CN105076217B - 一种淡紫拟青霉菌剂的制备方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淡紫拟青霉菌剂的制备方法，其步骤是：（1）硅藻土、玉米粉和水按质量3:3:4混合得到固体培养基；（2）发酵：超净台里以每200mlPDB种子菌液加入0.5kg固体培养基中，菌液中孢子浓度为10¹⁰‑10¹¹cfu/ml，搅拌均匀后，按厚度2.4‑2.6cm装入容器中，容器封口并通氧，消毒，温度25‑28℃湿度25%‑35%培养，发酵7d‑10d得到固体发酵物；（3）制成颗粒。同时还公开了一中淡紫拟青霉菌剂的发酵装置，在浅盘侧壁设置小孔，无菌棉球或硅胶塞堵住小孔，用橡皮筋将塑料薄膜箍在浅盘的盘口边沿密封。本发明的制备方法工艺简单、成本低廉，适宜于推广应用，装置简单，使用方便。

Description

一种淡紫拟青霉菌剂的制备方法及装置

技术领域

本发明涉及农作物防病控病领域，更具体涉及一种淡紫拟青霉菌剂的制备方法，本发明的制备工艺简单、成本低廉，适宜于推广应用，同时还涉及一种淡紫拟青霉菌剂的制备装置，该装置简单，使用方便。

背景技术

淡紫拟青霉( Paecilomyces lilacinus) 作为一种重要的生防真菌，皆为昆虫病原菌和线虫病原菌。淡紫拟青霉防治谱比较广，除能防治根结线虫、孢囊线虫外对常见的土传病害如棉花枯萎病（王明祖等，1996）、水稻立枯病（肖炎农等，1996）等有较高的防效，具有较好的应用前景。同时由于淡紫拟青霉菌剂具有不污染环境、生产原料来源丰富、对人畜无害、靶标生物不容易产生抗药性等优点，其研究与生产备受世人的关注。菲律宾亚州技术中心已将淡紫拟青霉商品化，以“BIOCON”出售这种真菌制剂，在秘鲁、美国、巴基斯坦用于防治马铃薯线虫效果显著。在印度有产品“Bio-Nematon”在生产上应用。我国也采用液体、固体发酵技术工业化生产商品制剂，在黑龙江、云南、江苏等地防治大豆孢囊线虫和南方根结线虫效果显著。高效生产淡紫拟青霉菌剂并提高淡紫拟青霉在田间的定殖与防效是扩大商业化应用的关键。

目前淡紫拟青霉菌剂的生产工艺和设备采用敞开式固体发酵，其缺点在于发酵过程物料含水量及空气湿度难以控制，且易受杂菌污染，导致发酵失败，故需要研制出发酵时间短，发酵过程稳定，生产成本低廉的制备方法及适用于该制备方法的装置。

发明内容

针对以上技术问题，本发明的目的是在于提供了一种淡紫拟青霉菌剂（P.lilacinus）的制备方法，主要包括最佳的培养基的配方的筛选，以及为了提高淡紫拟青霉的孢子活性，发酵时进行了水分保湿、通氧技术和发酵量的改进，并测试了发酵时间对淡紫拟青霉生长的影响，缩短了发酵时间，降低生产成本。

本发明的另一个目的是在于提供了一种淡紫拟青霉菌剂的装置，该装置结构简单，使用方便，无需特殊的工艺，只要具备打孔器和普通塑料盘即可，通过此装置的改进减少了发酵过程中杂菌的污染，保证了发酵中所需要的水分湿度，使得发酵过程更加稳定，降低了生产成本。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术措施：

