TWI805111B - 微生物內嵌生物炭以及其製備方法及用途 - Google Patents

Abstract

本揭露提供一種微生物內嵌生物炭的製備方法，包含以下步驟：提供農業廢剩物；將農業廢剩物進行破碎；以300℃至900℃的溫度範圍加熱該農業廢剩物，使其進行炭化作用以形成具有複數個孔洞的生物炭；將生物炭破碎後進行篩選；將經篩選後的生物炭與液態培養基混合，並將生物炭與液態培養基的混合物進行高溫滅菌；以及將預培養的微生物稀釋並且將其加入生物炭與液態培養基的混合物中進行培養，使微生物生長於生物炭的孔洞內部，以形成微生物內嵌生物炭。

Description

微生物內嵌生物炭以及其製備方法及用途

本揭露是關於一種微生物內嵌生物炭以及其製備方法及用途，且特別是關於可改善微生物的生長數量以及活性的生物炭的製備方法。

近年來，生物炭(biochar)的利用已獲得國際的重視，生物炭是生物有機材料在缺氧或無氧環境中，經高溫熱裂解後生成的固態產物，生物炭可作為固態燃料，亦常應用於農業領域、環境保護領域等。

生物炭可提供微生物生長棲所，提高微生物於不同場域的應用。詳細而言，微生物於環境中會出現競爭、抗生、重複寄生、捕食及靜菌作用等，施用微生物於特定環境中常會遇到效期不長或效果不佳等問題，而生物炭的結構可提供微生物避難及作為養分儲存場所，有助於微生物於不同環境中存活。然而，微生物一般係經發酵完成後以吸附的方式與生物炭結合，因此存在微生物活性不佳以及與生物炭結合穩定性較差等問題。

因此，發展可改善微生物於生物炭結構上的活性以及存活時間的微生物與生物炭之複合結構仍為相關領域致力研究的課題之一。

根據本揭露一些實施例，提供一種微生物內嵌生物炭的製備方法，包含以下步驟：提供農業廢剩物；將農業廢剩物進行破碎；以300℃至900℃的溫度範圍加熱該農業廢剩物，使其進行炭化作用以形成具有複數個孔洞的生物炭；將生物炭破碎後進行篩選；將經篩選後的生物炭與液態培養基混合，並將生物炭與液態培養基的混合物進行高溫滅菌；以及將預培養的微生物稀釋並且將其加入生物炭與液態培養基的混合物中進行培養，使微生物生長於生物炭的孔洞內部，以形成微生物內嵌生物炭。

根據本揭露一些實施例，提供一種微生物內嵌生物炭，包含生物炭以及微生物，生物炭具有複數個孔洞，微生物內嵌於孔洞中，並且，生物炭的比表面積介於20m ²/g至350m ²/g之間，生物炭的孔徑尺寸介於1µm至30µm之間，且微生物內嵌生物炭的微生物總含量為10 ⁸CFU/g以上。

根據本揭露一些實施例，提供一種如前述之微生物內嵌生物炭的用途，其係用於製造土壤改良劑。

根據本揭露一些實施例，提供一種如前述之微生物內嵌生物炭的用途，其係用於製造水質改良劑。

根據本揭露一些實施例，提供一種如前述之微生物內嵌生物炭的用途，其係用於製造飼料。

為讓本揭露之特徵、或優點能更明顯易懂，下文特舉出較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下。

以下針對本揭露實施例的微生物內嵌生物炭以及其製備方法及用途作詳細說明。應了解的是，以下之敘述提供許多不同的實施例或例子，用以實施本揭露一些實施例之不同樣態。以下所述特定的元件及排列方式僅為簡單清楚描述本揭露一些實施例。當然，這些僅用以舉例而非本揭露之限定。

於本文中，「約」、「大約」、「實質上」之用語通常表示在一給定值或範圍的5%內，或3%之內，或2%之內，或1%之內，或0.5%之內。於本中給定的數量為大約的數量，亦即在沒有特定說明「約」、「大約」、「實質上」的情況下，仍可隱含「約」、「大約」、「實質上」之含義。再者，描述數值範圍的用語「介於第一數值至第二數值之間」以及「第一數值至第二數值」表示所述範圍包含第一數值、第二數值以及它們之間的其它數值。

除非另外定義，於本文中使用的全部用語(包含技術及科學用語)具有與本揭露所屬技術領域的技術人員通常理解的相同涵義。能理解的是，這些用語例如在通常使用的字典中定義用語，應被解讀成具有與相關技術及本揭露的背景或上下文一致的意思，而不應以一理想化或過度正式的方式解讀。為了使本揭露的內容更容易理解，提供以下術語及用詞的定義。

