CN110824056A - 一种米拉贝隆有关物质的hplc分析方法 - Google Patents

一种米拉贝隆有关物质的hplc分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种米拉贝隆有关物质的HPLC分析方法。本发明的分析方法包括选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；采用流动相梯度洗脱，流动相的组成为磷酸二氢钾缓冲液、甲醇及乙腈；在适当流速和柱温下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。本发明能有效的洗脱、分离和定量米拉贝隆原料药中的杂质，使杂质峰与主峰完全分离，分析速度快，检测效果好。

Description

一种米拉贝隆有关物质的HPLC分析方法
技术领域
本发明属于芳乙醇胺类β3受体激动剂药物分析技术领域，特别是涉及一种米拉贝隆有关物质的HPLC分析方法。
背景技术
米拉贝隆((R)-2-(2-氨基-1,3-噻唑-4-基)-4'-[2-[(2-羟基-2-苯乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺)属于芳乙醇胺类β3受体激动剂，作用于膀胱逼尿平滑肌β3肾上腺素受体，使膀胱舒张，促进膀胱充盈并增加储尿量，能有效减少排尿次数，改善膀胱活动过度引起的尿频、尿急和尿失禁等。米拉贝隆为膀胱过度活动症患者提供了新的治疗方案，其片剂服用方便，服用剂量小，药效显著，能明显减轻膀胱过度活动症患者的痛苦，为广大患者带来福音。
米拉贝隆有关物质测定中，常见的杂质分别为八种，包括2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酸、(R)-2-羟基-N-[[(2-(4-氨基苯基)乙基]氨基]-1-苯基乙醇一盐酸盐、2-[2-[2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酰胺]噻唑-4-基]乙酸盐酸盐、2-(2-氨基噻唑-4-基)-N-[[4-(2-苯基乙基氨基)乙基]苯基]乙酰胺盐酸盐、(R)-2-{2-[2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酰胺]噻唑-4-基}-N-{4-[2-(2-羟基-2-苯基乙基氨基)乙基]苯基}乙酰胺盐酸盐、N-[2-(4-氨基-苯基)-乙基]-2-(2-氨基-噻唑-4-基)-N-(2-羟基-2-苯基-乙基)-乙酰胺、(R)-2-{2-[2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酰胺]噻唑-4-基}-N-(4-{2-[[2-(2-氨基-噻唑-4-基)-乙酰基]-(2-羟基-2-苯基-乙基)-氨基]-乙基}-苯基)-乙酰胺和(R)-2-{2-[2-(2-氨基噻唑-4-基)乙酰胺]噻唑-4-基}-N-(4-{2-[[2-(2-氨基噻唑-4-基)-乙酰基]-(2-羟基-2-苯乙基)氨基]乙基}苯基)-乙酰胺。
目前，已有的米拉贝隆有关物质HPLC检测方法，如“米拉贝隆有关物质的HPLC法测定”，《药物分析杂志》，2016年；以及“HPLC法测定米拉贝隆原料药中有关物质”，《天津药学》，2017年。虽然上述方法均对米拉贝隆原料药中存在的杂质进行了检测，但检测不全面，且上述方法均采用了离子对试剂作为洗脱剂，易对杂质检测产生干扰。
因此，寻找一种简单可行，能将米拉贝隆及其存在的八种杂质依次洗脱且分离，并做定量分析的方法势在必行。
发明内容
本发明的目的在于提供一种米拉贝隆有关物质的HPLC分析方法。本发明利用梯度洗脱的高效液相色谱法，实现了有效的洗脱、分离和定量米拉贝隆原料药中的杂质，使杂质峰与主峰完全分离，分析速度快，检测效果好。
为了达到上述的目的，本发明采取以下技术方案：
一种米拉贝隆有关物质的HPLC分析方法，其中，
(1)所述米拉贝隆(M)及其有关物质(A-H)的化学结构式如下：
Figure BDA0002283879610000031
(2)所述HPLC分析方法的主要参数：
a、色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
b、流动相梯度洗脱，其中：
流动相由流动相A和流动相B组成，其中，所述流动相A为磷酸二氢钾缓冲液和甲醇的混合溶液，所述流动相A中磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.01mol/L～0.05mol/L，pH为4.0～6.5，甲醇占比为5％～20％；所述流动相B为乙腈；
梯度洗脱时间与流动相比例如下：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 100 0
5 100 0
30～60 40～60 60～40
50～70 40～60 60～40
51～71 100 0
60～80 100 0
c、检测波长为220nm；
d、检测方法：
取测试样品适量，精密称定，加30％甲醇水溶解并稀释成一定浓度的样品溶液，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，在适当流速和柱温下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。
作为优选，所述流动相A中磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH为5.5。
作为优选，所述步骤b中流动相梯度洗脱中流动相A中的甲醇比例为12％。
作为优选，所述步骤b流动相梯度洗脱时间与流动相比例如下
Figure BDA0002283879610000051
作为优选，所述的步骤d检测方法中的流速为0.7～1.2ml/min；最优选流速为1.0ml/min。
作为优选，所述的步骤d检测方法中的柱温为20～35℃。
作为优选，所述步骤d检测方法中的样品浓度为0.25～2mg/ml；最优选浓度为1mg/ml。
本发明的有益效果是：
本发明提供的高效液相色谱分析方法，能有效的洗脱、分离和定量检测米拉贝隆中的杂质，使杂质峰与主峰完全分离，分析速度快，灵敏度高，准确度好。本发明提供的高效液相色谱梯度法可对米拉贝隆产品进行快速、简单、可靠的杂质控制。
附图说明
图1本发明实施例1中系统适应性溶液色谱图
图2本发明实施例2中(流动相A中磷酸氢二钾缓冲液浓度为0.01mol/L)系统适应性溶液色谱图
图3本发明实施例2中(流动相A中磷酸氢二钾缓冲液浓度为0.05mol/L)系统适应性溶液色谱图
图4本发明实施例3中(流动相A中磷酸氢二钾缓冲液pH为4.0)系统适应性溶液色谱图
