JPH06258578A

JPH06258578A - 試料断面からの立体情報画像化装置及びその試料断面画像の観察方法

Info

Publication number: JPH06258578A
Application number: JP4408893A
Authority: JP
Inventors: Toshiro Higuchi; 俊郎樋口; Isamu Aoki; 勇青木; Kenichi Kudo; 謙一工藤; Masatomo Kobayashi; 賢知小林
Original assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology
Current assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology
Priority date: 1993-03-04
Filing date: 1993-03-04
Publication date: 1994-09-16

Abstract

(57)【要約】【目的】従来の切片観察法での透過顕微鏡像に近い色
情報を用いられる光源（例えば、リングライト）を用い
た透明試料の色観察と、マイクロスライサを用いた切断
面観察の利点を活かした対物レンズの光軸と直交方向の
一断面抽出を行うことができる生体試料断面からの立体
情報画像化装置を提供する。【構成】試料の表層を順次除去し、該試料の表面を観
察する試料断面からの立体情報画像化装置において、透
過材料に包埋される試料２１と、該試料２１に対向する
対物レンズ２３と、該対物レンズ２３に直接反射光が入
射しないように配置するリングライト２４を設け、該リ
ングライト２４からの照射により前記試料２１の表層の
画像と該表層に続く内部の画像を得て、該試料の表層を
除去し、該除去により現れる新たな表層の画像と該表層
に続く内部の画像を得る撮像手段と、前記撮像手段から
の画像を処理して、色情報及び前記対物レンズの光軸と
直交方向の一断面像の抽出を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、マイクロスライサを用
いて試料を順次切断し、試料の切断面を観察する試料断
面からの立体情報画像化装置及びその試料断面画像の観
察方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来の微小組織の内部観察法の主流は、
ミクロトームやクリオスタットと呼ばれる切片作成装置
を用い、切片を作成した後、その切片を光学顕微鏡また
は電子顕微鏡を用いて透過観察するものである。ミクロ
トームを用いた生体組織の切片観察法を簡単に説明す
る。

【０００３】まず、ホルマリンなどの薬品を用い試料の
固定を行う。固定により組織の主要構成成分であるタン
パク質を安定化、不溶化し生きている状態に近い状態に
保つ。利用する染色法に適した固定法を選ぶ必要があ
る。次に、顕微鏡で観察する部分を採取する。これを切
り出し（細切り）と呼ぶ。骨、歯、石灰などの沈着した
組織を薄切りするには、前処理として、硝酸などの溶液
中で脱灰を行う。

【０００４】以上の処理を終えた後、包埋処理を行う。
これは固定を終えた組織でも、そのままでは固さが不均
一な上、柔らかすぎて２〜３μｍの厚さの薄切りが不可
能なためである。包埋剤には、パラフィン、セロイジ
ン、カーボワックス、ゼラチン、エポキシ樹脂等が用い
られるが、光学顕微鏡観察で最も一般的なものは、パラ
フィン包埋法である。包埋処理とは、脱水（脱脂）、置
換、パラフィン浸透、包埋の一連を指す。今日では、脱
水からパラフィン浸透までは、自動脱水包埋装置によっ
て自動化されている。

【０００５】包埋された試料を、光学顕微鏡下で観察す
るために、約３μｍ程度に薄切りを行う。この厚さは、
試料の組織や、細胞が重ならずに微細構造を観察するた
めである。常温で薄切りする装置は、ミクロトームと呼
ぶ。ミクロトームは構造的に、滑走式（ユング型、シャ
ンツェ型、ライヘルト型、テトランダー型）と、回転式
（ミノー型、ザルトリウス型）に大別されるが、最も普
及しているのはユング型ミクロトームである。これは二
組二本ずつの平行する滑走路があり、一組の滑走路上を
刃が、ねじれの位置にあるもう一組の滑走路上を試料が
移動する。切削は刃を手で移動させて行われ、試料の送
りは試料が刃とねじれた方向に進むことによって生ず
る。

【０００６】刃を逃げ角、引き角を合わせて固定し、冷
却したパラフィン試料ブロックも固定する。次に、余計
なパラフィンを削り落とす。面だし荒削り行う。その
後、所定の量だけブロック固定台を進める。そして、息
を吹きかけ湿気を与え、刃がブロックに切り込んだとこ
ろで左手で水に濡らした小紙片や筆をカーリング片裏面
に付着させ、メスを引く速度に合わせて持ち上げながら
薄切りする。