根據本揭露一些實施例，提供一種微生物內嵌生物炭的製備方法，其將經稀釋之未發酵的微生物與生物炭共同培養，使得生物炭中的微生物處於生長對數期(log phase)，相較於一般使用已發酵而處於成長穩定期(stationary phase)或成長衰退期(death phase)的微生物之微生物-生物炭複合材料，本揭露實施例提供的微生物內嵌生物炭可改善微生物的活性以及增加生物炭上的微生物總量。再者，於本揭露實施例提供的微生物內嵌生物炭的製備方法中，無需額外添加界面活性劑，藉此可降低製作成本。

請參照第1圖，第1圖顯示根據本揭露一些實施例中，微生物內嵌生物炭的製備方法10的步驟流程圖。應理解的是，可於微生物內嵌生物炭的製備方法10進行前、進行中及/或進行後加入額外的步驟，或是取代或刪除一些步驟。

首先，微生物內嵌生物炭的製備方法10可包含步驟S102：收集農業廢剩物。農業廢剩物可包含木本植物、草本作物或前述之組合，但不限於此。根據一些實施例，木本植物可包含蓮霧枝條、銀合歡枝條、棗樹枝條、相思樹枝條或前述之組合，但不限於此。根據一些實施例，草本植物可包含稻稈、香蕉桿或前述之組合，但不限於此。

接著，微生物內嵌生物炭的製備方法10可包含步驟S104：將農業廢剩物進行初步破碎。根據一些實施例，可使用碎枝機、碎木機或其它合適的器具使農業廢剩物初步破碎。

再者，微生物內嵌生物炭的製備方法10可包含步驟S106：加熱農業廢剩物使其進行炭化作用。具體而言，可以約300℃至約900℃的溫度範圍加熱經初步破碎的農業廢剩物，使其進行炭化作用以形成具有複數個孔洞的生物炭。加熱步驟可於缺氧或貧氧環境下進行。根據一些實施例，可以約10℃/分鐘至約20℃/分鐘的升溫速度加熱農業廢剩物至300℃至900℃的溫度範圍，例如，加熱溫度可為約400℃、約500℃、約600℃、約700℃、或約800℃。根據一些實施例，炭化作用的時間可介於約1小時至約4小時之間，例如，約2小時或約3小時。

再者，微生物內嵌生物炭的製備方法10可包含步驟S108：將生物炭破碎後進行篩選。詳細而言，將農業廢剩物經炭化作用後形成的生物炭進行破碎，並且篩選尺寸介於約1mm至約3mm之間的生物炭。例如，生物炭的長度及寬度均介於約1mm至約3mm之間，例如，約1.5mm、約2mm或約2.5mm。值得注意的是，若生物炭的尺寸過大(例如，大於3mm)，則可能會造成後續步驟的操作不便；反之，若生物炭的尺寸過小(例如，小於1mm)，則形成的微生物內嵌生物炭容易受到環境擾動而無法固定於特定場域，例如，於液體環境中容易被沖走。

根據一些實施例，可使用破碎機、以鐵鎚敲碎或其它合適的器具使生物炭破碎。

根據一些實施例，藉由前述步驟製備而成的生物炭的電導度可介於約0.5mS/cm至約6mS/cm之間，或約1mS/cm至約5mS/cm之間，例如，約2mS/cm、3mS/cm或4mS/cm。根據一些實施例，藉由前述步驟製備而成的生物炭的pH值可介於約pH6至約pH12之間，例如，約pH7、約pH8、約pH9、約pH10、或約pH11。再者，根據一些實施例，藉由前述步驟製備而成的生物炭的陽離子交換能力可介於約5cmol(+)/kg soil至15cmol(+)/kg soil之間，或約8cmol(+)/kg soil至13cmol(+)/kg soil之間，例如，約9cmol(+)/kg soil、10cmol(+)/kg soil、11cmol(+)/kg soil、或12cmol(+)/kg soil。

根據一些實施例，藉由前述步驟製備而成的生物炭的比表面積介於約20m ²/g至約350m ²/g之間，或約100m ²/g至約320m ²/g之間，或約150m ²/g至約300m ²/g之間，例如，約200m ²/g或約250m ²/g。根據一些實施例，藉由前述步驟製備而成的生物炭的孔徑尺寸介於約1µm至約30µm之間(亦即，生物炭的孔洞內的長度及寬度分別可介於約1µm至約30µm之間)，或約5µm至約25µm之間，例如，約10µm、15µm或20µm。此外，根據一些實施例，藉由前述步驟製備而成的生物炭的固定態炭可大於約80wt%，例如，約85wt%、90wt%、95wt%或99wt%。

