JPWO2019082293A1 - 生物組織試料の作成方法、及び生物組織片試料の観察方法 - Google Patents
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Abstract
Description
また、生物組織を透明化して、共焦点レーザー顕微鏡やシート照明顕微鏡を用いて三次元的に観察する方法も開発されているが、試料が透明化されるのに3から4日かかり、観察に要する時間が長いという問題がある。
しかし、SEMでの生物組織の観察では、立体的な構造の観察のためには凍結割断法を用いる必要がある。この場合、試料を凍結するための専用装置が必要で、観察したい部位を狙って割断することが困難であるという問題がある。また、凍結割断法では試料表面を金属でコーティングする必要があり、表面の形態のみしか観察することができない。
なお、皮膚サンプルの評価方法として、皮膚サンプルのSEM観察のためにパラフィン包埋した1〜100μmの厚さの試料で観察する技術が特許文献3により知られている。しかし、ここで紹介される観察技術は、皮膚組織から採った当該試料から細胞を蟻酸などで消化し、細胞間の膠原線維のみ残し、免疫染色して観察するものであり、もともと少ない膠原線維を残すための厚さの確保であり、最終的に観察する対象の厚さは減少している。細胞及び細胞間物質から構成される組織の構造、形態を観察する手法ではない。
以上説明したように、生物組織の立体的な観察を、簡易に且つ迅速に、且つ生物組織片を破壊することなく実行することが求められていたが、従来の方法ではそれが困難であった。
また、本発明に係る走査型電子顕微鏡で観察するための生物組織試料作成方法は、生物組織から切り出した試料を固定、脱水、パラフィン包埋して得られた試料ブロックから15〜50μmの厚さの試料を切り出し、前記試料を表面処理したスライドガラスに転載し、前記試料を前記スライドガラス上で伸展し、脱パラフィン処理を行い、その後、重金属系の染色剤で前記試料を染色することを特徴とする。
まず、第1の実施の形態に従う生物組織試料の観察方法、及び生物組織試料の作成方法を、図1のフローチャート、及び図2の概略図を参照して説明する。
まず、試料(例えば、臓器、iPS細胞から製造したミニ臓器などの組織片や細胞塊)を、片刃カミソリで数mm角の概ね直方体になるよう整形(トリミング)する(ステップS1)。ミニ臓器のように、もともとの大きさが1mm角程度である場合には、トリミングは省略され、そのまま次のステップS2に進む。
その後、トリミング等された試料を、ホルマリン液などで固定する(ステップS2)。
なお、上記のようなホルマリン液による固定に代えて、イソペンタン・プロパン凍結による固定処理を行った後、凍結置換を行うことも可能である。
パラフィンが凝固したら、パラフィンで包理された試料片の上下面を1mm程度、側面は3mm程度にパラフィンごとトリミングして試料ブロックとした後、ミクロトームMTを使用して、更に試料ブロックを薄切りにしてSEM観察用試料片を作製する(ステップS5、図2(a))。このSEM観察用試料片の厚さは、光学顕微鏡観察で常用される4〜5μmに比して3〜10倍に相当する15〜50μm(好適な例としては30μm)とする。また、同じSEMによる観察方法であるSBF−SEM法やFIB−SEM法では、数十nmの厚さで切片を連続して切り出し、後に複数の画像を合成する必要があるが、本実施の形態の方法では、厚さ15〜50μmの1つの切片にて、生物組織の観察が可能である。このため、従来の観察法に比べ、試料の作製は簡便性・迅速性・汎用性が改善される。
この45℃〜55℃、というスライドガラスSGの加熱温度は、従来において一般的な40℃よりも高い温度である。本実施の形態でも、このような一般的な温度である40℃で加熱することも可能である。
ただし、本実施の形態のSEM観察用試料片Sの厚さは、15〜50μm、好適には30μmと大きく、スライドガラスSG上で伸展しにくい場合がある。そのような場合には、4〜5μmの厚さの切片で頻用される40℃前後より高温の、45℃〜55℃、好適には約50℃に熱したホットプレート(図示せず)上で伸展することが効果的である。30μm厚の切片は、通常のスライドガラスSGでは染色の過程で剥離(サンプルが厚いと剥離しやすい)しやすいが、例えば、武藤化学製のNEWシランIIにより特殊コーティングされたスライドガラスなどを用いることによって剥離の問題は解決される。