【０００７】薄切りに成功した切片は、裏面（光沢のあ
る側）を水面に向け切片の端から気泡が入らないように
静かに浮かべる。連続切片を作る場合は、切片の移動を
なくすために水槽に卵白グリセリンを２〜３滴たらし水
槽の淵から順番に薄切り切片を並べて行く。切片をスラ
イドガラス上にすくい上げ、４０〜５０℃の伸展板に載
せ十分に伸展する。この後１〜２時間で６０〜６５℃の
恒温室内でスライドガラス上に固定し、各種染色操作に
はいる。染色を終えた試料は、アルコールで脱水され、
キシロールで標本を透明にし（透徹）、封入する。

【０００８】次に、凍結切片薄切り法について説明す
る。凍結切片作成には、クリオスタットを用いる。試料
は未固定でゼリー状のコンパウンドに包埋し、ドライア
イス・アセトン、ドライアイス・液体窒素等で瞬間凍結
させた後、クリオスタットで薄切りし、この後、固定処
理を行う。この方法は、組織化学的検索（酵素組織化
学、蛍光抗体法、酵素抗体法）に応用される。

【０００９】また、光学顕微鏡での観察では、パラフィ
ン包埋法に解像度では劣るが、極めて短時間に標本作成
が可能なため、特に術中迅速診断に利用されている。ク
リオスタットは、冷却装置の付いた回転式のミクロトー
ムで、ハンドルを手動で回転させ、リンクを介して刃を
直動させ切削する。薄切り、及び薄切りされた試料の取
り出しは、パラフィン試料同様、極めて高度な技能を要
する。また、未固定の試料を扱うため、感染の危険があ
り、感染予防に十分な注意を要する。

【００１０】最後に、ＴＥＭのための電子顕微鏡染色に
ついて簡単に説明する。これは一般の光学顕微鏡での切
片観察法に極めて似ている。しかし透過させるものが、
光線ではなく電子線であるために、切片の厚さが５０〜
９０ｎｍと極薄切り切片となる。試料の固定や切り出
し、脱水については、使用する薬品や切り出す大きさに
違いはあるが、基本的にはパラフィン包埋と同じ行程を
たどる。電子顕微鏡では、包埋剤として一般にエポキシ
樹脂系の包埋剤を用いる。こうして包埋された試料は、
ウルトラミクロトームと呼ばれる超薄切り専用装置を用
いて薄切りされる。この装置で用いられる刃は、ガラス
ナイフやダイヤモンドナイフなどである。この装置を用
い、まず光学顕微鏡標本を作成し、試料のどこを観察し
ているかを確認できるようにする。その後、超薄切りを
行い、超薄切り切片をグリッドに貼り付け染色処理を行
う。透過電子顕微鏡での染色ではウランや鉛などの重金
属の染色を行う。

【００１１】このように切片を作成する方法では、主に
分解能の高さや多重染色、複数の染色の利用を考えて観
察法が構築されてきている。しかしながら、切片作成法
では、その準備と後処理の行程の多さに加え、薄切りそ
のものが非常に高度な技術を要し、未だに自動化されて
いない。三次元像の再構築を考えるとき、連続切片法の
利用も考えられる。しかしこの方法は、同一組織を複数
の染色で観察する場合に利用されることが多く、同一の
染色を行っても、三次元像としての可視化は困難であ
る。なぜなら、実際に三次元像を作成するためには、ま
ず、連続する試料相互の位置決めが問題になる。また、
薄切りの際に生じた変形と、変形の回復のための伸展を
加えるが、試料切片の形状精度の維持を考えると大きな
問題になる。

【００１２】以上の二点を解決できたとしても、連続す
る多数枚の試料を重ね合わせて三次元像を構築すること
は、切片作成の労力を考えると事実上不可能である。し
たがって、従来の切片観察法は形状情報の観察に重点を
おいた、三次元像の再構築に適したシステムとは言いが
たい。そこで、生体試料の三次元像観察のために、新た
に生体試料の三次元顕微観察に適した観察システムが提
案され、開発されてきている。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】以下、マイクロスライ
サを用いた切断面観察法について説明する。前記したよ
うに、従来の内部観察法の主流である切片観察法は、（１）切片の作成自体が困難である。（２）切片の相互の位置決めが困難である。