值得注意的是，相較於一般製程生產的生物炭的比表面積(例如，約20m ²/g至約50m ²/g之間)，本揭露實施例製備而成的生物炭具有較高的比表面積，對於物質的吸附能力佳。

接著，微生物內嵌生物炭的製備方法10可包含步驟S110：將經篩選後的生物炭與液態培養基混合。詳細而言，可將經篩選具有適當尺寸的生物炭與液態培養基混合，並且可將生物炭與液態培養基的混合物進行高溫滅菌。根據一些實施例，生物炭與液態培養基的混合比例介於約1：20(w/v)至約5：20(w/v)之間，例如，約2：20(w/v)、約3：20(w/v)或約4：20(w/v)。值得注意的是，以上述比例範圍混合生物炭與液態培養基可提升後續步驟中的微生物培養效率。

根據一些實施例，對生物炭與液態培養基的混合物進行高溫滅菌的步驟中，可設定溫度介於約115℃至約135℃之間，壓力介於約1Kgs/cm ²至約2.5Kgs/cm ²之間，時間介於約30分鐘至約60分鐘之間。

此外，根據一些實施例，於將生物炭與液態培養基的混合物進行高溫滅菌之前，微生物內嵌生物炭的製備方法10可進一步包含調整生物炭與液態培養基的混合物的pH值至約pH3至約pH10的範圍中，或約pH6至約pH9的範圍中，例如，約pH7或約pH8。根據不同的實施例，可將生物炭與液態培養基的混合物的pH值調整至適合微生物生長的pH環境，以改善微生物的培養效率。

根據一些實施例，液態培養基的成份可包含胰蛋白腖(tryptone)、蛋白腖(peptone)、酵母菌萃取物、馬鈴薯萃取物、牛肉萃取物、無水酪蛋白、澱粉、大豆粉、葡萄糖、蔗糖、氯化鈉、氯化亞鐵、硼酸、四水合氯化錳、六水合氯化鈷、氯化鋅、六水合氯化鎳、氯化銅、鉬酸鈉、水、其它合適的成分或前述之組合。根據一些實施例，液態培養基可為一般市售的營養液體培養基(nutrient broth，NB)。根據不同的實施例，可依照微生物的種類選擇含有合適成分的培養基。

再者，微生物內嵌生物炭的製備方法10可包含步驟S112：將預培養的微生物稀釋並且將其加入生物炭與液態培養基的混合物中進行培養，使微生物生長於生物炭的孔洞內部，以形成微生物內嵌生物炭。詳細而言，根據一些實施例，待經滅菌以及pH調整後的生物炭與液態培養基的混合物冷卻後，將經稀釋之預培養的微生物加入其中。根據一些實施例，預培養的微生物係以稀釋50倍至500倍的濃度加入生物炭與液態培養基的混合物。具體而言，經稀釋之預培養的微生物的濃度(或菌量)介於約10 ³CFU/ml至約10 ⁵CFU/ml之間。

根據一些實施例，預培養的微生物係以溫度介於約28℃至約45℃之間、轉速介於約100rpm至約250rpm之間的條件於生物炭與液態培養基的混合物中培養約48小時至約168小時。例如，微生物的培養溫度可介於約30℃至約40℃之間，轉速可介於約130rpm至約200rpm之間，培養時間可介於約72小時至約120小時之間，但不限於此。根據不同的實施例，可依照微生物的種類調整合適的培養條件，以改善微生物的培養效率。

此外，值得注意的是，根據本揭露的實施例，在加入生物炭與液態培養基的混合物之前，預培養的微生物尚未完成發酵作用，亦即微生物尚未進行大量繁殖，例如，仍處於成長遲滯期(lag phase)，而在加入生物炭與液態培養基的混合物進行培養，微生物逐漸生長進入生長對數期後，開始大量繁殖。

