）中提及涡旋混匀、离心的条件为：涡旋混匀的时间为10min；所述离心的条件为：离心时温度为4℃，离心的转速为1200g，离心的时间为10min。
经处理后的校正标样、质控样本的上清进行LC-MS/MS分析测定时，米拉贝隆的监测离子对为397.1/260.1，每次扫描一个离子对时所停留的时间为100ms，去簇电压为100V，碰撞能量为28V；米拉贝隆-d5的监测离子对为402.1/260.1，每次扫描一个离子对时所停留的时间为100ms，去簇电压为100V，碰撞能量为25V。
本发明采用LC-MS/MS分析测定过程的工作条件为：
（1）色谱条件：色谱柱为Synergi Hydro-RP C18（4.0μm，2.0*50mm）；流动相A：（水/甲酸/5M-AF=100/0.1/0.1），流动相B：（甲醇/水/甲酸/5M-AF=90/10/0.1/0.1）；流速：0.3ml/min；柱温箱温度：40℃；洗脱方式为梯度洗脱；
（2）质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子模式、多反应监测（MRM）模式；电喷雾电压为5500V；离子源温度为550℃；气帘气为30psi；碰撞气为8psi；喷雾气为60psi；辅助加热气为60psi；
（3）进一步的，色谱条件还包括：进样体积8μl；自动进样器清洗溶液为：甲醇/水=80/20；自动进样针清洗时浸泡时间为10s；自动进样器清洗模式：进样前和进样后清洗；样品盘温度为5℃；
采用本发明的技术方案，优势如下：
（1）样本处理优化：米拉贝隆在中性和碱性条件下的logP值较高，因此采用液液萃取的方法应控制pH值条件，另外用液液萃取条件，米拉贝隆的回收率不到50%，影响灵敏度与方法的重现性。而固相萃取的方法虽然能满足方法学要求，但是处理过程繁琐，成本高。因此本发明中样本处理方法采用蛋白沉淀的方法，回收率高达90%，既能满足回收率的要求，又可以提高检测效率。
（2）灵敏度高：米拉贝隆的定量下限为0.15ng/ml。
（3）专属性强：采用米拉贝隆-d5为同位素内标，与米拉贝隆色谱保留完全一致，减小了基质效应对检测结果的影响。
（4）稳定性高：工作溶液在室温和-20℃条件下放置均稳定；
（5）基质稳定性考察：人空白血浆中加入2.50mg/ml 氟化钠作为稳定剂，基质样本在反复冻融、冰浴条件以及-80℃长期保存均稳定；
（6）全血稳定性考察：全血基质中加入2.50mg/ml 氟化钠作为稳定剂，全血样本在冰浴条件下1h内稳定。
（7）基质效应考察：考察包括不同来源空白血浆、溶血基质与高脂基质对于信号响应的影响，实验结果证明无显著差异。
附图说明
图1为本发明人血浆中米拉贝隆定量分析方法的标准曲线；
图2为人空白血浆的色谱图；图中：下图-米拉贝隆，上图-内标；
图3为人空白血浆添加内标的色谱图；图中：下图-米拉贝隆，上图-内标。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：一种人血浆中米拉贝隆的定量分析方法
一、实验材料与仪器
1.药品及试剂：米拉贝隆（TLC）；米拉贝隆-d5（TLC）；甲醇（色谱纯，OCEANPAK）；甲酸（色谱纯，Aladdin）；甲酸铵（色谱纯，Aladdin）；氟化钠（AR级，天津大茂）；纯净水（娃哈哈）。
2. 仪器：具体仪器的名称和规格见下表6.
