CN101390510A

CN101390510A - 一种直翅目昆虫整体连续切片的预处理方法

Info

Publication number: CN101390510A
Application number: CNA2008102263167A
Authority: CN
Inventors: 张龙; 尹学伟
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2008-11-12
Filing date: 2008-11-12
Publication date: 2009-03-25

Abstract

本发明公开一种直翅目昆虫整体连续切片的预处理方法。该方法依次包括如下步骤：1)将直翅目昆虫冷冻后于Bouin’s固定液中固定，去足，刺孔，之后再放入Bouin’s固定液中，负压抽气后固定；2)在负压抽气的条件下进行梯度脱水处理；3)在负压抽气的条件下进行透明处理；4)采用石蜡进行透蜡处理。本发明提供的预处理方法，在固定、脱水、侵蜡过程中进行负压抽气，可提高处理效率并使各个过程进行更加彻底；该方法优化了侵蜡的时间，使石蜡能够更好地侵入到直翅目昆虫体内各个部位，省略了比较繁琐的专门软化昆虫体壁的步骤。利用该方法能够获得完整的整体连续切片，效果良好，重复性高，适用于直翅目昆虫的整体连续切片。

Description

一种直翅目昆虫整体连续切片的预处理方法

技术领域

本发明涉及显微组织切片技术，特别是一种适用于直翅目昆虫整体连续切片的预处理方法。

背景技术

对直翅目昆虫，尤其是蝗虫组织切片的研究，普通切片技术基本都是对特定的部位取材，进行切片，但是由于蝗虫体壁的阻隔，普通切片技术的固定、脱水、透明、侵蜡等环节都进行不彻底，不好掌握时间，在切片的时候容易造成切片碎裂，不能对蝗虫进行很好的整体连续切片。而对蝗虫整体进行连续切片具有很重要的意义，可以确切了解蝗虫各个器官在特定时间和条件下的整体状态，不仅可以研究不同时期蝗虫各个器官整体发育情况，还可以研究蝗虫组织器官跟病原微生物相互作用在不同时期的整体变化情况。但是，我国目前还没有对直翅目昆虫，尤其是蝗虫进行整体连续切片技术的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种直翅目昆虫整体连续切片的预处理方法。

本发明提供的直翅目昆虫整体连续切片的预处理方法，依次包括如下步骤：

1)将直翅目昆虫冷冻后于Bouin’s固定液中固定，去足，刺孔，之后再放入Bouin’s固定液中，负压抽气后固定；

2)在负压抽气的条件下，用酒精溶液对步骤1)处理完毕的直翅目昆虫进行梯度脱水处理；所述梯度脱水处理的酒精溶液的起始浓度为70％，终浓度为100％；

3)在负压抽气的条件下，采用二甲苯置换步骤2)处理完毕的直翅目昆虫体内的酒精的方法对直翅目昆虫进行透明处理；

4)采用石蜡置换将步骤3)处理完毕的直翅目昆虫体内的二甲苯的方法对直翅目昆虫进行透蜡处理。

上述方法的步骤1)中，将直翅目昆虫冷冻是为了防止直接放到固定液后挣扎，损坏组织结构。用解剖针在蝗虫身体上刺几个孔时，注意要使用锐利的解剖针，刺孔时不能使蝗虫体壁变形，也不能刺入过深，以免伤害内部组织。去足步骤之前的固定时间为1-3小时；刺孔步骤之后的固定时间为12-24小时。

负压抽气时要逐步缓慢进行，以免伤害昆虫的内部组织。可先抽气至-0.03MPa，1小时后抽至-0.06MPa，再1小时抽气至-0.09MPa，放气也要逐步缓慢进行。24小时后，用70％酒精冲洗三次，每次10分钟，使黄色退去，以洗去固定液。

步骤2)中，梯度脱水处理时，酒精溶液的浓度梯度可为70％、80％、90％、95％、100％、100％，每个梯度的处理时间为0.5-1.5小时，优选1小时。本发明中所用浓度均为质量百分比浓度。

步骤3)中，处理时间可根据昆虫的大小和透明情况判断，透明后即可终止透明。如可将昆虫依次经过50％酒精+50％二甲苯、二甲苯、二甲苯。一般每个级别1-2个小时，不可透明时间过长，以免组织发脆，影响切片。

步骤4)中，起始石蜡溶液为50％石蜡水溶液与50％二甲苯水溶液的混合液。具体步骤可为：用50％石蜡水溶液与50％二甲苯水溶液的混合液进行透蜡处理时，温度为40-42℃，时间为1-2小时；

用70％石蜡水溶液与50％二甲苯水溶液的混合液进行透蜡处理时，温度为48-50℃，时间为1-2小时；

用纯石蜡进行透蜡处理的次数为2-4次，优选3次；每次用纯石蜡进行透蜡处理时，温度为56-58℃，时间为6-8小时。

该步骤可在负压抽气的条件下进行。上述步骤2)—步骤4)中，负压抽气的终态压力皆为-0.09MPa。

本发明经过一系列试验方法的筛选和条件的优化及重复试验，建立了一套适用于直翅目昆虫整体组织的预处理方法，采用该方法能对直翅目昆虫进行很好的连续整体切片，切片厚度为10μm。该方法具有以下优点：