图5本发明实施例3中(流动相A中磷酸氢二钾缓冲液pH为6.5)系统适应性溶液色谱图
图6本发明实施例4中(流动相A中甲醇比例为5％)系统适应性溶液色谱图
图7本发明实施例4中(流动相A中甲醇比例为20％)系统适应性溶液色谱图
图8本发明实施例5中(流动相B最终乙腈比例为40％)系统适应性溶液色谱图
图9本发明实施例5中(流动相B最终乙腈比例为60％)系统适应性溶液色谱图
图10本发明实施例6中(梯度洗脱程序1)系统适应性溶液色谱图
图11本发明实施例6中(梯度洗脱程序2)系统适应性溶液色谱图
图12本发明实施例7中(流速0.7ml/min)系统适应性溶液色谱图
图13本发明实施例7中(流速1.2ml/min)系统适应性溶液色谱图
图14本发明实施例8中(柱温20℃)系统适应性溶液色谱图
图15本发明实施例8中(柱温35℃)系统适应性溶液色谱图
图16本发明实施例9中(供试液浓度0.25mg/ml)系统适应性溶液色谱图
图17本发明实施例9中(供试液浓度2.0mg/ml)系统适应性溶液色谱图
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
除非另作定义，所有的份，百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。
本发明中米拉贝隆有关物质指的是米拉贝隆及其物质测定中的八种常见杂质，米拉贝隆和其杂质名称及代号，来源和结构式如表1所示。
表1米拉贝隆有关物质
除特别指出外，本发明实施例中按以下测定条件：色谱柱：Phenomenex luna C18(2)100A，5μm，4.6*250mm；检测波长：220nm；样品浓度：1.0mg/ml。
实施例1
检测方法：
取米拉贝隆测试样品适量，精密称定，加30％甲醇溶解并稀释成1mg/ml的样品溶液，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，在流速1.0ml/min和柱温30℃下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。
流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.02mol/L，pH为5.5，甲醇比例为12％。
按以下梯度洗脱程序分析系统适应性溶液
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 100 0
5 100 0
40 50 50
50 50 50
51 100 0
60 100 0
色谱图见图1，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表1。
表1
Figure BDA0002283879610000091
Figure BDA0002283879610000101
从表1数据可知：流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.02mol/L；pH为5.5；甲醇比例为12％；溶剂：30％甲醇；流速1.0ml/min；柱温：30℃时，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
实施例2
其他同实施例1，不同之处在于：
流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.01mol/L或0.05mol/L；
按实施例1中的梯度洗脱程序分析系统适应性溶液，色谱图见图2和3，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表2和表3。
表2流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.01mol/L时分离度结果
Figure BDA0002283879610000102
Figure BDA0002283879610000111
表3流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.05mol/L时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 3.187 /
杂质B 15.583 42.14
杂质C 21.152 34.26
米拉贝隆 24.182 11.40
杂质D 26.509 6.05
杂质E 27.870 3.95
杂质F 31.073 18.61
杂质G 31.682 3.56
杂质H 34.020 14.56
从表2和表3的数据可知：流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.01mol/L或0.05mol/L，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例2的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.02mol/L。
实施例3
其他同实施例1，不同之处在于：
流动相A中磷酸二氢钾缓冲液pH为4.0或6.5；
按实施例1中的梯度洗脱程序分析系统适应性溶液，色谱图见图4和5，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表4和表5。
表4流动相A中磷酸二氢钾缓冲液pH为4.0时分离度结果
Figure BDA0002283879610000121
Figure BDA0002283879610000131
表5流动相A中磷酸二氢钾缓冲液pH为6.5时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 3.243 /
杂质B 15.281 39.99
杂质C 21.927 40.61
米拉贝隆 25.165 12.15
杂质D 27.470 5.85
杂质E 28.953 3.92
杂质F 31.375 13.75
杂质G 31.973 3.48
杂质H 34.304 14.42
从表4和表5的数据可知：流动相A中磷酸二氢钾缓冲液pH为4.0或6.5，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例3的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即流动相A中磷酸二氢钾缓冲液pH为5.5。
实施例4
其他同实施例1，不同之处在于：
流动相A中甲醇比例为5％或20％；