一种淡紫拟青霉菌剂的制备方法，其步骤是：

（1）制备固体培养基：将硅藻土、玉米粉和水按质量3:3:4混合均匀得到固体培养基，121℃灭菌20-30min，置于无菌处冷却备用；

（2）发酵：超净台里以每200mlPDB（马铃薯葡萄糖液体培养基）种子菌液加入0.5kg固体培养基中，菌液中孢子浓度为10¹⁰-10¹¹cfu/ml，搅拌均匀后，按厚度2.4-2.6cm装入容器中，容器封口并通氧（在容器侧壁设置孔隙，自然通氧），在消毒的温室里进行培养，培养条件：25-28℃，控制湿度为25%-35%，发酵7d-10d得到固体发酵物；

（3）制成颗粒：按照240g固体发酵物+750g硅藻土+1010ml明胶溶液（冷却到常温）的比例混合均匀，用YK-60小型颗粒机制成颗粒（颗粒机中网筛的孔径为2mm)

所述的明胶溶液的配制方法为：按照75g明胶+935ml水的比例混合，然后加热至60-80℃搅拌至完全溶解，冷却到常温（20-25℃）。

所述的消毒温室采用用甲醛进行消毒，每立方米中将40%甲醛5-8ml与4-8g高锰酸钾混合，密闭熏蒸30-60分钟。

一种淡紫拟青霉菌剂的发酵装置，包括浅盘、塑料薄膜、橡皮筋、无菌棉球（或者硅胶塞），浅盘侧壁上距盘底边沿1.5-5cm处设有4-8个孔径为10-15mm的小孔，小孔内塞入无菌棉球堵住小孔，塑料薄膜覆盖浅盘的盘口并用橡皮筋箍在浅盘的盘口边沿密封。

所述的浅盘的材质为塑料，塑料薄膜的厚度为80μm，无菌棉球（或者硅胶塞）孔径根据打孔大小而定，橡皮筋直径为0.2-0.5mm。

对比试验

（1）传统方法与本发明方法的对比：传统的固体发酵培养基干培养料质量比为米糠：玉米粉：水=3：3：4，装入食用菌培养袋，本发明固体发酵培养基干培养料质量比为硅藻土：玉米粉：水=3：3：4，装入浅盘，两组均混合均匀，121℃灭菌30min，冷却后备用，以200mlPDB菌液加0.5kg固体发酵培养基（此操作在超净台里进行），搅拌均匀后，浅盘在消毒的温室里（用甲醛进行消毒）进行培养，培养条件：28℃，发酵10d。

试验结果见图5，从图中可以看出将培养基组分中米糠换为硅藻土后，每克发酵物中淡紫拟青霉活孢含量仍可以达到10⁹且与米糠作为培养基组分之间差异不显著，由于硅藻土比米糠价格低廉，因此在淡紫拟青霉发酵规模化生产中选用硅藻土作为培养基可以降低生产成本。

（2）通氧与未通氧条件的对比：按照本发明方法发酵，淡紫拟青霉发酵过程中一份通氧，一份未通氧，测定每克淡紫拟青霉发酵物中孢子量。

未通氧的一组采用来规格为45×30×8cm 浅盘发酵，通氧的一组将规格为45×30×8cm 浅盘两边距底部5cm处用12mm的灼热的打孔器各打3个小孔，即共打6个小孔，浅盘经过消毒后在超净台里面塞上无菌棉球，然后两组均以200mlPDB淡紫拟青霉发酵液加0.5kg固体发酵培养基比例加入塑料浅盘搅拌均匀后，用薄膜和橡皮筋密封，在消毒的温室里进行培养，培养条件：28℃，发酵10d，然后调查淡紫拟青霉孢子生长状况。

试验结果见图6，由图可知淡紫拟青霉在进行通氧的条件下可以显著提高孢子活性，可以达到1.23×10⁹。

（3）发酵时间的对比：按照本发明方法发酵，淡紫拟青霉发酵设置了7d、10d、14d，并进行三次重复，测定每克淡紫拟青霉发酵物中孢子量，确定最佳的发酵时间。

试验结果见图7，可以发现在淡紫拟青霉发酵7d、10d、14d淡紫拟青霉孢子量差异不显著，因此在进行淡紫拟青霉规模化发酵时选择7d作为发酵时间，可以缩短发酵时间，提高了生产量。