表6具体仪器的名称和规格
Figure DEST_PATH_IMAGE005
二、 液质条件
1. 液相色谱条件
色谱柱：Synergi Hydro-RP C18（4.0μm，2.0*50mm）；
流动相：流动相A：（水/甲酸/5M-AF=100/0.1/0.1），流动相B：（甲醇/水/甲酸/5M-AF=90/10/0.1/0.1）；
柱温箱温度：40℃；
流速：0.3ml/min；
进样体积8μl；
自动进样器清洗溶液为：甲醇/水=80/20；
自动进样针清洗时浸泡时间为10s；
自动进样器清洗模式：进样前和进样后清洗；
样品盘温度为5℃；
流动相初始比例设置为25%流动相B，先提高至55%流动相B，使米拉贝隆优先洗脱出，再进一步提高到90%的流动相B，使血浆中杂质洗脱出，杂质峰与主峰分离度良好，不干扰米拉贝隆的分析。
2. 质谱条件
质谱参数：离子源为ESI源，采用正离子模式、多反应监测模式；
电喷雾电压为5500V；
离子源温度为550℃；
气帘气为30psi；
碰撞气为8psi；
喷雾气为60psi；
辅助加热气为60psi；
其他参数见下表7。
表7质谱MRM参数设置
Figure DEST_PATH_IMAGE006
三、实验过程
1. 米拉贝隆标准溶液的配制
称取米拉贝隆标准品，经过折算，加入一定体积的甲醇溶解，配制成浓度为2.00mg/ml的米拉贝隆储备液，至少配制两份标准品储备液，一份作为标准曲线储备液，一份作为质控储备液。以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，将所述米拉贝隆标准曲线储备液稀释成梯度为3.00~1600ng/ml标准曲线工作溶液；以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，将所述米拉贝隆质控储备液稀释成梯度为3.00~1200ng/ml质控工作溶液；称取米拉贝隆-d5内标标准品，加入一定体积的甲醇溶解混匀，配制成浓度为200μg/ml的内标储备液，以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，将内标储备液稀释成5.00ng/ml的内标工作溶液。
2. 人血浆样本的配制与处理
取健康人空白血浆，分别加入所述米拉贝隆工作溶液，涡旋混匀，配制成浓度范围为0.150~80.0ng/ml的标准曲线样本以及浓度范围为0.150~60.0ng/ml的质控样本。
吸取标准曲线样本、质控样本、待测样本50.0μl，加入50.0μl内标工作溶液混匀（空白样本加入50μl空白溶剂），加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋后离心10分钟（4℃，1200g，10min），取100μl上清液至96孔板中，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀后进行LC-MS/MS测定。
3. 方法学验证
3.1精密度和准确度
以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，配制浓度分别为3.00ng/ml、9.00ng/ml、72.0ng/ml、360ng/ml、1200ng/ml的米拉贝隆工作溶液，吸取10μl工作溶液加入190μl空白血浆中，涡旋混合配制含米拉贝隆浓度分别为0.150ng/ml（定量下限）、0.450ng/ml（LQC）、3.60ng/ml（MQC1）、18.0ng/ml（MQC2）、60.0ng/ml（HQC）的质控样本。吸取质控样本50.0μl，加入50.0μl内标工作溶液混匀，加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋后离心10分钟（4℃，1200g，10min），取100μl上清液至96孔板中，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀后进行LC-MS/MS测定。根据随行标曲进行计算，计算获得批内与批间准确度和精密度。结果详见表8。
表8 米拉贝隆的批内和批间准确度与精密度
Figure DEST_PATH_IMAGE007
3.2线性
标准曲线样本每次新鲜配制，以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，分别配制浓度为3ng/ml、6ng/ml、16ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、320ng/ml、640ng/ml、1280ng/ml、1600ng/ml的米拉贝隆工作溶液，吸取10μl工作溶液加入190μl空白血浆中，涡旋混合配制含米拉贝隆浓度分别为0.150ng/ml、0.3 ng/ml、0.8 ng/ml、2.0 ng/ml、4.0 ng/ml、16.0 ng/ml、32.0 ng/ml、64.0 ng/ml、80.0 ng/ml的标准曲线样本。吸取标准曲线样本50.0μl，加入50.0μl内标工作溶液混匀，加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋后离心10分钟（4℃，1200g，10min），取100μl上清液至96孔板中，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀后进行LC-MS/MS测定。以米拉贝隆浓度为横坐标x，米拉贝隆与内标的峰面积比值为纵坐标y，用加权最小二乘法（权重为1/x2）进行回归运算，求得的直线方程即为标准曲线。
米拉贝隆在0.150~80.0ng/ml范围内线性关系良好，R＞0.995，典型线性回归曲线见附图1。
3.3选择性