光学顕微鏡での生物組織試料の観察は、試料の水洗後にヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)して観察するが、上記のように第1の実施の形態では、TEM観察と同様に重金属を含む染色液で試料片の内部を染色し、SEM観察をおこなう。この処理により反射電子像のコントラストを増加させることができる。なお、一般に、生物組織試料をSEM観察するためには、生物組織試料への帯電の防止のため、試料に金属をスパッタリングや真空蒸着によってコーティングするが、本実施の形態では、試料内部の観察を行うため、金属コーティングは行わない。第1の実施の形態では、低真空のSEM観察を行うことにより、帯電の問題を回避する。また、第2の実施の形態では、後述するように、イオン液体の付加により、帯電の問題を回避する。
試料片Sから発生した二次電子や反射電子(後方散乱電子)信号は、それぞれの信号に適した検出器107や106で検出され、画像処理部108により画像濃度の情報に変換される。XY走査に同期して画像濃度の情報を幅Lの表示装置に並べてSEM像を形成している。表示装置の110の幅Lと試料片S上での振り幅lとの比率が画像の倍率となる。倍率を大きくする時は振り幅lを小さくする。
SEMの観察倍率は、最大で数十万倍に設定することができるが、本実施の形態の場合、観察倍率は数百倍〜数千倍程度でよく、光学顕微鏡の観察倍率の一部重なる程度の倍率である。
なお、電子ビームの入射角度を変更する代わりに、ステージ113の傾斜角度を2通りに変化させて二枚の画像を撮影することもできる。また、2枚の画像の一方を赤、他方を青に変更して、アナグリフめがねで立体観察することもできる。なお、1枚の画像のみで試料の立体構造が十分に理解できる場合には、1枚の画像の撮影のみを行うこともできる。
第1の実施の形態の効果を以下に説明する。第1の実施の形態では、生物組織から切り出した試料を固定、脱水及びパラフィン包理し得られた試料ブロックから、好適には刃先角22°のミクロトーム替刃で、15〜50μmの厚さの試料片Sを切り出す。その後、試料片SをスライドガラスSGに転載し、当該試料片Sを前記スライドガラスSG上で伸展し、脱パラフィン処理を行う。その後、SEMでの観察のため、重金属系の染色剤で試料片Sを染色する。そして、染色した試料片Sを走査型電子顕微鏡で観察する。パラフィン包埋した切片をSEMで観察するので、光学顕微鏡では観察できなかった微細な構造を観察することができる。また、光学顕微鏡では数μm程度に薄切りして観察をする必要があったところ、本発明では観察にSEMを用いるため、15〜50μmという厚さの試料片Sを(更に薄切りすることなく)一括して観察することができる。試料片Sが50μmのような大きな厚さを有していたとしても、SEMの大きな焦点深度により、試料片Sの表面から裏面まで、鮮明にその構造が撮像された立体画像を得ることができる。このような大きな厚さの試料片Sをリアルタイムに観察することは光学顕微鏡では不可能であり、また、SEMでも、従来はSBM−SEM法などにより、薄切りされた試料片を連続撮影し、合成する必要があった。
次に、第2の実施の形態に従う生物組織試料の観察方法、及び生物組織試料の作成方法を、図10のフローチャートを参照して説明する。
この第2の実施の形態の観察方法は、高真空雰囲気化で行われる。このため、電子染色(S9)の後、イオン液体を、試料片Sの表面に塗布するか、又は試料片Sをイオン液体中に含浸させるなどして、試料片Sにイオン液体を付加させる(ステップS10)。それ以外の工程は、第1の実施の形態(図1)と同一である。
高真空のSEMを用いた場合、試料片Sへの電荷の蓄積が増加し、二次電子に影響を与えることがある。しかし、イオン液体を試料片Sの表面に付加することで、試料片Sへの電荷の蓄積(チャージアップ)を抑制することができ、これにより二次電子に基づく画像が観察しやすくなる。ただし、この場合、試料片Sの観察は、主に表面となる。ただし、表面の下方の画像は撮像され、これにより試料を立体観察することができる。
なお、第2の実施の形態においても帯電が問題にならない場合は、反射電子を用いた観察も可能である。