根據一些實施例，預培養的微生物可包含芽孢桿菌屬( Bacillus)、假單胞菌屬( Pseudomonas)、根瘤菌屬( Rhizobium)、伯克氏菌屬( Burkholderia)、無色桿菌屬( Achromobacter)、農桿菌屬( Agrobacterium)、細球菌屬( Micrococcus)、產氣桿菌屬( Aerobacter)、黃桿菌屬( Flavobacterium)、歐氏桿菌屬( Erwinia)、克雷伯氏菌屬( Klebsiella)、腸桿菌屬( Enterobacter)、光合菌(photosynthetic bacteria)、乳酸桿菌屬( Lactobacillus)、乳球菌屬( Lactococcus)、足球菌屬( Pediococcus)、鏈球菌屬( Streptococcus)、腸球菌屬( Enterococcus)、麴黴屬( Aspergillus)、酵母屬( Saccharomyces)、畢赤酵母屬( Pichia)、梭菌屬( Clostridium)、雙歧桿菌屬( Bifidobacterium)、白色念珠菌屬( Leuconostoc)、丙酸桿菌屬( Propionibacterium)、紅假單胞菌屬( Rhodopseudomonas)、其它合適的種類或前述之組合的微生物。

再者，於完成培養之後，將生物炭與液態培養基的混合物進行過濾，將固液態分離，過濾後得到的生物炭即為微生物內嵌生物炭。根據一些實施例，微生物除了內嵌於生物炭的孔洞內部之外，亦吸附於生物炭的表面上。

承前述，根據本揭露的實施例，將經稀釋之未發酵的微生物與生物炭共同培養，使得生物炭中的微生物處於生長對數期，相較於一般使用已發酵而處於成長穩定期或成長衰退期的微生物之微生物-生物炭複合材料，本揭露實施例提供的微生物內嵌生物炭可改善微生物的活性以及增加生物炭上的微生物總量。例如，根據一些實施例，藉由前述步驟製備而成的微生物內嵌生物炭的微生物總含量為約10 ⁸CFU/g以上，例如，介於約10 ⁸CFU/g至約10 ¹⁴CFU/g。

再者，於前述微生物內嵌生物炭的製備方法10中，無需額外添加界面活性劑的步驟，藉此可降低製作成本。此外，由於微生物與生物炭共同培養，微生物自然地成長於生物炭的孔洞內部以及表面上，製程中不需要使用抽真空設備施加外力使微生物進入生物炭的孔洞內，因此，可降低設備汙染的風險及降低設備設置的相關成本。

此外，根據本揭露的實施例，提供一種藉由前述製備方法形成的微生物內嵌生物炭，微生物內嵌生物炭包含生物炭以及微生物，生物炭具有複數個孔洞，且微生物內嵌於孔洞中。根據一些實施例，微生物除了內嵌於生物炭的孔洞內部之外，亦吸附於生物炭的表面上。

根據一些實施例，生物炭的比表面積介於約20m ²/g至約350m ²/g之間，或約100m ²/g至約320m ²/g之間，或約150m ²/g至約300m ²/g之間，例如，約200m ²/g或約250m ²/g。根據一些實施例，生物炭的孔徑尺寸介於約1µm至約30µm之間，或約5µm至約25µm之間，例如，約10µm、15µm或20µm。此外，根據一些實施例，微生物內嵌生物炭的微生物總含量為約10 ⁸CFU/g以上，例如，介於約10 ⁸CFU/g至約10 ¹⁴CFU/g。

根據一些實施例，微生物內嵌生物炭的尺寸介於約1mm至約3mm之間。例如，生物炭的長度及寬度均介於約1mm至約3mm之間，例如，約1.5mm、約2mm或約2.5mm。值得注意的是，具有合適尺寸(例如，介於約1mm至約3mm之間)的微生物內嵌生物炭可有效地應用於特定場域，例如，水或土壤等環境中，提供微生物生長及繁殖棲所，有利於微生物於環境中存活發揮其生物活性及功能。

根據一些實施例，生物炭的原料可包含木本植物、草本作物或前述之組合，但不限於此。根據一些實施例，木本植物可包含蓮霧枝條、銀合歡枝條、棗樹枝條、相思樹枝條或前述之組合，但不限於此。根據一些實施例，草本植物可包含稻稈、香蕉桿或前述之組合，但不限於此。

根據一些實施例，微生物可包含芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、伯克氏菌屬、無色桿菌屬、農桿菌屬、細球菌屬、產氣桿菌屬、黃桿菌屬、歐氏桿菌屬、克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、光合菌、乳酸桿菌屬、乳球菌屬、足球菌屬、鏈球菌屬)、腸球菌屬、麴黴屬、酵母屬、畢赤酵母屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬、白色念珠菌屬、丙酸桿菌屬、紅假單胞菌屬、其它合適的種類或前述之組合的微生物。