至少使用6批来自不同供体的人空白血浆。在冰水浴条件下，取50.0μl的空白血浆样本，加入50.0μl空白溶剂混匀，加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋5分钟后，离心10分钟（1200g，4℃），取100μl上清液加入96孔板，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀10分钟，作为DB样本。结果详见附图2。
在冰水浴条件下，取50.0μl的空白血浆样本，加入50.0μl内标工作溶液混匀，加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋5分钟后，离心10分钟（1200g，4℃），取100μl上清液加入96孔板，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀10分钟，作为Blank样本。结果详见附图3。内标对分析物无显著干扰。
3.4基质效应
以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，配制浓度分别为0.450 ng/ml和60.0 ng/ml的基质效应样本溶液。在冰水浴条件下，取50.0μl空白溶剂，加入300μl甲醇，涡旋5分钟后，取300μl上清，分别加入50.0μl的基质效应样本溶液和50.0μl的内标工作溶液，涡旋混匀，取100μl加入96孔板，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀10分钟，作为不含基质样本 (每一浓度至少平行配制三个样本)。在冰水浴条件下，取50.0μl人空白血浆，加入300μl甲醇，涡旋5分钟后，离心10分钟（1200g，4℃），取300μl上清，分别加入50.0μl的基质效应样本溶液和50.0μl的内标工作溶液，涡旋混匀，取100μl加入96孔板，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀10分钟，作为含基质样本(至少使用6批来自不同供体的空白血浆，每一浓度至少平行配制三个样本)。结果详见表9。
表9 基质效应
Figure DEST_PATH_IMAGE008
3.5提取回收率
以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，配制浓度分别为0.450 ng/ml、3.60 ng/ml、18.0 ng/ml和60.0 ng/ml的提取回收率样本溶液。在冰水浴条件下，取50.0μl人空白血浆，加入300μl甲醇，涡旋5分钟后，离心10分钟（1200g，4℃），取300μl上清液，分别加入50.0μl的提取回收率样本溶液和50.0μl的内标工作溶液，涡旋混匀，取100μl加入96孔板，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀10分钟，作为提取前样本（每一浓度平行配制六个样本）。在冰水浴条件下，吸取50.0μl的提取回收率基质样本和50.0μl的内标工作溶液，混匀，加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋5分钟后，离心10分钟（1200g，4℃），取100μl上清液加入96孔板，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀10分钟，作为提取后样本（每一浓度平行配制六个样本）。结果详见表10。
表10 提取回收率
Figure DEST_PATH_IMAGE009
3.6稀释可靠性
以人空白血浆为稀释液，在冰水浴条件下，配制浓度为300ng/ml的稀释质控样本，吸取稀释质控样本50.0μl，加入200μl人空白血浆，至少涡旋10s，配制成稀释后的生物样本。稀释倍数为5倍。在冰水浴条件下，吸取50.0μl的稀释后样本和50.0μl的内标工作溶液，混匀，加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋5分钟后，离心10分钟（1200g，4℃），取100μl上清液加入96孔板，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀10分钟，作为稀释可靠性样本（每一浓度平行配制六个样本）。结果详见表11。
表11 稀释可靠性
Figure DEST_PATH_IMAGE010
3.7稳定性考察
3.7.1基质稳定性
以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，配制浓度分别为9.00ng/ml和1200ng/ml的米拉贝隆工作溶液，吸取10μl工作溶液加入190μl空白血浆中，涡旋混合配制含米拉贝隆浓度分别为0.450ng/ml（LQC）和60.0ng/ml（HQC）的质控样本。
将质控样本分别放置于冰水浴条件下6小时、-80℃反复冻融4次后，吸取质控样本50.0μl，加入50.0μl内标工作溶液混匀，加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋后离心10分钟（4℃，1200g，10min），取100μl上清液至96孔板中，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀后进行LC-MS/MS测定。用当天新鲜配制的标准曲线进行标定。结果详见表12和表13。
配制好的血浆样本处理后在室温条件下保存4小时后进行稳定性检测，在自动进样器中至少保存24小时后进行稳定性检测。用当天新鲜配制的标准曲线进行标定。结果详见表14和表15。