按实施例1中的梯度洗脱程序分析系统适应性溶液，色谱图见图6和7，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表6和表7。
表6流动相A中甲醇比例为5％时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 3.633 /
杂质B 16.489 84.41
杂质C 22.059 34.25
米拉贝隆 24.722 8.27
杂质D 27.237 6.89
杂质E 28.506 4.11
杂质F 31.685 18.37
杂质G 32.215 3.11
杂质H 34.527 14.22
表7流动相A中甲醇比例为20％时分离度结果
Figure BDA0002283879610000141
从表6和表7的数据可知：流动相A甲醇比例为5％或20％，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例4的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即流动相A甲醇比例为12％。
实施例5
其他同实施例1，不同之处在于：
流动相B中最终的乙腈比例为40％或60％；
按以下梯度洗脱程序分析系统适应性溶液，
Figure BDA0002283879610000152
Figure BDA0002283879610000161
色谱图见图8和9，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表8和表9。
表8流动相B中乙腈比例为40％时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 3.189 /
杂质B 16.481 39.91
杂质C 23.308 33.60
米拉贝隆 27.175 9.98
杂质D 30.179 5.28
杂质E 32.033 4.32
杂质F 35.624 17.74
杂质G 36.571 4.63
杂质H 39.534 15.45
表9流动相B中乙腈比例为60％时分离度结果
Figure BDA0002283879610000162
Figure BDA0002283879610000171
从表8和表9的数据可知：流动相B最终比例为40％或60％时，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例5的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即流动相B中最终的乙腈比例为50％。
实施例6
其他同实施例1，不同之处在于：
梯度洗脱的时间；
分别按以下梯度洗脱程序1和梯度洗脱程序2分析系统适应性溶液，
梯度1：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 100 0
5 100 0
30 50 50
50 50 50
51 100 0
60 100 0
梯度2：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 100 0
5 100 0
60 50 50
70 50 50
71 100 0
80 100 0
色谱图见图10和11，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表10和表11。
表10梯度洗脱程序1的分离度结果
Figure BDA0002283879610000181
Figure BDA0002283879610000191
表11梯度洗脱程序2的分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 3.205 /
杂质B 17.597 41.80
杂质C 25.702 34.92
米拉贝隆 30.732 11.18
杂质D 34.315 4.73
杂质E 36.798 4.78
杂质F 40.948 17.87
杂质G 42.312 2.06
杂质H 46.060 16.40
从表10和表11的数据可知：梯度洗脱程序1或2，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例6的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即实施例1中的梯度程序。
实施例7
其他同实施例1，不同之处在于：
流速：0.7ml/min或1.2ml/min；
按实施例1中的梯度洗脱程序分析系统适应性溶液，色谱图见图12和13，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表12和表13。
表12流速为0.7ml/min时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 3.638 /
杂质B 16.469 35.82
杂质C 22.356 33.14
米拉贝隆 25.178 8.17
杂质D 27.767 6.28
杂质E 29.065 3.57
杂质F 32.321 17.79
杂质G 32.865 3.05
杂质H 35.197 13.74
表13流速为1.2ml/min时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 2.556 /
杂质B 14.109 43.92
杂质C 19.617 32.94
米拉贝隆 22.754 9.99
杂质D 25.159 5.13
杂质E 26.651 4.22
杂质F 29.510 17.28
杂质G 30.277 4.54
杂质H 32.659 14.90
从表12和表13的数据可知：流速为0.7ml/min或1.2ml/min时，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例7的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即流速1.0ml/min。
实施例8
其他同实施例1，不同之处在于：
柱温：20℃或35℃；
按实施例1中的梯度洗脱程序分析系统适应性溶液，色谱图见图14和15，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表14和表15。
表14柱温为20℃时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 3.368 /
杂质B 16.408 49.36
杂质C 22.209 34.43
米拉贝隆 25.004 8.22
杂质D 26.499 4.52
杂质E 28.291 3.81