此外，根據本揭露一些實施例，前述微生物內嵌生物炭可應用於農業、漁業養殖、水處理、動物飼料等領域，但不限於此。根據一些實施例，前述微生物內嵌生物炭可用於製造土壤改良劑的用途，例如，可選用具有土壤改良功能的微生物作為製備微生物內嵌生物炭的微生物。根據一些實施例，前述微生物內嵌生物炭可用於製造水質改良劑的用途，例如，可選用具有水質改良功能的微生物作為製備微生物內嵌生物炭的微生物。根據一些實施例，前述微生物內嵌生物炭可用於製造飼料的用途，例如，可選用具有提升營養成分功能的微生物作為製備微生物內嵌生物炭的微生物。

為了讓本揭露之上述及其它目的、特徵、及優點能更明顯易懂，下文特舉數實施例，作詳細說明如下，然其並非用以限定本揭露之內容。

實施例1-生物炭的製備以及分析

分別使用蓮霧枝條、銀合歡枝條以及棗樹枝條作為農業廢剩物進行生物炭的製備。首先，將農業廢剩物的粗料進行初步破碎，之後以10℃/分鐘的升溫速度，於900℃進行碳化作用2小時以形成生物炭，將炭化作用得到的生物炭進行再次破碎，並且過篩篩選出尺寸介於1~2mm之間的生物炭。

使用感應耦合電漿光譜儀(ICP-OES;Ultima Expert-Horiba)以及元素分析儀(elementar; UNICUBE)對前述步驟製成的蓮霧枝條生物炭、銀合歡枝條生物炭以及棗樹枝條生物炭進行元素分析，結果如表1所示。

表1

檢測項目	蓮霧枝條	銀合歡枝條	棗樹枝條
氮(%)	1.01	1.07	0.87
磷(%)	0.24	0.05	0.29
鉀(%)	1.16	0.74	2.05
鈣(ppm)	25232.43	13633.23	36618.98
鎂(ppm)	3471.38	1838.62	4692.5
錳(ppm)	25.43	22.27	72.57
鐵(ppm)	145.21	187.26	188.1
銅(ppm)	14.7	6.4	23.57
鋅(ppm)	12.85	12.01	32.05
鈉(ppm)	1162.53	677.77	1213.07
硼(ppm)	46.83	53.02	31.81
鎘(ppm)	＜0.009	＜0.009	＜0.009
鉻(ppm)	6.52	32.83	37.4
鎳(ppm)	5.7	20.72	26.85
鉛(ppm)	＜0.027	＜0.027	＜0.027
砷(ppm)	＜0.005	＜0.005	＜0.005
汞(ppm)	0.52	0.3	0.52

接著，分別使用pH計(EZDO 6011)、電導率儀(EZDO 6061)以及醋酸鈉法測量前述步驟製成的蓮霧枝條生物炭、銀合歡枝條生物炭以及棗樹枝條生物炭的pH值、電導度、陽離子交換能力(cation exchange capability，CEC)，並且，分別使用低溫氮氣吸附法以及能量色散X射線光譜量測蓮霧枝條生物炭、銀合歡枝條生物炭以及棗樹枝條生物炭的比表面積(Brunauer-Emmett-Teller，BET)以及固定態炭量，結果如表2所示。

表2

檢測項目	蓮霧枝條	銀合歡枝條	棗樹枝條
pH(1:10)*	10.59	10.17	10.91
電導度(1:10)* (mS/cm)	3.13	1.80	5.33
CEC (cmol(+)/kg soil)	10.4	6.80	13.3
BET(m 2/g)	315.09	213.53	318.53
固定態炭(wt%)	92.16	93.69	87.13

*固體(生物炭重量):去離子水(體積)為1:10

根據表1以及表2的結果可知，由蓮霧枝條、銀合歡枝條以及棗樹枝條製備而成的生物炭基本上均具有基礎元素，電導度在一般作物適合生長的範圍中(例如小於8.0 mS/cm)，且高溫燒製完成的生物炭的pH值偏鹼。此外，由蓮霧枝條、銀合歡枝條以及棗樹枝條製備而成的生物炭的陽離子交換能力分別為10.4、6.80及13.3 cmol(+)/kg soil，表示生物炭帶有基本的陽離子交換能力，可作為微生物孔洞內嵌之部分陽離子交換來源。

再者，由蓮霧枝條、銀合歡枝條以及棗樹枝條製備而成的生物炭的比表面積(BET)分別為315.09、213.53及318.53 m ²/g，遠大於一般製程所生產之生物炭的比表面積(大約介於20~50 m ²/g)，顯示實施例製備的生物炭對物質具有高吸附能力。另外，由蓮霧枝條、銀合歡枝條以及棗樹枝條製備而成的生物炭的固定態炭分別為92.16、93.69及87.13 wt%，由此可知經由碳化過程的作用，大部分植物中的其他元素在高溫中揮發，使得生物炭含有較高的炭比例。