表12 冰水浴6小时稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE011
表13 反复冻融4次后的稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE012
表14 处理后室温放置4小时后的稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE013
表15 处理后自动进样器放置24小时后的稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE014
3.7.2工作溶液稳定性
将含米拉贝隆浓度为1.60μg/ml和3.00ng/ml的溶液样本放置于室温条件下6个小时后，与新鲜配制的工作溶液相比，同时稀释后加内标进样分析。结果详见表16。
表16 工作溶液稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE015
3.7.3全血稳定性
以含氟化钠2.50mg/ml的人空白全血为空白基质，在冰水浴条件下，配制浓度分别为0.450ng/ml和60.0ng/ml的全血基质样本，37℃恒温孵育15min后，取一份全血样本立刻进行离心处理，获取血浆根本作为零点。其余血浆样本分别在冰水浴放置0.5小时和1小时后取出，取出后立刻进行离心处理，获取血样样本进行前处理，进样分析，结果详见表17。
表17 米拉贝隆全血稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE016
综上所述，本发明采用蛋白沉淀法处理人血浆样本，以米拉贝隆-d5为内标，采用高效液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）方法检测人血浆中米拉贝隆的含量。质谱采集方法选用ESI正离子及多反应监测模式（MRM）。本发明的检测方法，米拉贝隆在0.15ng/ml~80ng/ml线性关系良好；批内和批间的准确度和精密度均良好。加入氟化钠作为稳定剂后，米拉贝隆在血浆和全血基质中冰水浴放置条件下均稳定。采用本发明的检测方法，灵敏度高、专属性强、稳定性高、回收率高达90%，既能满足回收率的要求，又可以提高检测效率。此外，本检测方法的重现性好，分析时间短，能满足米拉贝隆在人血浆中浓度的检测要求，可用于米拉贝隆制剂药代动力学研究和生物等效性研究。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，将待测人血浆样本通过蛋白沉淀法对待测样本处理后，采用含甲酸和甲酸铵的流动相进行LC-MS/MS分析测得。
2.根据权利要求1所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，所述流动相中甲酸铵的浓度为5mmol/l；优选为含甲酸的甲酸铵体系；更优选，含甲酸的体积为流动相总体积的0.1%；采用Synergi Hydro-RP C18作为色谱柱，优选该色谱柱的长度为50mm，内径为2.0mm，填料粒径为4μm。
3.根据权利要求1、2所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，采用米拉贝隆-d5作为内标。
4.根据权利要求1所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，待测样品加入内标和沉淀剂，涡旋、离心后取上清进行LC-MS/MS分析测得。
5.根据权利要求1、2所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，人空白血浆中加入2.50mg/ml 氟化钠作为稳定剂，用以配制含基质的生物样本。
6.根据权利要求5所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，它包括以下步骤：
标准工作溶液的配制：
称取米拉贝隆标准品，经过折算，加入一定体积的甲醇溶解，配制成浓度为2.00mg/ml的米拉贝隆储备液，至少配制两份标准品储备液，一份作为标准曲线储备液，一份作为质控储备液，以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，将所述米拉贝隆标准曲线储备液稀释成梯度为3.00~1600ng/ml标准曲线工作溶液；以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，将所述米拉贝隆质控储备液稀释成梯度为3.00~1200ng/ml质控工作溶液；称取米拉贝隆-d5内标标准品，加入一定体积的甲醇溶解混匀，配制成浓度为200μg/ml的内标储备液，以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，将内标储备液稀释成5.00ng/ml的内标工作溶液，所有储备液、工作液分装后-20℃保存备用；
取健康人空白血浆，分别加入所述米拉贝隆工作溶液，涡旋混匀，配制成浓度范围为0.150~80.0ng/ml的标准曲线样本以及浓度范围为0.150~60.0ng/ml的质控样本；
样本处理：
吸取标准曲线样本、质控样本、待测样本50.0μl，加入50.0μl内标工作溶液混匀（空白样本加入50μl空白溶剂），加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋后离心10分钟，取100μl上清液，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀后进行LC-MS/MS测定；
标准曲线制作：
将经步骤（2）处理后的校正标样、质控样本进行LC-MS/MS分析测定，以米拉贝隆的峰面积与内标米拉贝隆-d5的峰面积比作为纵坐标，以人血浆中米拉贝隆浓度为横坐标制作标准曲线，并进行线性回归；