【００１４】（３）切片の形状精度の維持が困難であ
る。このように、従来の切片観察法は、大量の断面像から構
成する高精度な三次元像の再構築には適していない。そ
こで、切片を作成し、それを観察するのではなく、従来
切片は切りとられた後には、観察をされなかった試料ブ
ロックの切断面を観察することにより、上記の切片観察
法では解決できなかった問題を解決する。すなわち、（１）切片観察法同様に切削を行うが、切断面上の観察
を行うようにするので、切片作成の技術的困難を避けら
れる。

【００１５】（２）試料ブロックの側を観察しているの
で、試料ブロックの位置決めさえしっかり行えば、試料
観察時の試料相互の位置決め精度は極めて向上する。（３）また、切片と試料ブロックとでは切削時の変形は
明らかに試料ブロックの方が少ない。したがって、切断面観察法を用いることにより、多数の
断面を観察する必要のある三次元像再構築に適したシス
テム、すなわちマイクロスライサを用いた三次元内部構
造顕微鏡（ＭｉｃｒｏｓｌｉｃｅｒＩｍｐｌｅｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎｏｆ３ＤＩｎｔｅｒｎａｌＳｔｒｕ
ｃｔｕｒｅＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ＝３Ｄ−ｉｓｍ）を
構築可能である。

【００１６】また、この切断面観察法を用いれば、殆ど
あらゆる種類の表面観察装置の利用が可能になる。例え
ば、落射光学顕微鏡やＳＥＭ、ＳＴＭ、ＡＦＭ等の高分
解能顕微鏡の利用が可能であり、三次元像の分解能も顕
微鏡に応じたものが得られる。ここでは、切断面観察の
顕微鏡として、光学顕微鏡を用いる。これは、一般の生
体試料観察は、光学顕微鏡に基づいて行われているた
め、従来の観察との対照を容易にするためである。光学
顕微鏡には、透過型と落射型の二つがある。試料の切断
面の観察には、試料が透明か、薄くない限り落射光学系
が適している。

【００１７】したがって、マイクロスライサを用いた三
次元内部構造顕微鏡では、落射光学系の顕微鏡を用いる
こととした。ここで、なぜ、今まで光学式顕微鏡を用い
て切断面観察が行われなかったかを考えてみる。人の目
では明るさの差よりも色の違いにより敏感に反応する。
そのため組織の違いを色情報の違いとして肉眼で観察し
易くするために染色技術が進み、色情報の観察が重要視
されてきた。一方、落射光学顕微鏡は透明試料の色情報
の観察は困難だが、透過光学顕微鏡は試料の色情報を観
察するのに適している。

【００１８】しかしながら、透過光学顕微鏡では、試料
は透明か、薄くなければ観察できない。したがって、透
過光学顕微鏡を用いて色情報の観察を行うために、切片
観察法が利用されてきた。切片観察法のもう一つの利点
として、観察したい試料に光軸方向の重なりがないため
に明確な一断面像が得られるということが挙げられる。

【００１９】これは細胞の観察時にひとつの細胞層のみ
の観察が行えるので、肉眼観察には非常に適している。
一方、切断面の観察法では光軸方向のセクショニング
は、観察したい切断面より顕微鏡側については切片観察
法と同様重なりがないが、試料ブロック側に対しては分
解能は低く、下層の試料と重なりが生じてしまう。

【００２０】したがって、肉眼での直接観察には適して
いない。光軸方向のセクショニング技法として、共焦点
レーザ顕微鏡を用いたり、ＦＦＴを用いた画像処理等の
応用がなされている。しかしながら、共焦点レーザ顕微
鏡はシステムが高価で、一般的な観察法とは言いがた
い。また、ＦＦＴを用いた画像処理は、顕微鏡部分に一
般のものを利用可能で、画像処理もパーソナルコンピュ
ータやワークステーテョンレベルで可能であるが、ＦＦ
Ｔを用いても処理時間がかかりすぎるというのが問題に
なる。

