CN112293318A - 一种鱼类受精卵脱粘的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鱼类受精卵脱粘的方法，属于对鱼类受精卵进行粘液脱粘技术领域，该方法包括鱼卵的获取、受精卵的制取、实验性条件的确定、受精卵脱粘处理、受精卵孵化以及重复脱粘处理等一系列步骤，本发明通过初次脱粘、重复脱粘等步骤大大提高了受精卵的脱粘效率，且受精卵存活效率高，通过上述步骤能够有效地对准葛尔雅罗鱼受精卵进行脱粘处理并且避免了准葛尔雅罗鱼受精卵死亡的现象，从而有效地提高了准葛尔雅罗鱼受精卵的孵化率。

Description

一种鱼类受精卵脱粘的方法

技术领域

本发明属于对鱼类受精卵进行粘液脱粘技术领域，具体地说，涉及一种鱼类受精卵脱粘的方法。

背景技术

本发明中的鱼类以准葛尔雅罗鱼为例，是新疆独有的土著鱼类，仅分布在新疆天山北坡准噶尔盆地诸河中，是这些河流中唯一一种具有较高经济价值的鱼类，也是该区域内标志性物种，具有重要的学术研究价值。该鱼在《中国濒危动物红皮书》中被列为易危物种，2019年被新疆维吾尔自治区列为I级重点保护水生野生动物。但是，由于水生生态环境的变化，以及人类的经济活动，准噶尔雅罗鱼生存的天然河道渠系化、水量减少、鱼类栖息生境破碎化和生态阻隔。这造成了准噶尔雅罗鱼分布范围不断萎缩，资源的严重衰退，这将直接对该鱼的生态保护构成威胁，为了提高准葛尔雅罗鱼生存数量，新疆水产科学研究所对准噶尔雅罗鱼引种、驯化、繁育、苗种培育等多项技术进行突破，原种、苗种和种鱼数量都已初具规模，唯一不足的是准葛尔雅罗鱼率极低，严重影响了准葛尔雅罗鱼的繁殖。

经研究，准葛尔雅罗鱼卵为粘性卵，卵子外面具有一层蛋白外膜，具粘性，正常发育的受精卵与死卵极易粘附成团，易造成胚胎窒息，同时死卵中易感染水霉病，水霉的菌丝极易入侵正常发育的胚胎，导致受精卵大量死亡，直接大幅度降低孵化率。

为了提高了准葛尔雅罗鱼受精卵的孵化率，对准葛尔雅罗鱼受精卵外侧的具有粘性的蛋白外膜进行脱粘处理，以提高了准葛尔雅罗鱼受精卵的孵化率，现有技术中采用黄土、滑石粉和清水等传统物理脱粘法无法有效的进行脱粘，单宁酸化学脱粘法脱粘时效短，仍很快粘附在着卵板上，并会不断粘附污物。针对准噶尔雅罗孵化低的问题，目前急需寻求一种较为安全和有效的方法。

发明内容

针对现有的准葛尔雅罗鱼受精卵的孵化率较低的问题，本发明提供一种鱼类受精卵脱粘的方法，该方法主要是通过胰蛋白酶溶液对鱼卵外侧具有粘性的蛋白外膜进行脱粘处理，首先根据实验性条件确定了胰蛋白酶溶液的浓度和脱粘时间，从而对受精卵进行脱粘的同时降低了受精卵的死亡率，提高了准葛尔雅罗鱼受精卵的孵化率。

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种鱼类受精卵脱粘的方法，包括受精卵脱粘处理、受精卵孵化以及重复脱粘处理步骤，首先对受精卵进行脱粘处理，经过脱粘处理后的受精卵进行孵化，孵化后的受精卵再次进行脱粘处理；

所述的受精卵脱粘处理步骤为：将0.5%的胰蛋白酶溶液脱粘浓度倒入滤干的受精卵中，受精卵与脱粘的胰蛋白酶溶液配比1:8～10，使用羽毛顺时针轻微搅动之后，溶液表面出现白色蛋白泡沫，2min后及时用羽毛将胰蛋白酶溶液倾倒干净，去除受精卵表面的胰蛋白酶溶液；