定量分析
将经步骤（2）处理后的待测生物样本，按照步骤（3）所得的标准曲线方程计算，得到待测生物样本中米拉贝隆的浓度。
7.根据权利要求6所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述米拉贝隆工作液浓度为3.00ng/ml、6.00ng/ml、16.0ng/ml、40.0ng/ml、80.0ng/ml、320ng/ml、640ng/ml、1280ng/ml、1600ng/ml；所述米拉贝隆质控工作溶液浓度为：3.00ng/ml、9.00ng/ml、72.0ng/ml、360ng/ml、1200ng/ml；所述校正标样和所述质控样本为新鲜配制；所述校正标样的浓度为：0.150ng/ml、0.300ng/ml、0.800ng/ml、2.00ng/ml、4.00ng/ml、16.0ng/ml、32.0ng/ml、64.0ng/ml、80.0ng/ml；所述质控样本的浓度为：0.150ng/ml、0.450ng/ml、3.60ng/ml、18.0ng/ml、60.0ng/ml。
8.根据权利要求6所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述涡旋混匀的时间为10min；所述离心的条件为：离心时温度为4℃，离心的转速为1200g，离心的时间为10min。
9.根据权利要求6所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，在步骤（3）中采用LC-MS/MS分析测定时，色谱条件还包括：流速为0.3ml/min；柱温箱温度为40℃；所述色谱条件优选为，进样体积8μl；自动进样器清洗溶剂为甲醇/水=80/20；自动进样针清洗时浸泡时间10s；自动进样器清洗模式：进样前和进样后清洗；样品盘温度：5℃；流动相梯度洗脱程序：0~0.5min，25%流动相B；1.5~2min，55%流动相B；2.2~2.7min，90%流动相B；2.8~3.5min，25%流动相B；
质谱条件为：离子源为ESI源，采用正离子模式、多反应监测（MRM）模式；电喷雾电压为5500V；离子源温度为550℃；气帘气为30psi；碰撞气为8psi；喷雾气为60psi；辅助加热气为60psi。
10.根据权利要求6所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，在步骤（3）中，LC-MS/MS分析测定时米拉贝隆的监测离子对为397.1/260.1，每次扫描一个离子对时所停留的时间为100ms，去簇电压为100V，碰撞能量为28V；米拉贝隆-d5的监测离子对为402.1/260.1，每次扫描一个离子对时所停留的时间为100ms，去簇电压为100V，碰撞能量为25V。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115219616A (zh) * 2022-06-27 2022-10-21 湖北省疾病预防控制中心（湖北省预防医学科学院） 基于液质联用技术测定生物样本中内源性物质包括辅酶q10浓度的方法
CN116735761A (zh) * 2023-08-16 2023-09-12 四川省药品检验研究院(四川省医疗器械检测中心) 一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110824056A (zh) * 2019-11-22 2020-02-21 杭州华东医药集团浙江华义制药有限公司 一种米拉贝隆有关物质的hplc分析方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110824056A (zh) * 2019-11-22 2020-02-21 杭州华东医药集团浙江华义制药有限公司 一种米拉贝隆有关物质的hplc分析方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAYMOND VAN TEIJLINGEN等: "Development and validation of LC–MS/MS methods for the determination of mirabegron and its metabolites in human plasma and their application to a clinical pharmacokinetic study", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B》, vol. 887, pages 102 - 111, XP028460127, DOI: 10.1016/j.jchromb.2012.01.018 *
乔晓芳等: "LC-MS/MS法测定Beagle犬血浆中米拉贝隆缓释片的药动学特性", 《临床医学》, vol. 36, no. 5, pages 104 - 106 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115219616A (zh) * 2022-06-27 2022-10-21 湖北省疾病预防控制中心（湖北省预防医学科学院） 基于液质联用技术测定生物样本中内源性物质包括辅酶q10浓度的方法
CN116735761A (zh) * 2023-08-16 2023-09-12 四川省药品检验研究院(四川省医疗器械检测中心) 一种人血浆中布立西坦的uplc-ms/ms检测方法

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