次に、第3の実施の形態に従う生物組織試料の観察方法、及び生物組織試料の作成方法を、図11を参照して説明する。
この第3の実施の形態では、SEMにおいて、図11に示すように、検出器106として、複数、例えば4つに分割された反射電子検出器106A〜106Dを用いる。4つの反射電子検出器106A〜106Dは、反射電子の方位角に合致した向きに検出面を有する。すなわち、反射電子検出器106A〜106Dは、反射電子の方位角によって複数に分割されており、方位角ごとに独立して画像形成することが可能に構成されている。これにより、反射電子に基づく画像をより鮮明にすることができる。
この点、本実施の形態では、試料を固定、脱水及びパラフィン包理した試料を15〜50μmに切り出すものであり、このような処理はSEM、TEM、光学顕微鏡のいずれの観察でも行われていなかったものである。本発明は、このような試料の処理を行うことにより、初めて生物組織試料の立体構造を、組織を破壊することなく簡便に行うことを可能にしたものである。
106、106A〜106D…反射電子検出器、107…二次電子検出器、
108…画像処理部、109…走査電源、110…表示装置、113…ステージ、S…観察用試料片、SG…スライドガラス。
試料片Sから発生した二次電子や反射電子(後方散乱電子)信号は、それぞれの信号に適した検出器107や106で検出され、画像処理部108により画像濃度の情報に変換される。XY走査に同期して画像濃度の情報を幅Lの表示装置に並べてSEM像を形成している。表示装置110の幅Lと試料片S上での振り幅lとの比率が画像の倍率となる。倍率を大きくする時は振り幅lを小さくする。
Claims (13)
- 生体組織試料の立体的な形態を観察する生物組織試料の観察方法であって、
生物組織から切り出した試料を固定、脱水、及びパラフィン包埋して得られた試料ブロックから15〜50μmの厚さの試料を切り出し、
前記試料をスライドガラスに転載し、
前記試料を前記スライドガラス上で伸展し、脱パラフィン処理を行い、
その後、重金属系の染色剤で前記試料を染色し、
染色した前記試料を走査型電子顕微鏡で観察する、
ことを特徴とする、生物組織試料の観察方法。 - 前記試料を前記スライドガラス上で伸展することは、45℃〜55℃の温度下で行われる、請求項1記載の生物組織試料の観察方法。
- 前記試料ブロックからの試料の切り出しは、刃先角22°のミクロトーム替刃を用いて行われる、請求項1又は2記載の生物組織試料の観察方法。
- 前記走査型電子顕微鏡で、前記試料から生じる二次電子の信号に基づく画像を観察する、請求項1、2、3記載の観察方法。
- 前記走査型電子顕微鏡で、前記試料から生じる反射電子の信号に基づく画像を観察する、請求項1、2、3記載の観察方法。
- 前記走査型電子顕微鏡で、前記試料から生じる二次電子の信号と、前記試料から生じる反射電子の信号とを加算した信号に基づく画像を観察する、請求項1、2、3記載の観察方法。
- 染色した前記試料に対し、更にイオン液体を付加させる、請求項4、5、6記載の生物組織試料の観察方法。
- 前記走査型電子顕微鏡において、前記試料への電子線の入射角度が異なる複数の画像を取得することを特徴とする、請求項4、5、6、7記載の観察方法。
- 前記走査型電子顕微鏡において、前記試料の傾斜角を異ならせて複数の画像を取得することを特徴とする、請求項4、5、6、7記載の観察方法。
- 反射電子検出器が反射電子の方位角によって複数に分割され、方位角ごとに独立して画像形成する、請求項5、7記載の観察方法。
- 生物組織から切り出した試料を固定、脱水、パラフィン包埋して得られた試料ブロックから15〜50μmの厚さの試料を切り出し、
前記試料をスライドガラスに転載し、
前記試料を前記スライドガラス上で伸展し、脱パラフィン処理を行い、
その後、重金属系の染色剤で前記試料を染色する
ことを特徴とする、走査型電子顕微鏡で観察するための生物組織試料の作成方法。 - 前記試料を前記スライドガラス上で伸展することは、45℃〜55℃の温度下で行われる、請求項11記載の生物組織試料の作成方法。
- 前記試料ブロックからの試料の切り出しは、刃先角22°のミクロトーム替刃を用いて行われる、請求項11又は12記載の生物組織試料の作成方法。
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