【００２１】更に、従来の透明試料の色情報は試料の内
部での光の減衰による色の見えを観察している。ところ
が、落射光学顕微鏡の照明系は、図１０に示すように、
対物レンズ１により試料表面３での直接反射光を観察し
ているため、透明試料の色情報はほとんど観察ができな
い。本発明は、上記した問題を解決するために、従来の
切片観察法での透過顕微鏡像に近い色情報を用いられる
光源（例えば、リングライト）を用いた透明試料の色観
察と、マイクロスライサを用いた切断面観察の利点を活
かした前記対物レンズの光軸と直交方向の一断面抽出を
行うことができる試料断面からの立体情報画像化装置及
びその試料断面画像の観察方法を提供することを目的と
する。

【００２２】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するために、（Ａ）試料の表層を順次除去し、該試料の表面を観察す
る試料断面からの立体情報画像化装置において、透過材
料に包埋される試料と、該試料に対向する対物レンズ
と、該対物レンズに直接反射光が入射しないように配置
する光源と、該光源からの照射により前記試料の表層の
画像と該表層に続く内部の画像を得て、該試料の表層を
除去し、該除去により現れる新たな表層の画像と該表層
に続く内部の画像を得る撮像手段と、前記撮像手段から
の画像を処理して、色情報及び前記対物レンズの光軸と
直交方向の一断面像の抽出を行う手段とを設けるように
したものである。

【００２３】また、前記光源は前記対物レンズの回りに
配置されるリングライトとなし、前記透明生体試料の薄
層除去時の凹凸を消す絞りを設ける。更に、前記光源は
点光源又は線光源でもよい。（Ｂ）試料の表層を順次除去し、該試料の表面を観察す
る方法において、透過材料に包埋される試料をステージ
に設定し、該試料に対向する対物レンズに直接反射光が
入射しないように光源を配置し、該光源からの照射によ
り前記試料の表層の画像と該表層に続く内部の画像を観
察し、該試料の表層を除去し、該除去により現れる新た
な表層の画像と該表層に続く内部の画像を観察し、前記
観察画像を処理して色情報及び前記対物レンズの光軸と
直交方向の一断面像の抽出を行うようにしたものであ
る。

【００２４】また、前記試料の断面からの距離と前記試
料の光学的特性に基づいて、前記断面情報からの演算に
よって前記試料の内部の画像を取り除き、該試料の表層
の画像のみを得るようにしたものである。

【００２５】

【作用】本発明によれば、三次元像観察の可能な顕微鏡
システムとしてマイクロスライサを用いて試料を次々に
切断し、試料の切断面観察を行う。また、それに適した
切断面観察法として、落射光学顕微鏡を用い、従来の透
過光学顕微鏡での情報と対照できるマイクロスライサを
用いた三次元内部構造顕微鏡（Ｍｉｃｒｏｓｌｉｃｅｒ
Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆ３ＤＩｎｔ
ｅｒｎａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅＭｉｃｒｏｓｃｏｐ
ｅ＝３Ｄ−ｉｓｍ）を用いる。

【００２６】そこで、三次元像の再構築に適したシステ
ムとして、切片観察法に代えて、切断面観察を行い、マ
イクロスライサを用いて試料断面を次々に作成し、その
切断面を観察する。また、従来の透過光学顕微鏡観察で
得られた情報との対照を行いやすくするために、落射光
学顕微鏡を観察手段として選択し、しかも色情報の観察
と、対物レンズの光軸と直交方向の一断面像抽出を可能
にした。

【００２７】更に、落射光学系での透明生体試料の色情
報の観察法を行う。これは通常の落射照明の直接反射光
ではなく、リングライトを用いて試料内部の乱反射を観
察することによって、透過観察で得られる色情報を観察
する。また、リングライトを用いると、偏射照明の作用
により試料表面の切断表面の凹凸が強調されてしまう。
そこでリングライトに絞りを設けて、その凹凸を強調し
ないような照明を行う。

【００２８】最後に、前記対物レンズの光軸と直交方向
の一断面像の抽出を行う。これは、観察したい切断面
は、次の切断面の観察の前に除去されるという切断面観
察法の利点を活かし、従来法より簡単な画像処理によ
り、達成することができる。