接著，使用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察由蓮霧枝條、銀合歡枝條及棗樹枝條製備的生物炭的影像，結果分別如第2A圖、第2B圖以及第2C圖所示。如第2A~2C圖所示，三種生物炭皆呈現孔洞狀構造，其中蓮霧枝條生物炭的孔徑尺寸約為13.31~23.44µm x 16.88~23.06µm(第2A圖)、銀合歡枝條生物炭的孔徑尺寸約為15.94~25.31µm x 20.91~26.63µm(第2B圖)、棗樹枝條生物炭的孔徑尺寸約為8.53~16.68µm x 11.44~17.16µm(第2C圖)。由蓮霧枝條、銀合歡枝條及棗樹枝條製備的生物炭的孔徑適合多種常見的有益微生物(例如，菌體尺寸為約0.5~5μm×約0.5~10μm)生長。以液化澱粉芽孢桿菌為例，菌體的尺寸為約0.7~0.9μm×1.8~3.0μm，菌體常成直鏈狀，芽孢桿菌屬的其他微生物尺寸亦相似。再者，舉例而言，芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、伯克氏菌屬、無色桿菌屬、農桿菌屬、細球菌屬、產氣桿菌屬、黃桿菌屬、歐氏桿菌屬、克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、光合菌、乳酸桿菌屬、乳球菌屬、足球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、麴黴屬、酵母屬、畢赤酵母屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬、白色念珠菌屬、丙酸桿菌屬或紅假單胞菌屬的微生物亦具有類似的尺寸。

實施例2-微生物內嵌生物炭的製備以及分析

首先，進行微生物的預培養，以滅菌過的牙籤沾取培養基盤(plate)上的液化澱粉芽孢桿菌至液態培養基(10g/L的胰蛋白腖、10g/L的蛋白腖、5g/L的牛肉萃取物、5g/L的氯化鈉)中，以30℃、130rpm預培養48小時。

以1:20(w/v)的比例將實施例1中製備的蓮霧枝條生物炭、銀合歡枝條生物炭以及棗樹枝條生物炭分別加入液態培養基中，混合均勻後調整pH值至7.3±0.2，接著，放置於高溫高壓滅菌釜中，以121℃、壓力1.2 Kgs/cm ²進行滅菌30分鐘，待具有生物炭的培養基冷卻後，將前述預培養好的微生物以稀釋50倍的濃度加入至具有生物炭的培養基內，並以30℃、130rpm培養72小時，培養完成後以濾紙進行固液分離，分離後的生物炭即為微生物內嵌生物炭。

使用掃描電子顯微鏡觀察液化澱粉芽孢桿菌內嵌蓮霧枝條生物炭、銀合歡枝條生物炭以及棗樹枝條生物炭的影像，結果分別如第3A圖、第3B圖以及第3C圖所示。如第3A圖所示，蓮霧枝條生物炭的孔洞內明顯具有短桿狀液化澱粉芽孢桿菌(如箭頭指示處)，如第3B以及3C圖所示，液化澱粉芽孢桿菌內嵌亦內嵌於銀合歡枝條生物炭以及棗樹枝條生物炭的孔洞中(如箭頭指示處)。上述結果可證實微生物確實可進入生物炭的孔洞內進行生長及繁殖，並且，從掃描電子顯微鏡的影像亦觀察到微生物除了內嵌於生物炭孔洞內之外，亦同時被生物炭吸附於表面。

此外，使用微生物塗佈平板法對製備完成的微生物內嵌生物炭進行定量，測量到微生物總菌量可超過10 ⁸CFU/g，而培養液部分的測量結果甚至高達10 ¹⁰CFU/mL。

實施例3-微生物內嵌生物炭的盆栽試驗

以盆栽試驗測試微生物內嵌生物炭對於植物抗逆境的效果，使用水作為整體實驗的對照組，並以100 mM的氯化鈉作為鹽害逆境的來源，使用的作物為葉用萵苣(青妹)。在鹽害逆境的環境下，分為水、生物炭(蓮霧枝條生物炭)、微生物(液化澱粉芽孢桿菌)及微生物內嵌生物炭(實施例2製備的液化澱粉芽孢桿菌內嵌蓮霧枝條生物炭)4個組別。待作物生長1個月後，分別量測對照組以及上述4個組別的作物的SPAD值(代表綠素含量或綠色程度)、鮮重以及乾重，以及盆栽土壤的電導度(EC值)以及pH值。使用葉綠素計SPAD-502 plus (Konica Minolta, INC，Japan)測量作物的SPAD值，分別使用電導率儀(EZDO 6061)以及pH計(EZDO 6011)量測電導度以及pH值。測量結果如表3所示。