所述的受精卵孵化的步骤为：将上述脱粘后的受精卵置于防粘新水孵化器内孵化，每个孵化器内放入2～3万粒受精卵；

所述的重复脱粘的步骤为：在水温为17～22℃的孵化条件下，受精卵在防粘新水孵化器内孵化，孵化第三天选择0.5%浓度的胰蛋白酶溶液对孵化的受精卵进行重复脱粘2min，重复脱粘后将受精卵表面的胰蛋白酶溶液清洗干净。

优选地，所述的受精卵脱粘处理中，去除受精卵表面的胰蛋白酶溶液包括如下步骤：

免疫组化PBS缓冲液对脱粘后的受精卵进行清洗，清洗3次，每次清洗2～3min，清洗受精卵上残留的胰蛋白酶溶液，免疫组化PBS缓冲液清洗完成后，受精卵使用纯净水清洗6次，每次清洗2～3min。

优选地，清洗时免疫组化PBS缓冲液与受精卵的配比为1:8～10。

优选地，所述的受精卵脱粘处理之前还包括实验性条件的确定，其具体步骤如下：

分别配制胰蛋白酶溶液浓度为0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%五个脱粘梯度，分别使用定时器定时0min、2min、4min、6min、8min五个效应时间梯度；将受精卵置于上述不同浓度的胰蛋白酶溶液中分别进行五个效应时间梯度的脱粘处理。

优选地，经过实验性条件的确定，0.5%浓度的胰蛋白酶溶液经2min对受精卵进行脱粘处理为最佳脱粘条件。

本发明中，为了提高了受精卵的质量，提高采卵效率，本发明采用如下技术方案：

上述鱼类受精卵脱粘的方法，还包括鱼卵的获取，其具体步骤如下：

将性腺发育良好的鱼体进行催产孵化，使用激素诱导的方法进行催产，当鱼体轻压腹部即有卵流出时进行采卵。

优选地，采卵时对鱼体采用2-苯氧乙醇对鱼体进行麻醉。

本发明中，还采用如下技术方案：

上述鱼类受精卵脱粘的方法，还包括受精卵的制取，其具体步骤如下：

在采取的卵内挤入0.2%浓度葡萄糖受精液，同时使用洁净的羽毛顺时针轻微搅动，之后静止2～3min，卵子充分受精。

优选地，受精卵与葡萄糖受精液配比为1:5～10。

有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

（1）本发明中采用胰蛋白酶溶液对受精卵表面具备粘性的蛋白外膜进行脱粘，脱粘后的受精卵表面光滑，受精卵避免了由于粘性堆积死亡的情况发生，同时也避免了受精卵受水霉感染死亡的情况发生，大大提高了受精卵的成活率，从而进一步提高了受精卵的孵化率；

（2）本发明还采用了重复脱粘的步骤对受精卵进一步脱粘，避免了受精卵在孵化过程中出现粘液导致累积在一起死亡的情况，从而本发明中的脱粘方法大大提高了受精卵的脱粘效率，受精卵存活数量多，因此，其孵化率提高；

（3）本发明中在脱粘过程中采用羽毛搅拌，羽毛由于其质地柔软，在搅拌过程中可以使得胰蛋白酶溶液与受精卵表面的粘液充分混合达到脱粘效果，另一方面也避免了搅拌过程中在受精卵表面导致刮痕甚至导致受精卵破裂的问题发生，进一步提高了受精卵的存活率。

附图说明

图1为体视显微镜20x下受精卵经胰蛋白酶溶液脱粘后效果图；

图2为体视显微镜15x下受精卵孵化效果图。

具体实施方式

下面结合具体发明对本发明进一步进行描述。

实施例1

如图1所示，其为本发明中一优选实施方式的脱粘的方法对准葛尔雅罗鱼受精卵脱粘处理后受精卵的效果图，本实施例中的鱼类受精卵脱粘的方法，包括鱼卵的获取、受精卵的制取、实验性条件的确定、受精卵脱粘处理、受精卵孵化以及重复脱粘处理等一系列步骤，通过上述步骤能够有效地对准葛尔雅罗鱼受精卵进行脱粘处理并且避免了准葛尔雅罗鱼受精卵死亡的现象，从而有效地提高了准葛尔雅罗鱼受精卵的孵化率。

本发明中，鱼卵的获取的包括如下步骤：将性腺发育良好的准噶尔雅罗鱼进行催产孵化，使用激素诱导的方法进行催产。打完催产针，检查准噶尔雅罗鱼雌鱼时轻压腹部即有卵流出时，可马上进行人工授精，准葛尔雅罗鱼采取全人工采卵授精方式。