【００２９】

【実施例】以下、本発明の実施例について図面を参照し
ながら詳細に説明する。図１は本発明の実施例を示す試
料断面からの立体情報画像化装置の断面図、図２はその
試料断面からの立体情報画像化装置の概略斜視図であ
る。これらの図において、２１は透過材料に包埋された
生体試料（以下、透明生体試料）、２２はスピンドル、
２３は対物レンズ、２４はリングライト、２５は切断
刃、２６はインチウォーム・アクチュエータ、２７は変
位センサ、３１は上部プレート、３２は下部プレート、
３３はステージを構成する熱絶縁体、３４は切断アー
ム、３５はカウンタ・バランス・アーム、３６はエンコ
ーダ、３７はフライホイール、３８はベルト、３９はＡ
Ｃサーボモータである。

【００３０】透明生体試料２１はインチウォーム・アク
チュエータ２６の微小駆動により、上方へ押し上げられ
る。この透明生体試料２１の位置は、変位センサ２７に
より計測される。透明生体試料２１に対向するように、
対物レンズ２３が設けられ、その回りにリングライト２
４が配置される。そこで、後述する切断面観察による透
明試料の色観察が行われ、順次、切断刃２５の回転によ
り、透明生体試料２１は薄層切断され、この面が情報画
像となる。

【００３１】ここで、切断刃２５は、切断アーム３４に
取り付けられ、この切断アーム３４は装置に取り付けら
れたＡＣサーボモータ３９により、ベルト３８を介して
スピンドル２２により駆動される。以下、この実施例で
は、光源としてリングライトを用い、マイクロスライサ
を用いた切断面観察による透明試料の色観察法について
説明する。

【００３２】ここでは、照明からの直接反射光が対物レ
ンズに入らない落射光学系を構築することにより、透明
生体試料の色情報を観察する。図３に示すように、この
直接反射光のない光学系として、マイクロスコープ対物
レンズ１２の回りに光源としてのリングライト１３を用
いた照明系を用い、試料の内部１６や試料の表層１５で
の散乱光を観察することにより、透過観察時に観察され
る透明生体試料の色情報に近いものを観察可能にする。
なお、１４はオプティカルファイバーである。

【００３３】なお、この場合、偏射照明系としての回折
の作用を考慮しなければならない。偏射照明では見分け
ようとする被観察物表面の格子に対し直角の方向から偏
射を行った場合に、解像力を２倍に上げる作用が生ず
る。リングライト照明を行うと、切断面表面のチャター
マークやカッターマークなどの凹凸性状に照明の方向や
角度によって非常に敏感になる。切断機構の剛性を上げ
ることにより、チャターマークを減少することは比較的
容易であるが、カッターマークの除去は平刃を用いて切
削する限り困難である。

【００３４】そこで、図５に示すように、リングライト
２４の照明の内、表層１５のカッターマーク４１を強調
する方向のリングライト２４の照明に絞り４２を設けて
しまうことで、カッターマーク４１で生じた光学格子を
観察しないようにしながら色情報の観察を行う。逆に、
図６に示すように、リングライト２４に絞り４３を設け
て、リングライト２４をカッターマーク４１に対して、
図６に示すように、配置すると、絞りの効果はなくな
り、表層１５のカッターマーク４１が生じた光学格子を
観察することになってしまう。

【００３５】上記した照明装置としては、例えば、図４
に示すように、リングライト２４はホヤショット製のＦ
ＧＲ６ＦＤ３２Ｒを基にした特注品で、リング内径φ₁
は３２．１５ｍｍ、光源直径φ₂は３６ｍｍ、光軸角度
は３０°、開口角は２４°である。図４に示すように、
偏射照明系の効果を減らすために絞りが取り付けられ
る。

【００３６】高倍率観察や、蛍光観察では光量が不足す
るため高感度カメラが必要になる。そこで、例えば、池
上通信機製の最底被写体照度０．１１ｕｘの高感度ＣＣ
ＤカラーカメラＩＣＤ８８０を画像取り込み装置として
用いる。このように、リングライトを用いた透明生体試
料の色情報の観察法では、図３に示すように、試料表面
の直接反射光を観察するのではなく、試料内部にまで浸
入した光の散乱を観察している。