表3

	對照組(水)	鹽害逆境(100mM NaCl)
水	生物炭	微生物	微生物內嵌 生物炭
SPAD值	21.9	7.6	3.4	20.2	19
鮮重 (g)	7.86	0.64	0.12	2.02	0.77
乾重 (g)	0.83	0.05	0.01	0.2	0.1
乾重/鮮重 (%)	10.56	7.81	8.33	9.9	12.99
EC值 (dS/m)	1.5	9.5	9.6	9.9	9.8
pH	7	7.3	7.1	7.2	7.1

如表3所示，在鹽害逆境下，於土壤中加入微生物及微生物內嵌生物炭的組別的SPAD值均接近無鹽害逆境的處理，由此可知微生物可使植物的葉綠素含量相對不受鹽害逆境的影響。相較之下，於鹽害逆境下單獨只加入水的組別的SPAD值下降約65%，而加入蓮霧枝條生物炭的SPAD值下降約84%。

再者，由表3可知對照組(水)、鹽害逆境下的水、生物炭、微生物及微生物內嵌生物炭的組別的乾重/鮮重比例(亦可視為生物量(biomass))分別為10.56%、7.81%、8.33%、9.90%及12.99%。微生物內嵌生物炭組別的乾重/鮮重比例高於只加水的對照組，由此可知微生物內嵌生物炭確實對於作物在抗鹽害逆境的方面有效果，在各項數值中表現皆優良，其次為微生物組別。

此外，根據土壤的EC值以及pH值的量測結果，可知土壤確實累積大量鹽分造成作物萎縮，而土壤pH值大致偏向中性，因此，作物的生長勢在鹽害逆境下確實受到很大的影響，而前述實施例製備的微生物內嵌生物炭確實能幫助作物度過不良環境。

雖然本揭露的實施例及其優點已揭露如上，但應該瞭解的是，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本揭露之精神和範圍內，當可作更動、替代與潤飾。再者，每一申請專利範圍構成個別的實施例，且本揭露之保護範圍也包括各個申請專利範圍及實施例的組合。本揭露之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

10:微生物內嵌生物炭的製備方法

S102~S112:步驟

第1圖顯示根據本揭露一些實施例中，微生物內嵌生物炭的製備方法的步驟流程圖。 第2A圖顯示根據本揭露一些實施例中，以掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)觀察由蓮霧枝條製備的生物炭的影像。 第2B圖顯示根據本揭露一些實施例中，以掃描電子顯微鏡觀察由銀合歡枝條製備的生物炭的影像。 第2C圖顯示根據本揭露一些實施例中，以掃描電子顯微鏡觀察由棗樹枝條製備的生物炭的影像。 第3A圖根據本揭露一些實施例中，以掃描電子顯微鏡觀察液化澱粉芽孢桿菌( Bacillus amyloliquefaciens)內嵌由蓮霧枝條製備的生物炭的影像。 第3B圖根據本揭露一些實施例中，以掃描電子顯微鏡觀察液化澱粉芽孢桿菌內嵌由銀合歡枝條製備的生物炭的影像。 第3C圖根據本揭露一些實施例中，以掃描電子顯微鏡觀察液化澱粉芽孢桿菌內嵌由棗樹枝條製備的生物炭的影像。

10:微生物內嵌生物炭的製備方法

S102~S112:步驟

Claims (23)