（4）浅盘装入厚度对比：按照本发明方法发酵，在规格为45×30×8cm 浅盘里面分别装入厚度为2cm、2.5cm、3cm，重复三次，测定每克淡紫拟青霉发酵物中孢子量，确定最佳的装入量。

试验结果见图8，在规格为45×30×8的浅盘里装入厚度为2.5cm待发酵物时与装入厚度为2cm、3cm之间差异非常显著，淡紫拟青霉活孢含量达到了1.79×10⁹/g，因此在进行淡紫拟青霉小规模发酵时，在浅盘里装入厚度为2.5cm时待发酵物更加有利于淡紫拟青霉生长。

本发明与现有技术相比，具有以下优点

1、通过对淡紫拟青霉不同培养基组分进行筛选，在原有培养基米糠+玉米粉+水（3：3：4)组分中，将其中的米糠成分换为硅藻土后，对发酵物中淡紫拟青霉孢子量没有影响，活孢含量数量级可以保持在10⁹，而且硅藻土方便后期颗粒剂的制备，可以降低生产成本，扩大生产规模。

2、通过技术的改进，在发酵过程中，为了使淡紫拟青霉能够更好的生长，在其发酵过程中进行了氧气供应的改进，在单位空间内，可以提高发酵量。通过在发酵装置上加盖薄膜和捆绑橡皮筋保证了菌种生长所需要的湿度，同时还可以防止杂菌污染，使得生产工艺更加优化。

3、发酵时间和装入厚度对淡紫拟青霉生长的影响测定中，发现发酵7d、10d、14d淡紫拟青霉孢子活性之间差异不显著，且数量级保持在10⁹，因此选择7d作为发酵时间，缩短了发酵时间有助于提高生产量。而装入厚度测定中，在发酵浅盘里装入厚度为2.5cm进行发酵时，淡紫拟青霉孢子含量达到了1.76×10⁹。

4、采用本发明的淡紫拟青霉液、固双相发酵培养法，设备简单，只需食用菌培养袋、塑料方盘和能控温的培养室即可满足生产的需要，无需其他固体发酵方法所需固态反应器等专用设备。因此大大降低了生产成本，适宜于淡紫拟青霉的规模化生产，同时制成颗粒剂在施用时更加方便。

附图说明

图1为淡紫拟青霉PL461的液体发酵液。

图2为淡紫拟青霉PL461的固体发酵物。

图3为淡紫拟青霉PL461颗粒剂成品。

图4一种淡紫拟青霉菌剂的发酵装置示意图。

其中：1—浅盘，2—小孔，3—无菌棉球（或硅胶塞），4—橡皮筋，5—塑料薄膜。

图5为不同培养基组分对淡紫拟青霉孢子活性的影响图。

图6为通氧技术对淡紫拟青霉生长的影响图。

图7为不同发酵天数对淡紫拟青霉孢子活性的影响图。

图8浅盘装入厚度对淡紫拟青霉孢子生长的影响图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明。

实施例1

一种淡紫拟青霉菌剂的制备方法，其步骤是：

（1）淡紫拟青霉的液体发酵液制备：在培养基PDA上活化淡紫拟青霉PL461菌株（保藏号CCTCC NO. M2012049）使其生长一周，然后用9mm打孔器打菌饼接在100ml液体培养基里，28℃，160r/min的摇床上培养4d,所得到的淡紫拟青霉PL461发酵液如图1所示；

所述的淡紫拟青霉 (P.lilacinus)PL461菌株来源为：以野生型淡紫拟青霉 36-1菌株 ( 付艳平，1998 年，华中农业大学学报 ) 为出发菌株，一种分离筛选的对禾谷孢囊线虫病有防治作用的淡紫拟青霉菌，通过紫外诱变获得目的菌株，申请人将其命名为淡紫拟青霉 (P.lilacinus)PL461。该淡紫拟青霉(P.lilacinus)PL461于2012年3月9日已在武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO.M2012049，分类命名：淡紫拟青霉(P.lilacinus)PL461。