杂质F 31.801 16.20
杂质G 32.360 3.02
杂质H 34.677 13.39
表15柱温35℃时分离度结果
Figure BDA0002283879610000221
Figure BDA0002283879610000231
从表14和表15的数据可知：柱温为20℃或35℃时，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例8的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即柱温25℃。
实施例9
其他同实施例1，不同之处在于：
样品浓度为0.25mg/ml和2.0mg/ml；
按实施例1中的梯度洗脱程序分析系统适应性溶液，色谱图见图16和17，各杂质与主峰的保留时间及相邻峰之间的分离度见表16和表17。
表16样品浓度为0.25mg/ml时分离度结果
Figure BDA0002283879610000232
Figure BDA0002283879610000241
表17样品浓度为2.0mg/ml时分离度结果
名称/代号 保留时间(min) 相邻峰间分离度
杂质A 3.209 /
杂质B 15.573 48.16
杂质C 21.227 30.44
米拉贝隆 23.940 6.56
杂质D 26.628 5.77
杂质E 27.999 3.87
杂质F 31.141 18.12
杂质G 31.758 3.58
杂质H 34.096 14.53
从表16和表17的数据可知：样品浓度为0.25mg/ml或2.0mg/ml时，各杂质与主峰之间以及杂质与杂质之间均分离良好。
对实施例1及实施例9的色谱图进行比较，选择实施例1的色谱条件为优选条件，即样品浓度为1mg/ml。
结论：对比以上实施例1-9结果，最终优选条件为：色谱柱：Phenomenex luna C18(2)100A，5μm，4.6*250mm；检测波长：220nm；流速1.0ml/min；柱温30℃；溶剂为30％甲醇；供试液浓度为1.0mg/ml；流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.02mol/L，pH为5.5，甲醇比例为12％。
实施例10
按照实施例1的检测方法，按最终优选条件(即：色谱柱：Phenomenex luna C18(2)100A，5μm，4.6*250mm；检测波长：220nm；流速1.0ml/min；柱温30℃；溶剂为30％甲醇；供试液浓度为1.0mg/ml；流动相A中磷酸二氢钾缓冲液浓度为0.02mol/L，pH为5.5，甲醇比例为12％)检测米拉贝隆原料药和制剂样品，色谱图见附图18和19，各杂质的含量见表18和19。
表18米拉贝隆原料药样品杂质含量
杂质名称 杂质A 杂质B 杂质C 杂质D 杂质E 杂质F 杂质G 杂质H
杂质含量％ 未检出 0.01 未检出 0.01 0.04 未检出 0.06 未检出
表19米拉贝隆制剂样品杂质含量
杂质名称 杂质A 杂质B 杂质C 杂质D 杂质E 杂质F 杂质G 杂质H
杂质含量％ 未检出 0.01 未检出 0.01 0.03 未检出 0.06 未检出
从表18和19及色谱图18和19可知，样品中杂质与主峰以及各杂质间分离均良好，可对杂质进行准确的定量。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

Claims (10)

1.一种米拉贝隆有关物质的HPLC分析方法，其特征在于其中，
(1)所述米拉贝隆(M)及其有关物质(A-H)的化学结构式如下：
Figure FDA0002283879600000011
(2)所述HPLC分析方法的主要参数：
a、色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
b、流动相梯度洗脱，其中：
流动相由流动相A和流动相B组成，其中，所述流动相A为磷酸二氢钾缓冲液和甲醇的混合溶液，所述流动相A中磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.01mol/L～0.05mol/L，pH为4.0～6.5，甲醇占比为5％～20％；所述流动相B为乙腈；
梯度洗脱时间与流动相比例如下：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％ 0 100 0 5 100 0 30～60 40～60 60～40 50～70 40～60 60～40 51～71 100 0 60～80 100 0
c、检测波长为220nm；
d、检测方法：
取测试样品适量，精密称定，加30％甲醇水溶解并稀释成一定浓度的样品溶液，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，在适当流速和柱温下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述流动相A中磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH为5.5。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤b中流动相梯度洗脱中流动相A中的甲醇比例为12％。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤b流动相梯度洗脱时间与流动相比例如下
Figure FDA0002283879600000031
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤d检测方法中的流速为0.7～1.2ml/min。
6.根据权利要求5所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤d检测方法中的流速为1.0ml/min。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤d检测方法中的柱温为20～35℃。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤d检测方法中的样品浓度为0.25～2mg/ml。
9.根据权利要求8所述的分析方法，其特征在于，所述步骤d检测方法中的样品浓度为1mg/ml。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述分析方法用于米拉贝隆及中间体有关物质或米拉贝隆制剂产品有关物质的分析检测和质量控制。
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