【００３７】したがって、観察されているのは観察を行
いたい試料の切断面の表層のみならず、次に観察するべ
き切断面の情報も混在してしまっている。通常、このよ
うな光軸方向の光学情報の混入を避けるには、共焦点レ
ーザ顕微鏡やＦＦＴを用いた三次元光学顕微鏡などが利
用されている。しかし、前記したように、共焦点レーザ
顕微鏡やＦＦＴを用いた三次元光学顕微鏡などにはそれ
ぞれ欠点がある。

【００３８】そこで、本発明によれば、観察する切断面
が次の観察時には除去されているという切断面観察法の
特徴を活かした画像処理を行うことにする。以下、その
本発明の切断面観察法の画像処理について説明する。（１）まず、観察したい試料表面を落射光学顕微鏡で観
察する。（２）次に、試料表面を切削し、再び同様に観察する。

【００３９】このときの光の透過、反射、減衰を簡略化
した模式図を図７に示す。ここで、反射係数ｒ、吸収係
数ｋ、透過係数ｔ＝１−ｋ−ｒと置く。添数字は何層目
かを示し、Ｉ₀は入射光を示す。像に現れる全ての出射
光の和を、切断前はＩＭ_a、切断後はＩＭ_bとする。ま
た２度以上の反射の影響を無視する（ｒ＜＜１）。な
お、簡便のために各層は光学顕微鏡の焦点深度の中にあ
るものとする。〔画像処理法その１〕 IM_a＝I₀・ｒ₁＋I₀・ｔ₁ ²・ｒ₂＋I₀・ｔ₁ ²・ｔ₂ ²・ｒ₃＋… (1) IM_b＝ I₀ ・ｒ₂＋I₀ ・ｔ₂ ²・ｒ₃＋… (2) そこで、二つの画像の引算(2) −(1) を行う。

【００４０】 IM_b−IM_a＝ｒ₁・［｛（１−ｔ₁ ²）／ｒ₁｝・IM_b−I₀］ (3) 仮定よりｔ₁＝１−ｋ₁−ｒ₁ (4) ∴（１−ｔ₁ ²）／ｒ₁＝２−ｒ₁−２・ｋ₁＋ｋ₁・（１−ｋ₁）／ｒ₁ (5) ここで、反射率ｒ＜＜１で、減衰率ｋ₁がｒ₁より十分
に小さいとすると（つまり、透明であれば）（１−ｔ₁ ²）／ｒ₁＝２ (6) (6)を(3) に代入し、透過光観察に近い像 I₀・ｔ₁＝I₀・（１−ｒ₁）＝I₀［１−（IM_b−IM_a）／（２・IM_b−I₀）］ (7) を得る。

【００４１】ただし、減算時には非負条件を適用する。
このように、透過光観察を行うことにより、切断面に左
右されない切断面観察による透明試料の色観察を行うこ
とができる。実際に、カバーガラス上にＯＨＰ用のペン
で描いた図形を３枚重ねて観察した（図示なし）。

【００４２】その結果、上記観察法により、上の層のみ
の一層が抽出され、一層抽出画像を鮮明に得ることがで
き、色観察を行うことができた。〔画像処理法その２〕 IM_a＝I₀・ｒ₁＋I₀・ｔ₁ ²・ｒ₂＋I₀・ｔ₁ ²・ｔ₂ ²・ｒ₃＋… (1) IM_b＝ I₀ ・ｒ₂＋I₀ ・ｔ₂ ²・ｒ₃＋… (2) 上記(1) のｒ₁が十分小さいとすると、I₀・ｒ₁≒０
(8)になる。

【００４３】式(8) を(1) に代入すると、 IM_a＝ｔ₁ ²（I₀・ｒ₂＋I₀・ｔ₂ ²・ｒ₃＋…） (9) 式(9) の（）の中は、式(2) の右辺と同一である。し
たがって、 IM_a＝ｔ₁ ²・IM_b (10) この式(10)より、ｔ₁＝√IM_a／IM_b よって、I₀・ｔ₁＝I₀√IM_a／IM_b (11) これでも類似の効果が得られる。

【００４４】次に、具体的に上記の観察方法を実施する
装置と、その動作について図８及び図９を参照しながら
説明する。図８は本発明の実施例を示す三次元情報画像
作成システムのブロック図、図９は本発明の実施例を示
す三次元情報画像作成フローチャートである。図８にお
いて、５０は試料断面作成装置、６０は三次元情報画像
作成装置、６１はインターフェース、６２は試料の表層
及び内部の画像メモリ、６３は試料の表層画像演算部、
６４は試料の各表層の画像メモリ、６５は三次元可視化
装置、６６は三次元情報画像作成装置の全体を制御する
ＣＰＵ（中央処理装置）、７０は光源である。