1. 一種微生物內嵌生物炭的製備方法，包括：提供一農業廢剩物；將該農業廢剩物進行破碎；以300℃至900℃的溫度範圍加熱該農業廢剩物，使其進行炭化作用以形成具有複數個孔洞的一生物炭；將該生物炭破碎後進行篩選；將經篩選後的該生物炭與一液態培養基混合，並將該生物炭與該液態培養基的混合物進行高溫滅菌；以及將預培養的一微生物稀釋並且將其加入該生物炭與該液態培養基的混合物中進行培養，使該微生物生長於該生物炭的孔洞內部，以形成一微生物內嵌生物炭，其中預培養的該微生物尚未完成發酵作用。
2. 如請求項1所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，其中將該生物炭破碎後，篩選尺寸介於1mm至3mm之間的生物炭。
3. 如請求項1所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，其中以10℃/分鐘至20℃/分鐘的升溫速度加熱該農業廢剩物至300℃至900℃的溫度範圍。
4. 如請求項1所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，其中該生物炭與該液態培養基的混合比例介於1：20(w/v)至5：20(w/v)之間。
5. 如請求項1所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，其中預培養的該微生物係以稀釋50倍至500倍的濃度加入該生物炭與該液態培養基的混合物。
6. 如請求項5所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，其中預培養的該微生物的濃度介於10 ³CFU/ml至10 ⁵CFU/ml之間。
7. 如請求項1所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，其中於將該生物炭與該液態培養基的混合物進行高溫滅菌之前，更包括調整該生物炭與該液態培養基的混合物的pH值介於pH3~10。
8. 如請求項1所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，其中對該生物炭與該液態培養基的混合物進行高溫滅菌的步驟中，溫度介於115℃至135℃之間，壓力介於1Kgs/cm ²至2.5Kgs/cm ²之間，時間介於30分鐘至60分鐘之間。
9. 如請求項1所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，其中該微生物係以培養溫度介於28℃至45℃之間、轉速介於100rpm至250rpm之間於該生物炭與該液態培養基的混合物中培養48小時至168小時。
10. 如請求項1所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，其中該農業廢剩物包括木本植物、草本作物或前述之組合。
11. 如請求項1所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，其中該微生物可吸附於該生物炭的表面上。
12. 如請求項1所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，其中該生物炭的比表面積介於20m ²/g至350m ²/g之間，該生物炭的孔徑尺寸介於1µm至30µm之間。
13. 如請求項1所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，進行培養後其中該微生物內嵌生物炭的微生物總含量為10 ⁸CFU/g以上。
14. 如請求項1所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，其中該液態培養基的成份包括胰蛋白腖(tryptone)、蛋白腖(peptone)、酵母菌萃取物、馬鈴薯萃取物、牛肉萃取物、無水酪蛋白、澱粉、大豆粉、葡萄糖、蔗糖、氯化鈉、氯化亞鐵、硼酸、四水合氯化錳、六水合氯化鈷、氯化鋅、六水合氯化鎳、氯化銅、鉬酸鈉、水或前述之組合。
15. 如請求項1所述之微生物內嵌生物炭的製備方法，其中預培養的該微生物包括芽孢桿菌屬( Bacillus)、假單胞菌屬( Pseudomonas)、根瘤菌屬( Rhizobium)、伯克氏菌屬( Burkholderia)、無色桿菌屬( Achromobacter)、農桿菌屬( Agrobacterium)、細球菌屬( Micrococcus)、產氣桿菌屬( Aerobacter)、黃桿菌屬( Flavobacterium)、歐氏桿菌屬( Erwinia)、克雷伯氏菌屬( Klebsiella)、腸桿菌屬( Enterobacter)、光合菌(photosynthetic bacteria)、乳酸桿菌屬( Lactobacillus)、乳球菌屬( Lactococcus)、足球菌屬( Pediococcus)、鏈球菌屬( Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、麴黴屬(Aspergillus)、酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、梭菌屬(Clostridium)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、白色念珠菌屬(Leuconostoc)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)或前述之組合的微生物。
16. 一種微生物內嵌生物炭，包括：一生物炭，具有複數個孔洞；以及一微生物，內嵌於該複數個孔洞中；其中該生物炭的比表面積介於20m²/g至350m²/g之間，該生物炭的孔徑尺寸介於1μm至30μm之間，且該微生物內嵌生物炭的微生物總含量為10⁸CFU/g以上。
17. 如請求項16所述之微生物內嵌生物炭，其中該生物炭的原料包括木本植物、草本作物或前述之組合。
18. 如請求項16所述之微生物內嵌生物炭，其中該生物炭尺寸介於1mm至3mm之間。
19. 如請求項16所述之微生物內嵌生物炭，其中該微生物更吸附於該生物炭的表面上。
20. 如請求項16所述之微生物內嵌生物炭，其中該微生物包括芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、伯克氏菌屬、無色桿菌屬、農桿菌屬、細球菌屬、產氣桿菌屬、黃桿菌屬、歐氏桿菌屬、克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、光合菌、乳酸桿菌屬、乳球菌屬、足球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、麴黴屬、酵母屬、畢赤酵母屬、 梭菌屬、雙歧桿菌屬、白色念珠菌屬、丙酸桿菌屬、紅假單胞菌屬或前述之組合的微生物。
21. 一種如請求項16至20項中任一項所述之微生物內嵌生物炭之用途，其係用於製造土壤改良劑。
22. 一種如請求項16至20項中任一項所述之微生物內嵌生物炭之用途，其係用於製造水質改良劑。
23. 一種如請求項16至20項中任一項所述之微生物內嵌生物炭之用途，其係用於製造飼料。

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