本发明中，在采卵或采精之前，采用2-苯氧乙醇对鱼体进行麻醉，防止操作时对鱼体造成损伤。

本发明中，人工采卵时将亲鱼捕起，用毛巾将鱼体和操作者手上的水擦干，防止卵子吸水而被激活，影响受精。挤卵应先从靠近生殖孔处开始，逐步由腹部向生殖孔方向挤压，采卵时要求用力均匀，力度适中，防止亲鱼受伤。将卵子挤入擦干的盆中，同时挤入雄鱼的精液。

本发明中，受精卵的制取包括如下步骤：在室内环境条件下，将提前配制好的0.2%浓度葡萄糖受精液及时的倒入盆中，受精卵与葡萄糖受精液配比为1:5～10，同时使用洁净的羽毛顺时针轻微搅动，之后静止2～3min，使其充分受精。

本发明中，采用羽毛轻微搅动，由于羽毛质地柔软的特性避免了在搅动过程中导致受精卵破裂从而导致受精卵死亡的现象发生，搅拌3～5min后受精卵出现粘性，通过纯净水清洗5～6次，每次3～5min，经过30～40min后，受精卵吸收膨胀到最大卵径为1.73～1.88mm，即可开展胰蛋白酶溶液脱粘。

本发明中，实验性条件确定包括如下步骤：分别配制胰蛋白酶溶液浓度为0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%五个脱粘梯度，分别使用定时器定时0min、2min、4min、6min、8min五个效应时间梯度。将受精卵置于上述不同浓度的胰蛋白酶溶液中分别进行五个效应时间梯度的脱粘处理。经实验，0.75%及以上胰蛋白酶溶液浓度，易造成脱粘浓度过大，卵膜收缩，胚胎死亡；6min及以上效应时间易造成时效过长，受精卵消融，胚胎易造成死亡；0.5%相对0.25%胰蛋白酶溶液浓度能够保证脱粘效果，同样不损害受精卵；2min与4min脱粘效果较相同，按照最小损伤原则，选取最少效应时长2min。因此，本发明中，采用0.5%浓度的胰蛋白酶溶液经2min脱粘对受精卵进行脱粘处理。

本发明中，受精卵脱粘处理包括如下步骤：

将0.5%的胰蛋白酶溶液脱粘浓度倒入滤干的受精卵中，受精卵与脱粘的胰蛋白酶溶液配比1:8～10，使用羽毛顺时针轻微搅动之后，溶液表面出现白色蛋白泡沫，2min后及时用羽毛将胰蛋白酶溶液倾倒干净。

配制免疫组化PBS缓冲液，将配置好的免疫组化PBS缓冲液放入5℃冷藏冰箱内保存，将上述配制的免疫组化PBS缓冲液对上述进行脱粘后的受精卵进行清洗，清洗3次，每次清洗2～3min，清洗受精卵上残留的胰蛋白酶溶液，清洗时免疫组化PBS缓冲液与受精卵的配比为1:8～10。免疫组化PBS缓冲液清洗完成后，受精卵使用纯净水清洗6次，每次清洗2～3min，可使用羽毛较快搅动，完全将免疫组化PBS缓冲液清洗掉，脱粘后的受精卵见图1。

本发明中，受精卵的孵化包括如下步骤：将上述脱粘后的受精卵置于防粘新水孵化器内孵化，每个孵化器内放入2～3万粒受精卵，在防粘新水孵化器内孵化水温与室内水温尽量一致，或温差不超过2℃为宜。

本发明中，重复脱粘主要包括如下步骤：在水温为17～22℃的孵化条件下，受精卵在防粘新水孵化器内孵化，孵化第三天选择0.5%浓度的胰蛋白酶溶液对孵化的受精卵进行重复脱粘2min，重复脱粘后的受精卵既能达到脱粘的最佳效果，又不会对胚胎造成损失，同时减少挑拣死卵、长水霉的卵的工作量。

最后，受精卵重复脱粘后，在烧杯内将即将破膜的受精卵使用纯净水漂洗，清洗3次，使受感染水霉的受精卵与正常发育的受精卵有效分离，将快要破膜的受精卵铺设在30目的尼龙网着卵板上，等待孵化出苗，其效果见图2。