【００４５】図８に示すように、試料断面作成装置５０
において、試料断面が得られるとその断面が光源７０に
よって照射され、その試料の表層及び内部の画像が撮像
される。その画像は試料の表層及び内部の画像メモリ６
２に順次記憶される。その画像メモリに記憶されたデー
タに基づいて、試料の表層画像の演算部６３において試
料の表層画像の演算が行われ、試料の各表層画像が試料
の各表層画像メモリ６４に記憶される。そこで、試料の
各表層画像メモリ６４に基づいて三次元可視化装置６５
において三次元可視化情報を得ることができる。

【００４６】以下、その三次元情報画像作成方法を図９
を参照しながら説明する。ここでは、画像を得るべき層
数がｎ枚存在するものとして説明する。（１）試料断面作成装置に試料をセットする（ステップ
Ｓ１）。（２）試料の第１番目の表層及び内部の撮像を行う（ス
テップＳ２）。（３）試料断面作成装置により試料の表層を除去する
（ステップＳ３）。

【００４７】（４）次の新たな表層及び内部の撮像を行
う（ステップＳ４）。（５）試料断面作成装置により試料の表層を除去する
（ステップＳ５）。（６）試料の第ｎ番目（最後）の表層及び内部の撮像で
あるか否かを判断する（ステップＳ６）。試料の第ｎ番
目（最後）の表層及び内部の撮像でない場合は、ステッ
プＳ４に戻り、次の表層及び内部の撮像を行う。

【００４８】（７）試料の第ｎ番目（最後）の表層及び
内部の撮像が終了した場合には、上記した各表層及び内
部の画像に基づいて試料の各内部の画像を取り除き、試
料の各表層の画像のみを演算する（ステップＳ７）。（８）その演算された試料の各表層の画像を記憶する
（ステップＳ８）。（９）その試料の各表層の画像を編集して三次元可視化
情報を得る（ステップＳ９）。

【００４９】なお、上記した三次元情報画像作成方法は
あくまでも一例に過ぎない。特に、メモリ容量の増大に
伴って、メモリの構成及び画像情報の処理方法は適宜変
更することができることは言うまでもない。また、試料
の種類に応じて、光源の条件を代えたり、試料の表層の
除去条件を三次元情報画像作成装置の制御により、調整
することも可能である。

【００５０】なお、上記実施例においては、照明装置と
して、リングライトを用いたが、要するに、光源からの
直接反射光が対物レンズに入射されないように設計され
ることが重要であり、光源は点光源であっても、線光源
を用いるようにしてもよい。その点、光源及び線光源の
配置の場合にも、直接反射光が対物レンズに入射されな
いようにするとともに、透明生体試料の薄層切断時の凹
凸を消すように配置することは言うまでもない。

【００５１】また、試料としては生体以外の試料、例え
ば、複合材料、金属、プラスチック等を挙げることがで
きる。更に、上記実施例においては、試料は表層をカッ
タにより切断した例を示したが、表層を削ったり、化学
的に溶かしたりして除去するようにしてもよい。なお、
本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明
の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、それらを本発
明の範囲から排除するものではない。

【００５２】

【発明の効果】以上、詳細に説明したように、本発明に
よれば、以下のような効果を奏することができる。（１）切片観察法と同様に切削を行うが、切断面上の観
察を行うようにするので、切片作成の技術的困難を避け
ることができ、試料ブロックの側を観察しているので、
試料ブロックの位置決めさえ確実に行うことにより、試
料観察時の試料相互の位置決め精度の向上を図ることが
できるとともに、色情報の観察と、光軸方向の一断面像
の抽出を可能にすることができる。

【００５３】（２）更に、落射光学系での試料の色情報
の観察法を行う。これは通常の落射照明の直接反射光で
はなく、リングライトを用いて試料内部の乱反射を観察
することによって、透過観察で得られる色情報を観察す
ることができる。（３）また、リングライトを用いると、偏射照明の作用
により試料表面の切断表面の凹凸が強調されてしまう。
そこでリングライトに絞りを設けて、その凹凸を強調し
ないようにすることができる。