1)本发明优化了直翅目昆虫固定的方法和条件，针对直翅目昆虫体壁比较难渗透的特点，固定前进行预处理，先用固定液杀死直翅目昆虫，然后去足、刺孔，再使用逐步负压抽气的方法，使固定液能够更好地渗透到直翅目昆虫体内。

2)本发明在对直翅目昆虫进行固定、脱水、侵蜡的过程中，使用负压抽气的方法，加快各个过程，并且使各个过程进行更加彻底。

3)本发明优化了侵蜡的时间，使石蜡能够更好地侵入到直翅目昆虫体内各个部位，省略了比较繁琐的专门软化昆虫体壁的步骤。

4)本发明在应用于东亚飞蝗三龄蝗蝻的整体切片中，获得了完整的整体连续切片，效果良好，重复性高。由于东亚飞蝗属于直翅目蝗亚目中的飞蝗属，而螽蟖亚目和蝼蛄亚目的昆虫与蝗亚目昆虫具有非常相似的结构，因此本发明适用于直翅目昆虫的整体连续切片。

附图说明

图1是东亚飞蝗三龄蝗蝻的完整切片。

图2是东亚飞蝗三龄蝗蝻的完整切片。

图3是东亚飞蝗三龄蝗蝻的部分连续切片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1、对东亚飞蝗三龄蝗蝻进行整体连续切片的预处理方法

1)材料前处理：东亚飞蝗三龄蝗蝻稍冷冻，入30倍Bouin’s固定液固定1小时，去足，用解剖针在蝗虫身体上刺若干个孔。

2)材料固定：蝗虫放入50倍Bouin’s固定液中，进行负压抽气，固定24小时后，用70％酒精冲洗三次，每次10分钟。

3)脱水处理：经70％、80％、90％、95％、100％、100％梯度酒精进行脱水，每个梯度一个小时，每个梯度进行负压抽气，负压抽气的终态压力为-0.09MPa。

4)透明处理：依次经过50％酒精+50％二甲苯、二甲苯、二甲苯，每个级别1～2个小时，透明后即停止；每个级别负压抽气的终态压力为-0.09MPa。

5)透蜡处理：经过50％石蜡+50％二甲苯，温度40～42℃，时间1～2小时，然后经70％石蜡+50％二甲苯，温度48～50℃，时间1～2小时，最后经过三次纯石蜡，温度56～58℃，时间每次3～4小时，经过纯蜡时进行负压抽气，负压抽气的终态压力为-0.09MPa，完成对东亚飞蝗三龄蝗蝻进行整体连续切片的预处理。之后按照常规方法进行切片，所得结果如图1-图3所示。其中，图1和图2为东亚飞蝗三龄蝗蝻的完整切片，图3是东亚飞蝗三龄蝗蝻的部分连续切片(1～9切片顺序为从头部至尾部)。由图可知，利用本发明提供的预处理方法，能够得到东亚飞蝗三龄蝗蝻的整体连续切片。

Claims

1、一种直翅目昆虫整体连续切片的预处理方法，依次包括如下步骤：

2)在负压抽气的条件下，用酒精溶液对所述步骤1)处理完毕的直翅目昆虫进行梯度脱水处理；所述梯度脱水处理的酒精溶液的起始浓度为70％，终浓度为100％；

3)在负压抽气的条件下，采用二甲苯置换所述步骤2)处理完毕的直翅目昆虫体内的酒精的方法，对所述直翅目昆虫进行透明处理；

4)采用石蜡置换将所述步骤3)处理完毕的直翅目昆虫体内的二甲苯的方法，对所述直翅目昆虫进行透蜡处理。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)的去足步骤之前，所述Bouin’s固定液的用量为蝗虫体积的30-50倍；所述刺孔步骤之后，所述Bouin’s固定液的用量为蝗虫体积的30-50倍；

所述步骤3)中，起始溶液为质量百分比浓度为50％的酒精水溶液与50％的二甲苯水溶液的混合液；

所述步骤4)中，起始溶液为质量百分比浓度为50％的石蜡水溶液与50％的二甲苯水溶液的混合液。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)在负压抽气的条件下进行。

4、根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)—步骤4)中，负压抽气的终态压力均为-0.09MPa。

5、根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，冷冻温度为-5-10℃，冷冻时间为5-10分钟；去足步骤之前的固定时间为1-3小时；刺孔步骤之后的固定时间为12-24小时。

6、根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，用质量百分比浓度为50％的石蜡水溶液与质量百分比浓度为50％的二甲苯水溶液的混合液进行透蜡处理时，温度为40-42℃，时间为1-2小时；

用质量百分比浓度为70％的石蜡水溶液与质量百分比浓度为50％的二甲苯水溶液的混合液进行透蜡处理时，温度为48-50℃，时间为1-2小时；

用纯石蜡进行透蜡处理的次数为2-4次；所述每次用纯石蜡进行透蜡处理时，温度为56-58℃，时间为6-8小时。

7、根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述每个梯度的处理时间为0.5-1.5小时。

8、根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，用质量百分比浓度为50％的酒精水溶液与质量百分比浓度为50％的二甲苯水溶液的混合液进行透明处理时，处理时间为1-2小时；

所述用二甲苯进行透明处理时，处理时间为1-2小时。

9、根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述直翅目昆虫为蝗亚目昆虫。

10、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述直翅目昆虫为蝗亚目昆虫。