在传统技术中，采用黄土、滑石粉和清水等传统物理脱粘法以及单宁酸化学脱粘法对准葛尔雅罗鱼受精卵进行脱粘处理，本发明中为了进一步验证本发明的脱粘方法相比传统方法更具优越性，在同等条件性采用传统脱粘法和本发明中脱粘方法对同一批准葛尔雅罗鱼受精卵进行脱粘处理，处理后的受精卵孵化情况见表1。

表1 传统脱粘方法与本发明脱粘方法对受精卵进行脱粘处理后受精卵的孵化率

通过与传统脱粘方法相比较，本发明中的脱粘方法对受精卵进行脱粘处理后，受精卵粒分离效果明显，可以明显看到受精卵内胚胎发育情况，且受精卵的孵化率高达69.28，从而大大提高了受精卵的存活率。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

Claims (9)

1.一种鱼类受精卵脱粘的方法，其特征在于：

包括受精卵脱粘处理、受精卵孵化以及重复脱粘处理步骤，首先对受精卵进行脱粘处理，经过脱粘处理后的受精卵进行孵化，孵化后的受精卵再次进行脱粘处理；

所述的受精卵脱粘处理步骤为：将0.5%的胰蛋白酶溶液脱粘浓度倒入滤干的受精卵中，受精卵与脱粘的胰蛋白酶溶液配比1:8～10，使用羽毛顺时针轻微搅动之后，溶液表面出现白色蛋白泡沫，2min后及时用羽毛将胰蛋白酶溶液倾倒干净，去除受精卵表面的胰蛋白酶溶液；

所述的受精卵孵化的步骤为：将上述脱粘后的受精卵置于防粘新水孵化器内孵化，每个孵化器内放入2～3万粒受精卵；

所述的重复脱粘的步骤为：在水温为17～22℃的孵化条件下，受精卵在防粘新水孵化器内孵化，孵化第三天选择0.5%浓度的胰蛋白酶溶液对孵化的受精卵进行重复脱粘2min，重复脱粘后将受精卵表面的胰蛋白酶溶液清洗干净。

2.根据权利要求1所述的鱼类受精卵脱粘的方法，其特征在于：所述的受精卵脱粘处理中，去除受精卵表面的胰蛋白酶溶液包括如下步骤：

免疫组化PBS缓冲液对脱粘后的受精卵进行清洗，清洗3次，每次清洗2～3min，清洗受精卵上残留的胰蛋白酶溶液，免疫组化PBS缓冲液清洗完成后，受精卵使用纯净水清洗6次，每次清洗2～3min。

3.根据权利要求2所述的鱼类受精卵脱粘的方法，其特征在于：清洗时免疫组化PBS缓冲液与受精卵的配比为1:8～10。

4.根据权利要求1所述的鱼类受精卵脱粘的方法，其特征在于：所述的受精卵脱粘处理之前还包括实验性条件的确定，其具体步骤如下：

分别配制胰蛋白酶溶液浓度为0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%五个脱粘梯度，分别使用定时器定时0min、2min、4min、6min、8min五个效应时间梯度；将受精卵置于上述不同浓度的胰蛋白酶溶液中分别进行五个效应时间梯度的脱粘处理。

5.根据权利要求4所述的鱼类受精卵脱粘的方法，其特征在于：经过实验性条件的确定，0.5%浓度的胰蛋白酶溶液经2min对受精卵进行脱粘处理为最佳脱粘条件。

6.根据权利要求1-5任一项所述的鱼类受精卵脱粘的方法，其特征在于：还包括鱼卵的获取，其具体步骤如下：

将性腺发育良好的鱼体进行催产孵化，使用激素诱导的方法进行催产，当鱼体轻压腹部即有卵流出时进行采卵。

7.根据权利要求6所述的鱼类受精卵脱粘的方法，其特征在于：采卵时对鱼体采用2-苯氧乙醇对鱼体进行麻醉。

8.根据权利要求6所述的鱼类受精卵脱粘的方法，其特征在于：还包括受精卵的制取，其具体步骤如下：

在采取的卵内挤入0.2%浓度葡萄糖受精液，同时使用洁净的羽毛顺时针轻微搅动，之后静止2～3min，卵子充分受精。

9.根据权利要求8所述的鱼类受精卵脱粘的方法，其特征在于：受精卵与葡萄糖受精液配比为1:5～10。

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