（2）制备固体培养基：将硅藻土、玉米粉和水按质量3:3:4混合均匀得到固体培养基，121℃灭菌20-30min，置于无菌处冷却备用；

（2）发酵：超净台里以每200mlPDB（马铃薯葡萄糖液体培养基）种子菌液加入0.5kg固体培养基中，菌液中孢子浓度为10¹⁰-10¹¹cfu/ml，搅拌均匀后，按厚度2.4或2.5或2.6cm装入容器中，容器封口并通氧（在容器侧壁设置孔隙，自然通氧），在消毒的温室里进行培养，培养条件：25-28℃，控制湿度为25%-35%，发酵7d或8d或9d或10d得到固体发酵物；

（3）制成颗粒：按照240g固体发酵物+750g硅藻土+1010ml明胶溶液（25-40℃）的比例混合均匀，用YK-60小型颗粒机制成颗粒（颗粒机中网筛的孔径为2mm)，制成的颗粒物如图3所示，图3与现有技术相比该成品为椭圆形，视觉上更加美观。

所述的明胶溶液的配制方法为：按照75g明胶+935ml水的比例混合，然后加热至60-80℃搅拌溶解，然后冷却到常温20-25℃。

所述的消毒温室采用甲醛进行消毒，每立方米中将40%甲醛5-8ml与高锰酸钾4-8g混合，密闭熏蒸30-60分钟。

如图4所示，一种淡紫拟青霉菌剂的发酵装置，包括浅盘1、小孔2、无菌棉球3、塑料薄膜4、橡皮筋5，浅盘1侧壁上距盘底边沿1.5或5cm处设有6个孔径为10或12或15mm的小孔2，小孔2内塞入无菌棉球3堵住小孔2，塑料薄膜4覆盖浅盘1的盘口并用橡皮筋4箍在盘口边沿密封。

所述的浅盘1的材质为塑料，用来装发酵物，规格为45×30×8cm，可根据发酵规模选择浅盘大小，塑料薄膜4的厚度为80μm，用来密封保持水分蒸发和防治杂菌污染的，无菌棉球3孔径根据小孔2大小而定，用于保证发酵时氧气供给，图4中浅盘1的侧壁上共有6个小孔，前侧壁和后侧壁各3个，其中前侧壁的最右边的一个孔中塞有无菌棉球3，橡皮筋4直径为0.2或0.3或0.5mm。

Claims (3)

1.一种淡紫拟青霉菌剂的制备方法，其步骤是：

（1）制备固体培养基：将硅藻土、玉米粉和水按质量3:3:4混合均匀得到固体培养基，121℃灭菌20-30min，置于无菌处冷却备用；

（2）发酵：超净台里以每200mlPDB种子菌液加入0.5kg固体培养基中，菌液中孢子浓度为10¹⁰-10¹¹cfu/ml，搅拌均匀后，按厚度2.4-2.6cm装入容器中，容器封口并通氧，在消毒的温室里进行培养，培养条件：25-28℃，控制湿度为25%-35%，发酵7d-10d得到固体发酵物；

（3）制成颗粒：按照240g固体发酵物+750g硅藻土+1010ml明胶溶液的比例混合均匀，用颗粒机制成颗粒；

所述的明胶溶液的配制方法为：按照75g明胶+935ml水的比例混合，然后加热至60-80℃搅拌至完全溶解，冷却到20-25℃。

2.根据权利要求1所述的一种淡紫拟青霉菌剂的制备方法，其特征在于：所述的消毒温室采用甲醛进行消毒，每立方米中将40%甲醛5-8ml与高锰酸钾4-8g混合，密闭熏蒸30-60分钟。

3.根据权利要求1所述的一种淡紫拟青霉菌剂的制备方法，其特征在于：所述的颗粒剂为YK-60小型颗粒机，颗粒机中网筛的孔径为2mm。