【００５４】（４）光軸方向の一断面抽出を行う。これ
は、観察したい切断面は、次の切断面の観察の前に除去
されるという切断面観察法の利点を活かし、従来法より
簡単な画像処理により、達成することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例を示す試料断面からの立体情報
画像化装置の断面図である。

【図２】本発明の実施例を示す試料断面からの立体情報
画像化装置の概略斜視図である。

【図３】本発明の実施例を示すリングライトを用いた落
射光学系での顕微鏡観察の状態を示す断面図である。

【図４】本発明の具体的実施例を示すリングライトを用
いた落射光学系を示す断面図である。

【図５】本発明の実施例を示す偏射照明系としての影響
を制御する絞りの効果のある試料面を示す斜視図であ
る。

【図６】偏射照明系としての影響を制御する絞りの効果
のない試料面を示す斜視図である。

【図７】光の透過、反射、減衰を簡略化した模式図であ
る。

【図８】本発明の実施例を示す三次元情報画像作成シス
テムのブロック図である。

【図９】本発明の実施例を示す三次元情報画像作成フロ
ーチャートである。

【図１０】従来の落射光学系での顕微鏡観察の状態を示
す断面図である。

【符号の説明】

１５試料の表層１６試料の内部面２１透明生体試料２２スピンドル２３対物レンズ２４リングライト２５切断刃２６インチウォーム・アクチュエータ２７変位センサ３１上部プレート３２下部プレート３３熱絶縁体３４切断アーム３５カウンタ・バランス・アーム３６エンコーダ３７フライホイール３８ベルト３９ＡＣサーボモータ４１カッターマーク４２絞り５０試料断面作成装置６０三次元情報画像作成装置６１インターフェース６２試料の表層及び内部の画像メモリ６３試料の表層画像演算部６４試料の各表層の画像メモリ６５三次元可視化装置６６ＣＰＵ（中央処理装置）７０光源

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料の表層を順次除去し、該試料の表面
を観察する試料断面からの立体情報画像化装置におい
て、（ａ）透過材料に包埋される試料と、（ｂ）該試料
に対向する対物レンズと、（ｃ）該対物レンズに直接反
射光が入射しないように配置する光源と、（ｄ）該光源
からの照射により前記試料の表層の画像と該表層に続く
内部の画像を得て、該試料の表層を除去し、該除去によ
り現れる新たな表層の画像と該表層に続く内部の画像を
得る撮像手段と、（ｅ）前記撮像手段からの画像を処理
して、色情報及び前記対物レンズの光軸と直交方向の一
断面像の抽出を行う手段とを具備することを特徴とする
試料断面からの立体情報画像化装置。
【請求項２】前記光源は前記対物レンズの回りに配置
されるリングライトである請求項１記載の試料断面から
の立体情報画像化装置。
【請求項３】前記リングライトに前記試料の薄層除去
時の凹凸を消す絞りを設けることを特徴とする請求項２
記載の試料断面からの立体情報画像化装置。
【請求項４】前記光源は前記対物レンズの回りに配置
される点光源である請求項１記載の試料断面からの立体
情報画像化装置。
【請求項５】前記光源は前記対物レンズの回りに配置
される線光源である請求項１記載の試料断面からの立体
情報画像化装置。
【請求項６】試料の表層を順次除去し、該試料の表面
を観察する方法において、（ａ）透過材料に包埋される
試料をステージに設定し、（ｂ）該試料に対向する対物
レンズに直接反射光が入射しないように光源を配置し、
（ｃ）該光源からの照射により前記試料の表層の画像と
該表層に続く内部の画像を観察し、（ｄ）該試料の表層
を除去し、（ｅ）該除去により現れる新たな表層の画像
と該表層に続く内部の画像を観察し、（ｆ）前記観察画
像を処理して色情報及び前記対物レンズの光軸と直交方
向の一断面像の抽出を行うことを特徴とする試料断面画
像の観察方法。
【請求項７】前記試料の断面からの距離と前記試料の
光学的特性に基づいて、前記断面情報からの演算によっ
て前記試料の内部の画像を取り除き、該試料の表層の画
像のみを得ることを特徴とする請求項６記載の試料断面
画像の観察方法。